Introduction
Atomisk kraftmikroskopi (AFM) er en kraftig teknikk for analyse av protein-DNA-interaksjoner 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Det krever bare lave mengder prøveemne for direkte å visualisere heterogene prøver med en oppløsning på enkeltmolekylnivå. Heterogenitet kan skyldes forskjellige konformasjonelle eller oligomere tilstander i et protein. Spesielt kan proteinkompleksene i sammenheng med protein-DNA-prøver vise forskjellige støkiometrier og / eller konformasjoner indusert ved DNA-binding generelt eller bindende til et spesifikt målsted i DNA. Heterogene prøver kan også inneholde to (eller flere) forskjellige typer proteiner og forskjellige proteinkomplekserFormer ( f.eks . Som består av bare én type protein versus heteromere komplekser) kan interagere forskjellig med DNA. Studiene som diskuteres her, utnytter AFM-bildebehandling i luft på statiske, tørkede prøver av DNA-reparasjonsproteiner bundet til lange (~ 900 basepar, bp) DNA-fragmenter som inneholder en lesjon, som representerer et mål for disse proteinene. Den høye molekylære oppløsningen av AFM tillater forskjellen mellom forskjellige typer proteinkomplekser og å bestemme bindingsposisjonene av proteiner på DNA-fragmentene. Viktig er at lesjonene blir introdusert i DNA-substratene ved veldefinerte posisjoner. Fordi plasseringen av lesjonsstedet i DNA er kjent, gir fordelingen av proteiner bundet til DNA innsikt i (forskjellige) lesjonsgenkjenningsegenskaper av (forskjellige) proteinkompleksene, f.eks . Hvor godt de kjenner igjen en bestemt type lesjon (sammenlignet med Til ikke-skadet DNA) 2 , 3 ,
DNA-reparasjonsproteiner som er fokusert på her er helikaser som er ansvarlige for lesjonsgenkjenning i nukleotid-eksplisjonsreparasjonen (NER) -banen. I bakterier oppnås NER ved proteinene UvrA, UvrB og UvrC. UvrA er ansvarlig for innledende lesjonssensing i et UvaA 2 / UvrB 2 DNA-skanningskompleks. Ved lesjon verifisering av UvrB konverterer dette komplekset til monomer UvrB bundet på lesionsstedet, og dette bestemte komplekset kan deretter rekruttere pRokaryotisk NER endonuklease UvrC. UvrC aksepterer en kort (12-13 nt) strekning av enkeltstrenget DNA (ssDNA) som inneholder lesjonen. Den manglende strekk blir deretter påfyllt av DNA-polymerase. Endelig forsegler DNA-ligase den nylig syntetiserte strekk med det opprinnelige DNA 9 , 10 . I eukaryoter er de fleste proteiner i NER-kaskaden en del av det store multimeriske transkripsjonsfaktor II H (TFIIH) komplekset. Etter innledende lesjonsavkjenning via det trimeriske CEN2-XPC-HR23B-komplekset rekrutteres TFIIH til DNA-målstedet. Når XPD i komplekset verifiserer tilstedeværelsen av en NER-mållesjon, rekrutteres de eukaryote NER endonukleaser XPG og XPF for å aksessere en kort (24-32 nt) strekning av ssDNA som inneholder lesjonen 9 , 10 . Her ble spesielt undersøkt helikasene UvrB og XPD fra henholdsvis prokaryotisk og eukaryotisk NER. Disse helikasene krever en uparret region iDNA (en DNA-boble) for å tråkke på en av de to DNA-enkeltstrengene og deretter translokere langs denne strengen drevet av ATP-hydrolyse. I tillegg til DNA-lesjonene ble en DNA-boble introdusert i substratene som fungerer som lastingssted for proteinene.
Fremgangsmåten for fremstilling av spesifikke lesjon-DNA-substrater er blitt beskrevet tidligere 11 . Det krever en sirkulær DNA-konstruksjon (plasmid) med to tett avskilt restriksjonsseter for en nikase. I sammenheng med denne studien ble plasmidet pUC19N (2729 bp) brukt (opprettet av S. Wilsons laboratorium, NIEHS). Dette plasmidet inneholder tre nært avsatte restriksjonssteder for nikase Nt.BstNBI som rammer en strekning på 48 nukleotid (nt). Etter inkubering med nikasen kan strekningen av ssDNA mellom disse stedene fjernes og erstattes av et oligonukleotid som inneholder hvilken som helst målfunksjon. Etter hvert trinn testes komplett enzymatisk fordøyelse via agarosegelelektroforese. Nikket sirkulært DNA kan skelnes på grunn av sin lavere elektroforetiske mobilitet sammenlignet med det opprinnelige supercoiled plasmidet. Gapping av DNA og erstatning av den fjernede strekk av det spesifikke substratoligonukleotidet kan evalueres via fordøyelse med et restriksjonsenzym som inkludere substratet utelukkende innenfor regionen mellom nicks. Linearisering av det sirkulære plasmidet av enzymet vil følgelig bli undertrykt for gapped DNA og gjenopprettet etter innsetting av det spesifikke oligonukleotid. Endelig tillater to endonuklease restriksjonssteder (ideelt single cutters) genereringen av et lineært DNA-substrat, med lengde som ønsket og med det spesifikke målstedet i en definert posisjon, så vel som en DNA-boble i en avstand fra lesjonen enten i 5 'Eller 3' retning.
Anerkjennelse av lesjonene ved NER-helikasene kan undersøkes via AFM-bildebehandling. Stalled DNA-translokasjon av helikasene ved tHan lesionssted er synlig som en topp i proteinposisjonsfordelingen på DNA og indikerer lesjonsgenkjenning. Fordi DNA-translokasjon av disse helikasene er videre retningsbestemt, med 5'-til-3'-polaritet, indikerer avhengigheten av lesjonsgenkjenning på posisjonen til lastingsstedet (DNA-boblen oppstrøms eller nedstrøms fra lesjonen) også om lesjonen er fortrinnsvis gjenkjent På den translokaterte eller på motsatt, ikke-translokulerte ssDNA-streng 5 , 9 . I de følgende avsnittene vil de brukte metodene bli introdusert, og store funn fra disse forsøkene vil bli kort diskutert. Viktig, analogt med det eksemplariske arbeidet med DNA-reparasjon vist her, kan AFM-bildebehandling påføres studier av forskjellige DNA-interaksjonssystemer, slik som DNA-replikasjon eller transkripsjon 8 , 12 , 13 , 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- Fremstilling av DNA-substratene 11
- Genererer et ssDNA gap i plasmidet
- Fullstendig fordøye en prøve av plasmidet (her: modifisert pUC19, pUC19N) i et reaksjonsrør med en passende nikase (her: Nt.BstNBI) etterfulgt av enzymvarmeinaktivering ved bruk av betingelser i henhold til produsentens protokoll (se figur 1 for en skjematisk presentasjon). Start med ~ 50 μl og ~ 500 nM plasmid for et tilstrekkelig utbytte.
- Verifiser plasmid-nicking ved agarosegelelektroforese på fortynnede prøver (~ 20 nM) 15 . Bruk hansker for beskyttelse mot DNA-bindingsfargen som brukes til DNA-visualisering.
MERK: Ulike elektroforetiske mobiliteter tillater forskjell mellom nicked (avslappet) og supercoiled sirkulært plasmid DNA ( Figur 1 ). - Fjern den innsnevrede ssDNA-strengen (mellom nikksteder) fra plasmidet vedInkubasjon med et 10-folds overskudd av det komplementære oligonukleotidet (oligonukleotid 1 i tabell 1 ), risting ved 300 rpm i 30 minutter nær smeltetemperaturen til oligonukleotidet (her: 68 ° C for pUC19N) i en varmeblokk ( figur 1 ).
- Separat gapped plasmidet fra de mindre DNA-fragmentene ved bruk av et 50 kDa molekylvekt kuttet av (MWCO) filter ved sentrifugering i 10 minutter ved 10 000 xg i en bordsentrifuge ( Figur 1 ). For å ekstrahere det konsentrerte DNA fra filteret, inverter filteret og sett inn i et nytt 1,5 ml reaksjonsrør. Sentrifuger i 3 minutter ved 1000 x g.
- Påfyll den resulterende konsentrerte DNA-prøven til 500 ul med deionisert, filtrert vann, tilsett ytterligere ~ 5 ganger overskudd av komplementært oligonukleotid og gjenta trinn 1.1.1.3 og 1.1.1.4 minst 3 ganger.
- Test for fullstendig gapping av DNA ved inkubering med et egnet restriksjonsenzym (her: XhoI eller BglII) under anvendelse av conditiOns ifølge produsentens beskrivelse. Bruk fortynnede (nicked versus gapped) DNA-prøver (~ 20 nM). Kjør en agarosegelelektroforese for å skille mellom linearisert plasmid (som ikke inneholder noe ssDNA-gap) og ikke-incisert DNA (gapped DNA) ved bruk av nicked DNA som positiv kontroll (inkludere en DNA-stige for referanse, figur 1 ). Bruk hansker.
- Refilling av gapet med modifiserte ssDNA-oligonukleotider
- Anneal gapped plasmidet via inkubering med et 25-folds overskudd av et 5'-fosforylert oligonukleotid som inneholder spesifikk målsted (er) av valg, inkubering ved ~ 45 ° C i 4 timer ( figur 1 ). Her bruker du 48 nt ssDNA som inneholder en lesjon, enten en fluoresceinadduktet tymin eller en cyklobutanpyrimidindimer (CPD), og i tillegg en kort (8 nt) ikke-komplementær sekvens for å produsere DNA-bobler (se tabell 1 ).
- Kovalent lenke den glødelagte innsatsen til plasmidet ved hjelp av inkubaTion med T4 DNA ligase over natten ved romtemperatur i henhold til produsentens protokoll ( Figur 1 ). For denne reaksjonen, tilsett ATP som inneholder konsentrert bufferlagerløsning for å fremstille egnede bufferbetingelser for ligasen ( f.eks . Bruk UvrB-reaksjonsbuffer: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM ATP).
- Test for innsetting av det spesifikke oligonukleotidet i gapped plasmidet ved fordøyelse av fortynnede prøver med et egnet restriksjonsenzym (samme som i 1.1.1.6) i henhold til produsentens protokoll fulgt av en agarosegelelektroforese (som i 1.1.1.6, Figur 1 ).
- Fremstilling av lineært DNA-substrat
- Fordel det modifiserte plasmid-DNA med restriksjonsenzymer (ideelt med et enkelt restriksjonssted i plasmidet) ved bruk av betingelser som anbefalt av produsenten ( figur 1 ). Dette trinnet produserer lineære fragmenterLegg inn den innførte modifikasjonen i en definert posisjon. Her bruker du SspI- og BspQI-kutting i posisjonene 613 og 255 bp oppstrøms og nedstrøms for innsatsen, henholdsvis, hvilket resulterer i et 916 bp DNA-fragment som inneholder det spesifikke lesjonsstedet ved ~ 30% av DNA-lengden.
MERK: For AFM imaging eksperimenter som beskrevet her, er DNA fragmenter med lengder mellom ~ 200 bp og ~ 2000 bp passende substrater. - Isoler målfragmentet via agarosegel-elektroforese og gelekstraksjon ved bruk av et kommersielt sett. Bruk hansker for beskyttelse.
- Eventuelt, kut agarosegel med en skalpell for å separere DNA-stigen og fortynnede prøvebaner (første to baner) fra banene som inneholder det konsentrerte DNA som skal renses. Bare utelat geldelen med de to første banene til UV-bestråling ved å plassere bare denne delen av gelen på et UV-bord.
- Klipp ut båndet som svarer til fragmentet av valget med en skalpell. Forene de to geldelene igjen (av UV-fanenle). Bruk posisjonen til det ekskluderte båndet fra den fortynnede prøven som orientering for stillingen av båndet av det ønskede DNA-substrat. Beregn høyere konsentrasjon ved å kutte ut litt bredere skiver enn for fortynnet kontroll.
MERK: Fordi det ble undersøkt anerkjennelse av UV-lesjoner, ble innføring av ytterligere UV-lesjoner via UV-bestråling nøye unngått i DNA-substratet ved denne tilnærmingen.
- Klipp ut båndet som svarer til fragmentet av valget med en skalpell. Forene de to geldelene igjen (av UV-fanenle). Bruk posisjonen til det ekskluderte båndet fra den fortynnede prøven som orientering for stillingen av båndet av det ønskede DNA-substrat. Beregn høyere konsentrasjon ved å kutte ut litt bredere skiver enn for fortynnet kontroll.
- Beregn DNA-konsentrasjonen c fra absorpsjonen ved 260 nm målt ved et UV-Vis-spektrofotometer ved bruk av Lambert-Beer's law med en dobbelstrenget DNA (dsDNA) gjennomsnittlig molar ekstinksjonskoeffisient på ε 260nm ~ 6.700 M - 1 cm - 1 per bp:
Hvor L er sti lengden (målekammerlengde, typisk 1 cm).
- Fordel det modifiserte plasmid-DNA med restriksjonsenzymer (ideelt med et enkelt restriksjonssted i plasmidet) ved bruk av betingelser som anbefalt av produsenten ( figur 1 ). Dette trinnet produserer lineære fragmenterLegg inn den innførte modifikasjonen i en definert posisjon. Her bruker du SspI- og BspQI-kutting i posisjonene 613 og 255 bp oppstrøms og nedstrøms for innsatsen, henholdsvis, hvilket resulterer i et 916 bp DNA-fragment som inneholder det spesifikke lesjonsstedet ved ~ 30% av DNA-lengden.
- Genererer et ssDNA gap i plasmidet
- Ekspresjon og rensing av proteiner
- Rekombinant uttrykker UvrB i E. coli og renser proteinet via standard chitin-beadsaffinitet 15 og størrelseseksklusjonskromatografi 15 som tidligere beskrevet 16 .
MERK: UvrB genet fra Bacillus caldotenax hadde blitt klonet inn i pTYB1 vektoren. - Express XPD i E. coli og rens proteinet via standard nikkel IDA affinitet 15 og størrelseseksklusjonskromatografi 15 etterfulgt av anionbytterkromatografi 15 , som tidligere beskrevet 17 .
MERK: Genet for Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum gruppe D protein (XPD) ble klonet inn i pBADM11 vektoren. C. thermophilum p44 var en slags gave fra Caroline Kiskers laboratorium, uttrykt og puriFied som beskrevet 17 .
- Rekombinant uttrykker UvrB i E. coli og renser proteinet via standard chitin-beadsaffinitet 15 og størrelseseksklusjonskromatografi 15 som tidligere beskrevet 16 .
2. AFM-eksperiment
- Prøveforberedelse
- Eventuelt pre-inkuberer DNA-substratet ved 65 ° C i 10 minutter i en varmeblokk for å fjerne potensielle mikrosaltkrystaller som kan ha dannet under lagring i kjøleskapet.
- Klargjør reaksjonsbuffer (e) ved en 10-minutters konsentrasjon (10x buffere).
MERK: XPD-reaksjonsbuffer ved 1 x konsentrasjon inneholdt 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 2 mM ATP; 1 x UvrB reaksjonsbuffer inneholdt 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og 1 mM ATP. - Forinkuber proteiner ved høyere konsentrasjon i egnede inkubasjonsbetingelser for å forbedre kompleksdannelse. Fortynn et lite volum ( f.eks . 1 μl) av de enkelte proteiner i 1x proteinreaksjonsbuffer til ønsket konsentrasjon og bland små mengder ( f.eks . 1 μl) tHan individuelle proteinløsninger i et 0,5 ml reaksjonsrør.
- Plasser røret i en varmeblokk for inkubasjonstemperaturer høyere enn romtemperatur. Velg et konsentrasjonsforhold avhengig av forventet kompleks støkiometri, enten ekvimolar eller tilsvarende konsentrasjoner. Her inkuberer 1 μl XPD (20 μM i 1 x XPD reaksjonsbuffer) og 1 μL p44 (20 μM i 1x XPD-reaksjonsbuffer) ved 10 μM hver i 10 minutter ved 37 ° C.
- Inkuber prøver ved passende protein- og DNA-konsentrasjoner i proteinreaksjonsbuffer i et 0,5 ml reaksjonsrør. Her bruker du 500 nM UvrB eller 1 μM XPD + 1 μM p44 og 100 nM DNA. Pipette små volumer for å lagre materiale, for eksempel 0,25-0,5 μL protein (forfortynnet til en 10 ganger inkubasjonskonsentrasjon) og DNA i et totalt volum på 2,5-5 μl 1x proteinreaksjonsbuffer. Her inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C i en varmeblokk. Spinn ned i et reaksjonsrør kort (~ 1 s) i en tabell-sentrifugeringE for å sikre blanding av små volumer.
- Prøveavsetning
- Klargjør et glimmerstråle: Klipp en ca. 1 x 1 cm 2 glimmer fra større strimler ved hjelp av en skalpell. Strip av topplag av det flerlags glimmerbrikke med limbånd for å avsløre en ren, flat og atomisk glatt underlagsoverflate.
MERK: Glimmerplaten kan brukes til flere eksperimenter ved å fjerne ytterligere lag (er). - Forbered AFM-deponeringsbufferen med deionisert, filtrert vann, f.eks . 25 mM HEPES pH 7,5, 25 mM Na-acetat, 10 mM Mg-acetat. Filter gjennom et 0,02 μm sprøytefilter.
MERK: Divalente kationer i avsetningsbufferen tjener til å chelatere de negativt ladede DNA-molekylene til glimmeroverflaten, som også er negativt ladet ved nøytral pH. Hvis den relativt høye Mg2 + ionkoncentrasjonen i avsetningsbufferen utgjør et problem for et bestemt protein-DNA-system, alternativt,Glimmeroverflaten kan forhåndsbelastes med aminogrupper ved bruk av silatranbasert kjemi for å gi positive overfladetilførsler for forankring 18 . Prøveavsetning kan deretter utføres i en buffer som inneholder ingen eller bare lave mengder divalente kationer. - Fortynn prøven (se 2.1) for umiddelbar avsetting på glimmer i avsetningsbuffer. Sett inn et lite volum (her: 20 μL).
MERK: Fortynningsfaktorer avhenger av prøvekonsentrasjonen. Her fortynnes prøver 50-100x. Som en tommelfingerregel resulterer ~ 1 nM DNA i en god overflate dekning for ~ 1000 bp. - Skyll øyeblikkelig prøven tre til fire ganger med noen få milliliter filtrert, deionisert vann, avklut overflødig væske og tørk i en mild nitrogenstrøm. Hele prosessen fra prøveavsetning til tørkede prøver kan utføres innen mindre enn 30 s.
- Fest stykket glimmer på et mikroskopdia med limbånd på kantene.
MERK: Ulike AFM-systemer har dIfferent krav til å fikse prøven til scenen. Andre AFM har magnetiske trinn, og glimmerbitene er festet på magnetiske disker, for eksempel ved bruk av termisk lim. Detaljer om AFM-systemet som brukes her, finnes i Materialetabellen.
- Klargjør et glimmerstråle: Klipp en ca. 1 x 1 cm 2 glimmer fra større strimler ved hjelp av en skalpell. Strip av topplag av det flerlags glimmerbrikke med limbånd for å avsløre en ren, flat og atomisk glatt underlagsoverflate.
- AFM-bildebehandling
- Plasser prøven (se 2.2.5) sentralt på AFM-scenen og fest mikroskopdiafasen på scenen med magnetiske pads.
- Sett inn AFM-spissen i spissholderen. Bruk cantilevers med en skarp (<10 nm) AFM sonde som er egnet for oscillerende, intermittent kontaktmodus avbildning i luft. Bruk AFM-sonder, for eksempel, som vist i Materialetabellen . Her (avhenger av AFM), fest spissen i holderen under en klemme ved å klemme klemskruen (fingertett). Sett toppholderen i AFM målehodet. Legg hodet på ryggen for dette trinnet.
- Plasser AFM målehodet på toppen av prøven. Detaljer avhenger av AFM-modellen. Her mVær sikker på at hodet står stabilt med beina inne i scenen. Pass på at glimmeret befinner seg på scenen der AFM-spissen vil sveve rett over den. Mikrometer skruer på høyre side av scenen muliggjør fin posisjonering av prøven.
- Juster AFM-laseren på baksiden av cantilever for optimal signalstyrke fra den posisjonssensitive fotodetektoren som laseren reflekteres på. Detaljer avhenger av AFM-modellen.
- Her dreier du hjulene på høyre side og baksiden av AFM-målehodet for å justere AF- og y-posisjonene til AFM-laseren for å rette den sentralt på enden av kanten. Se refleksjonssignalet i AFM-videovinduet (hvis tilgjengelig, her: Trykk på kameraikonet og velg input: Svideo).
- Når du først har en god posisjon, optimaliserer du detektorens summesignal (Sum i Sum og Deflection Meter-vinduet i AFM-programvaren) ved å finjustere laserposisjonen med de to hjulene (hold deg på enden av cantilever, summen signalenJeg er avhengig av AFM og cantilever type, her: mål for sum> 5).
- Nul forskjelsessignalet fra detektorens topp- og bunndioder (her: Defleksjonssignal i Sum og Deflection Meter-vinduet) ved å rette AFM-laserrefleksjonen på detektorsenteret (her: dreie hjulet til venstre på AFM-måling hode).
MERK: Avvik fra null angir avbøyning av cantilever på grunn av overflateinteraksjoner, som oversettes til høydeinformasjon av AFM. - Bestem cantilever resonansfrekvensen med en frekvens melodi implementert i AFM-programvaren (her: kommando automatisk tune i hovedpanel / Tune vindu). Velg en amplitude som tilsvarer 1 V-inngang for piezoen som driver cantilever-svingningen. Still svingningsfrekvensen til litt (5%) lavere enn resonansfrekvensen og nullfase av svingningen.
- Tilnær spissen til prøveoverflaten ved hjelp av den rå inngrepsmodusE (her: kommandoen engasjere seg i hovedpanelvinduet) til beskyttelsesinnstillingen (settpunktet) er nådd. Bruk ~ 2% kutting av fri nivå oscillasjonsamplitude som setpunkt (her angi Set Point 980 mV i hovedpanelet).
- Sett inn AFM-tippen med prøveoverflaten ved å senke settpunktet ved hjelp av AFM-programvaren. Målet for avstøtende modusbilding med cantilever-svingningsfasen (Fase i Sum og Avbøyningsmåler-vinduet) like under frie nivåfasen (før engasjering, her typisk ~ 70). Her bruker du typiske endelige settpunkter i størrelsesorden 70-80% av fri nivåamplitude (1 V).
- Før du skanner, velg signaler for opptak i hovedkanalpanelet. Velg høyde (Ht) og amplitude (Am).
- Begynn prøveforsøk (her: kommandoen Skan i hovedpanelvinduet). Bruk en skannehastighet på f.eks. 2,5 μm / s (kommando Scanhastighet i hovedpanelet) til bildeoverflateområder på 4 μm x 4 μm eller 8 μm x 8 μm (skriv inn Scanstørrelse i hovedrutenL) med pikseloppløsninger på henholdsvis 2.048 eller 4.096 (Scan Points og Scan Lines i Master Panel).
- Lagre bildefilen (kommandoen Lagre bilde i hovedpanelet) uten tilpasningsendringer (velg Ingen i hovedkanalpanelet / Lagre planformat).
- For videre analyse, behandle det lagrede bildet. Last inn bildet (kommando Bla gjennom lagrede data i AFM-analyse-menyen). Åpne Modifiseringspanelet (trykk M i den øverste delen av bildet). Bruk et planfit i x og y dimensjoner til høydebildet (forlengelse HtR) (kommandoen XY i Planefit-vinduet i Modifiser panel, velg Planefit Order 3). Platt deretter bildet (kommandoen Flatten i flatt vindu i Modifiseringspanel) ved å velge Flatten Bestill 3.
- Eksporter bildet som en TIFF-fil (trykk på Kommandoer i øverste del av bildet, velg TIFF Export 2x tilsvarende 2,048 pixel oppløsning) for videre analyse.
3. AFM-analyse
- Proteinkompleksvolum
- pre-Velg relevante protein-DNA-komplekser ved direkte visuell inspeksjon av bildene i AFM-programvaren, ved hjelp av et passende fargeskjema for å maksimere forskjellige fremtoninger av forskjellige størrelseskomplekser (se forskjellige farger og størrelser av forskjellige komplekser i figur 2 , her: fargeskjema SeaLandAndFire in AFMsoftware). For XPD-prøver inkluderte mulige komplekser XPD / p44-DNA samt XPD-DNA og p44-DNA, med tydelig forskjellige størrelser på grunn av de relativt store molekylmassene av XPD (~ 95 kDa) og p44 (~ 40 kDa) .
- Mål volumer av individuelle protein topper på DNA for å verifisere kompleks type. Dette kan oppnås med forskjellig bildeprogramvare (her: seksjonsverktøyet til AFM-programvaren).
- Mål høyden (h) og diameteren (d) av protein toppseksjonene med delvinduet. Mål diameteren nær avdelingen av partikkelen.
- Bestem volumet (V) på ertenKs ved hjelp av enkle matematiske modeller, for eksempel ved hjelp av følgende formel, som er basert på en sfærisk cap-modell:
- Oversett målte volumer til en omtrentlig molekylmasse i protein.
- I utgangspunktet kalibrere AFM-systemet for volum til molekylvekt (MW) -konvertering ved å bruke et utvalg av proteiner med kjent molekylvekt (her: totalt 12 eksperimenter med mellom 25 og 851 datapunkter hver ble utført på 5 forskjellige proteiner i monomere dimeriske , Trimeriske eller tetrameriske tilstander) 4 , 19 , 20 . Innskudd og bildeproteiner (som beskrevet ovenfor, i 2.2 og 2.3) og måle volumene som beskrevet ovenfor (3.1.2). Plott volumer over deres kjente molekylvekter. Den resulterende grafen vil vise et lineært forhold mellom V og MW, ligningen som kan fås vedEn linje som passer til dataene. For det AFM-systemet som ble anvendt her, ble følgende forhold oppnådd 19 :
MERK: Dette trinnet må ikke gjentas før hver måling, men gjøres bare en gang. Volumet til MW-kalibrering kan påføres bilder som er oppnådd under liknende avbildningsforhold ved bruk av AFM-sonder med svakt varierende diametre. - Basert på deres målte volumer (3.1.2) og V-til-MW-kalibrering (3.1.3.1), bestemme omtrentlig MW av proteinkompleksene 20 , som gir informasjon om dets molekylære innhold. Eksempelvis ble det oppnådd XPD / p44-prøver, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa og ~ 140 kDa, i samsvar med p44-DNA-komplekser (eller topper forårsaket av bare DNA-overbygning), XPD bare topper og henholdsvis XPD / p44-toppene .
- I utgangspunktet kalibrere AFM-systemet for volum til molekylvekt (MW) -konvertering ved å bruke et utvalg av proteiner med kjent molekylvekt (her: totalt 12 eksperimenter med mellom 25 og 851 datapunkter hver ble utført på 5 forskjellige proteiner i monomere dimeriske , Trimeriske eller tetrameriske tilstander) 4 , 19 , 20 . Innskudd og bildeproteiner (som beskrevet ovenfor, i 2.2 og 2.3) og måle volumene som beskrevet ovenfor (3.1.2). Plott volumer over deres kjente molekylvekter. Den resulterende grafen vil vise et lineært forhold mellom V og MW, ligningen som kan fås vedEn linje som passer til dataene. For det AFM-systemet som ble anvendt her, ble følgende forhold oppnådd 19 :
- Proteinkompleksposisjoner på DNA
- Bestem DNAFragment lengder.
- Spor DNA-fragmentene i AFM-bildene, for eksempel med frihåndslinjefunksjonen til en egnet bildeanalyseprogramvare (se for eksempel tabell av materialer) og mål lengden på linjen.
MERK: Ekskluder DNA-aggregater, så vel som fragmenter som kuttes av bildemarginene. - Plasser DNA-lengdene fra hele eksperimentet i et histogram ved hjelp av egnet dataanalyse og grafikkprogramvare (se, for eksempel , tabelloversikt ).
- Tilpass lengdefordelingen med en Gauss-kurve i dataanalysen og grafikkprogramvaren for å bestemme lengden på DNA-fragmentene. For å kjenne posisjonen til det innsatte DNA-målstedet (se 1.1), inkluderer bare DNA-fragmenter med riktig lengde innen to standardavvik fra sentrum av Gauss-kurven (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), hvor z er en normfaktor og x c og w er sentrum ogFull maksimal halvbredde av Gauss) i videre analyser.
MERK: DNA-lengden i midten av Gauss-kurven må være nær den teoretiske lengden av DNA-fragmentet (beregnet ved hjelp av 0,34 nm / bp). Lengder på opptil 10% kortere enn den teoretiske verdien er typiske og er sannsynligvis forårsaket av AFM-oppløsningsgrenser.
- Spor DNA-fragmentene i AFM-bildene, for eksempel med frihåndslinjefunksjonen til en egnet bildeanalyseprogramvare (se for eksempel tabell av materialer) og mål lengden på linjen.
- Bestem posisjoner av proteintopp på DNA-substrat.
- Mål avstanden til proteintoppene fra den nærmere DNA-fragmentenden, som beskrevet i 3.2.1.1, og divider med den totale DNA-lengden for å oppnå avstander i enheter i fraksjon av DNA-lengde.
- Bøy og plott de målte avstandene i et histogram ved hjelp av en egnet dataanalyse og grafikkprogramvare (se f.eks . Figur 3 ). Som en tommelfingerregel, velg en skuffstørrelse som gir omtrent √n-bokser for n datapunkter.
MERK: Siden DNA-ender ikke kan skilles her, bare plott til brøkdel av DNA lengde 0,5 (sentrum av DNA fragmente). Fordi DNA-endebinding ikke er fokus for studien, utelukker DNA-ender fra analysene ved å begynne å lagre posisjonsdataene litt etter posisjon 0 ( f.eks . Her: binning fra en DNA-lengdefraksjon på 0,02).
- Bestem målstedets spesifisitet fra proteinkompleksposisjoner.
- Tilpass maksimal (forbedret bindingshendelser) i stillingsfordelingen med en Gauss-kurve som i 3.2.1.3, men foten på høyden av bakgrunnsbindingen (se figur 3 ).
- Beregn spesifisiteten S for det spesifikke stedet versus den ikke-spesifikke DNA-bakgrunnen (proteinmolekyler bundet til ikke-spesifikke DNA-steder) med følgende formel 21
Et sp : Antall spesifikke komplekser (område under den gaussiske kurven)
En nsp : Antall ikke-spesifikke komplekser (område av bakgrunnen,
N: antall mulige DNA-bindingssteder (her: N = 914 unntatt DNA-ender)
- Bestem DNAFragment lengder.
- DNA-bøyningsvinkler
- Bruk vinkelverktøyet i en egnet bildeanalyseprogramvare, måler vinkelen β mellom to linjer plassert sentralt langs DNA-ryggraden og sentrering ved proteintoppen (se f.eks . Innspill i figur 4 ). Mål vinklene for et statistisk relevant antall protein-DNA-komplekser (> 50, ideelt sett> 100) 2 , 3 , 5 .
MERK: DNA-bøyningsvinkelen er definert som 180 ° -β 2 , 3 , 5 . - Bruke data analyse og grafikk programvare(Se tabell over materialer) produserer et bøyningsvinkeldistribusjonshistogram ved å binde DNA-bøyningsvinklene.
- Monter bøyningsvinkeldistribusjonen med en Gauss-kurve. Hvis mer enn ett maksimum er tydelig i distribusjonen, velg flere topp Gauss-passform. Senteret (e) av Gauss-kurven (e) gir (e) den gjennomsnittlige bøyningsvinkeltilstanden til den aktuelle arten.
- Hvis et skifte i bøyningsvinkelen (er) (maksima for Gaussisk passform (er)) er tydelig for fordelinger, for eksempel av forskjellige proteinvarianter eller forskjellige proteinkomplekstyper, gjelder en student t-test for å vurdere signifikansnivået til Endringer.
- Bruk vinkelverktøyet i en egnet bildeanalyseprogramvare, måler vinkelen β mellom to linjer plassert sentralt langs DNA-ryggraden og sentrering ved proteintoppen (se f.eks . Innspill i figur 4 ). Mål vinklene for et statistisk relevant antall protein-DNA-komplekser (> 50, ideelt sett> 100) 2 , 3 , 5 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å skille mellom forskjellige komplekse typer basert på proteinkompleksvolumer
Helikaseaktiviteten til den prokaryote NER-helikase UvrB stimuleres ved DNA-binding 22 , 23 . UvrB krever en uparret region i DNA (en DNA-boble) for å laste riktig på en av de to enkelt ssDNA-strengene. In vivo er denne DNA-strukturen tilveiebrakt ved DNA-interaksjoner gjennom et annet protein fra NER-kaskade; I in vitro- eksperimenter kan boblen kunstig innføres i dsDNA-fragmenter i nærhet av en mållesjon. Protein-protein-interaksjoner øker også DNA-binding med UvrB 9 . Når UvrB er lastet på DNA, ser imidlertid ikke sin aktivitet ut av proteinkomponentene 9 . I kontrast krever den eukaryote NER helikase XPD interaktivitetVidere med proteinet p44, som som XPD, er en del av flerkomponent-transkripsjonsfaktor IIH (TFIIH) -komplekset in vivo , for aktivering av dets helikaseaktivitet, men denne interaksjonen påvirker ikke XPD-binding til DNA 17 . XPD alene forventes å laste på DNA ved en DNA-boble, men ikke translokere til lesjonen (i fravær av dets helikaseaktiverende ko-faktor). XPD uten p44 burde derfor ikke kunne samhandle med og identifisere lesjonen når den lastes i avstand fra lesjonsstedet. Inkubasjoner av XPD med p44 i nærvær av lesjonholdig DNA-substrat resulterer i en blanding av XPD- eller XPD / p44-DNA-komplekser (og muligens en mindre art av p44 alene bundet til DNA). For å separat analysere lesjongjenkjenning ved XPD / p44 og XPD, kan disse forskjellige komplekse typer skelnes ut fra volumene deres i AFM-bilder ( figur 2 ) 9 , som beskrevet i protokoll 3.1 ovenfor. AFM-systemer kan kalibreres ved hjelp av en rekke pRoteiner med kjent molekylvekt, for å avdekke et lineært forhold mellom AFM-volumet og den omtrentlige molekylmasse av et protein (kompleks) 20 , noe som tillater en tolkning av de målte volumer. Bindende stillinger på DNA kunne således bestemmes separat for helikase inaktiv monomer XPD (~ 95 kDa, konsistent med arten 100 nm 3 klasse 2 i figur 2 ) og for helikase-aktive XPD / p44-komplekser (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 klasse 3 arter), basert på deres forskjellige AFM volumer.
Lesjonsgenkjenningsbestemmelse fra proteinbindingsposisjoner på DNA
Her ble lange (916 bp) DNA-substratene som inneholdt en lesjon ved ~ 30% av DNA-lengden benyttet. Kontroll over den eksakte posisjonen av lesjonen i DNA-substratet gjør at forskjellen mellom spesifikk (lesjonsbundet, 30% av DNA-lengden) og nonspeCific (lesion search) komplekser avhengig av deres posisjoner på DNA. To forskjellige lesjoner ble valgt, som er mål for NER; DNA-substratene inneholdt enten et fluorescein (F) addukt eller en cyklobutanpyrimidindimer (CPD). I tillegg til lesjonsstedet inneholdt DNA et uparert område (8 nt DNA-boble) som fungerte som lastingssted for helikasene. Dette belastningsstedet var plassert i en avstand på 26 nt (for F-holdige DNA-substratene) eller 23 nt (for CPD-holdige substrater) enten 5 'eller 3' fra lesjonen (se tabell 1 ). Lesjonsgenkjenning fører til stalled DNA-translokasjon av helikasene UvrB og XPD på målstedet, tydelig i AFM-proteinposisjonsfordelingen på DNA som en topp ved lesjonens posisjon. Lesjon og bobleposisjoner i disse substratene kan ikke i seg selv skelnes innenfor oppløsningsgrensene for AFM-bildebehandling (<10 nm avstand). Men brøkdelen av bestemte komplekser som representerer aMontering av molekyler stallet ved lesjonen og indikerer lesjonsgenkjenning, avhenger sterkt av om lesjonen ble plassert 3 'eller 5' fra boblen ( figur 3 ) 9 .
Fra fraksjonen av komplekser på det spesifikke området (område under den gaussiske pasienttoppen versus arealet av den ikke-spesifikt bundet bakgrunnen) ble spesifisiteten S av UvrB og XPD beregnet for de to undersøkte lesjonstyper beregnet (se protokoll 3.2 ovenfor). For UvrB resulterte lasting 5 'fra lesjonsposisjonen i høyere spesifisiteter (SB , F5 ~ 200 og SB, CPD5 ~ 400) enn lasting 3' fra lesjonen ( SB , F3 og SB, CPD3 ~ 100) for Begge lesjonstyper. For XPD ble komplekser som bare inneholdt XPD (klasse 2 i figur 2 ) og komplekser inneholdende XPD, samt det helikaseaktiverende kofaktorproteinet p44 (klasse 3 i figur 2 ) skilt som descrIbed i forrige del. Klasse 2 protein topper (XPD bare, helikase inaktive) lokalisert seg ikke fortrinnsvis ved lesionssteder uavhengig av om de ble lastet 5 'eller 3' og uavhengig av lesjonstypen (data ikke vist). I motsetning til dette viste posisjonfordelingen for XPD / p44 (klasse 3) komplekser forbedret binding ved F lesjoner for å laste 5'fra lesjonen (S XPD / p44, F5 ~ 300 versus S XPD / p44, F3 ~ 100), men ved CPD Lesjoner for lasting 3 'fra lesjonen (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 versus S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Figur 3 ). Fordi UvrB og XPD er 5'-til-3'-helikaser, gir disse dataene informasjon om hvorvidt komplekser blir stanset via interaksjoner med lesjonen i ssDNA-strengen som de translokaterer på (den translokaterte strengen, for å laste 5'fra lesjonen) Eller i motsatt, ikke-translokert streng (for å legge 3 'fra lesjonen). Konseptet er skjematisk vist i Undersøkelse av konformasjonelle endringer ved lesjonidentifikasjon av XPD Måling av bøyingen introdusert i DNA på stedet av bundet komplekser fra AFM-bilder (se protokoll 3.3 ovenfor) kan avsløre viktig informasjon om komplekse konformasjonsendringer. DNA-bøyningsvinkler ble målt for archaeal XPD 5 , som ikke krever protein-co-faktorinteraksjon for helikaseaktivitet. I disse studiene var en fluorescein lesjon lokalisert direcTly i sammenheng med en DNA-boble for forbedret proteinbelastning ved lesjonen, ved ~ 30% av DNA-fragmentlengden. Figur 4 viser Gaussian passer til DNA-bøyningsvinkeldistribusjoner oppnådd for proteinkomplekser ved ikke-skadede (ikke-skadede) DNA-posisjoner og ved ~ 30% DNA-lengde, konsistent med XPD bundet ved fluoresceinlesjonsposisjonen (spesifikke komplekser). Dataene viser en gjennomsnittlig bøyningsvinkel på ~ 50 ° for ikke-spesifikke komplekser versus ~ 65 ° for bestemte komplekser. Dette DNA-bøyningsvinkelsvinget var avhengig av nærværet av ATP eller ATP-tall, hvilket indikerer at ATP (re) -bindende, men ikke hydrolyse, var nødvendig for konformasjonelle omplasseringer 5 . Tabell 1: DNA-oligonukleotider for DNA-substratpreparasjon. Alle oligonukleotider er 48 nt lange og toppstrenger (oligonukleotider 2-6) ble oppnådd fosforylert ved deres 5'-ende for ligering inn i gapped-DNA'et (se protokoll 1.1). F = fluoresceinadduktet tymin, TT = cyklobutanpyrimidin (tymin) dimer (CPD), ikke-komplementære regioner (DNA-bobleformende regioner) er understreket. F inneholdende oligonukleotider ble oppnådd fra Integrated DNA Technologies (IDT), CPD inneholdende oligonukleotider ble gitt vennlig fra Thomas Carell's laboratorium (Ludwig-Maximilian University Munich, Germany). 
Figur 1: Fremstilling av DNA-substrat. Et ssDNA gap innføres i sirkulært plasmid DNA ved å nicking plasmidet (her med kinase N.BstNBI) ved cloSelyte steder og fjerning av vedlagte ssDNA-strekk via sentrifugefiltrering etter varm destabilisering i nærvær av et overskudd av komplementært oligonukleotid. Et spesifikt oligonukleotid som inneholder egenskapen til valg kan deretter bli annealed og ligert inn i gapområdet. Endelig resulterer fordøyelsen med restriksjonsenzymer (her med SspI og BspQI) i et lineært DNA-substrat med målegenskapen i en nøyaktig kjent posisjon (her ved 30% av DNA-fragmentlengden). Kontrollanalyser tillater testing av de enkelte trinnene (vist under) via agarosegelelektroforese (svart pil indikerer 3000 bp). Nicking kan testes med den forandrede elektroforetiske mobiliteten til det nicked, avslappede sirkulære DNA (kontroll nicking, lane 2) versus supercoiled plasmidet (lane 1). Fullstendig gapping av DNA så vel som påfølgende innføring av den spesifikke oligo kan testes ved fordøyelse med et restriksjonsenzym som kutter i gapområdet (her: XhoI, iBaner 2, 4 og 6) slik at mangel på DNA-snitt indikerer gapdannelse (baner 1,2 nicked DNA, baner 3,4 gapped DNA) og re-stalled snitt indikerer innsetting av den spesifikke oligo (baner 5,6) . Det endelige lineære substratet som inneholder den spesifikke egenskapen, kan renses fra gelen etter agarosegelelektroforese og testes for homogenitet og renhet via AFM-bildebehandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 2: Å skille forskjellige komplekse typer fra deres AFM-volumer. ( A ) AFM-bilde av XPD / p44-DNA (grå pil) og XPD-DNA (svart pil) komplekser. ( B ) Eksempler på tre forskjellige typer DNA-bundet kompleks, tolket som p44 eller bare DNA-overbygning (klasse 1),XPD (klasse 2, svart ramme) og XPD / p44 (klasse 3, grå ramme) komplekser basert på deres AFM-volumer (vist til høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 3: Ulike lesjonsgenkjenningsstrategier av prokaryotiske og eukaryote NER-helikaser. Lesjongjenkjennelse kompetent DNA-translokasjon av NER-helikasene UvrB og XPD (i kompleks med dets helikaseaktiverende ko-faktor p44) krever lasting av proteinene i et uparget DNA-område (DNA-boble). Proteinene beveger seg deretter i 5'-til-3'-retning langs ssDNA-strengen som de laster på. Anerkjennelse av DNA-lesjon (her: CPD) ved helikasene enten på den translokaterte streng (for lasting ved 5'-boble) eller på motsatt, ikke-translokert streng (foR laster ved 3'-boble) resulterer i stoppet DNA-translokasjon. I stillingsfordelingene viser dette seg som en topp (Gaussisk pasientlinje), som indikerer forbedret binding ved lesjonsposisjonen (ved ~ 30% av DNA-lengden for DNA-substratene vist her). Den prokaryote NER-helikase UvrB og dens eukaryotiske motpart XPD viser forskjellige strategier for CPD-lesjongjenkjenning som indikerer forskjellige DNA-strengpreferanser. Spesielt er CPD-lesjoner gjenkjent på den translokaterte streng av UvrB, men fortrinnsvis på den motsatte, ikke-translokaterte streng av XPD. Figur endret fra referanse 9 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 4: Konformasjonsendringer i XPD-DNA-komplekser ved lesjonidentifikasjon. Fordelingen av DNA-bøyningsvinkler indusert av XPD indikerer konformasjonsendringer i protein-DNA-kompleksene ved en fluorescein-lesjon. Disse konformasjonelle omarrangementene var avhengig av tilstedeværelsen av ATP (B) eller ATP-tallene (C). ( A ) I fravær av ATP er ikke-spesifikke bøyningsvinkler (grå) og bøyningsvinkler på lesjonsstedet (spesifikke bøyningsvinkler, svarte) like og passer med en Gaussisk kurve med senter ved ~ 50 °. ( B , C ) I nærvær av ATP eller ATP-stasjoner, viser den spesifikke bøyningsvinkeldistribusjonen (svart) et signifikant skift (P = 2,5 x 10 -7 ) til en gjennomsnittlig bøyningsvinkel på ~ 65 °. Dette DNA-bøyning ved lesjonsstedet var uavhengig av type lesjon (CPD eller fluoresceinaddukt) eller nærvær eller fravær av en DNA-boble 5 . Figur ble reprodusert fra referanse 5 . Innspillet i (C) viser hvordan bøyningsvinkler (180 ° -β) ble bestemt.Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Antall sekvens beskrivelse 1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC bunn 2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC F / 5 'boble 3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC F / 3 'boble 4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC CPD / 5'bubble 5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC CPD / 3'bubble 6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC F / boble
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM statistiske analyser av bindingsposisjoner av proteiner på lange DNA-fragmenter som inneholder spesifikke målsteder, kan avsløre interessante detaljer om de spesifikke strategiene som brukes av proteinet for å gjenkjenne disse nettstedene 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . For å tolke de resulterende stillingsfordelingene må posisjonene til målene i DNA være nøyaktig kjent. Dette oppnås ved å introdusere bestemte steder ved veldefinerte sekvensposisjoner i sirkulært plasmid-DNA og kutte ut et fragment av DNAet, inkludert dette bestemte området, ved hjelp av restriktionsenzymteknologi. I AFM-bildeanalyser av proteinbindingsposisjoner kan bare DNA-fragmenter med korrekte lengder (i samsvar med full lengde av det kuttede fragmentet) inkluderes fordi bare for disse er posisjonen til målstedet kjent. Det er verdt neiDet betyr at preparasjonsprosedyren som er beskrevet her, resulterer i lineære DNA-substrat med to ikke-separerbare fragment-ender. Posisjonsfordelinger kan følgelig bare måles og plottes fra 0 x DNA lengde (proteiner bundet ved DNA-fragmenter) til 0,5 x DNA lengde (proteiner bundet i sentrum av fragmenter). Videre, for målposisjoner som ikke er lokalisert nøyaktig i midten av substratet, inneholder disse fordelingene alltid en liten bakgrunn av proteiner som er uspesifikt bundet i samme avstand fra den andre DNA-enden. Imidlertid regner en Gauss-kurve til fordelingen som ligger på den gjennomsnittlige bakgrunnshøyden (ikke-spesifikt bundet proteiner, figur 3 ) for disse kompleksene. Alternativt kan en av DNA-ender merkes, for eksempel med små volum topper fra sekundær struktur som danner ssDNA overhang 24 . Typiske oppløsningsgrenser for disse stillingsanalysene ligger i området 100-ganger preferanse av målet siTe over nonspecifik nettsted bindende. I tillegg utgjør DNA-fragment-ender ikke uspesifikke dsDNA-steder, men representerer i stedet dsDNA-pauser. DNA-reparasjonsproteiner binder ofte til disse destabiliserte fragmentendene, i tillegg til streng-internt introduserte bestemte målsteder. DNA-endebinding kan avsløres ved AFM-analyser og kan gi viktig informasjon om funksjonen av et protein. Hvis DNA-endebinding ikke er av interesse, kan disse posisjonene lett utelates fra stillingsfordelingene ved å starte plottene ved en posisjon> 0 ( f.eks . Her 0,02 DNA-lengder).
En av de spesielle fordelene, og faktisk den definerende, fellesegenskapen til enkle molekyleteknikker er oppløsningen av individuelle, forskjellige tilstander som er tilstede i en prøve, som kan ha langt forskjellige egenskaper og aktiviteter. Selv i tilfeller der spesielle arter av interesse bare kan være sjeldne i en prøve, tillater disse tilnærmingene dermedSeparat fokus på denne arten hvis bidrag ville bli dverget i en ensemble måling. For proteinprøver muliggjør for eksempel AFM-bildebehandling det direkte skillet mellom forskjellige typer proteinkomplekser basert på kompleks volum, hvis størrelsene av de enkelte proteiner varierer tilstrekkelig (typiske oppløsningsgrenser er ca. 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . AFM-systemer kan kalibreres for å tillate oversettelse av de målte volumer til proteinmolekylvekt (protokoll 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . Alternativt har proteinstandarder med kjente størrelser vært anvendt som en direkte referanse i bildene 1 , 6 . ISystem fokusert på her, kunne bindingsposisjoner på DNA således separat bestemmes for helikase inaktive monomere XPD og for helikase-aktive heterodimere XPD / p44-komplekser. Foretrukket binding til et lesjonssted i en veldefinert posisjon i DNA indikerte DNA-lesjonsgenkjenning med et proteinkompleks. Siden proteinbelastning og lesjonssteder var romlig separert, var DNA-translokasjon en nødvendig forutsetning for lesjonsgenkjenning i DNA-substratene som anvendes her. Bare de heterodimeriske XPD / p44-kompleksene var i stand til DNA-translokasjon ( Figur 3 ), i samsvar med resultater fra helikaseaktivitetsanalyser 9 . AFM-volumanalyse kan derfor gi viktig informasjon om differensielle aktiviteter i forskjellige proteinkomplekse former.
Lesjonens interaksjon og anerkjennelse ved det helikaseaktive XPD / p44-komplekset resulterte i forbedret binding på målstedet på grunn av stalling av helikase-translokasjon ( figur 3 figur 3 ) indikerer dette funnet at enzymet detekterer fluorescein fortrinnsvis på den translokaterte streng, men CPD fortrinnsvis på den motsatte, ikke-translokserte streng. Den prokaryote NER-helikase UvrB, i motsetning, anerkjente fortrinnsvis både fluorescein- og CPD-lesjoner ved lasting 5 'fra lesjonen, dvs. på den translokaterte streng ( figur 3 ). Disse karakteristiske forskjellene i deres lesjongenkjenningsegenskaper kan forstås fra de forskjellige strukturelle egenskapene til de to helikasene. UvrB samhandler med potensielle mål iN DNA via aminosyrerester på innsiden av en β-hårnålfunksjon i enzymet bak som den translokaterte strengen sannsynligvis er gjenget med 16 , 25 . XPD, derimot, vert for en liten pore i nærheten av en jern-svovel (FeS) klynge 26 . Den translokaterte DNA-strengen tråkker trolig gjennom denne porene 26 . Bulkier lesjoner som fluorescein kan stanse helikase translokasjon via interaksjoner med rester i denne porene, mens mindre voluminøse CPD lesjoner kan identifiseres lettere via interaksjoner med FeS klyngen. I det prokaryote systemet antas to molekyler UvrB å være involvert i målstedssøk i et hetertetramer UvrA2-UvrB2-kompleks, hvor hver av de to UvrB-monomerer er i stand til å undersøke en annen DNA-streng 27 . XPD i eukaryotisk NER finnes sannsynligvis som en enkelt kopi iTFIIH lesjon anerkjennelse kompleks. Fleksibilitet i lesjonens interaksjonsmetoder for det eukaryote enzymet kan følgelig kreves for å muliggjøre anerkjennelse av det ekstremt store målstedspekteret for NER-reparasjonssystemet.
Fordi spesifikke (målstedbundne) og ikke-spesifikke komplekser kan skilles i AFM-bilder basert på deres posisjoner på DNA, kan disse forskjellige komplekse typer analyseres separat og sammenlignes. Enkeltmolekyl-AFM er en av svært få tilnærminger som gir tilgang til strukturelle egenskaper av proteinkomplekser bundet ikke-spesifikt til DNA på grunn av deres ofte forbigående eller variable natur. Her ble konformasjonsendringer på målstedgjenkjenning visualisert og karakterisert i arkeal XPD basert på bøyingen introdusert i DNAet av enzymet. AFM-dataene viste et lite, men tydelig, signifikant skift i DNA-bøyningsvinkler for XPD bundet ved et lesionssted versus XPD bundet til ikke-spesifikt DNA 5 . conformationalEndringer i DNA-bundet proteiner ved målstedidentifikasjon utløser sannsynligvis rekrutteringen av NER-endonukleaser (XPG og XPF i eukaryotisk NER) som utfører ekskisjon av en kort strekk av ssDNA som inneholder lesjonen. Interessant, krevde dette skiftet og dermed konformasjonsreorganiseringen binding av ATP til enzymet (men ikke hydrolyse). En lignende tilnærming til ATP-gjenoppretting ved målplassidentifikasjon og etterfølgende rekruttering av UvrC-endonuklease er blitt rapportert for UvrB i prokaryotisk NER 28 , 29 .
Sammendrag, AFM single molecule imaging har avslørt subtile forskjeller i målsted anerkjennelse av prokaryotiske og eukaryote NER helikaser. Når en mållesjon er blitt identifisert av enzymer, deler de en lignende strategi for rekruttering av NER-endonukleasene via ATP-bindingsinducerte konformasjonelle re-arrangementer selektivt ved lesjonen. Teknikken til AFM i comKombinasjon med forsiktig DNA-substratdesign for å etterligne essensielle egenskaper til det undersøkte systemet kan dermed gi innsikt i målstedssammenvirkning av ikke bare DNA-reparasjon, men DNA-bindingsproteinsystemer generelt. Strukturell informasjon om både spesifikke og ikke-spesifikke komplekser med oppløsninger i lavnanometerområdet (på molekylivå, begrenset av AFM-sonden) kan bidra betydelig til forståelsen av de involverte mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
PUC19N, CPD-holdige oligonukleotider og p44 ble levert av Samuel Wilson, Korbinian Heil og Thomas Carell og Gudrun Michels og Caroline Kisker. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 og TE-671/4 til IT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 mL block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
