Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una poderosa técnica para el análisis de las interacciones proteína-ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Requiere sólo cantidades bajas de material de muestra para visualizar directamente muestras heterogéneas con una resolución a nivel de molécula única. La heterogeneidad puede resultar de diferentes estados conformacionales u oligoméricos de una proteína. En particular, en el contexto de muestras de proteína-ADN, los complejos de proteínas pueden mostrar diferentes estequiometrías y / o conformaciones inducidas por unión al ADN en general o unión a un sitio diana específico dentro del ADN. Las muestras heterogéneas también pueden contener dos (o más) tipos diferentes de proteínas, y diferentes complejos de proteínas( Por ejemplo , que consisten en un solo tipo de proteína frente a complejos heteroméricos) pueden interactuar de manera diferente con el ADN. Los estudios analizados aquí explotan imágenes AFM en aire en muestras estáticas y secas de proteínas de reparación de ADN unidas a fragmentos de ADN largos (~ 900 pares de bases, bp) que contienen una lesión, lo que representa un objetivo de estas proteínas. La alta resolución molecular del AFM permite distinguir entre diferentes tipos de complejos de proteínas y determinar las posiciones de unión de las proteínas en los fragmentos de ADN. Es importante destacar que las lesiones se introducen en los sustratos de ADN en posiciones bien definidas. Debido a que la posición del sitio de la lesión en el ADN es conocida, las distribuciones de proteínas unidas al ADN proporcionan una visión de las diferentes propiedades de reconocimiento de lesiones de los diferentes complejos de proteínas, por ejemplo , cuán bien reconocen un tipo particular de lesión A ADN no dañado) 2 , 3 , , 5 , 6 . Sus posiciones sobre el ADN también permiten la distinción entre los complejos de proteínas unidos específicamente a las lesiones y los complejos unidos no específicamente en otras partes del ADN. La caracterización separada de estos diferentes tipos complejos (complejos unidos específicamente a la lesión frente a complejos no específicos) puede revelar cambios conformacionales potenciales en los complejos inducidos en la identificación del sitio de destino.

Las proteínas de reparación del ADN que se enfocan aquí son helicases que son responsables del reconocimiento de la lesión en la ruta de reparación de escisión de nucleótidos (NER). En las bacterias, NER se logra por las proteínas UvrA, UvrB y UvrC. UvrA es responsable de la detección inicial de lesiones en un complejo de exploración de ADN UvaA 2 / UvrB 2 . Tras la verificación de la lesión por UvrB, este complejo se convierte en UvrB monomérico unido en el sitio de la lesión y este complejo específico puede entonces reclutar el pEndonucleasa NER de rokaryotic UvrC. UvrC excisa un tramo corto (12-13 nt) de ADN monocatenario (ssDNA) que contiene la lesión. El estiramiento que falta es entonces rellenado por ADN polimerasa. Finalmente, la ADN ligasa sella el estiramiento recién sintetizado con el ADN original 9 , 10 . En los eucariotas, la mayoría de las proteínas de la cascada de NER son parte del complejo de factor de transcripción II H (TFIIH) grande y multimérico. Después de la detección de la lesión inicial a través del complejo trimérico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH se recluta al sitio diana de ADN. Cuando XPD dentro del complejo verifica la presencia de una lesión NER objetivo, el eucariota NER endonucleasas XPG y XPF son contratados para excise un corto (24-32 nt) tramo de ssDNA que contiene la lesión [ 9 , 10] . Aquí, específicamente, las helicases UvrB y XPD procedentes de NER procariótico y eucariótico, respectivamente, se estudiaron. Estas helicases requieren una región noADN (una burbuja de ADN) para roscar sobre una de las dos cadenas simples de ADN y posteriormente trasladarse a lo largo de esta cadena alimentada por hidrólisis de ATP. Además de las lesiones de ADN, se introdujo una burbuja de ADN en los sustratos que funciona como sitio de carga para las proteínas.

El procedimiento para la preparación de sustratos específicos de ADN de lesión ha sido descrito previamente 11 . Requiere una construcción de ADN circular (plásmido) con dos sitios de restricción estrechamente espaciados para una nickasa. En el contexto de este estudio, se usó el plásmido pUC19N (2729 pb) (creado por el laboratorio de S. Wilson, NIEHS). Este plásmido contiene tres sitios de restricción estrechamente espaciados para la nickasa Nt.BstNBI que enmarcan un estiramiento de 48 nucleótidos (nt). Después de la incubación con la nickasa, el tramo de ssDNA entre estos sitios puede ser eliminado y reemplazado por un oligonucleótido que contiene cualquier característica diana. Después de cada paso, se somete a ensayo la digestión enzimática completa mediante gel de agarosaElectroforesis. Se puede distinguir el ADN circundante circular debido a su menor movilidad electroforética en comparación con el plásmido superenrollado original. La separación del ADN y la sustitución del estiramiento eliminado por el oligonucleótido de sustrato específico se pueden evaluar mediante digestión con una enzima de restricción que incisa el sustrato exclusivamente dentro de la región entre los cortes. La alineación del plásmido circular por la enzima se suprimirá por lo tanto para el ADN gapped y se restaurará después de la inserción del oligonucleótido específico. Por último, dos sitios de restricción de endonucleasa (idealmente cortadores únicos) permiten la generación de un sustrato de ADN lineal, con longitud como se desee y con el sitio diana específico en una posición definida así como una burbuja de ADN a una distancia de la lesión en 5 'O 3'.

El reconocimiento de las lesiones por las helicasas NER puede ser investigado a través de imágenes AFM. La translocación del ADN bloqueado de las helicasas en tEl sitio de la lesión es visible como un pico en la distribución de la posición de la proteína en el ADN e indica el reconocimiento de la lesión. Debido a que la translocación del ADN de estas helicasas es además direccional, con una polaridad de 5 'a 3', la dependencia del reconocimiento de la lesión en la posición del sitio de carga (burbuja de ADN aguas arriba o aguas abajo de la lesión) también indica si la lesión es preferentemente reconocida En el filamento de ssDNA no translocado o en el lado opuesto, 5 , 9 . En las siguientes secciones, se introducirán los métodos utilizados y se discutirán brevemente los hallazgos principales de estos experimentos. Es importante destacar que, análogamente al trabajo ejemplar sobre reparación de ADN mostrado aquí, la formación de imágenes AFM puede aplicarse al estudio de diferentes sistemas de interacción de ADN, tales como la replicación o transcripción de ADN 8 , 12 , 13 , 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación de la muestra

  1. Preparación de sustratos de ADN 11
    1. Generación de una brecha ssDNA en el plásmido
      1. Se completa la digestión de una muestra del plásmido (en este caso: pUC19 modificado, pUC19N) en un tubo de reacción con una apropiada nickasa (aquí: Nt.BstNBI) seguido de inactivación por calor enzimático, usando las condiciones según el protocolo del fabricante (véase la figura 1 para un esquema presentación). Comience con ~ 50 μL y ~ 500 nM de plásmido para un rendimiento suficiente.
      2. Verificar el plasmid nicking mediante electroforesis en gel de agarosa en muestras diluidas (~ 20 nM) 15 . Use guantes para protección contra el tinte de unión al ADN utilizado para la visualización del ADN.
        NOTA: Diferentes movilidades electroforéticas permiten la distinción entre el ADN plasmídico circular mellado (relajado) y superenrollado ( Figura 1 ).
      3. Eliminar el estiramiento de ssDNA inciso (entre los sitios de corte) del plásmido porIncubación con un exceso de sim 10 veces del oligonucleótido complementario (oligonucleótido 1 de la Tabla 1 ), agitación a 300 rpm durante 30 minutos cerca de la temperatura de fusión del oligonucleótido (aquí: 68ºC para pUC19N) en un bloque térmico ( Figura 1). ).
      4. Se separa el plásmido bloqueado de los fragmentos de ADN más pequeños usando un filtro de corte molecular de 50 kDa (MWCO) por centrifugación durante 10 min a 10.000 xg en una centrífuga de mesa ( Figura 1 ). Para extraer el ADN concentrado del filtro, invierta el filtro e inserte en un nuevo tubo de reacción de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 1.000 x g.
      5. Rellene la muestra de ADN concentrada resultante a 500 μL con agua filtrada desionizada, agregue un exceso adicional de 5 veces de oligonucleótido complementario y repita los pasos 1.1.1.3 y 1.1.1.4 al menos 3 veces.
      6. Ensayo para la eliminación completa del ADN por incubación con una enzima de restricción adecuada (aquí: XhoI o BglII) utilizando conditiOns según la descripción del fabricante. Utilizar muestras de ADN diluidas (melladas contra mues- tras) (~ 20 nM). Se hace funcionar una electroforesis en gel de agarosa para distinguir entre el plásmido linealizado (que no contiene hueco de ssDNA) y el ADN no escindido (ADN gapped) usando el ADN cortado como control positivo (incluir una escalera de ADN para referencia, Figura 1 ). Usar guantes.
    2. Rellenar la brecha con oligonucleótidos modificados de ssDNA
      1. Recobre el plásmido bloqueado mediante la incubación con un exceso de ~ 25 veces de un oligonucleótido fosforilado 5 'que contiene el sitio diana específico elegido, incubando a ~ 45ºC durante 4 h ( Figura 1 ). En este caso, utilice ssDNA de 48 nt que contenga una lesión, ya sea una timina aductada con fluoresceína o un dímero de pirimidina de ciclobutano (CPD), y además una secuencia no complementaria corta (8 nt) para producir burbujas de ADN (véase Tabla 1 ).
      2. Vincular de forma covalente el inserto recocido al plásmido por incubaCon T4 ADN ligasa durante una noche a temperatura ambiente de acuerdo con el protocolo del fabricante ( Figura 1 ). Para esta reacción, se añade una solución concentrada de tampón concentrada con ATP para producir condiciones de tampón adecuadas para la ligasa ( por ejemplo , se usa tampón de reacción UvrB: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, KCl 50 mM, DTT 5 mM, ATP).
      3. Ensayo para la inserción del oligonucleótido específico en el plásmido con abertura por digestión de muestras diluidas con una enzima de restricción adecuada (igual que en 1.1.1.6) de acuerdo con el protocolo del fabricante seguido de una electroforesis en gel de agarosa (como en 1.1.1.6, Figura 1 ).
    3. Preparación de un sustrato de ADN lineal
      1. Digerir el ADN del plásmido modificado con enzimas de restricción (idealmente con un solo sitio de restricción en el plásmido) usando las condiciones recomendadas por el fabricante ( Figura 1 ). Este paso produce fragmentos lineales que contienenModificación introducida en una posición definida. En este caso, utilice el corte SspI y BspQI en las posiciones 613 y 255 pb aguas arriba y aguas abajo del inserto, respectivamente, dando como resultado un fragmento de ADN de 916 pb que contiene el sitio de lesión específico a aproximadamente el 30% de la longitud del ADN.
        NOTA: Para los experimentos de formación de imágenes AFM como se describe aquí, los fragmentos de ADN con longitudes entre ~ 200 pb y ~ 2.000 pb son sustratos adecuados.
      2. Aislar el fragmento diana mediante electroforesis en gel de agarosa y extracción de gel utilizando un equipo comercial. Use guantes para protección.
      3. Opcionalmente, se corta el gel de agarosa con un bisturí para separar la escala de ADN y los carriles de muestra diluidos (los dos primeros carriles) de los carriles que contienen el ADN concentrado a purificar. Sólo exponga la parte del gel con los dos primeros carriles a la irradiación UV colocando sólo esta parte del gel sobre una mesa UV.
        1. Cortar la banda correspondiente al fragmento de elección con un bisturí. Vuelva a unir las dos partes del gel (de la lengüeta UVLe). Utilizar la posición de la banda escindida de la muestra diluida como orientación para la posición de la banda del sustrato de ADN deseado. Tenga en cuenta la mayor concentración cortando rebanadas ligeramente más amplias que para el control diluido.
          NOTA: Debido a que aquí se investigó el reconocimiento de las lesiones UV, se evitó cuidadosamente la introducción de lesiones UV adicionales a través de la irradiación UV en el sustrato de ADN mediante este enfoque.
      4. Calcular la concentración de ADN c a partir de la absorción a 260 nm medida por un espectrofotómetro UV-Vis utilizando la ley de Lambert-Beer con un coeficiente de extinción molar medio de ADN de doble hebra (dsDNA) de ε 260 nm ~ 6.700 M -1 cm -1 por pb:
        Ecuación
        Donde L es la longitud de la trayectoria (longitud de la cámara de medida, típicamente 1 cm).
    <Li
  2. Expresión y purificación de proteínas
    1. Recombinantemente expresar UvrB en E. coli y purificar la proteína a través de la afinidad de talón de chitina estándar 15 y cromatografía de exclusión de tamaño 15 como se describe anteriormente [ 16] .
      NOTA: El gen uvrB de Bacillus caldotenax se había clonado en el vector pTYB1.
    2. Expresar XPD en E. coli y purificar la proteína a través de la afinidad estándar de níquel IDA 15 y la cromatografía de exclusión de tamaño 15 seguido por cromatografía de intercambio aniónico 15 , como se describió anteriormente 17 .
      NOTA: El gen de la proteína del grupo D de Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum (XPD) se había clonado en el vector pBADM11. C. thermophilum p44 era un regalo amable del laboratorio de Caroline Kisker, expresado y puriComo se describe 17 .

2. Experimento de AFM

  1. preparación de la muestra
    1. Opcionalmente, preincubar el sustrato de ADN a 65 ° C durante 10 minutos en un bloque de calor para eliminar cristales potenciales de micro-sal que pueden haberse formado durante el almacenamiento en el frigorífico.
    2. Preparar tampón (s) de reacción a una concentración de 10 veces (10 x tampones).
      NOTA: El tampón de reacción XPD a 1 x concentración contenía Tris-HCl 20 mM pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, TCEP 1 mM, ATP 2 mM; 1x tampón de reacción UvrB contenía 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, y 1 mM ATP.
    3. Pre-incubar las proteínas a una mayor concentración en condiciones de incubación adecuadas para mejorar la formación de complejos. Pre-diluir un pequeño volumen ( por ejemplo , 1 μl) de las proteínas individuales en un tampón de reacción de proteína 1x a la concentración deseada y mezclar pequeños volúmenes ( por ejemplo , 1 μl) de tLas soluciones de proteínas individuales en un tubo de reacción de 0,5 ml.
      1. Coloque el tubo en un bloque de calor para temperaturas de incubación más altas que la temperatura ambiente. Elija una relación de concentración dependiendo de la estequiometría compleja esperada, ya sea equimolar o las concentraciones correspondientes. Aquí, se incuba 1 μl de XPD (20 μM en 1 x tampón de reacción XPD) y 1 μl de p44 (20 μM en tampón de reacción 1x XPD) a 10 μM cada 10 min a 37 ° C.
    4. Incubar las muestras a concentraciones adecuadas de proteína y ADN en el tampón de reacción de proteínas en un tubo de reacción de 0,5 ml. En este caso, utilizar 500 nM UvrB o 1 μM XPD + 1 μ M p44 y 100 nM de ADN. Pipetear volúmenes pequeños para ahorrar material, por ejemplo , 0,25-0,5 μL de proteína (diluida previamente a una concentración de incubación de 10 veces) y ADN en un volumen total de 2,5-5 μl de tampón de reacción de proteína 1x. En este caso, incubar durante 30 min a 37 ° C en un bloque de calor. Girar brevemente en un tubo de reacción (~ 1 s) en un centrifugador de mesaE para asegurar la mezcla de pequeños volúmenes.
  2. Depósito de muestra
    1. Prepare un sustrato de mica: corte un pedazo aproximadamente de 1 x 1 cm 2 de mica de tiras más grandes usando un bisturí. Retirar las capas superiores de la pieza mineral multicapa de mica usando cinta adhesiva para revelar una superficie de sustrato limpia, plana y atómicamente lisa.
      NOTA: La pieza de mica puede reutilizarse para experimentos múltiples mediante la separación de otras capas.
    2. Preparar el tampón de deposición de AFM con agua filtrada desionizada, por ejemplo , HEPES 25 mM pH 7,5, Na-acetato 25 mM, acetato Mg 10 mM. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,02 μm.
      NOTA: Los cationes divalentes en el tampón de deposición sirven para quelar las moléculas de ADN cargadas negativamente a la superficie de mica, que también se carga negativamente a pH neutro. Si la concentración relativamente alta de iones de Mg2 + en el tampón de deposición plantea un problema para un sistema de proteína-ADN particular, alternativamente,La superficie de la mica puede cargarse previamente con grupos amino usando química basada en silatrane para proporcionar cargas superficiales positivas para el anclaje 18 . La deposición de la muestra puede entonces llevarse a cabo en un tampón que no contiene o sólo cantidades bajas de cationes divalentes.
    3. Diluir la muestra (ver 2.1) para la deposición inmediata sobre la mica en el tampón de deposición. Deposite un pequeño volumen (aquí: 20 μL).
      NOTA: Los factores de dilución dependen de la concentración de la muestra. Aquí, diluya las muestras 50-100x. Como regla general, ~ 1 nM de ADN da como resultado una buena cobertura superficial de ~ 1.000 pb.
    4. Enjuagar inmediatamente la muestra tres o cuatro veces con unos pocos mililitros de agua desionizada filtrada, eliminar el exceso de líquido y secar con un chorro suave de nitrógeno. Todo el proceso, desde la deposición de muestras hasta muestras secas, se puede llevar a cabo en menos de 30 s.
    5. Fijar el pedazo de mica en una diapositiva del microscopio usando la cinta adhesiva en sus bordes.
      NOTA: Los diferentes sistemas AFM hanOtros requisitos para la fijación de la muestra a la etapa. Otros AFM poseen etapas magnéticas, y las piezas de mica se fijan en discos magnéticos, por ejemplo , usando pegamento térmico. Los detalles del sistema AFM utilizado aquí se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
  3. Imágenes AFM
    1. Coloque la muestra (véase 2.2.5) en el centro de la etapa AFM y fije la lámina del microscopio en el escenario con pastillas magnéticas.
    2. Inserte la punta AFM en el soporte de la punta. Utilice cantilevers con una sonda afilada (<10 nm) AFM adecuada para la oscilación, imagen de modo de contacto intermitente en el aire. Utilice sondas AFM, por ejemplo, como se indica en la Tabla de materiales . Aquí (depende de AFM), fije la punta en el soporte debajo de una abrazadera apretando el tornillo de sujeción (apretado con los dedos). Inserte el soporte de la punta en el cabezal de medición AFM. Coloque la cabeza en la espalda para este paso.
    3. Coloque el cabezal de medición AFM en la parte superior de la muestra. Los detalles dependen del modelo AFM. Aquí estoyAsegúrese de que la cabeza se mantenga estable con sus patas dentro de las muescas del escenario. Asegúrese de que la mica se encuentra en el escenario donde la punta AFM se ciernen directamente encima de ella. Los tornillos micrométricos a la derecha de la platina permiten el posicionamiento fino de la muestra.
    4. Alinee el láser AFM en la parte trasera del voladizo para obtener una intensidad de señal óptima desde el fotodetector sensible a la posición sobre el que se refleja el láser. Los detalles dependen del modelo AFM.
      1. Aquí, gire las ruedas en el lado derecho y en la parte posterior del cabezal de medición AFM para ajustar las posiciones x e y del láser AFM para dirigirla centralmente al extremo del voladizo. Ver la señal de reflexión en la ventana de vídeo AFM (si está disponible, aquí: presione el icono de la cámara y seleccione la entrada: Svideo).
      2. Una vez ubicada de forma cruda, optimice la señal de suma del detector (suma en la suma y la ventana del medidor de deflexión en el software AFM) ajustando la posición del láser con las dos ruedas (permanezca al final del voladizo, la suma signaL depende del tipo AFM y cantilever, aquí: apunte para suma> 5).
    5. Cero la señal de diferencia de los diodos superior e inferior de la matriz de detectores (aquí: señal de desviación en la ventana Sum and Deflection Meter) dirigiendo la reflexión del AFM al centro del detector (aquí: gire la rueda en el lado izquierdo de la medición AFM cabeza).
      NOTA: Las desviaciones de cero indican la deflexión del voladizo debido a las interacciones superficiales, que se traducen en información de altura por el AFM.
    6. Determine la frecuencia de resonancia en voladizo mediante una melodía de frecuencia implementada en el software AFM (aquí: comando automático en la ventana Master Panel / Tune). Elija una amplitud correspondiente a la entrada de 1 V para el piezo que acciona la oscilación en voladizo. Ajuste la frecuencia de oscilación a un valor ligeramente inferior (5%) a la frecuencia de resonancia y cero a la fase de oscilación.
    7. Acercar la punta a la superficie de la muestra utilizando el mod de acoplamiento brutoE (aquí: comando Engage en la ventana del Panel Maestro) hasta que se alcance el ajuste de protección (set-point). Use ~ 2% de corte de la amplitud de oscilación de nivel libre como punto de ajuste (aquí, ingrese el punto de ajuste 980 mV en el panel maestro).
    8. Acople finamente la punta AFM con la superficie de la muestra bajando el punto de ajuste usando el software AFM. Objetivo de la imagen de modo repulsivo con la fase de oscilación en voladizo (fase en la suma y la ventana del medidor de deflexión) justo por debajo de la fase de nivel libre (antes de enganche, aquí por lo general ~ 70). En este caso, utilice puntos finales típicos del orden del 70-80% de la amplitud de nivel libre (1 V).
    9. Antes de escanear, elija las señales para la grabación en el Panel de canales maestros. Elija la altura (Ht) y la amplitud (Am).
    10. Comience el análisis de muestra (aquí: comando Hacer Escanear en la ventana del Panel Maestro). Utilice una velocidad de exploración de, por ejemplo, 2,5 μm / s (velocidad de escaneo de comandos en el panel maestro) a áreas de superficie de imagen de 4 μm x 4 μm u 8 μm x 8 μm (introduzca Tamaño de exploración en el panel maestroL) con resoluciones de píxeles de 2.048 o 4.096 (Puntos de escaneo y líneas de escaneado en el panel maestro), respectivamente.
    11. Guarde el archivo de imagen (comando Guardar imagen en el panel maestro) sin modificaciones de ajuste (seleccione Ninguno en el panel de canal principal / Guardar ajuste de plano).
    12. Para un análisis posterior, procese la imagen guardada. Cargue la imagen (comando Examinar datos guardados en el menú Análisis de AFM). Abra el Panel de Modificación (presione M en la parte superior de la imagen). Aplique un plano plano en las dimensiones x e y a la imagen de altura (extensión HtR) (comando XY en la ventana Planefit en el panel Modificar, escoja Planefit Order 3). Luego aplanar la imagen (comando Aplanar en la ventana Aplanar en el panel Modificar) eligiendo Ordenar plano 3.
    13. Exporte la imagen como un archivo TIFF (presione Comandos en la parte superior de la imagen, elija Exportación TIFF 2x correspondiente a la resolución de 2,048 píxeles) para un análisis posterior.

3. Análisis de AFM

  1. Volumen del complejo proteico
    1. Pre-Seleccionar complejos proteína-ADN relevantes mediante la inspección visual directa de las imágenes en el software AFM, utilizando un esquema de color adecuado para maximizar las diferentes apariencias de diferentes complejos de tamaño (ver diferentes colores y tamaños de diferentes complejos en la Figura 2 , aquí: esquema de color SeaLandAndFire en El software AFM). Para las muestras de XPD, los complejos posibles incluyeron XPD / p44-DNA así como XPD-DNA y p44-DNA, con tamaños claramente diferentes debido a las masas moleculares relativamente grandes y diferentes de XPD (~ 95 kDa) y p44 (~ 40 kDa) .
    2. Mida los volúmenes de los picos individuales de proteína en el ADN para verificar el tipo complejo. Esto se puede lograr con software de imagen diferente (aquí: la herramienta de sección del software AFM).
      1. Mida la altura (h) y el diámetro (d) de las secciones del pico de la proteína con los cursores de la ventana de sección. Mida el diámetro cerca de la base de la sección de partículas.
      2. Determine el volumen (V) del guisanteKs utilizando modelos matemáticos simples, por ejemplo , utilizando la siguiente fórmula, que se basa en un modelo de tapa esférica:
        Ecuación
    3. Traducir los volúmenes medidos en una masa molecular aproximada de proteínas.
      1. Inicialmente, se calibra el sistema de AFM para la conversión de volumen a peso molecular (MW) utilizando una gama de proteínas con peso molecular conocido (aquí: un total de 12 experimentos con entre 25 y 851 puntos de datos se realizaron en 5 proteínas diferentes en monómero, , Trimérico o tetramérico) 4 , 19 , 20 . Depósito y proteínas de imagen (como se describió anteriormente, en 2.2 y 2.3) y medir sus volúmenes como se describió anteriormente (3.1.2). Trazar los volúmenes sobre sus pesos moleculares conocidos. El gráfico resultante mostrará una relación lineal entre V y MW, cuya ecuación puede obtenerse porUna línea ajustada a los datos. Para el sistema AFM utilizado aquí, se obtuvo la siguiente relación 19 :
        Ecuación
        NOTA: Este paso no tiene que repetirse antes de cada medición, pero sólo se realiza una vez. La calibración de volumen a MW se puede aplicar a imágenes obtenidas bajo condiciones de imagen similares usando sondas AFM con diámetros ligeramente variables.
      2. Con base en sus volúmenes medidos (3.1.2) y en la calibración V-MW (3.1.3.1), determine el MW aproximado de los complejos proteínicos 20 , que proporciona información sobre su contenido molecular. Se obtuvieron muestras de XPD / p44, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa, y ~ 140 kDa, consistentes con complejos de p44-ADN (o picos causados ​​por mera superestructura de ADN), picos de XPD solamente y picos de XPD / p44 respectivamente .
  2. Posiciones complejas de proteínas en el ADN
    1. Determinar el ADNFragmento longitudes.
      1. Trace los fragmentos de ADN en las imágenes AFM, por ejemplo , con la función de línea a mano alzada de un software de análisis de imagen adecuado (ver por ejemplo Tabla de Materiales) y mida la longitud de la línea.
        NOTA: Excluir los agregados de ADN así como los fragmentos cortados por los márgenes de la imagen.
      2. Bin y trazar las longitudes de ADN de todo el experimento en un histograma, utilizando un adecuado análisis de datos y software de gráficos ( por ejemplo , ver Tabla de Materiales ).
      3. Ajustar las distribuciones de longitud con una curva gaussiana en el análisis de datos y software de gráficos para determinar la longitud de los fragmentos de ADN. Con el fin de conocer la posición del sitio diana de ADN insertado (véase 1.1), sólo incluya fragmentos de ADN con la longitud correcta dentro de dos desviaciones estándar desde el centro de la curva de Gauss (y = 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), donde z es un factor normalizado yx c yw son el centro yMáximo ancho máximo del Gaussiano) en otros análisis.
        NOTA: La longitud del ADN en el centro de la curva de Gauss debe estar cerca de la longitud teórica del fragmento de ADN (calculado usando 0,34 nm / bp). Las longitudes de hasta 10% más cortas que el valor teórico son típicas y son probablemente causadas por los límites de resolución de AFM.
    2. Determinar las posiciones de los picos de proteínas en sustratos de ADN.
      1. Mida la distancia de los picos de proteína desde el extremo del fragmento de ADN más cercano, como se describe en 3.2.1.1 y divida la longitud total del ADN para obtener distancias en unidades de fracción de longitud de ADN.
      2. Colocar y trazar las distancias medidas en un histograma usando un software de análisis de datos y graficación adecuado (véase, por ejemplo , la figura 3 ). Como regla general, elija un tamaño bin que proporcione aproximadamente √n contenedores para n puntos de datos.
        NOTA: Dado que los extremos del ADN no se pueden distinguir aquí, trazar sólo una fracción de la longitud del ADN 0,5 (centro del fragmento de ADNCión). Debido a que la unión del extremo del ADN no es el foco del estudio, excluya los extremos del ADN de los análisis comenzando a separar los datos de posición ligeramente después de la posición 0 ( por ejemplo , aquí: binning de una fracción de longitud de ADN de 0,02).
    3. Determine la especificidad del sitio objetivo de las distribuciones de posición complejas de proteínas.
      1. Ajustar el máximo (ocurrencias de enlace mejoradas) en la distribución de posición con una curva de Gauss como en 3.2.1.3 pero sobre la altura de la unión de fondo (ver Figura 3 ).
      2. Calcular la especificidad S para el sitio específico frente al fondo de ADN no específico (moléculas de proteína unidas a sitios de ADN no específicos) con la siguiente fórmula 21
        Ecuación
        A sp : Número de complejos específicos (área bajo la curva de Gauss)
        A nsp : Número de complejos no específicos (área del fondo, 0 ); La fracción de longitud de ADN cubierta aquí es de 0,48 para un histograma que comienza en 0,02 de longitud de ADN)
        N: número de posibles sitios de unión al ADN (aquí: N = 914 excluyendo los extremos del ADN)
  3. Ángulos de flexión del ADN
    1. Usando la herramienta de ángulo en un software de análisis de imagen adecuado, mida el ángulo β entre dos líneas colocadas centralmente a lo largo de la columna vertebral del ADN y centrándose en el pico de la proteína (véase, por ejemplo , inserto en la Figura 4 ). Mida los ángulos para un número estadísticamente relevante de complejos proteína-ADN (> 50, idealmente> 100) 2 , 3 , 5 .
      NOTA: El ángulo de doblado del ADN se define como 180 °-β 2 , 3 , 5 .
    2. Uso de análisis de datos y software de gráficos(Véase la Tabla de Materiales) producen un histograma de distribución de ángulo de curvado dividiendo los ángulos de doblado del ADN.
    3. Ajuste la distribución del ángulo de curvatura con una curva de Gauss. Si más de un máximo es aparente en la distribución, elija el ajuste máximo de Gauss máximo. El centro o centros de la (s) curva (s) gaussiana (s) da (n) el estado de ángulo de curvatura medio de la especie particular.
    4. Si un desplazamiento en el ángulo o ángulos de curvatura (máximo de ajuste (s) gaussiano) es aparente para distribuciones, por ejemplo, de diferentes variantes proteicas o especies complejas de proteínas diferentes, aplique una prueba t de estudiante para evaluar el nivel de significación del Cambios.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Distinguir entre diferentes tipos complejos basados ​​en volúmenes complejos de proteínas

La actividad helicasa de la NER helicasa UvrB procariótico es estimulada por la unión del ADN 22 , 23 . UvrB requiere una región no apareada en el ADN (una burbuja de ADN) con el fin de cargar correctamente en una de las dos hebras individuales ssDNA. In vivo , esta estructura de ADN es proporcionada por interacciones de ADN a través de otra proteína de la cascada NER; En experimentos in vitro , la burbuja puede ser introducida artificialmente en fragmentos de dsDNA muy cerca de una lesión diana. Las interacciones proteína-proteína también aumentan la unión del ADN por UvrB 9 . Sin embargo, una vez que UvrB se carga en el ADN, su actividad no parece depender de cofactores de proteínas [ 9] . Por el contrario, la helicasa EVO eucariota XPD requiere interacciónCon la proteína p44, que como XPD forma parte del complejo de transcripción IIH (TFIIH) multi-subunidad in vivo , para la activación de su actividad helicasa, pero esta interacción no afecta a la unión de XPD al ADN 17 . Se espera que XPD solo se cargue en el ADN en una burbuja de ADN, pero no se traslocará a la lesión (en ausencia de su co-factor de activación de helicasa). Por lo tanto, XPD sin p44 debería ser capaz de interactuar e identificar la lesión cuando se carga a una distancia del sitio de la lesión. Las incubaciones de XPD con p44 en presencia de una lesión que contiene un sustrato de ADN dan como resultado una mezcla de complejos XPD- o XPD / p44-DNA (y posiblemente una especie menor de p44 unida a ADN). Para analizar por separado el reconocimiento de lesiones por XPD / p44 y XPD, estos diferentes tipos complejos pueden distinguirse basándose en sus volúmenes en las imágenes AFM ( Figura 2 ) 9 , tal como se describe en el Protocolo 3.1 anterior. Los sistemas AFM pueden calibrarse utilizando una gama de pRoteins con peso molecular conocido, para revelar una relación lineal entre el volumen de AFM y la masa molecular aproximada de una proteína (complejo) 20 , lo que permite una interpretación de los volúmenes medidos. Por lo tanto, las posiciones de unión en el ADN podrían determinarse por separado para el XPD monomérico inactivo con helicasa (~ 95 kDa, consistente con las especies ~ 100 nm de clase 3 en la Figura 2 ) y para complejos XPD / p44 activos de helicasa (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 especies de clase 3), basado en sus diferentes volúmenes de AFM.

Determinación del reconocimiento de las lesiones de las posiciones de unión a proteínas en el ADN

En este caso, se utilizaron sustratos de DNA largos (916 pb) que contenían una lesión a ~ 30% de la longitud del ADN. El control sobre la posición exacta de la lesión dentro del sustrato de ADN permite distinguir entre los específicos (lesión-limitados, a ~ 30% de la longitud del ADN) y nonspe(Búsqueda de lesiones) dependientes de sus posiciones en el ADN. Se eligieron dos lesiones diferentes, que son blancos de NER; Los sustratos de ADN contenían o bien un aducto de fluoresceína (F) o un dímero de pirimidina de ciclobutano (CPD). Además del sitio de la lesión, el ADN contenía una región no empareja (burbuja de 8 nt de ADN) que servía de sitio de carga para las helicasas. Este sitio de carga se localizó a una distancia de 26 nt (para los sustratos de ADN que contenían F) o de 23 nt (para los sustratos que contenían CPD) a 5 'o 3' de la lesión (ver Tabla 1 ). El reconocimiento de la lesión conduce a la translocación de ADN bloqueada de las helicasas UvrB y XPD en el sitio diana, aparente en la distribución de posición de proteína AFM en el ADN como un pico en la posición de la lesión. Las posiciones de lesión y burbuja en estos sustratos no pueden distinguirse per se dentro de los límites de resolución de la formación de imágenes AFM (distancia <10 nm). Sin embargo, la fracción de complejos específicos que representa el aMontaje de moléculas estancadas en la lesión e indica el reconocimiento de la lesión, dependía fuertemente de si la lesión se colocó 3 'o 5' de la burbuja ( Figura 3 ] [ 9] .

Se calculó la especificidad S de UvrB y XPD para los dos tipos de lesión investigados (véase el Protocolo 3.2 anterior), a partir de la fracción de complejos en el sitio específico (área bajo el pico de ajuste gaussiano versus área del fondo unido de forma no específica). Para UvrB, cargar 5 'de la posición de la lesión resultó en especificidades más altas (S B, F5 ~ 200 y S B, CPD5 ~ 400) que cargar 3' de la lesión (S B, F3 y S B, CPD3 ~ 100) Ambos tipos de lesión. Para XPD, los complejos que contenían sólo XPD (clase 2 en la Figura 2 ) y complejos que contenían XPD así como la helicasa que activaba la proteína del cofactor p44 (clase 3 en la Figura 2 ) se distinguieron como descrEn la sección anterior. Los picos de proteína de la clase 2 (XPD solamente, helicasa inactiva) no se localizaron preferentemente en los sitios de lesión independientemente de si se cargaron 5 'o 3' e independientemente del tipo de lesión (datos no mostrados). Por el contrario, las distribuciones de posición para XPD / p44 (clase 3) complejos mostraron una unión mejorada en las lesiones F para la carga 5 'de la lesión (S XPD / p44, F5 ~ 300 frente a S XPD / p44, F3 ~ 100), pero en CPD Lesiones para cargar 3 'de la lesión (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 frente a S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Figura 3 ). Dado que UvrB y XPD son helicasas 5'-a-3 ', estos datos proporcionan información sobre si los complejos se estancan a través de interacciones con la lesión dentro de la hebra de ssDNA a la que se translocan (la cadena translocada para cargar 5' de la lesión) O dentro de la hebra opuesta, no translocada (para cargar 3 'de la lesión). El concepto se muestra esquemáticamente en

Investigación de cambios conformacionales tras la identificación de lesiones por XPD

La medición de la flexión introducida en el ADN en el sitio de complejos enlazados a partir de imágenes AFM (véase el Protocolo 3.3 anterior) puede revelar información importante sobre cambios conformacionales complejos. Los ángulos de doblado del ADN se midieron para XPD 5 archaeal, que no requiere interacción co-factor proteico para la actividad helicasa. En estos estudios, una lesión de fluoresceína se localizó direcEn el contexto de una burbuja de ADN para aumentar la carga de proteínas en la lesión, a ~ 30% de la longitud del fragmento de ADN. La figura 4 muestra las adaptaciones gaussianas a las distribuciones de ángulo de curvatura del ADN obtenidas para los complejos proteicos en las posiciones de ADN inespecíficas (no dañadas) y al ~ 30% de la longitud del ADN, consistente con el XPD unido a la posición de la lesión de fluoresceína (complejos específicos). Los datos demuestran un ángulo de curvatura medio de ~ 50 ° para complejos no específicos frente a ~ 65 ° para complejos específicos. Este desplazamiento del ángulo de doblado del ADN dependía de la presencia de ATP o ATPƔs, lo que indica que la (re-) unión, pero no la hidrólisis de ATP, era necesaria para los reordenamientos conformacionales 5 .

Figura 1
Figura 1: Preparación de sustratos de ADN. Se introduce una brecha de ssDNA en ADN de plásmido circular cortando el plásmido (aquí con la nickasa N.BstNBI) a cloY separar el fragmento de ssDNA incluido mediante filtración por centrifugación después de la desestabilización por calor en presencia de un exceso de oligonucleótido complementario. Un oligonucleótido especıfico que contiene la caracterıstica de elección puede ser entonces recocido y ligado en la región de separación. Finalmente, la digestión con enzimas de restricción (aquí con SspI y BspQI) da como resultado un sustrato de ADN lineal con la característica diana en una posición precisamente conocida (aquí en el 30% de la longitud del fragmento de ADN). Los ensayos de control permiten ensayar las etapas individuales (mostradas debajo) mediante electroforesis en gel de agarosa (la flecha negra indica 3000 pb). El entintado se puede ensayar mediante la alteración de la movilidad electroforética del ADN circundante relajado (corte de control, carril 2) frente al plásmido superenrollado (carril 1). La separación completa del ADN, así como la subsiguiente inserción del oligo específico, se pueden ensayar por digestión con una enzima de restricción que corta en la región del hueco (aquí: XhoI, enCarriles 2, 4 y 6) de manera que la falta de incisión de ADN indica formación de hueco (pistas 1, 2 de ADN cortado, pistas de 3,4 gapped ADN) y la incisión retalde indica la inserción del oligo específico (carriles 5, 6) . El sustrato lineal final que contiene la característica específica puede purificarse del gel después de la electroforesis en gel de agarosa y se ensaya la homogeneidad y pureza mediante la formación de imágenes AFM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Distinguir diferentes tipos complejos de sus volúmenes AFM. ( A ) imagen AFM de complejos XPD / p44-DNA (flecha gris) y XPD-DNA (flecha negra). ( B ) Ejemplos de tres tipos diferentes de complejos ligados a ADN, interpretados como p44 o mera superestructura de ADN (clase 1),XPD (clase 2, marco negro) y XPD / p44 (clase 3, marco gris) basado en sus volúmenes AFM (mostrados a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Diferentes estrategias de reconocimiento de la lesión de procarias y eucariotas NER helicases. Reconocimiento de lesiones translocación de ADN competente por el NER helicases UvrB y XPD (en complejo con su helicasa activación co-factor p44) requiere la carga de las proteínas en una región de ADN no emparejados (burbuja de ADN). Las proteínas luego se mueven en 5 'a 3' dirección a lo largo de la cadena ssDNA en el que se cargan. Reconocimiento de una lesión de ADN (aquí: CPD) por las helicasas ya sea en la hebra translocada (para cargar a la burbuja 5 ') o en la hebra opuesta no translocada (foR carga en la burbuja 3 ') da lugar a la translocación del DNA estancada. En las distribuciones de posición, esto se muestra como un pico (líneas de ajuste gaussianas), lo que indica una unión mejorada en la posición de la lesión (a ~ 30% de la longitud de ADN para los sustratos de ADN mostrados aquí). El NER helicasa UvrB procariota y su contraparte eucariótica XPD muestran diferentes estrategias de reconocimiento de lesión CPD que indican diferentes preferencias de hebra de ADN. Específicamente, las lesiones de CPD se reconocen en la hebra translocada por UvrB, pero preferentemente en la cadena opuesta no translocada por XPD. Figura modificada a partir de la referencia 9 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Cambios conformacionales en los complejos XPD-ADN tras la identificación de lesiones. Las distribuciones de ángulos de doblado del ADN inducidos por XPD indican cambios conformacionales en los complejos proteína-ADN en una lesión de fluoresceína. Estos reordenamientos conformacionales fueron dependientes de la presencia de ATP (B) o ATPƔS (C). ( A ) En ausencia de ATP, ángulos de curvatura inespecíficos (gris) y ángulos de curvatura en el sitio de la lesión (ángulos de curvatura específicos, negro) son similares y ajustados por una curva gaussiana con centro a ~ 50 °. ( B , C ) En presencia de ATP o ATPƔS, la distribución específica del ángulo de curvatura (negro) muestra un desplazamiento significativo (P = 2,5 x 10 -7 ) hasta un ángulo de curvatura medio de ~ 65 °. Este ADN doblado en el sitio de la lesión fue independiente del tipo de lesión (CPD o aducto de fluoresceína) o la presencia o ausencia de una burbuja de ADN [ 5] . La figura se reproduce a partir de la referencia 5 . La inserción en (C) demuestra cómo se determinaron los ángulos de curvatura (180º-β).Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

número secuencia descripción
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 		fondo
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		Burbuja de f / 5
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		Burbuja de f / 3
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		Burbuja

Tabla 1: oligonucleótidos de ADN para la preparación de sustrato de ADN. Todos los oligonucleótidos tienen 48 nt de longitud y las cadenas superiores (oligonucleótidos 2-6) se fosforilaron en su extremo 5 'para ligarse al ADN gapped (véase el Protocolo 1.1). F = timina aductada con fluoresceína, TT = dímero de ciclobutano pirimidina (timina) (CPD), regiones no complementarias (regiones formadoras de burbujas de ADN) están subrayadas. F que contenían oligonucleótidos se obtuvieron de Integrated DNA Technologies (IDT), los oligonucleótidos que contenían CPD fueron proporcionados amablemente por el laboratorio de Thomas Carell (Ludwig-Maximilian University Munich, Alemania).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Los análisis estadísticos AFM de posiciones de unión de proteínas en fragmentos de ADN largos que contienen sitios diana específicos pueden revelar detalles interesantes sobre las estrategias particulares empleadas por la proteína para reconocer estos sitios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Para interpretar las distribuciones de posición resultantes, es necesario conocer con precisión las posiciones de los objetivos en el ADN. Esto se logra introduciendo sitios específicos en posiciones de secuencia bien definidas en ADN de plásmido circular y cortando un fragmento del ADN que incluye este sitio específico, usando tecnología de enzimas de restricción. En los análisis de imágenes AFM de posiciones de unión a proteínas, sólo se pueden incluir fragmentos de ADN con longitudes correctas (consistentes con la longitud total del fragmento recortado) porque sólo para éstas se conoce la posición del sitio diana. No vale la penaQue el procedimiento de preparación descrito aquí da como resultado sustratos de ADN lineales con dos extremos de fragmentos indistinguibles. Por lo tanto, las distribuciones de posición sólo pueden medirse y trazarse a partir de 0 x longitud del ADN (proteínas unidas a los extremos del fragmento de ADN) a 0,5 x longitud del ADN (proteínas unidas al centro de los fragmentos). Además, para las posiciones objetivo que no se encuentran exactamente en el centro del sustrato, estas distribuciones siempre contienen un pequeño fondo de proteínas que están unidas de forma no específica a la misma distancia del otro extremo del ADN. Sin embargo, la adaptación de una curva gaussiana a la distribución con base en la altura de fondo promedio (proteínas no especificamente unidas, Figura 3 ) explica estos complejos. Alternativamente, uno de los extremos del ADN puede marcarse, por ejemplo con picos de pequeño volumen procedentes de la estructura secundaria que forman salientes de ADNs 24 . Los límites de resolución típicos de estos análisis de posición están en el rango de 100 veces la preferencia de la meta siTe sobre unión no específica del sitio. Además, los extremos del fragmento de ADN no constituyen sitios dsDNA inespecíficos sino que representan roturas de dsDNA. Las proteínas de reparación del ADN a menudo se unen a estos extremos de fragmentos desestabilizados, además de los sitios diana específicos introducidos internamente en la hebra. ADN vinculante final puede ser revelado por AFM análisis y puede proporcionar información importante sobre la función de una proteína. Sin embargo, si la unión al extremo del ADN no es el foco de interés, estas posiciones pueden ser omitidas fácilmente de las distribuciones de posición iniciando las gráficas en una posición> 0 ( por ejemplo , aquí 0,02 longitudes de ADN).

Una de las ventajas particulares y, de hecho, la propiedad común definitoria de las técnicas de molécula única es la resolución de estados individuales, diferentes presentes en una muestra, que pueden poseer propiedades y actividades muy diferentes. Incluso en los casos en que las especies particulares de interés pueden ser poco frecuentes en una muestra, estos enfoques permitenSeparar el foco en esta especie cuyas contribuciones serían empequeñecidas en una medida del conjunto. Para las muestras de proteínas, por ejemplo, la imagen AFM permite la distinción directa entre diferentes tipos de complejos de proteínas basados ​​en el volumen complejo, si los tamaños de las proteínas individuales difieren suficientemente (los límites típicos de resolución son alrededor de 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . Los sistemas AFM pueden calibrarse para permitir la traducción de los volúmenes medidos en el peso molecular de la proteína (Protocolo 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . Alternativamente, se han utilizado patrones de proteínas con tamaños conocidos como referencia directa en las imágenes 1 , 6 . En elCentrado en aquí, las posiciones de unión en el ADN podrían determinarse por separado para el XPD monomérico inactivo con helicasa y para los complejos heterodiméricos activos XPD / p44 de helicasa. La unión preferente a un sitio de lesión en una posición bien definida en el ADN indica el reconocimiento de la lesión de ADN por un complejo de proteínas. Dado que la carga de proteínas y los sitios de lesión se separaron espacialmente, la translocación de ADN fue un requisito previo necesario para el reconocimiento de la lesión en los sustratos de ADN utilizados aquí. Sólo el heterodimérico XPD / p44 complejos fueron capaces de translocación de ADN ( Figura 3 ], en consonancia con los resultados de helicasa actividad ensayos [ 9] . Por lo tanto, el análisis de volumen de AFM puede proporcionar información importante sobre las actividades diferenciales de diferentes formas complejas de proteínas.

La interacción de la lesión y el reconocimiento por la helicasa activa XPD / p44 complejo dio lugar a una mayor vinculante en el sitio de destino debido a la detención de helicasa translocación ( Figura 3 Figura 3 ), este hallazgo indica que la enzima detecta preferentemente fluoresceína en la hebra translocada pero CPD preferentemente en la cadena opuesta, no translocada. En cambio, la helicasa UERR procariótica UvrB reconocía preferentemente las lesiones de fluoresceína y CPD al cargar 5 'de la lesión, es decir , en la hebra translocada ( Figura 3 ). Estas diferencias distintivas en sus propiedades de reconocimiento de la lesión se pueden entender a partir de las diferentes propiedades estructurales de las dos helicasas. UvrB interactúa con objetivos potenciales iN el ADN a través de residuos de aminoácidos en el interior de una función β-horquilla en la enzima detrás de la cual la hebra translocada es probable roscado [ 16 , 25] . XPD, por otro lado, aloja un pequeño poro muy cerca de un hierro-azufre (FeS) cluster [ 26] . La hebra de ADN translocada probablemente hilos a través de este poro [ 26] . Las lesiones más voluminosas como la fluoresceína pueden bloquear la translocación por helicasa a través de las interacciones con los residuos dentro de este poro, mientras que las lesiones CPD menos voluminosas pueden identificarse más fácilmente a través de las interacciones con el grupo FeS. En el sistema procariótico, se cree que dos moléculas de UvrB están implicadas en la búsqueda del sitio diana en un complejo UvrA2-UvrB2 hetero-tetrameric, en el que cada uno de los dos monómeros UvrB es capaz de investigar una hebra 27 de ADN diferente. XPD en NER eucariotas existe probablemente como una copia única en elComplejo de reconocimiento de lesiones TFIIH. La flexibilidad en los enfoques de interacción de la lesión de la enzima eucariótica puede por lo tanto ser necesaria para permitir el reconocimiento del espectro del sitio objetivo extremadamente grande del sistema de reparación de NER.

Debido a que los complejos específicos (unidos al sitio de destino) y no específicos pueden distinguirse en las imágenes de AFM basándose en sus posiciones en el ADN, estos diferentes tipos complejos pueden analizarse por separado y compararse. La molécula única AFM es uno de los pocos enfoques que proporcionan acceso a las propiedades estructurales de los complejos de proteínas unidos de forma no específica al ADN debido a su naturaleza a menudo transitoria o variable. En este caso, los cambios conformacionales sobre el sitio de destino de reconocimiento se visualizaron y se caracteriza en arcaeal XPD basado en la flexión introducida en el ADN por la enzima. Los datos de AFM revelaron un cambio pequeño pero distinto y significativo en los ángulos de doblado del ADN para XPD unido a un sitio de lesión frente a XPD unido al ADN no específico 5 . ConformacionalLos cambios en las proteínas unidas al ADN en la identificación del sitio de destino probablemente desencadenan el reclutamiento de las endonucleasas de NER (XPG y XPF en NER eucariotas) que llevan a cabo la escisión de un tramo corto de ADNcs que contiene la lesión. Curiosamente, este cambio y, por tanto, conformación reordenación necesaria vinculante de ATP a la enzima (pero no la hidrólisis). Un enfoque similar de ATP-reencuentro en el sitio de destino de identificación y posterior reclutamiento de UvrC endonucleasa se ha informado de UvrB en procariótico NER 28 , 29 .

En resumen, AFM molécula única de imágenes ha revelado sutiles diferencias en el sitio de reconocimiento por el procariota y eucariotas NER helicases. Una vez que una lesión objetivo ha sido identificada por las enzimas, comparten una estrategia similar de reclutar las endonucleasas de NER a través de la unión ATP inducida reorganizaciones conformacionales selectivamente en la lesión. La técnica de AFM en comLa combinación con un diseño cuidadoso del sustrato de ADN para imitar las propiedades esenciales del sistema investigado puede proporcionar información sobre las interacciones del sitio diana no sólo de la reparación del ADN, sino de los sistemas de proteínas de unión al ADN en general. La información estructural sobre los complejos específicos y no específicos con resoluciones en el rango de nanómetros bajos (a nivel molecular, limitado por la sonda AFM) puede contribuir significativamente a la comprensión de los mecanismos involucrados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

PUC19N, oligonucleótidos que contienen CPD y p44 fueron amablemente proporcionados por Samuel Wilson, Korbinian Heil y Thomas Carell, y Gudrun Michels y Caroline Kisker, respectivamente. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 y TE-671/4 a IT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

Genética edición 123 microscopía de fuerza atómica (AFM) interacción proteína-ADN reparación del ADN reparación de escisión de nucleótidos (NER) reconocimiento de lesión de ADN modificación de ADN preparación de muestras AFM análisis de volumen AFM y análisis de posición de ADN.
Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter