Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

القوة الذرية المجهري التحقيقات من الحمض النووي الآفة الاعتراف في إصلاح ختان النوكليوتيدات

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

المجهر القوة الذرية (عفم) هو تقنية قوية لتحليل التفاعلات البروتين الحمض النووي 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 . وهو يتطلب كميات قليلة فقط من المواد عينة لتصور مباشرة عينات غير متجانسة مع قرار على مستوى جزيء واحد. يمكن أن ينتج عدم التجانس من مختلف حالات التوافقية أو أوليغوميريك من البروتين. على وجه الخصوص، في سياق عينات من الحمض النووي للبروتين، يمكن أن المجمعات البروتين عرض مختلف الكيمياء المتجانسة و / أو التوافق الناجم عن الحمض النووي ملزمة بشكل عام أو ملزمة لموقع مستهدف معين داخل الحمض النووي. قد تحتوي عينات غير متجانسة أيضا اثنين (أو أكثر) أنواع مختلفة من البروتينات، ومختلفة البروتين معقدةأشكال (على سبيل المثال ، تتكون من نوع واحد فقط من البروتين مقابل المجمعات هيتيروميريك) قد تتفاعل بشكل مختلف مع الحمض النووي. الدراسات التي نوقشت هنا استغلال التصوير عفم في الهواء على عينات ثابتة، المجففة من البروتينات إصلاح الحمض النووي إلى طويلة (~ 900 أزواج قاعدة، بي بي) شظايا الحمض النووي التي تحتوي على الآفة، وهو ما يمثل هدفا لهذه البروتينات. القرار الجزيئي العالي ل عفم يسمح بالتمييز بين أنواع مختلفة من المجمعات البروتينية وتحديد المواقف الملزمة للبروتينات على شظايا الحمض النووي. الأهم من ذلك، يتم إدخال الآفات في ركائز الحمض النووي في مواقف محددة جيدا. لأنه من المعروف موقع موقع الآفة في الحمض النووي، وتوزيعات البروتينات ملزمة على الحمض النووي توفر نظرة ثاقبة (مختلفة) خصائص التعرف على الآفات من (مختلف) المجمعات البروتين، على سبيل المثال ، مدى أنها تعترف نوع معين من الآفة (مقارنة إلى الحمض النووي غير التالفة) 2 ، 3 ، ، 5 ، 6 . مواقفهم على الحمض النووي تسمح أيضا التمييز بين المجمعات البروتين ملزمة على وجه التحديد في الآفات والمجمعات ملزمة غير محددة في أماكن أخرى على الحمض النووي. توصيف منفصل من هذه الأنواع المعقدة المختلفة (المجمعات المرتبطة تحديدا في الآفة مقابل المجمعات غير محددة) يمكن أن تكشف عن التغييرات التوافقية المحتملة في المجمعات التي يسببها تحديد الموقع المستهدف.

البروتينات إصلاح الحمض النووي التي تركز على هنا هي هيليكاسيس التي هي المسؤولة عن التعرف على الآفات في إصلاح ختان النوكليوتيدات (نر) المسار. في البكتيريا، ويتحقق نر من البروتينات أوفرا، أوفرب، و أوفرك. أوفرا هو المسؤول عن استشعار الآفة الأولية في أوفا 2 / أوفرب 2 الحمض النووي المسح الضوئي المعقدة. بعد التحقق من الآفة من قبل أوفرب تحول هذا المجمع إلى أوفرب أحادية الحد ملزمة في موقع الآفة وهذا المجمع المحدد يمكن بعد ذلك تجنيد pداء النواة النواة نونوكلياز نونوكلياز. أوفرك يكيس قصيرة (12-13 نت) تمتد من الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد (سدنا) التي تحتوي على الآفة. ثم يتم إعادة ملء المفقود من قبل البلمرة الحمض النووي. وأخيرا، دنا يغاز الأختام تمتد حديثا تمدد مع الحمض النووي الأصلي 9 ، 10 . في حقيقيات النوى، معظم البروتينات من سلسلة نر هي جزء من مجمع النسخ مولتيمريك كبير H H (تفيه) معقدة. بعد الآفة الأولية الاستشعار عن طريق مجمع CEN2-شيك-HR23B تريمي، يتم تعيين تفييه إلى موقع الهدف الحمض النووي. عندما شد داخل مجمع يتحقق من وجود آفة الهدف نر، يتم تعيين إندونوكليس نر حقيقية النواة النواة زغ و زف لاستئصال قصيرة (24-32 نت) تمتد من سدنا تحتوي على الآفة 9 ، 10 . هنا، على وجه التحديد، و هيليكاسيس أوفرب و شد من بدائية النواة و نر حقيقية النواة، على التوالي، ودرس. هذه هيليكاسيس تتطلب منطقة غير مزدحمة فيالحمض النووي (فقاعة الحمض النووي) لخيوط على واحد من اثنين من الحمض النووي فروع واحدة وترجمة بعد ذلك على طول هذا حبلا تغذيها أتب التحلل. بالإضافة إلى آفات الحمض النووي، وبالتالي تم إدخال فقاعة الحمض النووي في ركائز التي تعمل كموقع تحميل للبروتينات.

وقد وصف الإجراء لإعداد ركائز الحمض النووي الآفة محددة سابقا 11 . فإنه يتطلب بناء دنا دائري (البلازميد) مع اثنين من مواقع تقييد متباعدة عن كثب لنيكاز. في سياق هذه الدراسة، تم استخدام البلازميد pUC19N (2729 بي بي) (التي تم إنشاؤها بواسطة مختبر S. ويلسون، نيهس). هذا البلازميد يحتوي على ثلاثة مواقع تقييد متباعدة عن كثب ل Nt.BstNBI النيك التي تأطير 48 النيوكليوتيدات (نت) تمتد. بعد الحضانة مع نيكيس، يمكن إزالة امتداد سدنا بين هذه المواقع واستبدالها من قبل قليل النوكليوتيدات التي تحتوي على أي ميزة الهدف. بعد كل خطوة، يتم اختبار الهضم الأنزيمي الكامل عن طريق هلام الاغاروزالكهربائي. يمكن تمييز الحمض النووي دائري نيكيد بسبب انخفاض التنقل الكهربي مقارنة البلازميد سوبيركويلد الأصلي. ويمكن تقييم الفجوات من الحمض النووي واستبدال تمتد إزالتها من قبل قليل النوكليوتيد الركيزة محددة عن طريق الهضم مع انزيم تقييد الذي يحرض الركيزة حصرا داخل المنطقة بين النكات. ومن ثم سيتم قمع الخطي من البلازميد دائري من قبل الانزيم للحمض النووي المنبثق واستعادة بعد إدراج أوليغونكلأوتيد محددة. وأخيرا، فإن اثنين من مواقع تقييد نوكلياز داخلية (من الناحية المثالية القواطع واحدة) تسمح لتوليد الركيزة الحمض النووي الخطي، مع طول كما هو مطلوب ومع موقع الهدف المحدد في موقف محدد وكذلك فقاعة الحمض النووي على مسافة من الآفة إما في 5 'أو 3' الاتجاه.

التعرف على الآفات التي كتبها نيل هيليكاسيس يمكن التحقيق عن طريق التصوير عفم. توقفت الحمض النووي نقل من هيليكاسيس في رموقع الآفة مرئية كذروة في توزيع موقف البروتين على الحمض النووي ويشير إلى التعرف على الآفات. لأن نقل الحمض النووي لهذه هيليكاسيس هو علاوة على ذلك الاتجاه، مع 5 إلى 3 'قطبية، والاعتماد على الاعتراف الآفة على موقع موقع التحميل (فقاعة دنا المنبع أو المصب من الآفة) يشير أيضا إلى ما إذا كانت الآفة معترف بها بشكل تفضيلي على ترانزلاتوكاتد أو على العكس، غير ترانزلاتوكات سدنا حبلا 5 ، 9 . في الأقسام التالية، سيتم عرض الأساليب المستخدمة وسيتم مناقشة النتائج الرئيسية من هذه التجارب بإيجاز. الأهم من ذلك، على غرار العمل المثالي على إصلاح الحمض النووي هو مبين هنا، والتصوير عفم يمكن تطبيقها على دراسة مختلف النظم المتفاعلة الحمض النووي، مثل تكرار الحمض النووي أو النسخ 8 و 12 و 13 و 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد العينة

  1. إعداد ركائز الحمض النووي 11
    1. توليد سدنا الفجوة في البلازميد
      1. هضم تماما عينة من البلازميد (هنا: تعديل pUC19، pUC19N) في أنبوب التفاعل مع النكاز المناسب (هنا: Nt.BstNBI) تليها انزيم الحرارة تعطيل، وذلك باستخدام الظروف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر الشكل 1 للتخطيطي عرض). تبدأ مع ~ 50 ميكرولتر و ~ 500 نانومتر البلازميد للحصول على عائد كاف.
      2. التحقق من البلازميد النك بواسطة الاغاروز هلام الكهربائي على عينات المخفف (~ 20 نانومتر) 15 . ارتداء قفازات للحماية من الحمض النووي ملزمة صبغ تستخدم لتصور الحمض النووي.
        ملاحظة: التحركات الكهربي مختلفة تسمح التمييز بين النيكل (استرخاء) و سوبيركويلد دائري البلازميد دائري ( الشكل 1 ).
      3. إزالة تمتد سدنا المحطمة (بين مواقع نيك) من البلازميد من قبلالحضانة مع ~ 10 أضعاف الزائدة من أوليغونكلأوتيد التكميلية (أوليغونوكلأوتيد 1 في الجدول 1 )، والهز في 300 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة بالقرب من درجة حرارة انصهار أوليغونكلأوتيد (هنا: 68 درجة مئوية ل pUC19N) في كتلة الحرارة ( الشكل 1 ).
      4. فصل البلازميد الانفجارات من شظايا الحمض النووي أصغر باستخدام 50 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع (موكو) تصفية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج في الطرد المركزي الجدول ( الشكل 1 ). لاستخراج الحمض النووي المركزة من مرشح، عكس مرشح وإدراجها في أنبوب رد فعل 1.5 مل جديد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1000 × ز.
      5. إعادة ملء العينة الحمض النووي المركزة الناتجة إلى 500 ميكرولتر مع منزوع الأيونات، المياه التي تمت تصفيتها، إضافة إضافية ~ 5 أضعاف الزائدة من قليل النوكليوتيد التكميلي وكرر الخطوات 1.1.1.3 و 1.1.1.4 3 مرات على الأقل.
      6. اختبار للفجوات كاملة من الحمض النووي عن طريق الحضانة مع انزيم تقييد مناسب (هنا: شوي أو بغلي) باستخدام كونديتيأونس وفقا لوصف الشركة المصنعة. استخدام المخفف (نيك مقابل مقابل) عينات الحمض النووي (~ 20 نانومتر). تشغيل الاغاروز هلام الكهربائي للتمييز بين البلازميد الخطي (التي لا تحتوي على فجوة سدنا) والحمض النووي غير منقوشة (الحمض النووي غاب) باستخدام الحمض النووي نك كما السيطرة الإيجابية (تشمل سلم الحمض النووي كمرجع، الشكل 1 ). ارتداء القفازات.
    2. إعادة ملء الفجوة مع أوليغونوكلأوتيدس سدنا تعديل
      1. أنال البلازميد عن طريق الحاضنة مع زيادة ~ 25 أضعاف من 5 'أوليغونوكليوتيد فوسفهوريلاتيد الذي يحتوي على موقع الهدف المحدد (ق) من الاختيار، واحتضان في ~ 45 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ( الشكل 1 ). هنا، استخدم 48 نت سدنا تحتوي على آفة، إما فلوريسئين ثيمين أدوكتد أو سيكلوبوتان بيريميدين ديمر (كبد)، وبالإضافة إلى ذلك قصيرة (8 نت) تسلسل غير تكميلي لإنتاج فقاعات الحمض النووي (انظر الجدول 1 ).
      2. تساهميا ربط إدراج صلب إلى البلازميد التي كتبها إنكوبامع T4 الحمض النووي ليغاز بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ( الشكل 1 ). لهذا التفاعل، إضافة أتب تحتوي على محلول المخزون العازلة المركزة لإنتاج الظروف العازلة مناسبة لليغاز (على سبيل المثال ، استخدام العازلة رد أوفرب: 50 ملي تريس هكل درجة الحموضة 7.5، 10 ملي مغكل 2 ، 50 ملي بوكل، 5 ملي دت، 1 ملم ATP).
      3. اختبار لإدراج أوليغونكلأوتيد محددة في البلازميد عن طريق الهضم من العينات المخففة مع انزيم تقييد مناسبة (كما هو الحال في 1.1.1.6) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة تليها الكهربائي هلام الاغاروز (كما هو الحال في 1.1.1.6، الشكل 1 ).
    3. إعداد الركيزة الحمض النووي الخطي
      1. هضم تعديل الحمض النووي البلازميد مع الانزيمات تقييد (من الناحية المثالية مع موقع تقييد واحد في البلازميد) باستخدام الظروف الموصى بها من قبل الشركة المصنعة ( الشكل 1 ). تنتج هذه الخطوة شظايا خطية تحتويإدخال التعديل المدرج في موضع محدد. هنا، استخدم سسبي وقطع بسبكي في مواقف 613 و 255 نقطة أساس المنبع والمصب من إدراج، على التوالي، مما أدى إلى 916 شظية الحمض النووي جزء يحتوي على موقع الآفة محددة في ~ 30٪ من طول الحمض النووي.
        ملاحظة: لتجارب التصوير عفم كما هو موضح هنا، شظايا الحمض النووي مع أطوال بين ~ 200 بب و ~ 2000 بب هي ركائز مناسبة.
      2. عزل شظية الهدف عبر الاغاروز هلام الكهربائي واستخراج هلام باستخدام مجموعة التجارية. ارتداء قفازات للحماية.
      3. اختياريا، وقطع هلام الاغاروز مع مشرط لفصل سلم الحمض النووي والممرات عينة المخفف (الممرات الأولى) من الممرات التي تحتوي على الحمض النووي المركزة لتنقيته. فقط تعريض جزء هلام مع الممرات الأولين للأشعة فوق البنفسجية عن طريق وضع هذا الجزء فقط من هلام على طاولة الأشعة فوق البنفسجية.
        1. قطع الفرقة المقابلة لجزء من الاختيار مع مشرط. إعادة توحيد اثنين من أجزاء هلام (قبالة علامة التبويب الأشعة فوق البنفسجيةلو). استخدام موقف الفرقة استئصال من العينة المخففة والتوجه لموقف الفرقة من الركيزة الحمض النووي المطلوب. حساب لتركيز أعلى من خلال قطع شرائح أوسع قليلا من السيطرة المخففة.
          ملاحظة: لأنه هنا، تم التحقيق من التعرف على الأشعة فوق البنفسجية الآفات، وإدخال الآفات الأشعة فوق البنفسجية إضافية عن طريق أشعة فوق البنفسجية تم تجنبها بعناية في الركيزة الحمض النووي من خلال هذا النهج.
      4. حساب تركيز الحمض النووي ج من امتصاص في 260 نانومتر يقاس من قبل طيف الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام قانون لامبرت البيرة مع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (دسدنا) متوسط ​​معامل الانقراض المولي من ε 260nm ~ 6،700 M - 1 سم - 1 لكل بب:
        معادلة
        حيث L هو طول المسير (طول غرفة القياس، عادة 1 سم).
    </ لى>
  2. التعبير وتنقية البروتينات
    1. ريكومبينانتلي التعبير عن أوفرب في E. القولونية وتنقية البروتين عن طريق معيار الكيتين تقارب حبة 15 وحجم الاستبعاد اللوني 15 كما هو موضح سابقا 16 .
      ملاحظة: تم استنساخ الجين أوفرب من عصيات كالدوتيناكس في ناقلات pTYB1.
    2. التعبير عن شد في E. القولونية وتنقية البروتين عن طريق معيار النيكل إيدا تقارب 15 واللون استبعاد اللوني 15 تليها أنيون التبادل اللوني 15 ، كما هو موضح سابقا 17 .
      ملاحظة: تم استنساخ الجين ل شيتوميوم ثيروفوفيلوم زيروديرما بيغمينتوسوم المجموعة D البروتين (شد) في ناقلات pBADM11. C. كان ثيرموفيلوم p44 هدية نوع من مختبر كارولين كيسكر، وأعرب ونقيكما ورد وصفه 17 .

2. تجربة عفم

  1. إعداد عينة
    1. اختياريا، قبل احتضان الركيزة الحمض النووي عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة لإزالة بلورات الملح الصغيرة المحتملة التي قد تكونت خلال التخزين في الثلاجة.
    2. إعداد العازلة رد فعل (ق) في تركيز 10 أضعاف (10X مخازن).
      ملاحظة: رد فعل رد شد في تركيز 1X الواردة 20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 10 ملي بوكل، 5 ملي مغكل 2 ، 1 مم تسيب، 2 ملم أتب. 1x أوفرب رد فعل العازلة الواردة 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 50 ملي بوكل، 10 ملي مغكل 2 ، 5 ملي دت، و 1 ملم أتب.
    3. قبل احتضان البروتينات في تركيز أعلى في ظروف حضانة مناسبة لتعزيز تشكيل معقدة. قبل تمييع حجم صغير (على سبيل المثال ، 1 ميكرولتر) من البروتينات الفردية في 1X العازلة رد فعل البروتين إلى التركيز المطلوب وتخلط كميات صغيرة (على سبيل المثال ، 1 ميكرولتر) من روقال انه حلول البروتين الفردية في أنبوب رد فعل 0.5 مل.
      1. وضع أنبوب في كتلة الحرارة لدرجات حرارة الحضانة أعلى من درجة حرارة الغرفة. اختيار نسبة تركيز اعتمادا على الكيمياء المتكافئة المعقدة المتوقعة، إما متساوي الأقطاب أو تركيزات المقابلة. هنا، احتضان 1 ميكرولتر شد (20 ميكرومتر في 1 × رد فعل رد شد) و 1 P44 ميكرولتر (20 ميكرومتر في 1X رد فعل رد شد) في 10 ميكرومتر كل لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. احتضان عينات في البروتينات المناسبة وتركيزات الحمض النووي في المخزن المؤقت رد فعل البروتين في أنبوب رد فعل 0.5 مل. هنا، استخدم 500 نانومتر أوفرب أو 1 ميكرومتر شد + 1 ميكرومتر P44 و 100 نانومتر الحمض النووي. ماصة أحجام صغيرة لحفظ المواد، على سبيل المثال ، 0.25-0.5 بروتين ميكرولتر (المخفف مسبقا إلى 10 أضعاف تركيز الحضانة) والحمض النووي في حجم إجمالي 2.5-5 ميكرولتر من 1X العازلة رد فعل البروتين. هنا، احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في كتلة الحرارة. تدور باستمرار في أنبوب رد فعل لفترة وجيزة (~ 1 ثانية) في الطرد المركزي الجدوله لضمان خلط أحجام صغيرة.
  2. عينة ترسب
    1. إعداد الركيزة الميكا: قطع ما يقرب من 1 × 1 سم 2 قطعة من الميكا من شرائط أكبر باستخدام مشرط. تخرج من الطبقات العليا للطبقة المعدنية الميكا متعددة الطبقات باستخدام شريط لاصق للكشف عن نظيفة، مسطحة، وعلى نحو سلس ركيزة سطح الركيزة.
      ملاحظة: قطعة الميكا يمكن إعادة استخدامها لتجارب متعددة عن طريق تجريد طبقة أخرى (ق).
    2. إعداد العازلة ترسب عفم مع منزوع الأيونات، المياه التي تمت تصفيتها، على سبيل المثال ، 25 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 7.5، 25 ملي نا خلات، 10 ملم مغ أسيتات. تصفية من خلال مرشح حقنة 0.02 ميكرون.
      ملاحظة: الكاتيونات ثنائي التكافؤ في المخزن المؤقت ترسب تعمل على خلب جزيئات الحمض النووي سالبة الشحنة إلى سطح الميكا، وهو أيضا مشحونة سلبا في الرقم الهيدروجيني محايد. إذا كانت عالية نسبيا مغ 2 + تركيز أيون في المخزن المؤقت ترسب يطرح مشكلة لنظام معين من البروتين الحمض النووي، بدلا من ذلك،يمكن أن يكون سطح الميكا محملة مسبقا مع مجموعات الأمينية باستخدام الكيمياء القائمة على سيلاتران لتوفير رسوم سطح إيجابية لرسو 18 . ويمكن بعد ذلك ترسب عينة يتم تنفيذها في المخزن المؤقت الذي يحتوي على أو كميات قليلة فقط من الكاتيونات ثنائي التكافؤ.
    3. تمييع العينة (انظر 2.1) لترسب فوري على الميكا في العازلة ترسب. إيداع حجم صغير (هنا: 20 ميكرولتر).
      ملاحظة: عوامل التخفيف تعتمد على تركيز العينة. هنا، تمييع عينات 50-100x. كقاعدة من الإبهام، ~ 1 نانومتر النتائج الحمض النووي في تغطية سطح جيدة ل ~ 1000 نقطة أساس.
    4. على الفور شطف عينة ثلاث إلى أربع مرات مع بضعة ملليلتر من المياه المصفاة منزوع الأيونات، وصمة عار قبالة السائل الزائد، وضربة الجافة في تيار لطيف من النيتروجين. العملية برمتها من عينة ترسب إلى عينات المجففة يمكن تنفيذها ضمن أقل من 30 ثانية.
    5. إصلاح قطعة من الميكا على شريحة المجهر باستخدام شريط لاصق في حوافها.
      ملاحظة: أنظمة عفم مختلفة لديها دمتطلبات إفيرنت لتحديد العينة إلى المرحلة. وتمتلك أدمس أخرى مراحل مغناطيسية، ويتم تثبيت قطع الميكا على الأقراص المغناطيسية، على سبيل المثال ، باستخدام الغراء الحراري. تفاصيل نظام عفم المستخدمة هنا يمكن العثور عليها في جدول المواد.
  3. عفم التصوير
    1. وضع العينة (انظر 2.2.5) مركزيا على مرحلة عفم وإصلاح شريحة المجهر على خشبة المسرح مع منصات المغناطيسي.
    2. إدراج طرف عفم في حامل طرف. استخدام الكابولي مع حاد (<10 نانومتر) عفم التحقيق مناسبة للتأرجح، متقطع وضع الاتصال الاتصال في الهواء. استخدام تحقيقات عفم ، على سبيل المثال، كما هو موضح في جدول المواد . هنا (يعتمد على عفم)، إصلاح طرف في حامل تحت المشبك عن طريق تشديد المسمار المشبك (إصبع ضيق). أدخل حامل طرف في رأس قياس عفم. بقية الرأس على ظهره لهذه الخطوة.
    3. وضع رأس قياس عفم على رأس العينة. التفاصيل تعتمد على نموذج عفم. هنا، متأكد من أن الرأس يقف مستقر مع ساقيه داخل المسافات البادئة. تأكد من أن الميكا تقع على خشبة المسرح حيث سوف تلميح عفم تحوم مباشرة فوقه. مسامير ميكرومتر على يمين المرحلة تسمح لتحديد المواقع بدقة من العينة.
    4. محاذاة الليزر عفم على الجزء الخلفي من ناتئ لقوة إشارة الأمثل من موقف فوتوديتكتور حساسة على ينعكس الليزر. التفاصيل تعتمد على نموذج عفم.
      1. هنا، وتحويل العجلات في الجانب الأيمن والجزء الخلفي من رئيس قياس عفم لضبط X- و Y- مواقف الليزر عفم لتوجيهه مركزيا على نهاية ناتئ. مشاهدة إشارة الانعكاس في إطار الفيديو عفم (إذا كان متوفرا، هنا: اضغط على أيقونة الكاميرا واختر الإدخال: سفيديو).
      2. مرة واحدة في وضع فظيع، وتحسين إشارة مجموع الكشف (مجموع في مجموع ونافذة متر نافذة في برنامج عفم) عن طريق ضبط دقيق موقف الليزر مع عجلتين (البقاء في نهاية ناتئ،لتر يعتمد على عفم ونوع ناتئ، هنا: الهدف للمبلغ> 5).
    5. صفر إشارة الفرق من الثنائيات العلوية والسفلية من مجموعة الكاشف (هنا: إشارة الانحراف في مجموع ونافذة متر نافذة) عن طريق توجيه انعكاس الليزر عفم على مركز الكشف (هنا: تحويل عجلة في الجانب الأيسر من قياس عفم رئيس).
      ملاحظة: الانحرافات من الصفر ثم تشير إلى انحراف ناتئ بسبب التفاعلات السطحية، والتي يتم ترجمتها إلى معلومات الارتفاع من قبل عفم.
    6. تحديد تردد الرنين ناتئ بواسطة لحن تردد تنفيذها في برنامج عفم (هنا: قيادة السيارات لحن في لوحة ماستر / نافذة اللحن). اختيار السعة المقابلة إلى 1 V المدخلات لبيزو الذي يدفع التذبذب ناتئ. تعيين تردد التذبذب إلى قليلا (5٪) أقل من تردد الرنين وصفر مرحلة من التذبذب.
    7. نهج طرف إلى سطح العينة باستخدام الخام الانخراط وزارة الدفاعe (هير: كوماند إنغاج في نافذة اللوحة الرئيسية) حتى يتم الوصول إلى إعداد الحماية (نقطة مجموعة). استخدام ~ 2٪ قطع من السعة الحرة التذبذب مستوى كنقطة مجموعة (هنا، أدخل تعيين نقطة 980 مف في اللوحة الرئيسية).
    8. غرامة إشراك طرف عفم مع سطح العينة عن طريق خفض نقطة مجموعة باستخدام برنامج عفم. تهدف للتصوير وضع التنافر مع مرحلة التذبذب ناتئ (المرحلة في مجموع وانحراف متر نافذة) فقط تحت مرحلة مستوى الحرة (قبل الانخراط، وهنا عادة ~ 70). هنا، استخدام نقاط مجموعة النهائية النموذجية على الترتيب من 70-80٪ من السعة مستوى الحرة (1 V).
    9. قبل المسح الضوئي، اختر الإشارات للتسجيل في لوحة القناة الرئيسية. اختر الارتفاع (هت) والسعة (آم).
    10. بدء المسح الضوئي عينة (هنا: الأمر مسح في إطار اللوحة الرئيسية). استخدام سرعة المسح الضوئي على سبيل المثال، 2.5 ميكرون / ثانية (الأمر سرعة المسح الضوئي في اللوحة الرئيسية) إلى مناطق سطح الصورة من 4 ميكرون × 4 ميكرون أو 8 ميكرون × 8 ميكرون (أدخل حجم المسح الضوئي في الجزء الرئيسيل) مع دقة بكسل من 2،048 أو 4،096 (نقاط المسح وخطوط المسح الضوئي في اللوحة الرئيسية)، على التوالي.
    11. حفظ ملف الصورة (الأمر حفظ الصورة في اللوحة الرئيسية) مع عدم وجود تعديلات المناسب (اختيار لا شيء في لوحة القناة الرئيسية / حفظ الطائرة صالح).
    12. لمزيد من التحليل، معالجة الصورة المحفوظة. تحميل الصورة (الأمر استعراض البيانات المحفوظة في القائمة تحليل عفم). افتح لوحة التعديل (اضغط على M في القسم العلوي من الصورة). تطبيق بلانيفيت في x و y أبعاد إلى صورة الارتفاع (ملحق هتر) (الأمر زي في نافذة بلانيفيت في لوحة تعديل، اختيار بلانفيت النظام 3). ثم تسطيح الصورة (الأمر تتسطح في نافذة فلاتن في تعديل لوحة) اختيار تسطيح النظام 3.
    13. تصدير الصورة كملف تيف (اضغط على أوامر في الجزء العلوي من الصورة، واختيار تيف تصدير 2X المقابلة ل 2048 بكسل القرار) لمزيد من التحليل.

3. تحليل عفم

  1. البروتين حجم مجمع
    1. ما قبلحدد المجمعات البروتين الحمض النووي ذات الصلة عن طريق الفحص البصري المباشر من الصور في برنامج عفم، وذلك باستخدام نظام الألوان المناسبة لتحقيق أقصى قدر من المظاهر المختلفة من المجمعات حجم مختلفة (انظر ألوان وأحجام مختلفة من المجمعات المختلفة في الشكل 2 ؛ هنا: نظام الألوان سيلانداندفير في و أفمسوفتوار). بالنسبة لعينات شد، شملت المضاعفات المحتملة شد / p44-دنا وكذلك شد -دنا و p44-دنا، مع أحجام مختلفة بشكل واضح بسبب الكتلة الجزيئية الكبيرة نسبيا والمختلفة من شد (~ 95 كيلو دالتون) و p44 (~ 40 كيلو دالتون) .
    2. قياس كميات من قمم البروتين الفردية على الحمض النووي للتحقق من نوع معقد. ويمكن تحقيق ذلك مع برنامج صورة مختلفة (هنا: أداة القسم من برنامج عفم).
      1. قياس ارتفاع (ح) وقطر (د) من أقسام ذروة البروتين مع مؤشر نافذة القسم. قياس القطر على مقربة من قاعدة قسم الجسيمات.
      2. تحديد حجم (V) من البازلاءكس باستخدام نماذج رياضية بسيطة، على سبيل المثال ، باستخدام الصيغة التالية، التي تقوم على نموذج غطاء كروي:
        معادلة
    3. ترجمة الأحجام تقاس في كتلة البروتين الجزيئي التقريبي.
      1. في البداية، ومعايرة نظام عفم للتحجم إلى الوزن الجزيئي (مو) باستخدام مجموعة من البروتينات ذات الوزن الجزيئي المعروف (هنا: ما مجموعه 12 التجارب مع ما بين 25 و 851 نقطة البيانات كل أجريت على 5 بروتينات مختلفة في أحادية، ديميريك ، تريميريك، أو تيترامريك الدول) 4 ، 19 ، 20 . بروتينات الإيداع والصورة (كما هو موضح أعلاه، في 2.2 و 2.3) وقياس أحجامها كما هو موضح أعلاه (3.1.2). رسم الأحجام على الأوزان الجزيئية المعروفة. ويظهر الرسم البياني الناتج علاقة خطية بين V و مو، يمكن الحصول على معادلة من خلالهاخط يصلح للبيانات. بالنسبة لنظام عفم المستخدم هنا، تم الحصول على العلاقة التالية 19 :
        معادلة
        ملاحظة: هذه الخطوة لا يجب أن تتكرر قبل كل قياس، ولكن يتم فقط مرة واحدة. ويمكن تطبيق حجم مو المعايرة على الصور التي تم الحصول عليها في ظل ظروف التصوير مماثلة باستخدام تحقيقات عفم مع أقطار متفاوتة قليلا.
      2. استنادا إلى حجمها المقاسة (3.1.2) ومعايرة V- إلى- مو (3.1.3.1)، وتحديد مو التقريبية من المجمعات البروتين 20 ، الذي يوفر معلومات عن المحتوى الجزيئي لها. على سبيل المثال ، بالنسبة لعينات شد / p44، ~ 50 كيلو دالتون، ~ 100 كيلو دالتون، و ~ 140 كيلو دالتون تم الحصول عليها، بما يتفق مع المجمعات دنا p44 (أو قمم الناجمة عن مجرد البنية الفوقية الحمض النووي)، شد قمم فقط، و شد / P44 قمم، على التوالي .
  2. المواقف المعقدة البروتين على الحمض النووي
    1. تحديد الحمض النوويأطوال الشظايا.
      1. تتبع شظايا الحمض النووي في الصور عفم، على سبيل المثال ، مع وظيفة خط يدوي من برنامج تحليل صورة مناسبة (انظر على سبيل المثال جدول المواد) وقياس طول الخط.
        ملاحظة: استبعاد المجاميع الحمض النووي وكذلك شظايا قطعت من قبل هوامش الصورة.
      2. بن ورسم أطوال الحمض النووي من التجربة برمتها في الرسم البياني، وذلك باستخدام تحليل البيانات المناسبة والرسوم البيانية البرمجيات (على سبيل المثال ، انظر جدول المواد ).
      3. تناسب توزيع طول مع منحنى غاوس في تحليل البيانات والرسوم البيانية البرمجيات لتحديد طول شظايا الحمض النووي. من أجل معرفة موقع الموقع المستهدف للدنا (انظر 1.1)، لا تشمل سوى شظايا الحمض النووي ذات الطول الصحيح ضمن انحرافين معياريين عن مركز منحنى غاوس (y = y 0 + z إكس (-2 (شكس c ) 2 / w 2 )، حيث z هو عامل القاعدة و x c و w هي المركز وكامل أقصى نصف العرض من غاوس) في مزيد من التحليلات.
        ملاحظة: طول الحمض النووي في وسط منحنى غاوس يجب أن يكون قريبا من الطول النظري لشظية الحمض النووي (محسوبة باستخدام 0.34 نانومتر / بي بي). أطوال تصل إلى 10٪ أقصر من القيمة النظرية هي نموذجية ومن المرجح أن تسببها حدود القرار عفم.
    2. تحديد مواقف قمم البروتين على ركائز الحمض النووي.
      1. قياس المسافة من قمم البروتين من نهاية جزء الحمض النووي أقرب، كما هو موضح في 3.2.1.1 وتقسيم طول الحمض النووي الكلي للحصول على مسافات في وحدات من جزء من طول الحمض النووي.
      2. بن ورسم المسافات المقاسة في الرسم البياني باستخدام تحليل البيانات المناسبة والرسوم البيانية البرمجيات (انظر على سبيل المثال ، الشكل 3 ). وكقاعدة عامة، اختر حجم بن الذي يعطي حاويات √n تقريبا لنقاط البيانات n.
        ملاحظة: منذ ينتهي الحمض النووي لا يمكن تمييز هنا، مؤامرة فقط لجزء من طول الحمض النووي 0.5 (مركز دنا فراجمنة). لأن نهاية الحمض النووي ملزمة ليست محور الدراسة، استبعاد ينتهي الحمض النووي من التحليلات عن طريق البدء في بن البيانات الموقف قليلا بعد موقف 0 (على سبيل المثال ، بينينغ من جزء طول الحمض النووي من 0.02).
    3. تحديد خصوصية الموقع المستهدف من البروتين توزيعات الموقف المعقدة.
      1. تناسب الحد الأقصى (أحداث الربط المعززة) في توزيع المواضع بمنحنى غاوس كما هو موضح في الفقرة 3.2.1.3 ولكن تم تثبيته على ارتفاع ارتباط الخلفية (انظر الشكل 3 ).
      2. حساب خصوصية S لموقع معين مقابل الخلفية الحمض النووي غير محددة (جزيئات البروتين ملزمة لمواقع الحمض النووي غير محددة) مع الصيغة التالية 21
        معادلة
        A سب: عدد من المجمعات محددة (منطقة تحت منحنى غاوسيان)
        A نسب : عدد من المجمعات غير محددة (منطقة الخلفية، 0 )؛ وجزء من طول الحمض النووي المغطاة هنا هو 0.48 للرسم البياني بدءا من 0.02 طول الحمض النووي)
        N: عدد مواقع ربط الحمض النووي المحتملة (هنا: N = 914 باستثناء نهايات الحمض النووي)
  3. زوايا منحنى الحمض النووي
    1. باستخدام أداة زاوية في برنامج تحليل صورة مناسبة، وقياس زاوية β بين سطرين وضعت مركزيا على طول العمود الفقري الحمض النووي وتركز في ذروة البروتين (انظر على سبيل المثال ، أقحم في الشكل 4 ). قياس الزوايا لعدد ذات الصلة إحصائيا من المجمعات الحمض النووي للبروتين (> 50، من الناحية المثالية> 100) 2 ، 3 ، 5 .
      ملاحظة: يتم تعريف زاوية منحنى الحمض النووي كما 180 ° -β 2 ، 3 ، 5 .
    2. استخدام تحليل البيانات والرسوم البيانية البرمجيات(انظر جدول المواد) تنتج منحنى توزيع زاوية الانحناء من قبل بينينغ زوايا منحنى الحمض النووي.
    3. تناسب توزيع زاوية الانحناء مع منحنى غاوس. إذا كان أكثر من الحد الأقصى هو واضح في التوزيع، واختيار متعددة الذروة غاوس صالح. مركز (مراكز) منحنى غاوس (ق) تعطي (ق) متوسط ​​حالة زاوية الانحناء من الأنواع المحددة.
    4. إذا كان التحول في زاوية الانحناء (ق) (ماكسيما من تناسب غاوس) s هو واضح للتوزيعات، على سبيل المثال، من مختلف المتغيرات البروتين أو أنواع مختلفة من البروتين معقدة، وتطبيق الطالب t -test لتقييم مستوى أهمية التغييرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التمييز بين أنواع معقدة مختلفة على أساس وحدات التخزين المعقدة البروتين

يتم تنشيط النشاط هيليكاس من بدائية النواة نر هيليكاس أوفرب من الحمض النووي ملزمة 22 ، 23 . أوفرب يتطلب منطقة غير مزروعة في الحمض النووي (فقاعة الحمض النووي) من أجل تحميل بشكل صحيح على واحد من اثنين من خيوط سدنا واحدة. في الجسم الحي ، يتم توفير هذا الهيكل الحمض النووي من خلال التفاعلات الحمض النووي من خلال بروتين آخر من سلسلة نر. في التجارب في المختبر ، فقاعة يمكن إدخالها بشكل مصطنع في شظايا دسدنا على مقربة من الآفة المستهدفة. التفاعلات البروتين البروتين أيضا تعزيز الحمض النووي ملزمة من قبل أوفرب 9 . ومع ذلك، مرة واحدة يتم تحميل أوفرب على الحمض النووي، لا يبدو أن نشاطها تعتمد على البروتين العوامل المشتركة 9 . على النقيض من ذلك، يتطلب النواة النوى هيليكاس شد التفاعليعلى مع البروتين p44، والتي مثل شد هو جزء من متعدد النسخ عامل عامل إيه (تفيه) المعقدة في الجسم الحي ، لتفعيل النشاط هليكاس لها، ولكن هذا التفاعل لا يؤثر شد ملزمة ل دنا 17 . ومن المتوقع أن يتم تحميل الحمض النووي وحده على الحمض النووي في فقاعة الحمض النووي، ولكن لا يترجم إلى الآفة (في غياب لهليكاس تفعيل عامل مشترك). وينبغي أن شد دون P44 وبالتالي لا تكون قادرة على التفاعل مع وتحديد الآفة عند تحميلها على مسافة من موقع الآفة. حضانات شد مع p44 في وجود الآفة التي تحتوي على الركيزة الحمض النووي نتيجة في مزيج من XPD- أو شد / P44 الحمض النووي المجمعات (وربما نوع بسيط من p44 وحدها ملزمة إلى الحمض النووي). لتحليل منفصل التعرف على الآفات بواسطة شد / P44 و شد، يمكن تمييز هذه الأنواع المعقدة المختلفة استنادا إلى وحدات التخزين في الصور عفم ( الشكل 2 ) 9 ، كما هو موضح في بروتوكول 3.1 أعلاه. يمكن معايرة أنظمة عفم باستخدام مجموعة من pروتينات مع الوزن الجزيئي المعروف، للكشف عن علاقة خطية بين حجم عفم والكتلة الجزيئية التقريبية للبروتين (معقدة) 20 ، مما يسمح بتفسير الأحجام قياسها. وبالتالي يمكن تحديد المواقف ملزمة على الحمض النووي بشكل منفصل ل هيليزاس شد أحادية غير نشطة (~ 95 كيلو دالتون، بما يتفق مع ~ 100 نانومتر 3 فئة 2 الأنواع في الشكل 2 ) و هيليكاس النشطة شد / P44 المجمعات (~ 135 كيلو دالتون، ~ 150 نانومتر 3 أنواع 3 أنواع)، استنادا إلى أحجام مختلفة عفم.

تحديد الاعتراف الآفة من المواقف ملزمة البروتين على الحمض النووي

هنا، استخدمت طويلة (916 بب) ركائز الحمض النووي تحتوي على آفة في ~ 30٪ من طول الحمض النووي. السيطرة على الموضع الدقيق للآفة داخل الركيزة الحمض النووي يسمح للتمييز بين محددة (الآفة ملزمة، في ~ 30٪ من طول الحمض النووي) و نونسبسيفيك (البحث الآفة) المجمعات تعتمد على مواقعها على الحمض النووي. تم اختيار اثنين من الآفات المختلفة، والتي هي أهداف نر. ركائز الحمض النووي الواردة إما فلوكورسين (F) أدوكت أو سيكلوبوتان بيريميدين ديمر (كبد). بالإضافة إلى موقع الآفة، يحتوي الحمض النووي على منطقة غير مزدحمة (8 نت دنا فقاعة) التي كانت بمثابة موقع تحميل ل هيليكاسيس. يقع موقع التحميل هذا على مسافة 26 نيوتن متر (ل F تحتوي على ركائز الحمض النووي) أو 23 نت (ل كبد تحتوي على ركائز) إما 5 'أو 3' من الآفة (انظر الجدول 1 ). الاعتراف الآفة يؤدي إلى توقف الحمض النووي المتوقفة من هيليكاسس أوفرب و شد في الموقع المستهدف، واضح في عفم توزيع موقف البروتين على الحمض النووي كذروة في موقف الآفة. المواقف فقاعة و فقاعة في هذه ركائز لا يمكن في حد ذاتها التمييز ضمن حدود القرار للتصوير عفم (<10 نانومتر المسافة). ومع ذلك، فإن جزء من المجمعات المحددة التي تمثل أجبل من الجزيئات المتوقفة في الآفة ويشير الاعتراف الآفة، تعتمد بقوة على ما إذا كانت الآفة وضعت 3 'أو 5' من الفقاعة ( الشكل 3 ) 9 .

من جزء المجمعات في موقع معين (المنطقة تحت ذروة تناسب غاوس مقابل المنطقة من الخلفية ملزمة بشكل غير محدد)، تم حساب خصوصية، S، أوفرب و شد لأنواع الآفة التحقيق اثنين (انظر بروتوكول 3.2 أعلاه). ل أوفرب، تحميل 5 'من موقف الآفة أسفرت عن خصائص أعلى (S ب، F5 ~ 200 و S ب، CPD5 ~ 400) من تحميل 3' من الآفة (S B، F3 و S B، CPD3 ~ 100) ل كلا أنواع الآفة. ل شد، والمجمعات التي تحتوي على شد فقط (الفئة 2 في الشكل 2 ) والمجمعات التي تحتوي على شد وكذلك هيليكاس تفعيل المشارك عامل البروتين p44 (الفئة 3 في الشكل 2 ) وتميز كما ديسرإبيد في القسم السابق. لم تصنف قمم البروتين من الفئة 2 (شد فقط، هيليكاس الخاملة) بشكل تفضيلي في مواقع الآفة مستقلة عن ما إذا كانت محملة 5 'أو 3' ومستقلة عن نوع الآفة (لا تظهر البيانات). على النقيض من ذلك، أظهرت توزيعات الموقف ل شد / P44 (الفئة 3) المجمعات تعزيز ملزمة في الآفات F لتحميل 5 'من الآفة (S شبد / P44، F5 ~ 300 مقابل S شد / P44، F3 ~ 100) ولكن في كبد الآفات للتحميل 3 'من الآفة (S شد / P44، CPD3 ~ 600 مقابل S شد / P44، CPD5 ~ 100، الشكل 3 ). لأن أوفرب و شد هي هليكاسيس 5'إلى 3 '، توفر هذه البيانات معلومات حول ما إذا كانت المجمعات متوقفة عبر التفاعلات مع الآفة داخل حبلا سدنا أنها ترانزلاتوكيت على (حبلا ترانزلوكاتد، لتحميل 5' من الآفة)، أو داخل العكس، حبلا غير ترانزلاتد (لتحميل 3 'من الآفة). يظهر المفهوم بشكل تخطيطي في

التحقيق في التغييرات التوافقية على تحديد الآفات بواسطة شد

قياس الانحناء التي أدخلت على الحمض النووي في موقع المجمعات ملزمة من الصور عفم (انظر بروتوكول 3.3 أعلاه) يمكن أن تكشف عن معلومات هامة عن التغيرات التوافقية المعقدة. تم قياس زوايا منحنى الحمض النووي ل أركايل شد 5 ، والتي لا تتطلب البروتين المشارك عامل التفاعل لنشاط هيليكاس. في هذه الدراسات، تم العثور على الآفة فلوريسئين ديريكتلي في سياق فقاعة الحمض النووي لتعزيز تحميل البروتين في الآفة، في ~ 30٪ من طول جزء الحمض النووي. ويبين الشكل 4 جاوس يناسب دنا توزيعات زاوية الانحناء التي تم الحصول عليها لمجمعات البروتين في مواقع الحمض النووي غير محددة (غير التالفة) وفي ~ 30٪ من طول الحمض النووي، بما يتفق مع شد ملزمة في موقف الآفة فلوريسئين (مجمعات محددة). تظهر البيانات زاوية انحناء متوسطة من ~ 50 درجة للمجمعات غير محددة مقابل ~ 65 درجة لمجمعات محددة. وكان هذا التحول زاوية الانحناء الحمض النووي يعتمد على وجود أتب أو أتبس، مشيرا إلى أن أتب (إعادة) ملزمة ولكن ليس التحلل كان ضروريا لإعادة ترتيب التوافقية 5 .

شكل 1
الشكل 1: إعداد ركائز الحمض النووي. يتم إدخال فجوة سدنا في دنا البلازميد دائري عن طريق ركل البلازميد (هنا مع نيكاز N.BstNBI) في كلوومواقع متباعدة سيلي وإزالة سدنا المغلقة تمتد عن طريق الترشيح الطرد المركزي بعد زعزعة الحرارة في وجود فائض من قليل النوكليوتيد التكميلي. ويمكن بعد ذلك أن يكون أوليغونوكليوتيد محددة تحتوي على ميزة الاختيار صلب و ليغاتد في منطقة الفجوة. وأخيرا، الهضم مع الانزيمات تقييد (هنا مع سبي و بسبكي) النتائج في الركيزة الحمض النووي الخطي مع ميزة الهدف في موقف معروف على وجه التحديد (هنا في 30٪ من طول جزء الحمض النووي). اختبارات المقايسة تسمح لاختبار الخطوات الفردية (يظهر تحت) عبر الاغاروز هلام الكهربائي (السهم الأسود يشير إلى 3000 بب). النعناع يمكن اختبارها من قبل التنقل الكهربي المتغير من النيكل، الحمض النووي دائري استرخاء (السيطرة على الرقيق، حارة 2) مقابل البلازميد سوبيركويلد (حارة 1). ويمكن اختبار الثغرات الكاملة للحمض النووي وكذلك الإدراج اللاحق للأوليغو المحدد عن طريق الهضم مع إنزيم التقييد الذي يقطع في منطقة الفجوة (هنا: شوي، فيالممرات 2 و 4 و 6) حتى أن عدم وجود شق الحمض النووي يشير تشكيل الفجوة (الممرات 1،2 نك الحمض النووي، والممرات 3،4 الحمض النووي غاب) وإعادة شق متوقفة يشير إلى إدراج أوليغو محددة (الممرات 5،6) . الركيزة الخطي النهائي الذي يحتوي على ميزة محددة يمكن تنقيته من هلام بعد الاغاروز هلام الكهربائي واختبارها للتجانس والنقاء عبر التصوير عفم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تمييز الأنواع المعقدة المختلفة من أحجام عفم. ( A ) عفم صورة شد / P44-دنا (السهم الرمادي) و شد-دنا (السهم الأسود) المجمعات. ( ب ) أمثلة من ثلاثة أنواع مختلفة من المجمعات دنا ملزمة، وتفسر على أنها P44 أو مجرد البنية الفوقية الحمض النووي (الطبقة 1)،شد (الفئة 2، الإطار الأسود)، و شد / p44 (الفئة 3، الرمادي الإطار) المجمعات على أساس وحدات التخزين عفم (يظهر على اليمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل (3): استراتيجيات التعرف على الآفات مختلفة من هيليكاسيس نخر النواة بدائية النواة وحقيقي النواة. اعتراف الآفة نقل الحمض النووي المختصة من قبل هليكاسيس نر أوفرب و شد (في معقدة مع هليكاس تفعيل عامل مشارك p44) يتطلب تحميل البروتينات في منطقة الحمض النووي غير المنضبطة (فقاعة الحمض النووي). ثم تتحرك البروتينات في 5 'إلى 3' الاتجاه على طول حبلا سدنا التي تم تحميلها. التعرف على الآفة الحمض النووي (هنا: كبد) من قبل هيليكاسيس إما على حبلا ترانزلاتوكاتد (للتحميل في 5 'فقاعة) أو على العكس، غير ترانزلاتوكات حبلا (فوr تحميل في 3 'فقاعة) النتائج في توقف الحمض النووي المتوقفة. في توزيعات الموقف هذا يظهر كذروة (خطوط تناسب غاوس)، مما يدل على تعزيز ملزمة في موقف الآفة (في ~ 30٪ من طول الحمض النووي ل ركائز الحمض النووي هو مبين هنا). و بدائية النواة نر هيليكاس أوفرب ونظرية حقيقية النواة شد تظهر استراتيجيات مختلفة من الاعتراف كبد الآفة التي تشير إلى تفضيلات حبلا الحمض النووي مختلفة. على وجه التحديد، يتم التعرف على الآفات كبد على حبلا ترانزلاتوكاتد من قبل أوفرب، ولكن بشكل تفضيلي على العكس، حبلا غير ترانزلاتوكد بواسطة شد. الشكل المعدل من المرجع 9 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: التغيرات التوافقية في المجمعات دنا شد على تحديد الآفة. توزيعات زوايا منحنى الحمض النووي التي يسببها شد تشير إلى التغيرات التوافقية في المجمعات الحمض النووي للبروتين في آفة فلوريسئين. واعتمدت إعادة الترتيب هذه على وجود أتب (B) أو أتبس (C). ( A ) في غياب أتب، زوايا منعطف غير محددة (الرمادي) وزوايا الانحناء في موقع الآفة (زوايا منحنية محددة، أسود) متشابهة وتناسب منحنى غاوس مع مركز في ~ 50 درجة. ( B ، C ) في وجود أتب أو أتبس، توزيع زاوية الانحناء محددة (أسود) يظهر تحولا كبيرا (P = 2.5 × 10 -7 ) إلى زاوية الانحناء المتوسط ​​من ~ 65 درجة. كان هذا الانحناء الحمض النووي في موقع الآفة مستقلة عن نوع الآفة (كبد أو فلوريسئين أدوكت) أو وجود أو عدم وجود فقاعة دنا 5 . واستنسخ الشكل من المرجع 5 . يوضح الملحق في (C) كيف تم تحديد زوايا الانحناء (180 ° -β).ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

رقم تسلسل وصف
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 		الأسفل
2 / فوس / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		F / 5 'فقاعة
3 / فوس / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		F / 3 'فقاعة
4 / فوس / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		CPD / 5'bubble
5 / فوس / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		CPD / 3'bubble
6 / فوس / غسا تغكتسغتكتاغاكتكف
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		F / فقاعة

الجدول 1: أوليغونوكلأوتيدس الحمض النووي لإعداد الركيزة الحمض النووي. كل أوليغونوكلأوتيدس هي 48 نانوغرام طويلة وتم الحصول على خيوط أعلى (أوليغونوكلأوتيدس 2-6) فوسفهوريلاتد في نهاية 5 'لربط في الحمض النووي المنبثقة (انظر بروتوكول 1.1). F = فلوريسئين ثيمين مقتبس، ت = سيكلوبوتان بيريميدين (ثيمين) ديمر (كبد)، والمناطق غير التكميلية (مناطق فقاعة الحمض النووي تشكيل). تم الحصول على F تحتوي على أوليغونوكلأوتيدس من تقنيات الحمض النووي المتكاملة (إدت)، وقدمت كبد تحتوي على أوليغونوكلأوتيدس تفضلت من قبل مختبر توماس كاريل (لودفيغ ماكسيميليان جامعة ميونيخ، ألمانيا).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحليلات إحصائية عفم من المواقف ملزمة من البروتينات على شظايا الحمض النووي طويلة التي تحتوي على مواقع مستهدفة محددة يمكن أن تكشف عن تفاصيل مثيرة للاهتمام حول الاستراتيجيات المحددة المستخدمة من قبل البروتين للتعرف على هذه المواقع 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . لتفسير توزيعات الموقف الناتجة، فإن مواقف الأهداف في الحمض النووي تحتاج إلى أن تعرف على وجه التحديد. ويتحقق ذلك عن طريق إدخال مواقع محددة في مواقع تسلسل محددة جيدا في دنا البلازميد دائري وقطع جزء من الحمض النووي بما في ذلك هذا الموقع المحدد، وذلك باستخدام تقنية انزيم تقييد. في تحليلات صورة عفم من المواقف ملزمة البروتين، فقط شظايا الحمض النووي مع أطوال الصحيحة (بما يتفق مع كامل طول قطعة قطع) يمكن أن تدرج لأن فقط لهذه، موقع الموقع المستهدف هو معروف. ومن الجدير لاتينغ أن الإجراء إعداد وصفها هنا ينتج ركائز الحمض النووي الخطي مع اثنين من جزء لا يمكن تمييزه ينتهي. ويمكن بالتالي توزيع توزيعات الموقع وبالتالي يقاس فقط من طول الحمض النووي x 0 (البروتينات ملزمة في شظايا دنا ينتهي) إلى 0.5 x طول الحمض النووي (البروتينات ملزمة في وسط شظايا). وعلاوة على ذلك، بالنسبة للمواقع المستهدفة التي لا تقع بالضبط في وسط الركيزة، وهذه التوزيعات تحتوي دائما على خلفية صغيرة من البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد على نفس المسافة من نهاية الحمض النووي الأخرى. ومع ذلك، فإن تركيب منحنى غاوسي على التوزيع المطور على ارتفاع الخلفية المتوسطة (البروتينات المرتبطة بشكل غير محدد، الشكل 3 ) حسابات لهذه المجمعات. بدلا من ذلك، واحدة من الحمض النووي ينتهي يمكن وصفها، على سبيل المثال مع قمم حجم صغير من بنية ثانوية تشكيل سدنا يتدلى 24 . حدود القرار النموذجية لهذه التحليلات الموقف هي في حدود 100 أضعاف تفضيل سي الهدفتي على موقع غير محدد ملزمة. وبالإضافة إلى ذلك، شظايا الحمض النووي ينتهي لا تشكل مواقع دسدنا غير محددة ولكن بدلا من ذلك تمثل فواصل دسدنا. وغالبا ما ترتبط بروتينات إصلاح الحمض النووي بهذه الأجزاء من الشظايا المزعزعة، بالإضافة إلى المواقع المستهدفة المستهدفة داخليا. يمكن الكشف عن نهاية الحمض النووي ملزمة من قبل تحليلات عفم ويمكن أن توفر معلومات هامة عن وظيفة البروتين. إذا كان نهاية الحمض النووي ملزمة ليست بؤرة الاهتمام، ولكن يمكن حذف هذه المواقف بسهولة من توزيعات الموقف من خلال بدء المؤامرات في موقف> 0 (على سبيل المثال ، هنا 0.02 أطوال الحمض النووي).

واحدة من مزايا معينة، في الواقع، تعريف، الملكية المشتركة لتقنيات جزيء واحد هو حل الفردية، دول مختلفة موجودة في العينة، والتي يمكن أن تمتلك خصائص وأنشطة مختلفة إلى حد كبير. حتى في الحالات التي تكون فيها الأنواع المحددة من الفائدة قد تكون نادرة فقط في العينة، وبالتالي هذه النهج تسمحالتركيز بشكل منفصل على هذا النوع من المساهمات التي سوف تكون مقزومة في قياس الفرقة. لعينات البروتين، على سبيل المثال، والتصوير عفم يسمح التمييز المباشر بين أنواع مختلفة من المجمعات البروتين على أساس حجم مجمع، إذا كانت الأحجام من البروتينات الفردية تختلف بما فيه الكفاية (حدود القرار النموذجي حوالي 20 كيلو دالتون) 1 ، 4 ، 6 ، 7 ، 9 ، 12 . يمكن معايرة نظم عفم للسماح بترجمة الأحجام المقاسة إلى البروتين الوزن الجزيئي (بروتوكول 3.1.3.1) 4 ، 8 ، 19 ، 20 . بدلا من ذلك، تم استخدام معايير البروتين مع الأحجام المعروفة كمرجع مباشر في الصور 1 ، 6 . في النظام يركز على هنا، يمكن تحديد المواقف ملزمة على الحمض النووي بشكل منفصل ل هيليكاس غير نشط شد أحادية و هيليكاس هيتيروديميريك النشطة شد / p44 المجمعات. ربط تفضيلي لموقع الآفة في موقف محدد جيدا في الحمض النووي أشار الحمض النووي الاعتراف الآفة من قبل مجمع البروتين. منذ بروتين التحميل والمواقع الآفة فصل مكانيا، كان نقل الحمض النووي شرطا أساسيا لازما للتعرف على الآفات في ركائز الحمض النووي المستخدمة هنا. فقط هيتيروديمريك شد / P44 المجمعات كانت قادرة على نقل الحمض النووي ( الشكل 3 )، بما يتفق مع نتائج من فحوصات النشاط هيليكاس 9 . تحليل حجم عفم يمكن بالتالي تقديم معلومات هامة عن الأنشطة التفاضلية من أشكال معقدة البروتين المختلفة.

أدى التفاعل الآفة والاعتراف من قبل هيليكاس نشط شد / P44 معقدة في تعزيز ملزمة في الموقع المستهدف بسبب توقف من هيليكاس نقل ( الشكل 3 الشكل 3 )، وهذه النتيجة تشير إلى أن الانزيم بالكشف عن فلوريسئين تفضيلي على حبلا ترانزلاتوكاتد ولكن كبد تفضيلي على العكس، حبلا غير ترانزلاتوكاتد. و بروكاريوتيك نر هيليكاس أوفرب، في المقابل، معترف بها بشكل تفضيلي كل من فلوريسئين و كبد الآفات عند تحميل 5 'من الآفة، أي على حبلا ترانزلوكاتد ( الشكل 3 ). ويمكن فهم هذه الاختلافات المميزة في خصائص التعرف على الآفات من الخصائص الهيكلية المختلفة لهليكاسيس اثنين. يتفاعل أوفرب مع الأهداف المحتملة طن الحمض النووي عن طريق بقايا الأحماض الأمينية في الداخل من β دبوس دبوس ميزة في الانزيم وراء الذي ترانزلوكاتد حبلا من المرجح الخيوط 16 ، 25 . شد، من ناحية أخرى، يستضيف مسام صغير على مقربة من مجموعة من الحديد والكبريت (فس) 26 . حبل الحمض النووي ترانزلاتوكات المرجح المواضيع من خلال هذا المسام 26 . الآفات السائبة مثل فلوريسئين قد المماطلة هليكاس نقل عن طريق التفاعلات مع المخلفات داخل هذا المسام، في حين يمكن تحديد الآفات كبد أقل ضخمة بسهولة أكبر عن طريق التفاعلات مع الكتلة فس. في نظام بدائية النواة، ويعتقد جزيئين من أوفرب أن تشارك في البحث عن الموقع المستهدف في متغاير تيتيراميك أوفرا 2 -UvrB 2 المعقدة، التي كل من مونومرات أوفرب اثنين قادرين على التحقيق في حبلا الحمض النووي مختلفة 27 . شد في النواة الحقيقية نر موجود على الأرجح كنسخة واحدة فيتعترف تفيه معقدة التعقيد. وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى المرونة في نهج التفاعل الآفة من انزيم حقيقية النواة لتمكين الاعتراف الطيف الموقع المستهدف كبير جدا من نظام إصلاح نر.

لأن محددة (الهدف الموقع ملزمة) والمجمعات غير محددة يمكن تمييزها في الصور عفم على أساس مواقفها على الحمض النووي، ويمكن تحليل هذه الأنواع المعقدة المختلفة بشكل منفصل ومقارنتها. جزيء واحد عفم هو واحد من عدد قليل جدا من النهج التي توفر الوصول إلى الخصائص الهيكلية من المجمعات البروتين ملزمة بشكل غير محدد إلى الحمض النووي بسبب طبيعتها في كثير من الأحيان عابرة أو متغيرة. هنا، تم تصور التغييرات التوافقية على التعرف على الموقع المستهدف وتتميز في شد القصبة على أساس الانحناء التي أدخلت في الحمض النووي من قبل الانزيم. كشفت بيانات عفم تحول صغير ولكن متميز، كبير في زوايا منحنى الحمض النووي ل شد ملزمة في موقع الآفة مقابل شد ملزمة إلى الحمض النووي غير محددة 5 . بتكوين جزئيوالتغيرات في البروتينات الحمض النووي ملزمة على تحديد الموقع المستهدف المرجح أن يؤدي إلى توظيف إندونوكليسيس نر (زبغ و زف في النواة الحقيقية نر) التي تنفذ استئصال امتداد قصير من سدنا تحتوي على الآفة. ومن المثير للاهتمام، وهذا التحول، وبالتالي إعادة ترتيب المطابقة المطلوبة ملزمة من أتب إلى الانزيم (ولكن ليس التحلل). تم الإبلاغ عن نهج مماثل من أتب-ريبيندينغ على تحديد الموقع المستهدف والتعيين اللاحق من نوكلياز أوفرك ل أوفرب في بدائية النواة نر 28 ، 29 .

وباختصار، كشفت عفم التصوير جزيء واحد اختلافات طفيفة في التعرف على الموقع المستهدف من قبل هيليكاسيس نخر النواة بدائية النواة وحقيقية النواة. مرة واحدة وقد تم تحديد الآفة المستهدفة من قبل الإنزيمات، فإنها تشترك في استراتيجية مماثلة لتجنيد إندونوكليسيس نر عن طريق أتب ملزمة الناجم عن إعادة ترتيب الترتيبات بشكل انتقائي في الآفة. تقنية عفم في كومبيناتيون مع دقيق تصميم الركيزة الحمض النووي لتقليد الخصائص الأساسية للنظام التحقيق يمكن بالتالي تقديم نظرة ثاقبة تفاعلات الموقع المستهدف ليس فقط إصلاح الحمض النووي ولكن الحمض النووي أنظمة البروتين ملزمة بشكل عام. المعلومات الهيكلية على كل من المجمعات المحددة وغير محددة مع القرارات في نطاق نانومتر منخفضة (على المستوى الجزيئي، محدودة بواسطة التحقيق عفم) يمكن أن تسهم بشكل كبير في فهم الآليات المعنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

PUC19N، أوليغونوكلأوتيدس التي تحتوي على كبد، و p44 تم توفيرها من قبل صمويل ويلسون، كوربينيان هيل وتوماس كاريل، و غودرون ميشلز وكارولين كيسكر، على التوالي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من دويتشه فورسشونغزجيمينشافت (دفغ) FZ82 و تي-671/4 لتكنولوجيا المعلومات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

علم الوراثة، العدد 123، المجهر القوة الذرية (عفم)، والتفاعل الحمض النووي البروتين، وإصلاح الحمض النووي، وإصلاح استئصال النوكليوتيدات (نر)، والتعرف على الآفات الحمض النووي، تعديل الحمض النووي، عفم إعداد العينات، تحليل حجم عفم، دنا تحليل موقف ملزم.
القوة الذرية المجهري التحقيقات من الحمض النووي الآفة الاعتراف في إصلاح ختان النوكليوتيدات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter