Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Atomic Force Microscopy Undersøgelser af DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
* These authors contributed equally

Introduction

Atomisk kraftmikroskopi (AFM) er en kraftfuld teknik til analyse af protein-DNA-interaktioner 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Det kræver kun lave mængder prøveemne til direkte at visualisere heterogene prøver med en opløsning på det enkelte molekylniveau. Heterogenitet kan skyldes forskellige konformationelle eller oligomere tilstande af et protein. Specielt kan proteinkomplekser i forbindelse med protein-DNA-prøver vise forskellige støkiometrier og / eller konformationer induceret ved DNA-binding i almindelighed eller binding til et specifikt målsted inden for DNA. Heterogene prøver kan også indeholde to (eller flere) forskellige slags proteiner og forskellige proteinkomplekserFormer ( fx bestående af kun én type protein versus heteromere komplekser) kan interagere forskelligt med DNA. De undersøgelser, der diskuteres her, udnytter AFM-billeddannelse i luft på statiske, tørrede prøver af DNA-reparationsproteiner bundet til lange (~ 900 basepar, bp) DNA-fragmenter, der indeholder en læsion, hvilket repræsenterer et mål for disse proteiner. Den høje molekylære opløsning af AFM tillader sondringen mellem forskellige typer af proteinkomplekser og for at bestemme bindingspositionerne af proteinerne på DNA-fragmenterne. Det er vigtigt, at læsionerne indføres i DNA-substraterne på veldefinerede positioner. Fordi positionen af ​​læsionsstedet i DNA'et er kendt, giver distributionerne af proteiner bundet til DNA indsigt i (forskellige) læsionsgenkendelsesegenskaber af (forskellige) proteinkomplekser, fx hvor godt de genkender en bestemt type læsion (sammenlignet med Til ikke-beskadiget DNA) 2 , 3 , , 5 , 6 . Deres positioner på DNA'et tillader også sondringen mellem proteinkomplekser bundet specifikt ved læsionerne og komplekserne bundet uspecifikt andetsteds på DNA'et. Separat karakterisering af disse forskellige komplekse typer (komplekser bundet specifikt til læsionen versus uspecifikke komplekser) kan afsløre potentielle konformationsændringer i komplekserne induceret ved målstedidentifikation.

DNA-reparationsproteinerne fokuseret på her er helicaser, der er ansvarlige for læsionsgenkendelse i nukleotid-excisionsreparationen (NER) -vejen. I bakterier opnås NER ved proteinerne UvrA, UvrB og UvrC. UvrA er ansvarlig for indledende læsionsføler i et UvaA 2 / UvrB 2 DNA-scanningskompleks. Ved læsionsverifikation af UvrB omdanner dette kompleks til monomerisk UvrB bundet på læsionsstedet, og dette specifikke kompleks kan derefter rekruttere pRokaryotisk NER endonuclease UvrC. UvrC udskiller en kort (12-13 nt) strækning af enkeltstrenget DNA (ssDNA) indeholdende læsionen. Den manglende strækning bliver derefter genopfyldt af DNA-polymerase. Endelig forsegler DNA-ligase den nyligt syntetiserede strækning med det originale DNA 9 , 10 . I eukaryoter er de fleste proteiner fra NER-kaskaden en del af det store multimeriske transkriptionsfaktor IIH (TFIIH) kompleks. Efter indledende læsionssensor via det trimeriske CEN2-XPC-HR23B-kompleks rekrutteres TFIIH til DNA-målstedet. Når XPD i komplekset verificerer tilstedeværelsen af ​​en NER mållæsion, rekrutteres de eukaryote NER endonukleaser XPG og XPF til at punkere en kort (24-32 nt) strækning af ssDNA indeholdende læsionen 9 , 10 . Her blev specifikt undersøgt helikaserne UvrB og XPD fra henholdsvis prokaryotisk og eukaryotisk NER. Disse helikaser kræver en uparget region iDNA (en DNA-boble) til tråd på en af ​​de to DNA-enkeltstrenger og efterfølgende at omplacere langs denne streng brændt af ATP-hydrolyse. Ud over DNA-læsionerne blev der således introduceret en DNA-boble i substraterne, der fungerer som ladningssted for proteinerne.

Fremgangsmåden til fremstilling af specifikke lesions-DNA-substrater er blevet beskrevet tidligere 11 . Det kræver en cirkulær DNA-konstruktion (plasmid) med to tæt adskilte restriktionssteder for en nickase. I forbindelse med denne undersøgelse blev plasmidet pUC19N (2729 bp) anvendt (skabt af S. Wilsons laboratorium, NIEHS). Dette plasmid indeholder tre tæt adskilte restriktionssteder for nickase Nt.BstNBI, der rammer en 48 nukleotid (nt) strækning. Efter inkubation med nickasen kan strækningen af ​​ssDNA mellem disse steder fjernes og erstattes af et oligonukleotid indeholdende et hvilket som helst target-træk. Efter hvert trin testes fuldstændig enzymatisk fordøjelse via agarosegelelektroforese. Nikkel-cirkulært DNA kan skelnes på grund af dets lavere elektroforetiske mobilitet sammenlignet med det oprindelige supercoulerede plasmid. Gapping af DNA'et og udskiftning af den fjernede strækning med det specifikke substratoligonukleotid kan evalueres via fordøjelse med et restriktionsenzym, som udelukker substratet udelukkende inden for området mellem nicks. Linearisering af det cirkulære plasmid af enzymet vil således blive undertrykt for gapped DNA og genoprettet efter indsættelse af det specifikke oligonukleotid. Endelig tillader to endonuklease restriktionssteder (ideelt single cutters) genereringen af ​​et lineært DNA-substrat med længde som ønsket og med det specifikke målsted i en defineret position såvel som en DNA-boble i en afstand fra læsionen, enten i 5 'Eller 3' retning.

Anerkendelse af læsionerne ved hjælp af NER-helicaser kan undersøges via AFM-billeddannelse. Stalled DNA-translokation af helicaserne ved tHans læsionssted er synligt som en top i proteinpositionsfordelingen på DNA'et og indikerer læsionsgenkendelse. Fordi DNA-translokation af disse helicaser desuden er retningsbestemt, med 5'-til-3'-polaritet angiver afhængigheden af ​​læsionsgenkendelse på positionen af ​​læsningsstedet (DNA-boblen opstrøms eller nedstrøms for læsionen) også, om læsionen fortrinsvis er genkendt På den translokerede eller på den modsatte ikke-translokerede ssDNA-streng 5 , 9 . I de følgende afsnit vil de anvendte metoder blive introduceret og væsentlige resultater fra disse eksperimenter vil kort diskuteres. Det er vigtigt, at analogt med det eksemplariske arbejde med DNA-reparation vist her, kan AFM-billeddannelse anvendes til undersøgelsen af ​​forskellige DNA-interagerende systemer, såsom DNA-replikation eller transkription 8 , 12 , 13 , 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøveforberedelse

  1. Fremstilling af DNA-substrater 11
    1. Generering af et ssDNA-hul i plasmidet
      1. Komplet fordøjes en prøve af plasmidet (her: modificeret pUC19, pUC19N) i et reaktionsrør med en passende nickase (her: Nt.BstNBI) efterfulgt af enzymvarmeinaktivering under anvendelse af betingelser ifølge producentens protokol (se figur 1 for en skematisk præsentation). Start med ~ 50 μl og ~ 500 nM plasmid for et tilstrækkeligt udbytte.
      2. Verificér plasmidnicking ved agarosegelelektroforese på fortyndede prøver (~ 20 nM) 15 . Brug handsker til beskyttelse mod DNA-bindingsfarvestoffet, der anvendes til DNA-visualisering.
        BEMÆRK: Forskellige elektroforetiske mobiliteter tillader sondring mellem nicked (afslappet) og supercoiled cirkulært plasmid DNA ( Figur 1 ).
      3. Fjern den indsnævrede ssDNA-strækning (mellem nikkestedene) fra plasmidet vedInkubation med et ~ 10 gange overskud af det komplementære oligonukleotid (oligonukleotid 1 i tabel 1 ), omrystning ved 300 omdr./min. I 30 minutter nær oligonukleotidets smeltetemperatur (her: 68 ° C for pUC19N) i en varmeblok ( figur 1 ).
      4. Separat gapped plasmidet fra de mindre DNA-fragmenter ved anvendelse af et 50 kDa molekylvægt afskåret (MWCO) filter ved centrifugering i 10 minutter ved 10.000 xg i en bordcentrifuge ( Figur 1 ). For at ekstrahere det koncentrerede DNA fra filteret, inverter filteret og indsæt i et nyt reaktionsrør på 1,5 ml. Centrifuge i 3 minutter ved 1000 x g.
      5. Påfyld den resulterende koncentrerede DNA-prøve til 500 μl med deioniseret, filtreret vand, tilsæt et yderligere ~ 5 gange overskud af komplementært oligonukleotid og gentag trin 1.1.1.3 og 1.1.1.4 mindst 3 gange.
      6. Test for fuldstændig gapping af DNA'et ved inkubering med et egnet restriktionsenzym (her: XhoI eller BglII) under anvendelse af conditiOns ifølge fabrikantens beskrivelse. Brug fortyndede (nicked versus gapped) DNA-prøver (~ 20 nM). Kør en agarosegelelektroforese for at skelne mellem lineariseret plasmid (indeholdende ikke ssDNA-mellemrum) og ikke-inciseret DNA (gapped DNA) ved anvendelse af nicked-DNA'et som positiv kontrol (inklusiv en DNA-stige til reference, figur 1 ). Brug handsker.
    2. Genopfyldning af mellemrummet med modificerede ssDNA-oligonukleotider
      1. Anneal gapped plasmidet via inkubation med et 25 gange overskud af et 5'-phosphoryleret oligonukleotid, der indeholder det eller de valgte specifikke målsted (er), inkubering ved ~ 45 ° C i 4 timer ( figur 1 ). Brug her 48 nt ssDNA, der indeholder en læsion, enten et fluoresceinadduceret thymin eller en cyclobutanpyrimidindimer (CPD), og desuden en kort (8 nt) ikke-komplementær sekvens til fremstilling af DNA-bobler (se tabel 1 ).
      2. Kovalent forbinder den udglødte insert til plasmidet ved incubaTion med T4 DNA ligase natten over ved stuetemperatur ifølge producentens protokol ( figur 1 ). Til denne reaktion tilsættes ATP indeholdende koncentreret bufferbeholderopløsning for at fremstille egnede bufferbetingelser for ligasen ( f.eks . Brug UvrB reaktionsbuffer: 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM ATP).
      3. Test for indsættelse af det specifikke oligonukleotid i gapped plasmidet ved fordøjelse af fortyndede prøver med et egnet restriktionsenzym (samme som i 1.1.1.6) i overensstemmelse med producentens protokol efterfulgt af en agarosegelelektroforese (som i 1.1.1.6, Figur 1 ).
    3. Fremstilling af lineært DNA-substrat
      1. Fordøj det modificerede plasmid-DNA med restriktionsenzymer (ideelt med et enkelt restriktionssted i plasmidet) under anvendelse af betingelser som anbefalet af producenten ( figur 1 ). Dette trin producerer lineære fragmenter indeholderIndsætte den indsatte ændring i en defineret position. Her bruger du SspI- og BspQI-skæring i positioner 613 og 255 bp opstrøms og nedstrøms for indsatsen, hvilket resulterer i et 916 bp DNA-fragment indeholdende det specifikke læsionssted ved ~ 30% af DNA-længden.
        BEMÆRK: For AFM-billeddannelsesforsøg som beskrevet her er DNA-fragmenter med længder mellem ~ 200 bp og ~ 2.000 bp egnede substrater.
      2. Isoler målfragmentet via agarosegelelektroforese og gelekstraktion ved anvendelse af et kommercielt kit. Brug handsker til beskyttelse.
      3. Eventuelt klippe agarosegel med en skalpel for at adskille DNA-stigen og fortyndede prøvebaner (første to baner) fra banerne indeholdende det koncentrerede DNA, som skal oprenses. Udsæt kun geldelen med de første to baner til UV-bestråling ved kun at placere denne del af gelen på et UV-bord.
        1. Skær båndet svarende til det ønskede fragment med en skalpel. Genforene de to geldele (fra UV-fanenle). Brug positionen af ​​det udskårne bånd fra den fortyndede prøve som orientering for positionen af ​​båndet af det ønskede DNA-substrat. Redegør for den højere koncentration ved at skære lidt bredere skiver ud end for den fortyndede kontrol.
          BEMÆRK: Fordi der blev undersøgt anerkendelse af UV-læsioner, blev indførelsen af ​​yderligere UV-læsioner via UV-bestråling omhyggeligt undgået i DNA-substratet ved denne fremgangsmåde.
      4. Beregn DNA-koncentrationen c fra absorptionen ved 260 nm målt ved et UV-Vis-spektrofotometer under anvendelse af Lambert-Beer's lov med en dobbeltstrenget DNA (dsDNA) gennemsnitlig molær ekstinktionskoefficient på ε 260nm ~ 6.700 M - 1 cm - 1 pr. Bp:
        ligning
        Hvor L er sti længden (målekammerlængde, typisk 1 cm).
    </ Li>
  2. Ekspression og oprensning af proteiner
    1. Rekombinant udtrykker UvrB i E. coli og renser proteinet via standard chitin-beadsaffinitet 15 og størrelseseksklusionskromatografi 15 som tidligere beskrevet 16 .
      BEMÆRK: UvrB genet fra Bacillus caldotenax blev klonet ind i pTYB1 vektoren.
    2. Express XPD i E. coli og rens proteinet via standard nikkel IDA affinitet 15 og størrelseseksklusionskromatografi 15 efterfulgt af anionbytningskromatografi 15 som tidligere beskrevet 17 .
      BEMÆRK: Genet for Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum gruppe D protein (XPD) blev klonet ind i pBADM11 vektoren. C. thermophilum p44 var en venlig gave fra Caroline Kiskers laboratorium, udtrykt og puriFied som beskrevet 17 .

2. AFM-eksperiment

  1. Prøveforberedelse
    1. Eventuelt præinkuberer DNA-substratet ved 65 ° C i 10 minutter i en varmeblok for at fjerne mulige mikrosaltkrystaller, der kan have dannet under opbevaring i køleskabet.
    2. Forbered reaktionsbuffer (er) ved en 10 gange koncentration (10x buffere).
      BEMÆRK: XPD reaktionsbuffer ved 1x koncentration indeholdt 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 2 mM ATP; 1 x UvrB reaktionsbuffer indeholdt 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og 1 mM ATP.
    3. Prækinkuber proteiner ved en højere koncentration i egnede inkubationsbetingelser for at forbedre kompleks dannelse. Fortynd et lille volumen ( f.eks . 1 μl) af de enkelte proteiner i 1x proteinreaktionsbuffer til den ønskede koncentration og bland små volumener ( f.eks . 1 μl) tHan individuelle proteinopløsninger i et 0,5 ml reaktionsrør.
      1. Placer røret i en varmeblok for inkubationstemperaturer højere end stuetemperatur. Vælg et koncentrationsforhold afhængigt af den forventede komplekse støkiometri, enten ækvimolære eller tilsvarende koncentrationer. Her inkuberes 1 μl XPD (20 μM i 1 x XPD reaktionsbuffer) og 1 μL p44 (20 μM i 1x XPD reaktionsbuffer) ved 10 μM hver i 10 minutter ved 37 ° C.
    4. Inkuber prøver ved passende protein- og DNA-koncentrationer i proteinreaktionsbuffer i et 0,5 ml reaktionsrør. Brug her 500 nM UvrB eller 1 μM XPD + 1 μM p44 og 100 nM DNA. Pipette små volumener for at spare materiale, f.eks . 0,25-0,5 μL protein (fortyndet til en 10 gange inkubationskoncentration) og DNA i et totalt volumen på 2,5-5 μl 1x proteinreaktionsbuffer. Her inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C i en varmeblok. Spin ned i et reaktionsrør kort (~ 1 s) i en bordcentrifugE for at sikre blanding af små mængder.
  2. Prøveaflejring
    1. Forbered et glimmer substrat: Skær et ca. 1 x 1 cm 2 stykke glimmer fra større strimler ved hjælp af en skalpel. Strimle de øverste lag af det flerlagede glimmer-mineralstykke ved hjælp af klæbebånd for at afsløre en ren, flad og atomisk glat underlagsoverflade.
      BEMÆRK: Glimmerstykket kan genbruges til flere eksperimenter ved at fjerne yderligere lag (er).
    2. Forbered AFM-aflejringsbufferen med deioniseret, filtreret vand, fx 25 mM HEPES pH 7,5, 25 mM Na-acetat, 10 mM Mg-acetat. Filtrer gennem et 0,02 μm sprøjtefilter.
      BEMÆRK: Divalente kationer i aflejringsbufferen tjener til at chelatere de negativt ladede DNA-molekyler til glimmeroverfladen, som også er negativt ladet ved neutral pH. Hvis den relativt høje Mg2 + ionkoncentration i aflejringspufferen udgør et problem for et bestemt protein-DNA-system, alternativt,Glimmeroverfladen kan forhåndsbelastes med aminogrupper under anvendelse af silatranbaseret kemi for at tilvejebringe positive overfladeafgifter for forankring 18 . Prøveaflejring kan derefter udføres i en buffer, der indeholder ingen eller kun lave mængder af divalente kationer.
    3. Fortynd prøven (se 2.1) til øjeblikkelig deponering på glimmer i aflejringsbuffer. Indsæt et lille volumen (her: 20 μL).
      BEMÆRK: Fortyndingsfaktorer afhænger af prøvekoncentrationen. Her udtyndes prøver 50-100x. Som en tommelfingerregel resulterer ~ 1 nM DNA i en god overflade dækning for ~ 1000 bp.
    4. Skyl straks prøven tre til fire gange med et par milliliter filtreret, deioniseret vand, afvasket overskydende væske og blæst i en mild nitrogenstrøm. Hele processen fra prøveaflejring til tørrede prøver kan udføres inden for mindre end 30 s.
    5. Fastgør stykket glimmer på et mikroskopglas ved hjælp af klæbebånd ved dets kanter.
      BEMÆRK: Forskellige AFM-systemer har dIfferent krav til fastgørelse af prøven til scenen. Andre AFM'er har magnetiske trin, og glimmerstykkerne er fastgjort på magnetiske diske, fx ved hjælp af termisk lim. Nærmere oplysninger om AFM-systemet, der anvendes her, findes i Materialetabellen.
  3. AFM billedbehandling
    1. Placer prøven (se 2.2.5) centralt på AFM-fasen og fastgør mikroskopglaset på scenen med magnetiske puder.
    2. Indsæt AFM-spidsen i spidsholderen. Brug cantilevers med en skarp (<10 nm) AFM sonde, der er egnet til oscillerende, intermitterende kontaktmodus billeddannelse i luft. Brug AFM-prober, f.eks. Som angivet i Materialetabellen . Her (afhænger af AFM), fastgør spidsen i holderen under en klemme ved at stramme klemskruen (fingertæt). Indsæt tipholderen i AFM målehoved. Rid hovedet på ryggen for dette trin.
    3. Placer AFM målehovedet oven på prøven. Detaljer afhænger af AFM-modellen. Her mAke sikker på, at hovedet står stabilt med sine ben inde i stadiumindrykket. Sørg for, at glimmeret ligger på scenen, hvor AFM-spidsen svæver direkte over den. Mikrometer skruer på højre side af scenen giver mulighed for fin positionering af prøven.
    4. Juster AFM-laseren på bagsiden af ​​cantilever for optimal signalstyrke fra den positionsfølsomme fotodetektor, på hvilken laseren afspejles. Detaljer afhænger af AFM-modellen.
      1. Drej hjulene på højre side og bagsiden af ​​AFM-målehovedet for at justere AFM-laserens x- og y-positioner for at rette det centralt på enden af ​​cantileveren. Se refleksionssignalet i AFM-videovinduet (hvis tilgængeligt, her: tryk på kameraikonet og vælg input: Svideo).
      2. Når du først har valgt en god position, optimerer du detektorens sumsignal (Sum in Sum og Deflection Meter-vinduet i AFM-softwaren) ved at finjustere laserpositionen med de to hjul (forbliver i slutningen af ​​cantilever, summen signaJeg afhænger af AFM og cantilever type, her: mål for sum> 5).
    5. Nul forskelsignalet fra detektorens array og topdioder (her: Deflektionssignal i Sum og Deflection Meter-vinduet) ved at rette AFM-laserrefleksionen på detektorcentret (her: drej hjulet til venstre for AFM-måling hoved).
      BEMÆRK: Afvigelser fra nul angiver derefter afbøjning af cantilever på grund af overfladeinteraktioner, som oversættes til højdeinformation af AFM.
    6. Bestem cantilever resonansfrekvensen med en frekvens melodi implementeret i AFM software (her: kommando automatisk tune i Master Panel / Tune vindue). Vælg en amplitude svarende til 1 V indgang til piezoen, der driver cantileveroscillationen. Indstil oscillationsfrekvensen til lidt (5%) lavere end resonansfrekvensen og nul oscillationsfasen.
    7. Rør spidsen til prøveoverfladen ved hjælp af den rå indgreb modE (her: kommando Indtast i hovedpanel vindue), indtil beskyttelsesindstillingen (setpunkt) er nået. Brug ~ 2% skæring af fri niveau oscillations amplitude som setpunkt (her indtast Set Point 980 mV i Master Panel).
    8. Sæt AFM-spidsen ind med prøveoverfladen ved at sænke setpunktet ved hjælp af AFM-softwaren. Formålet med afvisning af afstødende tilstand med cantilever-oscillationsfasen (fase i sum og afbøjningsmåler) lige under fri niveaufasen (før indgreb, her typisk ~ 70). Brug her typiske endelige sætpunkter i størrelsesordenen 70-80% af fri niveau amplitude (1 V).
    9. Før du scanner, skal du vælge signalerne til optagelse i Master Channel Panel. Vælg højde (Ht) og amplitude (Am).
    10. Begynd prøve scanning (her: kommando Skan i hovedpanel vindue). Brug en scanhastighed på f.eks. 2,5 μm / s (kommandoen Scanhastighed i hovedpanel) til billedoverfladearealer på 4 μm x 4 μm eller 8 μm x 8 μm (indtast Scanstørrelse i Master PanelL) med pixelopløsninger på henholdsvis 2.048 eller 4.096 (Scan Points og Scan Lines i Master Panel).
    11. Gem billedfilen (kommando Gem billede i hovedpanelet) uden nogen passende modifikationer (vælg Ingen i Master Channel Panel / Save Plane Fit).
    12. For yderligere analyse, behandle det gemte billede. Indlæs billedet (kommando Gennemse gemte data i AFM-analyse-menuen). Åbn modifikationspanelet (tryk på M i øverste del af billedet). Anvend et planfit i x og y dimensioner til højdebilledet (forlængelse HtR) (kommando XY i Planefit vindue i Modify Panel, vælg Planefit Order 3). Flad derefter billedet (kommandoen Flad i fladvinduet i Modificeringspanel) ved at vælge Flatten Order 3.
    13. Eksporter billedet som en TIFF-fil (tryk på kommandoer i øverste del af billedet, vælg TIFF Export 2x svarende til 2.048 pixel opløsning) til yderligere analyse.

3. AFM-analyse

  1. Proteinkompleksvolumen
    1. pre-Vælg relevante protein-DNA-komplekser ved direkte visuel inspektion af billederne i AFM-softwaren ved hjælp af et passende farveskema for at maksimere forskellige fremtoninger af forskellige størrelseskomplekser (se forskellige farver og størrelser af forskellige komplekser i figur 2 her: farveskema SeaLandAndFire in AFMsoftware). For XPD-prøver indeholdt mulige komplekser XPD / p44-DNA såvel som XPD-DNA og p44-DNA med tydeligt forskellige størrelser på grund af de relativt store molekylmasser af XPD (~ 95 kDa) og p44 (~ 40 kDa) .
    2. Mål mængder af individuelle proteintoppe på DNA'et for at verificere kompleks typen. Dette kan opnås med forskellige billedsoftware (her: AFM-softwarens sektionsværktøj).
      1. Mål høyden (h) og diameteren (d) af protein-topsektionerne med sektionsvinduet markører. Mål diameteren tæt på partikelafsnittets bund.
      2. Bestem volumenet (V) af ærtenKs ved hjælp af enkle matematiske modeller, fx ved hjælp af følgende formel, der er baseret på en sfærisk cap model:
        ligning
    3. Oversæt målte mængder til en omtrentlig molekylmasse i protein.
      1. Indledningsvis kalibrere AFM-systemet for volumen til molekylvægt (MW) -omdannelse under anvendelse af et område af proteiner med kendt molekylvægt (her: i alt 12 eksperimenter med mellem 25 og 851 datapunkter hver blev udført på 5 forskellige proteiner i monomere, dimeriske , Trimeriske eller tetrameriske tilstande) 4 , 19 , 20 . Deponerings- og billedproteiner (som beskrevet ovenfor, i 2.2 og 2.3) og måle deres volumener som beskrevet ovenfor (3.1.2). Plot volumenerne over deres kendte molekylvægte. Den resulterende graf vil vise et lineært forhold mellem V og MW, hvor ligningen kan opnås vedEn linje, der passer til dataene. For det AFM-system, der anvendes her, blev følgende forhold opnået 19 :
        ligning
        BEMÆRK: Dette trin skal ikke gentages før hver måling, men foretages kun én gang. Volumen til MW-kalibrering kan påføres billeder opnået under lignende billeddannelsesbetingelser ved brug af AFM-sonder med lidt varierende diametre.
      2. Baseret på deres målte volumener (3.1.2) og V-til-MW-kalibrering (3.1.3.1) bestemmes den omtrentlige MW af proteinkomplekserne 20 , som giver information om dets molekylære indhold. Eksempelvis blev der opnået XPD / p44-prøver, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa og ~ 140 kDa, i overensstemmelse med p44-DNA-komplekser (eller toppe forårsaget af blot DNA-overbygning), XPD-toppe og henholdsvis XPD / p44-toppe .
  2. Proteinkomplekspositioner på DNA
    1. Bestem DNA'etFragment længder.
      1. Spor DNA-fragmenterne i AFM-billederne, f. Eks . Med frihåndsledningsfunktionen af ​​en egnet billedanalysesoftware (se for eksempel Materialebord) og måler længden af ​​linjen.
        BEMÆRK: Ekskluder DNA-aggregater samt fragmenter afskåret af billedmargenerne.
      2. Bin og plot DNA længderne fra hele eksperimentet i et histogram ved hjælp af egnet data analyse og grafik software ( fx se Materialebeskrivelse ).
      3. Tilpas længdefordelingen med en Gaussisk kurve i dataanalysen og grafisk software til bestemmelse af længden af ​​DNA-fragmenterne. For at kende placeringen af ​​det indsatte DNA-målsted (se 1.1), omfatter kun DNA-fragmenter med den korrekte længde inden for to standardafvigelser fra centrum af Gauss-kurven (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), hvor z er en normfaktor, og x c og w er centrum ogFuld maksimal halv bredde af Gausserne) i yderligere analyser.
        BEMÆRK: DNA-længden i midten af ​​Gauss-kurven skal være tæt på den teoretiske længde af DNA-fragmentet (beregnet ved anvendelse af 0,34 nm / bp). Længder på op til 10% kortere end den teoretiske værdi er typiske og skyldes sandsynligvis AFM-opløsningsgrænser.
    2. Bestem positioner af protein toppe på DNA substrater.
      1. Mål afstanden af ​​proteintoppene fra den tættere DNA-fragment-ende som beskrevet i 3.2.1.1 og divider med den totale DNA-længde for at opnå afstande i enheder af fraktion af DNA-længde.
      2. Buk og plot de målte afstande i et histogram ved hjælp af en egnet dataanalyse og grafiksoftware (se fx figur 3 ). Som en tommelfingerregel skal du vælge en papirstørrelse, der giver ca. √n placeringer for n datapunkter.
        BEMÆRK: Da DNA-ender ikke kan skelnes her, skal du kun plotte til en fraktion af DNA-længde 0,5 (center for DNA fragling). Fordi DNA-endebinding ikke er fokus for undersøgelsen, udelukker DNA-ender fra analyserne ved at begynde at binere positionsdataene lidt efter position 0 ( fx her: binning fra en DNA-længdefraktion på 0,02).
    3. Bestem målspecifikiteten fra proteinkomplekspositionsfordelinger.
      1. Pas den maksimale (forbedrede bindingshændelser) i positionsfordelingen med en Gauss-kurve som i 3.2.1.3, men fodfæste på højden af ​​baggrundsbindingen (se figur 3 ).
      2. Beregn specificiteten S for det specifikke sted i forhold til den uspecifikke DNA-baggrund (proteinmolekyler bundet til ikke-specifikke DNA-steder) med følgende formel 21
        ligning
        Et sp : Antal specifikke komplekser (område under den gaussiske kurve)
        A nsp : Antal ikke-specifikke komplekser (område af baggrunden, 0 ); Den her omhandlede fraktion af DNA-længden er 0,48 for et histogram, der starter ved 0,02 DNA-længde)
        N: antal mulige DNA-bindingssteder (her: N = 914 eksklusive DNA-ender)
  3. DNA-bøjningsvinkler
    1. Ved hjælp af vinkelværktøjet i en egnet billedanalysesoftware måles vinklen β mellem to linjer placeret centralt langs DNA-rygraden og centrering ved proteintoppen (se fx indsats i figur 4 ). Mål vinklerne for et statistisk relevant antal protein-DNA-komplekser (> 50, ideelt> 100) 2 , 3 , 5 .
      BEMÆRK: DNA-bøjningsvinklen er defineret som 180 ° -β 2 , 3 , 5 .
    2. Brug af data analyse og grafik software(Se Materialebeskrivelse) producerer et bøjningsvinkeldistributionshistogram ved at binde DNA-bøjningsvinklerne.
    3. Monter bøjningsvinkeldistributionen med en Gauss-kurve. Hvis mere end et maksimum er tydeligt i fordelingen, skal du vælge flere top Gauss fit. Gaussiske kurves midtpunkt (er) giver den gennemsnitlige bøjningsvinkel tilstand for den pågældende art.
    4. Hvis et skifte i bøjningsvinklen (s) (maxima for gaussisk pasform (er)) er tydelig for fordelinger, for eksempel af forskellige proteinvarianter eller forskellige proteinkompleksarter, skal du anvende en student t-test for at vurdere signifikansniveauet for ændringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

At skelne mellem forskellige komplekse typer baseret på proteinkompleksvolumener

Helicaseaktiviteten af ​​den prokaryote NER-helicase UvrB stimuleres ved DNA-binding 22 , 23 . UvrB kræver en uparget region i DNA'en (en DNA-boble) for at kunne indlæse korrekt på en af ​​de to enkelt ssDNA-tråde. In vivo tilvejebringes denne DNA-struktur ved hjælp af DNA-interaktioner gennem et andet protein fra NER-kaskade; I in vitro eksperimenter kan boblen kunstigt indføres i dsDNA-fragmenter i umiddelbar nærhed af en mållæsion. Protein-protein-interaktioner forøger også DNA-binding med UvrB 9 . Men når UvrB er indlæst på DNA, synes dets aktivitet ikke at afhænge af proteinkoaktorer 9 . I modsætning hertil kræver den eukaryote NER-helicase XPD interaktionPå med proteinet p44, som ligesom XPD er en del af multi-subunit-transkriptionsfaktor IIH (TFIIH) -komplekset in vivo , til aktivering af dets helicaseaktivitet, men denne interaktion påvirker ikke XPD-binding til DNA 17 . XPD alene forventes at indlæse på DNA ved en DNA-boble, men ikke translokere til læsionen (i fravær af dets helicaseaktiverende co-faktor). XPD uden p44 burde derfor ikke kunne interagere med og identificere læsionen, når den læses i en afstand fra læsionsstedet. Inkubationer af XPD med p44 i nærværelse af læsion indeholdende DNA-substrat resulterer i en blanding af XPD- eller XPD / p44-DNA-komplekser (og muligvis en mindre art af p44 alene bundet til DNA). For særskilt at analysere læsionsgenkendelse af XPD / p44 og XPD kan disse forskellige komplekse typer skelnes ud fra deres volumener i AFM-billeder ( figur 2 ) 9 som beskrevet i protokol 3.1 ovenfor. AFM-systemer kan kalibreres ved hjælp af en række pRoteiner med kendt molekylvægt for at afsløre et lineært forhold mellem AFM-volumenet og den omtrentlige molekylvægt af et protein (kompleks) 20 , hvilket tillader en fortolkning af de målte mængder. Bindende positioner på DNA'et kunne således bestemmes separat for helicase inaktiv monomer XPD (~ 95 kDa, i overensstemmelse med ~ 100 nm 3 klasse 2-species i figur 2 ) og for helicase-aktive XPD / p44-komplekser (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 klasse 3 arter), baseret på deres forskellige AFM volumener.

Lesionsgenkendelse bestemmelse fra proteinbindingspositioner på DNA

Her blev lange (916 bp) DNA-substrater indeholdende en læsion ved ~ 30% af DNA-længden anvendt. Kontrol over den nøjagtige position af læsionen i DNA-substratet gør det muligt at skelne mellem specifikke (læsionsbundne, ved 30% af DNA-længden) og nonspeCific (læsionssøgning) komplekser afhængige af deres positioner på DNA'et. To forskellige læsioner blev valgt, som er mål for NER; DNA-substrater indeholdt enten et fluorescein (F) -addukt eller en cyclobutanpyrimidin-dimer (CPD). Foruden læsionsstedet indeholdt DNA'et en oparret region (8 nt DNA-boble), der tjente som påfyldningssted for helicaserne. Dette belastningssted var placeret i en afstand på 26 nt (for de F-holdige DNA-substrater) eller 23 nt (for CPD-indeholdende substrater) enten 5 'eller 3' fra læsionen (se tabel 1 ). Lesionsgenkendelse fører til stalled DNA-translokation af helicaserne UvrB og XPD på målstedet, som er tydeligt i AFM-proteinpositionsfordelingen på DNA som en top ved læsionens position. Skader og boblepositioner i disse substrater kan ikke i sig selv skelnes inden for beslutningsgrænserne for AFM-billeddannelse (<10 nm afstand). Men den brøkdel af specifikke komplekser, der repræsenterer aMontering af molekyler stallet ved læsionen og indikerer læsionsgenkendelse, afhang stærkt af om læsionen blev placeret 3 'eller 5' fra boblen ( figur 3 ) 9 .

Fra fraktionen af ​​komplekser på det specifikke sted (område under den gaussiske pasningstopp versus arealet af den ikke-specifikbundne baggrund) blev specificiteten S af UvrB og XPD beregnet for de to undersøgte læsionstyper beregnet (se protokol 3.2 ovenfor). For UvrB resulterede læsning 5 'fra læsionspositionen i højere specifikationer (SB , F5 ~ 200 og SB, CPD5 ~ 400) end læsning 3' fra læsionen ( SB , F3 og SB, CPD3 ~ 100) for Begge læsionstyper. For XPD blev komplekser indeholdende kun XPD (klasse 2 i figur 2 ) og komplekser indeholdende XPD samt det helicaseaktiverende co-faktor protein p44 (klasse 3 i figur 2 ) skelnet som descrIbed i det foregående afsnit. Klasse 2 protein toppe (kun XPD, helikase inaktiv) lokaliserede ikke fortrinsvis ved læsionssteder uafhængigt af om de blev fyldt 5 'eller 3' og uafhængige af læsionstypen (data ikke vist). I modsætning hertil viste positionfordelingerne for XPD / p44 (klasse 3) komplekser forbedret binding ved F læsioner for at indlæse 5 'fra læsionen (S XPD / p44, F5 ~ 300 versus S XPD / p44, F3 ~ 100) men ved CPD Læsioner til læsning 3 'fra læsionen (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 versus S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Figur 3 ). Fordi UvrB og XPD er 5'-til-3'-helikaser, giver disse data information om, hvorvidt komplekser er stoppet via interaktioner med læsionen inden for ssDNA-strengen, som de translokerer på (den translokerede streng for at indlæse 5 'fra læsionen) Eller inden for den modsatte, ikke-translokerede streng (til læsning 3 'fra læsionen). Konceptet er skematisk vist i

Undersøgelse af konformationelle ændringer ved læsionsidentifikation ved XPD

Måling af bøjning indført i DNA på stedet for bundne komplekser fra AFM-billeder (se protokol 3.3 ovenfor) kan afsløre vigtige oplysninger om komplekse konformationsændringer. DNA-bøjningsvinkler blev målt for archaeal XPD 5 , hvilket ikke kræver protein-cofaktorinteraktion for helicaseaktivitet. I disse studier var en fluorescein læsion placeret direcI forbindelse med en DNA-boble til forbedret proteinindlæsning ved læsionen ved 30% af DNA-fragmentlængden. Figur 4 viser gaussiske passer til DNA-bøjningsvinkeldistributioner opnået for proteinkomplekser ved uspecifikke (ikke-beskadigede) DNA-positioner og ved ~ 30% DNA-længde, der er i overensstemmelse med XPD bundet ved fluoresceinlæsionspositionen (specifikke komplekser). Dataene viser en gennemsnitlig bøjningsvinkel på ~ 50 ° for uspecifikke komplekser versus ~ 65 ° for specifikke komplekser. Dette DNA-bøjningsvinkelskifte var afhængig af tilstedeværelsen af ​​ATP- eller ATP-signaler, hvilket indikerer at ATP (re) -bindende men ikke hydrolyse var nødvendig for de konformationelle omlejringer 5 .

figur 1
Figur 1: Fremstilling af DNA-substrater. Et ssDNA-gap indføres i cirkulært plasmid-DNA ved at nicking plasmidet (her med nickasen N.BstNBI) ved cloAdskilte steder og fjernelse af den vedlagte ssDNA-strækning via centrifugefiltrering efter varm destabilisering i nærværelse af et overskud af komplementært oligonukleotid. Et specifikt oligonukleotid indeholdende egenskaben kan vælges og ligeres ind i mellemrumområdet. Endelig resulterer fordøjelsen med restriktionsenzymer (her med SspI og BspQI) i et lineært DNA-substrat med målfunktionen i en netop kendt position (her ved 30% af DNA-fragmentlængden). Kontrolanalyser tillader testning af de enkelte trin (vist nedenunder) via agarosegelelektroforese (sort pil indikerer 3000 bp). Nicking kan testes ved den ændrede elektroforetiske mobilitet af det nickede, afslappede cirkulære DNA (kontrol nicking, bane 2) versus det supercoulerede plasmid (bane 1). Komplet gapping af DNA såvel som efterfølgende insertion af den specifikke oligo kan testes ved fordøjelse med et restriktionsenzym, der skærer i gapområdet (her: XhoI, iBaner 2, 4 og 6), således at mangel på DNA-snit indikerer spaltdannelse (baner 1,2 nicked DNA, baner 3,4 gapped DNA) og genopstået snit indikerer indsættelse af den specifikke oligo (baner 5,6) . Det endelige lineære substrat, som indeholder det specifikke træk, kan oprenses fra gelen efter agarosegelelektroforese og testes for homogenitet og renhed via AFM-billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: At differentiere forskellige komplekse typer fra deres AFM-mængder. ( A ) AFM-billede af XPD / p44-DNA (grå pil) og XPD-DNA (black arrow) komplekser. ( B ) Eksempler på tre forskellige typer af DNA-bundet komplekser, fortolket som p44 eller blot DNA-overbygning (klasse 1),XPD (klasse 2, sort ramme) og XPD / p44 (klasse 3, grå ramme) komplekser baseret på deres AFM-volumener (vist til højre). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Forskellige læsionsgenkendelse strategier af prokaryote og eukaryote NER helicaser. Lærionsgenkendelse kompetent DNA-translokation af NER-helicaserne UvrB og XPD (i kompleks med dets helicaseaktiverende co-faktor p44) kræver påfyldning af proteinerne i et oppareret DNA-område (DNA-boble). Proteinerne bevæges derefter i 5'-til-3'-retning langs ssDNA-strengen, på hvilken de lægges. Anerkendelse af en DNA-læsion (her: CPD) ved hjælp af helicaserne enten på den translokerede streng (til indlæsning ved 5'-boble) eller på den modsatte, ikke-translokerede streng (foR loading ved 3 'boble) resulterer i stalled DNA-translokation. I positionsfordelingerne viser dette sig som en top (Gaussian fit lines), hvilket indikerer forbedret binding ved læsionspositionen (ved ~ 30% af DNA-længden for DNA-substrater vist her). Den prokaryote NER-helicase UvrB og dens eukaryotiske modstykke XPD viser forskellige strategier for CPD-læsionsgenkendelse, der angiver forskellige DNA-strengpræferencer. Specifikt genkendes CPD læsioner på den translokerede streng af UvrB, men fortrinsvis på den modsatte, ikke-translokerede streng ved XPD. Figur ændret fra reference 9 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Konformationsændringer i XPD-DNA-komplekser ved læsionsidentifikation. Fordelingen af ​​DNA-bøjningsvinkler induceret af XPD indikerer konformationsændringer i protein-DNA-komplekserne ved en fluoresceinlæsion. Disse konformationelle omlejringer var afhængige af tilstedeværelsen af ​​ATP (B) eller ATP-tallene (C). ( A ) I fravær af ATP er ikke-specifikke bøjningsvinkler (grå) og bøjningsvinkler på læsionsstedet (specifikke bøjningsvinkler, sorte) ens og passer med en Gaussisk kurve med center ved ~ 50 °. ( B , C ) I nærvær af ATP eller ATP-stationer viser den specifikke bøjningsvinkelfordeling (sort) et signifikant skift (P = 2,5 x 10-7 ) til en gennemsnitlig bøjningsvinkel på ~ 65 °. Dette DNA-bøjning ved læsionsstedet var uafhængigt af typen af ​​læsion (CPD eller fluoresceinaddukt) eller tilstedeværelsen eller fraværet af en DNA-boble 5 . Figur blev gengivet fra reference 5 . Indgangen i (C) viser hvordan bøjningsvinkler (180 ° -β) blev bestemt.Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

nummer sekvens beskrivelse
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC
bund
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC
F / 5 'boble
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC
F / 3 'boble
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC
CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC
CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC
F / boble

Tabel 1: DNA-oligonukleotider til DNA-substratfremstilling. Alle oligonukleotider er 48 nt lange, og topstrenger (oligonukleotider 2-6) blev phosphoryleret ved deres 5'-ende for ligering i det gapped-DNA (se protokol 1.1). F = fluoresceinadduceret thymin, TT = cyclobutanpyrimidin (thymin) dimer (CPD), ikke-komplementære regioner (DNA-boblende dannende regioner) er understreget. F indeholdende oligonukleotider blev opnået fra Integrated DNA Technologies (IDT), CPD indeholdende oligonukleotider blev venligt tilvejebragt af Thomas Carell's laboratorium (Ludwig-Maximilian University Munich, Germany).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM statistiske analyser af bindingspositioner af proteiner på lange DNA-fragmenter, der indeholder specifikke målsteder, kan afsløre interessante detaljer om de specifikke strategier, der anvendes af proteinet til at genkende disse steder 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . For at fortolke de resulterende positionsfordelinger skal positionerne af målene i DNA'et være præcist kendt. Dette opnås ved at indføre specifikke steder ved veldefinerede sekvenspositioner i cirkulært plasmid-DNA og skære et fragment af DNA'et indeholdende dette specifikke sted ved anvendelse af restriktionsenzymteknologi. I AFM-billedanalyser af proteinbindingspositioner kan kun DNA-fragmenter med korrekte længder (i overensstemmelse med den fulde længde af det udskårne fragment) indbefattes, fordi kun for disse er positionen af ​​målstedet kendt. Det er værd at nejHvilket betyder, at fremstillingsproceduren beskrevet her resulterer i lineære DNA-substrater med to ikke-separerbare fragment-ender. Positionsfordelinger kan følgelig kun måles og plottet fra 0 x DNA-længde (proteiner bundet til DNA-fragment-ender) til 0,5 x DNA-længde (proteiner bundet i centrum af fragmenter). Endvidere indeholder disse fordeling for målpositioner, der ikke er placeret nøjagtigt i midten af ​​substratet, altid en lille baggrund af proteiner, som er uspecifikt bundet i samme afstand fra den anden DNA-ende. Imidlertid tegner en Gaussisk kurve til fordelingen på den gennemsnitlige baggrundshøjde (ikke-specifikt bundet proteiner, figur 3 ) for disse komplekser. Alternativt kan en af ​​DNA-enderne mærkes, for eksempel med små volumen toppe fra sekundær struktur, der danner ssDNA overhæng 24 . Typiske opløsningsgrænser for disse positionsanalyser ligger inden for området 100-gange præference af målet siTe over uspecifik site binding. Derudover udgør DNA-fragment-ender ikke nogen uspecifikke dsDNA-steder, men repræsenterer i stedet dsDNA-pauser. DNA-reparationsproteiner binder ofte til disse destabiliserede fragment-ender, udover de streng-internt indførte specifikke målsteder. DNA-endebinding kan afsløres ved AFM-analyser og kan give vigtige oplysninger om proteinets funktion. Hvis DNA-endebinding ikke er interessepunktet, kan disse positioner let udelades fra positionsfordelingen ved at starte plotterne i en position> 0 ( fx her 0,02 DNA-længder).

En af de særlige fordele og faktisk den definerende fælles egenskab ved enkeltmolekyleteknikker er opløsningen af ​​individuelle forskellige tilstande til stede i en prøve, som kan besidde vidt forskellige egenskaber og aktiviteter. Selv i tilfælde hvor de pågældende arter af interesse kun kan være sjældne i en prøve, tillader disse tilgange såledesSærskilt fokus på denne art, hvis bidrag ville blive dværget i en ensemble måling. For proteinprøver muliggør f.eks. AFM-billeddannelse den direkte sondring mellem forskellige typer proteinkomplekser baseret på komplekst volumen, hvis størrelserne af de individuelle proteiner afviger tilstrækkeligt (typiske opløsningsgrænser er ca. 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . AFM-systemer kan kalibreres for at muliggøre oversættelse af de målte mængder til proteinmolekylvægt (protokol 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . Alternativt har proteinstandarder med kendte størrelser været anvendt som en direkte reference i billederne 1 , 6 . ISystem fokuseret her kunne bindingspositioner på DNA således separat bestemmes for helikaseinaktive monomere XPD og for helicase-aktive heterodimere XPD / p44-komplekser. Foretrukne binding til et læsionssted ved en veldefineret position i DNA'et angav DNA-læsionsgenkendelse af et proteinkompleks. Da proteinindlæsning og læsionssteder var rumligt adskilt, var DNA-translokation en nødvendig forudsætning for læsionsgenkendelse i de DNA-substrater, der anvendes her. Kun de heterodimere XPD / p44-komplekser var i stand til DNA-translokation ( Figur 3 ), i overensstemmelse med resultater fra helicaseaktivitetsanalyser 9 . AFM-volumenanalyse kan derfor tilvejebringe vigtig information om differentielle aktiviteter i forskellige proteinkompleksformer.

Lesionsinteraktion og genkendelse af det helicase-aktive XPD / p44-kompleks resulterede i forøget binding på målstedet på grund af standsning af helicase-translokation ( Figur 3 figur 3 ) indikerer dette fund, at enzymet detekterer fluorescein fortrinsvis på den translokerede streng, men CPD fortrinsvis på den modsatte, ikke-translokerede streng. Den prokaryote NER-helicase UvrB genkendte derimod fortrinsvis både fluorescein- og CPD-læsioner ved påsætning af 5 'fra læsionen, dvs. på den translokerede streng ( figur 3 ). Disse karakteristiske forskelle i deres læsionsgenkendelsesegenskaber kan forstås ud fra de forskellige strukturelle egenskaber af de to helicaser. UvrB interagerer med potentielle mål iN DNA'et via aminosyrerester på indersiden af ​​en β-hårnålfunktion i enzymet bagfra, hvor den translokerede streng sandsynligvis er gevindskåret 16 , 25 . XPD, derimod, er vært for en lille pore i nærheden af ​​en jern-svovl (FeS) klynge 26 . Den translokerede DNA-streng trænger sandsynligvis gennem denne pore 26 . Bulkier læsioner såsom fluorescein kan stoppe helikase-translokation via interaktioner med rester i denne pore, medens mindre omfangsrige CPD-læsioner kan identificeres lettere via interaktioner med FeS-klyngen. I det prokaryote system menes to molekyler UvrB at være involveret i målstedssøgning i et hetertetramer UvrA2-UvrB2-kompleks, hvori hver af de to UvrB-monomerer er i stand til at undersøge en anden DNA-streng 27 . XPD i eukaryotisk NER findes sandsynligvis som en enkelt kopi iTFIIH læsion genkendelse kompleks. Fleksibilitet i læsionsinteraktionsmetoder af det eukaryote enzym kan derfor være påkrævet for at muliggøre genkendelse af det ekstremt store målstedspektrum for NER-reparationssystemet.

Fordi specifikke (målstedbundne) og uspecifikke komplekser kan skelnes i AFM-billeder baseret på deres positioner på DNA'et, kan disse forskellige komplekse typer analyseres separat og sammenlignes. Single-molekyl-AFM er en af ​​meget få fremgangsmåder, der giver adgang til strukturelle egenskaber af proteinkomplekser, der er bundet nonspecifikt til DNA på grund af deres ofte forbigående eller variable natur. Her blev konformationsændringer ved målstedgenkendelse visualiseret og karakteriseret ved arkæisk XPD baseret på den bøjning, der blev introduceret i DNA'et af enzymet. AFM-dataene afslørede et lille, men tydeligt, signifikant skift i DNA-bøjningsvinkler for XPD bundet på et læsionssted versus XPD bundet til ikke-specifikt DNA 5 . konformationalÆndringer i de DNA-bundet proteiner ved identifikation af målsted sandsynligvis udløser rekruttering af NER-endonukleaser (XPG og XPF i eukaryotisk NER), der udfører udskæring af en kort strækning af ssDNA indeholdende læsionen. Interessant nok krævede dette skifte og dermed konformationelle re-arrangement binding af ATP til enzymet (men ikke hydrolyse). En lignende fremgangsmåde for ATP-genopretning efter målstedidentifikation og efterfølgende rekruttering af UvrC-endonuclease er blevet rapporteret for UvrB i prokaryotisk NER 28 , 29 .

Sammenfattende har AFM single molecule imaging afsløret subtile forskelle i målsted genkendelse af de prokaryote og eukaryote NER helicaser. Når en mållæsion er blevet identificeret af enzymerne, deler de en lignende strategi for rekruttering af NER-endonukleaserne via ATP-bindingsinducerede konformationelle re-arrangementer selektivt ved læsionen. Teknikken for AFM i comBination med omhyggeligt DNA-substratdesign for at efterligne væsentlige egenskaber ved det undersøgte system kan derfor give indsigt i målstedinteraktioner af ikke kun DNA-reparation, men DNA-bindingsproteinsystemer generelt. Strukturelle oplysninger om både specifikke og uspecifikke komplekser med opløsninger i det lave nanometerområde (på molekyliveau, begrænset af AFM sonden) kan bidrage væsentligt til forståelsen af ​​de involverede mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

PUC19N, CPD-holdige oligonukleotider og p44 blev venligt tilvejebragt af henholdsvis Samuel Wilson, Korbinian Heil og Thomas Carell og Gudrun Michels og Caroline Kisker. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 og TE-671/4 til IT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

Genetik udgave 123 atomisk kraftmikroskopi (AFM) protein-DNA-interaktion DNA-reparation nukleotid-excisionsreparation (NER) DNA-læsionsgenkendelse DNA-modifikation AFM-prøvepræparation AFM-volumenanalyse DNA-bindingspositionsanalyse.
Atomic Force Microscopy Undersøgelser af DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter