Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

Atomische krachtmicroscopie (AFM) is een krachtige techniek voor de analyse van eiwit-DNA-interacties 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Het vereist slechts lage hoeveelheden monstermateriaal om heterogene monsters rechtstreeks te visualiseren met een resolutie op het molecuulniveau. Heterogeniteit kan resulteren uit verschillende conformatieve of oligomere toestanden van een eiwit. In het bijzonder kunnen eiwitcomplexen in het kader van eiwit-DNA-monsters verschillende stoichiometrieën en / of conformaties veroorzaken die geïnduceerd zijn door DNA-binding in het algemeen of aan een specifieke doelplaats in DNA binden. Heterogene monsters kunnen ook twee (of meer) verschillende soorten eiwitten bevatten en een ander eiwitcomplexVormen (bijvoorbeeld bestaande uit slechts één type eiwit versus heteromeer complexen) kunnen verschillen met DNA. De hier beschreven studies maken gebruik van AFM-beeldvorming in lucht op statische, gedroogde monsters van DNA-reparatie-eiwitten die gebonden zijn aan lange (~ 900 basisparen, bp) DNA-fragmenten die een letsel bevatten, die een doelstelling voor deze eiwitten vertegenwoordigt. De hoge moleculaire resolutie van AFM maakt het onderscheid mogelijk tussen verschillende typen eiwitcomplexen en om de bindingsposities van de eiwitten op de DNA-fragmenten te bepalen. Het is belangrijk dat de laesies in de DNA-substraten worden ingevoerd bij goed gedefinieerde posities. Omdat de positie van de laesieplaats in het DNA bekend is, geven de verdelingen van eiwitten die gebonden zijn aan DNA inzicht in (verschillende) laesieherkenningseigenschappen van de (verschillende) eiwitcomplexen, bijvoorbeeld hoe goed ze een bepaald type laesie herkennen (vergeleken Naar niet beschadigd DNA) 2 , 3 , , 5 , 6 . Hun posities op het DNA maken het onderscheid mogelijk tussen eiwitcomplexen die specifiek gebonden zijn aan de laesies en complexen die niet specifiek gebonden zijn elders op het DNA. Afzonderlijke karakterisering van deze verschillende complexe typen (complexen die specifiek zijn gebonden aan de lesie versus niet-specifieke complexen) kunnen potentiële conformatieve veranderingen onthullen in de complexen die zijn geïnduceerd bij de identificatie van de doelplaats.

De DNA-herstellingsproteïnen die hierop gericht zijn, zijn helicasen die verantwoordelijk zijn voor de herkenning van de laesie in de nucleotide-excisie-reparatie (NER) -weg. Bij bacteriën wordt NER bereikt door de eiwitten UvrA, UvrB en UvrC. UvrA is verantwoordelijk voor het aanvankelijke letselsensor in een UvaA 2 / UvrB 2 DNA-scanningskomplex. Bij laesieverificatie door UvrB converteert dit complex naar monomere UvrB gebonden op de lesion site en dit specifieke complex kan dan de pRokaryotische NER endonuclease UvrC. UvrC exciseert een korte (12-13 nt) streep van enkelstrengs DNA (ssDNA) dat de laesie bevat. Het ontbrekende rek wordt dan door DNA-polymerase opgevuld. Ten slotte sluit DNA ligase de nieuw gesynthetiseerde rek met het originele DNA 9 , 10 . In eukaryoten zijn de meeste eiwitten van de NER-cascade onderdeel van het grote, multimere transcriptiefactor II H (TFIIH) complex. Na aanvankelijke letselsensor via het trimerische CEN2-XPC-HR23B-complex, wordt TFIIH aangeworven op de DNA-doelplaats. Wanneer XPD binnen het complex de aanwezigheid van een NER-targetletsel verifieert, worden de eukaryote NER-endonucleasen XPG en XPF aangeworven om een ​​korte (24-32 nt) streep van ssDNA die de letsel 9 , 10 bevat , te accijnzen. Hierbij werden specifiek de helicasen UvrB en XPD van respectievelijk prokaryotische en eukaryote NER bestudeerd. Deze helicasen vereisen een ongeparkeerde regio in deDNA (een DNA-bubble) om op een van de twee DNA-enkele strengen te treden en vervolgens te verplaatsen langs deze streng, die door ATP-hydrolyse wordt aangevuurd. Naast de DNA-laesies werd derhalve een DNA-bubble geïntroduceerd in de substraten die fungeren als laadplaats voor de eiwitten.

De werkwijze voor de bereiding van specifieke lesion-DNA-substraten is eerder beschreven 11 . Het vereist een cirkelvormig DNA-construct (plasmide) met twee dicht gespannen restrictieplaatsen voor een nickase. In het kader van deze studie werd het plasmide pUC19N (2729 bp) gebruikt (gecreëerd door S. Wilson's laboratorium, NIEHS). Dit plasmide bevat drie nauw gespecificeerde restrictieplaatsen voor de nickase Nt.BstNBI die een 48 nucleotide (nt) rek vormt. Na incubatie met de nickase kan de streep van ssDNA tussen deze plaatsen verwijderd en vervangen worden door een oligonucleotide dat elke doelstelling bevat. Na elke stap wordt complete enzymatische vertering getest via agarosegelelektroforese. Gesneden cirkelvormig DNA kan onderscheiden worden door zijn lagere elektroforetische mobiliteit in vergelijking met het oorspronkelijke supercoiled plasmide. Gapping van het DNA en vervanging van de verwijderde rek door het specifieke substraat oligonucleotide kan worden geëvalueerd via digestie met een restrictie-enzym dat het substraat uitsluitend binnen het gebied tussen de nicks inciseert. Linearisatie van het cirkelvormige plasmide door het enzym zal derhalve worden onderdrukt voor het gapped DNA en hersteld na insertie van het specifieke oligonucleotide. Tenslotte maken twee endonuclease restrictieplaatsen (ideaal single cutters) de mogelijkheid tot het genereren van een lineair DNA-substraat, met de gewenste lengte en met de specifieke doelplaats in een gedefinieerde positie, evenals een DNA-bubble op een afstand van de laesie, ook in 5 'Of 3' richting.

Erkenning van de laesies door de NER helicases kan worden onderzocht via AFM beeldvorming. Verstoppelde DNA-translocatie van de helicasen bij tZijn lesion site is zichtbaar als een piek in de eiwit positie verdeling op het DNA en geeft aan dat er lesie herkenning is. Omdat DNA-translocatie van deze helicasen verder gericht is, met 5'-tot-3'-polariteit, geeft de afhankelijkheid van laesieherkenning op de positie van de laadplaats (DNA-bubbel stroomopwaarts of stroomafwaarts van de laesie) ook aan of de lesion bij voorkeur herkend wordt Op de getransloceerde of op de tegenovergestelde, niet-getranslodeerde ssDNA-streng 5 , 9 . In de volgende paragrafen worden de gebruikte methoden ingevoerd en worden de belangrijkste bevindingen van deze experimenten kort besproken. Belangrijk, analoog aan het voorbeeldige werk op DNA-reparatie hier getoond, kan AFM beeldvorming worden toegepast op de studie van verschillende DNA-interactie systemen, zoals DNA replicatie of transcriptie 8 , 12 , 13 , 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbeeld Bereiding

  1. Bereiding van DNA-substraten 11
    1. Het genereren van een ssDNA-kloof in het plasmide
      1. Volledig verteer een monster van het plasmide (hier: gemodificeerd pUC19, pUC19N) in een reactiebuis met een gepaste nickase (hier: Nt.BstNBI) gevolgd door enzym-inactivatie onder gebruikmaking van condities volgens het protocol van de fabrikant (zie Figuur 1 voor een schematische presentatie). Begin met ~ 50 μL en ~ 500 nM plasmide voor een voldoende opbrengst.
      2. Verifieer plasmide nicking door agarosegel elektroforese op verdunde monsters (~ 20 nM) 15 . Draag handschoenen voor bescherming tegen de DNA bindende kleurstof die wordt gebruikt voor DNA visualisatie.
        OPMERKING: Verschillende elektroforetische mobiliteiten maken onderscheid tussen nicked (relaxed) en supercoiled circulaire plasmide DNA ( Figuur 1 ).
      3. Verwijder de gesneden ssDNA-rek (tussen de nick sites) van het plasmide doorIncubatie met een 10-voudige overmaat van het complementaire oligonucleotide (oligonucleotide 1 in tabel 1 ), schudden bij 30 minuten bij 300 ° C bij de smeltemperatuur van het oligonucleotide (hier: 68 ° C voor pUC19N) in een warmteblok ( Figuur 1 ).
      4. Scheid de gapped plasmide uit de kleinere DNA-fragmenten met behulp van een 50 kDa molecuulgewicht afgesneden (MWCO) filter door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 10.000 xg in een tafelsentrifuge ( Figuur 1 ). Om het geconcentreerde DNA uit het filter te extraheren, draai het filter in en plaats in een nieuwe 1,5 ml reactiebuis. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1000 x g.
      5. Vul het resulterende geconcentreerde DNA-monster op 500 μl met gedeïoniseerd, gefilterd water, voeg een extra 5-voudige overmaat complementair oligonucleotide toe en herhaal stap 1.1.1.3 en 1.1.1.4 ten minste 3 keer.
      6. Test voor volledige gapping van het DNA door incubatie met een geschikt restrictie-enzym (hier: XhoI of BglII) onder gebruikmaking van conditiOns volgens de beschrijving van de fabrikant. Gebruik verdunde (nicked versus gapped) DNA monsters (~ 20 nM). Doe een agarosegel-elektroforese om onderscheid te maken tussen gelineariseerd plasmide (geen ssDNA-kloof) en niet-ingehakt DNA (gapped DNA) met behulp van het nicked DNA als positieve controle (inclusief een DNA ladder voor referentie, Figuur 1 ). Draag handschoenen.
    2. Opvullen van de kloof met gemodificeerde ssDNA oligonucleotiden
      1. Anneal het gapped plasmide via incubatie met een 25-voudige overmaat van een 5'-gefosforyleerd oligonucleotide dat de gewenste specifieke doelplaats (en) bevat, incubatie bij ~ 45 ° C gedurende 4 uur ( Figuur 1 ). Gebruik hier 48 nt ssDNA die een laesie bevat, ofwel een fluoresceine adducted thymine of een cyclobutane pyrimidine dimer (CPD), en bovendien een korte (8 nt) niet-complementaire sequentie om DNA-bubbels te produceren (zie tabel 1 ).
      2. Kovalent koppel het gegloeide insert aan het plasmide door incubaBinding met T4 DNA ligase 's nachts bij kamertemperatuur volgens het protocol van de fabrikant ( Figuur 1 ). Voor deze reactie voeg ATP met geconcentreerde buffer voorraadoplossing toe om geschikte bufferomstandigheden voor de ligase te produceren ( bv . Gebruik UvrB-reactiebuffer: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM ATP).
      3. Test voor het inbrengen van het specifieke oligonucleotide in het gapped plasmide door middel van vertering van verdunde monsters met een geschikt restrictie-enzym (hetzelfde als in 1.1.1.6) volgens het protocol van de fabrikant gevolgd door een agarosegel-elektroforese (zoals in 1.1.1.6, Figuur 1 ).
    3. Bereiding van lineair DNA-substraat
      1. Digest het gemodificeerde plasmide-DNA met restrictie-enzymen (ideaal met een enkele restrictieplaats in het plasmide) onder gebruik van de omstandigheden zoals aanbevolen door de fabrikant ( Figuur 1 ). Deze stap produceert lineaire fragmenten bevattenDe ingevoegde wijziging op een bepaalde positie invoeren. Gebruik hier SspI- en BspQI-snijden op posities 613 en 255 bp, stroomopwaarts en stroomafwaarts van het inzetstuk, respectievelijk, wat resulteert in een 916 bp DNA fragment dat de specifieke laesieplaats bevat bij ~ 30% van de DNA lengte.
        OPMERKING: Voor AFM beeldvormingsexperimenten zoals hier beschreven, zijn DNA fragmenten met lengten tussen ~ 200 bp en ~ 2.000 bp geschikte substraten.
      2. Isoleer het doelfragment via agarosegel-elektroforese en gel-extractie met behulp van een commerciele kit. Draag handschoenen voor bescherming.
      3. Optioneel, snij agarosegel met een scalpel om de DNA ladder en verdunde monsterbanen (eerste twee rijstroken) van de rijstroken die het geconcentreerde DNA bevatten te scheiden. Laat het geldeel bloot met de eerste twee rijstroken bloot aan UV-bestraling door alleen dit gedeelte van de gel op een UV-tafel te plaatsen.
        1. Knip de band uit die overeenstemt met het fragment van de keuze met een scalpel. Maak de twee geldelen opnieuw verenigbaar (uit het UV-tabbladle). Gebruik de positie van de uitgesneden band uit het verdunde monster als oriëntatie voor de positie van de band van het gewenste DNA-substraat. Account voor de hogere concentratie door iets bredere plakjes te snijden dan voor de verdunde controle.
          OPMERKING: Aangezien hier herkenning van UV-letsels werd onderzocht, werd door deze benadering zorgvuldig vermeden in het DNA-substraat de introductie van extra UV-letsels via UV-bestraling.
      4. Bereken de DNA-concentratie c uit de absorptie bij 260 nm, gemeten met een UV-Vis-spectrofotometer met gebruikmaking van de wet van Lambert-Beer met een gemiddelde molaire extinctiecoëfficiënt van dubbelzijdige DNA (dsDNA) van ε 260nm ~ 6.700 M - 1 cm - 1 per bp:
        Vergelijking
        Waar L de padlengte is (lengte van de maatkamer, typisch 1 cm).
    </ Li>
  2. Expressie en zuivering van eiwitten
    1. Recombinant UvrB uitdrukken in E. coli en zuiveren het eiwit via standaard chitine kraal affiniteit 15 en grootte exclusion chromatografie 15 zoals eerder beschreven 16 .
      OPMERKING : Het uvrB- gen van Bacillus caldotenax was gekloneerd in de pTYB1-vector.
    2. Express XPD in E. coli en zuiver het eiwit via standaard nikkel IDA affiniteit 15 en grootte exclusion chromatografie 15 gevolgd door anionuitwisselingschromatografie 15 , zoals eerder beschreven 17 .
      OPMERKING : Het gen voor Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum groep D eiwit (XPD) was gekloneerd in de pBADM11 vector. C. thermophilum p44 was een vriendelijk cadeau van Caroline Kisker's laboratorium, uitgedrukt en puriFied zoals beschreven 17 .

2. AFM Experiment

  1. Voorbeeld bereiding
    1. Optioneel pre-incubeer het DNA-substraat bij 65 ° C gedurende 10 minuten in een warmteblok om potentiële microsoutkristallen te verwijderen die tijdens de opslag in de koelkast kunnen ontstaan.
    2. Bereid de reactiebuffer (s) op 10-voudige concentratie (10x buffers).
      OPMERKING: XPD-reactiebuffer bij 1x concentratie bevatte 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 2 mM ATP; 1x UvrB reactiebuffer bevatte 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT en 1 mM ATP.
    3. Pre-incubate eiwitten bij een hogere concentratie in geschikte incubatie condities om complexe vorming te verbeteren. Voorspoel een klein volume ( bijv . 1 μL) van de afzonderlijke eiwitten in 1x eiwitreactiebuffer naar de gewenste concentratie en meng kleine hoeveelheden ( bijv . 1 μl) tHij individuele eiwitoplossingen in een 0,5 ml reactiebuis.
      1. Plaats de buis in een hitteblok voor incubatietemperaturen hoger dan kamertemperatuur. Kies een concentratieratio afhankelijk van de verwachte complexe stoichiometrie, ofwel equimolaire of overeenkomstige concentraties. Hier incubeer 1 μL XPD (20 μM in 1 x XPD reactiebuffer) en 1 μL p44 (20 μM in 1x XPD reactiebuffer) bij 10 μM elk gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
    4. Incubeer monsters bij geschikte eiwit- en DNA-concentraties in eiwitreactiebuffer in een 0,5 ml reactiebuis. Gebruik hier 500 nM UvrB of 1 μM XPD + 1 μM p44 en 100 nM DNA. Pipette kleine volumes om materiaal te besparen, bijvoorbeeld 0,25-0,5 μL eiwit (vooraf verdund tot een 10-voudige incubatieconcentratie) en DNA in een totaal volume van 2,5-5 μl 1x eiwitreactiebuffer. Incubeer hier 30 minuten bij 37 ° C in een warmteblok. Spin kort in een reactiebuis (~ 1 s) in een tafelcentrifugeE om te zorgen voor het mengen van kleine volumes.
  2. Steekproefafzetting
    1. Bereid een mica substraat: snijd een ongeveer 1 x 1 cm 2 stuk glimmer uit grotere stroken met een scalpel. Strook de bovenste lagen van het meervoudige mica met meerdere lagen uit met plakband om een ​​schoon, vlak en atoom glad oppervlak te onthullen.
      OPMERKING: Het mica-stuk kan opnieuw worden gebruikt voor meerdere experimenten door verdere laag (en) te verwijderen.
    2. Bereid de AFM afzettingsbuffer met gedeïoniseerd, gefilterd water, bijvoorbeeld 25 mM HEPES pH 7,5, 25 mM Na-acetaat, 10 mM Mg-acetaat. Filter door een 0,02 μm spuitfilter.
      OPMERKING: Divalente kationen in de afzettingsbuffer dienen de negatief geladen DNA moleculen te cheleren op het mica oppervlak, dat ook negatief geladen is bij neutrale pH. Als de relatief hoge Mg 2+ ionenconcentratie in de afzettingsbuffer een probleem voor een bepaald eiwit-DNA-systeem vormt,Het mica oppervlak kan vooraf worden geladen met aminogroepen met behulp van op silicaat gebaseerde chemie om positieve oppervlaktedata te verschaffen voor het verankeren van 18 . Sample depositie kan dan uitgevoerd worden in een buffer die geen of slechts lage hoeveelheden divalente kationen bevat.
    3. Verdun het monster (zie 2.1) voor onmiddellijke afzetting op mica in afzettingsbuffer. Plaats een klein volume (hier: 20 μL).
      OPMERKING: Verdunningsfactoren zijn afhankelijk van de monsterconcentratie. Hier, verdunde monsters 50-100x. Als een vuistregel resulteert ~ 1 nM DNA in een goede oppervlakte dekking voor ~ 1000 bp.
    4. Spoel het monster onmiddellijk drie tot vier keer met een paar milliliter gefilterd, gedeïoniseerd water, ontruim overmaat vloeistof en blaas droog in een zachte stroom stikstof. Het gehele proces van monsterafzetting naar gedroogde monsters kan binnen minder dan 30 s uitgevoerd worden.
    5. Fix het stuk mica op een microscoopschuif met kleefband aan de randen.
      OPMERKING: Verschillende AFM-systemen hebben dEisen voor het vaststellen van het monster op het podium. Andere AFM's beschikken over magnetische fasen en de mica-onderdelen worden op magnetische schijven vastgezet, bijv . Met thermische lijm. Details van het hier gebruikte AFM-systeem vindt u in de Tabel.
  3. AFM beeldvorming
    1. Plaats het monster (zie 2.2.5) centraal op de AFM-fase en maak de microscoopschuif op het podium met magnetische pads.
    2. Steek de AFM-tip in de tiphouder. Gebruik cantilevers met een scherpe (<10 nm) AFM sonde die geschikt is voor oscillerende, intermitterende contactmodusbeelden in de lucht. Gebruik AFM-probes, bijvoorbeeld , zoals vermeld in de Tabel . Hier (afhankelijk van AFM), bevestig de tip in de houder onder een klem door de klemschroef vast te draaien (vingerdicht). Steek de tiphouder in de AFM meetkop. Rust de kop op zijn rug voor deze stap.
    3. Plaats de AFM meetkop bovenop het monster. Details zijn afhankelijk van het AFM-model. Hier, mAke, zeker, het hoofd staat stabiel met zijn benen in de podiumindentaties. Zorg ervoor dat de mica zich bevindt op het podium waar de AFM-tip direct daarboven beweegt. Micrometer schroeven aan de rechterkant van het podium zorgen voor een fijne positionering van het monster.
    4. Richt de AFM laser op de achterkant van de cantilever voor optimale signaalsterkte van de positiegevoelige fotodetector waarop de laser wordt weerspiegeld. Details zijn afhankelijk van het AFM-model.
      1. Draai hier de wielen aan de rechterkant en achterkant van de AFM-meetkop om de x- en y-posities van de AFM-laser aan te passen om het centraal op het uiteinde van de cantilever te sturen. Bekijk het reflectiesignaal in het AFM video venster (indien beschikbaar, hier: druk op het camera icoon en selecteer de invoer: Svideo).
      2. Zodra u eenmaal crudely hebt gepositioneerd, optimaliseer het detectorensignaal (Sum in Sum en Deflection Meter-venster in AFM-software) door de laserpositie met de twee wielen goed af te stemmen (blijf aan het einde van de cantilever, de som signaIk hang af van het AFM en cantilever type, hier: streef naar som> 5).
    5. Zero het verschilssignaal van de bovenste en onderste diodes van de detector array (hier: afbuigingssignaal in Sum en Deflection Meter venster) door de AFM laser reflectie op het detector centrum te leiden (hier: draai het wiel aan de linkerkant van de AFM meting hoofd).
      OPMERKING: Afwijkingen van nul geven de afbuiging van de cantilever aan als gevolg van oppervlakinteracties, die door de AFM in hoogteinformatie worden vertaald.
    6. Bepaal de cantilever resonantie frequentie door middel van een frequentietoets die is geïmplementeerd in de AFM software (hier: commando automatisch afstemmen in het hoofdpaneel / Tune venster). Kies een amplitude die overeenkomt met 1 V ingang voor de piezo die de cantilever-oscillatie aandrijft. Zet de oscillatiefrequentie lichtjes (5%) lager dan de resonantiefrequentie en stel de fase van de oscillatie nul in.
    7. Benader de tip naar het monsteroppervlak met behulp van de ruwe ingrijpende modE (hier: commando inschakelen in het hoofdpaneel venster) tot de beveiligingsinstelling (instelpunt) is bereikt. Gebruik ~ 2% snijden van de vrije oscillatie amplitude als de setpoint (hier komt u in Set Point 980 mV in het hoofdpaneel).
    8. Maak de AFM-tip goed met het monsteroppervlak door het instelpunt met behulp van de AFM-software te verlagen. Doel voor afstotende modusbeeldvorming met de cantilever-oscillatiefase (Fase in Sum en Afbuigingsmeter) net onder de vrije-fase fase (voor de ingreep, hier typisch ~ 70). Gebruik hier typische eindinstellingen in de orde van 70-80% van de vrije niveau amplitude (1 V).
    9. Voordat u scant, kies de signalen voor opname in het hoofdkanaalpaneel. Kies hoogte (Ht) en amplitude (Am).
    10. Begin het scannen van het monster (hier: commando Doe scan in het hoofdvenster venster). Gebruik een scansnelheid van bijvoorbeeld 2,5 μm / s (opdracht Scansnelheid in het hoofdpaneel) naar beeldoppervlakken van 4 μm x 4 μm of 8 μm x 8 μm (voer de scangrootte in het hoofdvenster inL) met respectievelijk pixelresoluties van 2.048 of 4.096 (scanpunten en scanlijnen in het hoofdpaneel).
    11. Sla het afbeeldingsbestand op (opslaan Afbeelding opslaan in het hoofdpaneel) zonder aanpassingen aan te passen (kies Geen in het hoofdkanaalpaneel / Bewaar Plane Fit).
    12. Voor verdere analyse verwerk de opgeslagen afbeelding. Laad de afbeelding (commando Bladeren opgeslagen data in het AFM analyse menu). Open het wijzigingspaneel (druk op M in de bovenste sectie van de afbeelding). Pas een vliegtuigfit in x en y afmetingen toe op het hoogtebeeld (uitbreiding HtR) (commando XY in Planefit venster in Modify Panel, kies Planefit Order 3). Vervolgens platte de afbeelding (opdracht Flatten in Flatten venster in Modify Panel) Flatten Order 3 kiezen.
    13. Exporteer de afbeelding als een TIFF-bestand (druk op Commands in het bovenste gedeelte van de afbeelding, kies TIFF Export 2x die overeenkomt met 2,048 pixels resolutie) voor verdere analyse.

3. AFM-analyse

  1. Proteïne complex volume
    1. Pre-Selecteer relevante eiwit-DNA-complexen door directe visuele inspectie van de afbeeldingen in de AFM-software, met behulp van een geschikt kleurenschema om verschillende verschijningen van verschillende groottecomplexen te maximaliseren (zie verschillende kleuren en maten van verschillende complexen in figuur 2 ; hier: kleurenschema SeaLandAndFire in De AFMsoftware). Voor XPD-monsters omvatten mogelijke complexen XPD / p44-DNA , evenals XPD-DNA en p44-DNA, met duidelijk verschillende maten dankzij de relatief grote, verschillende moleculaire massa's van XPD (~ 95 kDa) en p44 (~ 40 kDa) .
    2. Meet volumes van individuele eiwitpieken op het DNA om het complexe type te verifiëren. Dit kan worden bereikt met verschillende beeldsoftware (hier: de sectie tool van de AFM software).
      1. Meet de hoogte (h) en de diameter (d) van de eiwitpiekafdelingen met de sectievensters. Meet de diameter dicht bij de basis van de deeltjes sectie.
      2. Bepaal het volume (V) van de erwtKs met behulp van eenvoudige wiskundige modellen, bijvoorbeeld met behulp van de volgende formule, die is gebaseerd op een bolvormig model:
        Vergelijking
    3. Vertaal gemeten volumes in een geschatte moleculaire massa van eiwitten.
      1. Initialen kalibreren van het AFM-systeem voor volume tot molecuulgewicht (MW) omzetting onder toepassing van een bereik van eiwitten met bekend molecuulgewicht (hier: in totaal 12 experimenten met tussen 25 en 851 data punten werden elk uitgevoerd op 5 verschillende eiwitten in monomere, dimeer , Trimeer- of tetramerische toestanden) 4 , 19 , 20 . Depot- en beeldproteïnen (zoals hierboven beschreven in 2.2 en 2.3) en meet hun volumes zoals hierboven beschreven (3.1.2). Plot de volumes over hun bekende moleculaire gewichten. De resulterende grafiek laat een lineaire relatie zien tussen V en MW, waarvan de vergelijking kan worden verkregen doorEen lijn die geschikt is voor de gegevens. Voor het hier gebruikte AFM-systeem werd de volgende relatie verkregen: 19 :
        Vergelijking
        OPMERKING: deze stap hoeft niet voor elke meting te worden herhaald, maar wordt slechts één keer gedaan. Het volume naar MW-kalibratie kan worden toegepast op afbeeldingen die worden verkregen onder vergelijkbare afbeeldingsomstandigheden met AFM-probes met licht wisselende diameters.
      2. Bepaal op basis van hun gemeten volumes (3.1.2) en de V-to-MW-kalibratie (3.1.3.1) de geschatte MW van de eiwitcomplexen 20 , die informatie verschaffen over de moleculaire inhoud ervan. Bijvoorbeeld , voor XPD / p44 monsters, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa en ~ 140 kDa werden verkregen, consistent met p44-DNA complexen (of pieken veroorzaakt door blote DNA superstructuur), XPD alleen pieken en respectievelijk XPD / p44 pieken .
  2. Proteïne complexe posities op DNA
    1. Bepaal het DNAFragmentlengtes.
      1. Traceer de DNA-fragmenten in de AFM-afbeeldingen, bijv . Met de freehand-lijnfunctie van een geschikte beeldanalysesoftware (zie bijvoorbeeld tabel van materialen) en meet de lengte van de lijn.
        OPMERKING: uitsluit DNA-aggregaten, evenals fragmenten die door de beeldmarges worden afgesneden.
      2. Plaats de DNA-lengtes van het gehele experiment in een histogram en plot het met behulp van geschikte data-analyse en grafische software (zie bijvoorbeeld Tabel van Materialen ).
      3. Pas de lengteverdelingen aan met een Gaussische kromme in de data-analyse en grafische software om de lengte van de DNA-fragmenten te bepalen. Om de positie van de ingevoegde DNA-doelplaats te kunnen zien (zie 1.1), omvatten alleen DNA-fragmenten met de juiste lengte binnen twee standaardafwijkingen van het centrum van de Gauss-kromme (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), waar z een normfactor is en x c en w zijn het midden enVolledige maximale halve breedte van de Gaussian) in verdere analyses.
        OPMERKING: De DNA lengte in het midden van de Gauss-kromme moet dicht bij de theoretische lengte van het DNA-fragment zijn (berekend met behulp van 0,34 nm / bp). Lengtes tot 10% korter dan de theoretische waarde zijn typisch en worden waarschijnlijk veroorzaakt door AFM-resolutie limieten.
    2. Bepaal posities van eiwitpieken op DNA-substraten.
      1. Meet de afstand van de eiwitpieken uit het dichter DNA fragment, zoals beschreven in 3.2.1.1 en verdeel met de totale DNA lengte om afstanden te verkrijgen in eenheden van fractie van DNA lengte.
      2. Doe de gemeten afstanden in een histogram en plot met behulp van een geschikte data analyse en grafische software (zie bijv . Figuur 3 ). Als vuistregel, kies een bin grootte die ongeveer √n-bakken geeft voor n data-punten.
        OPMERKING: Aangezien DNA-eindjes hier niet kunnen worden onderscheiden, plot alleen op fractie van DNA lengte 0,5 (centrum van DNA fragment). Omdat DNA-eindbinding niet de focus van de studie is, sluit de DNA-eindjes uit de analyses uit door de positiegegevens licht na positie 0 te binnen (bijvoorbeeld hier: binning van een DNA-lengte fractie van 0,02).
    3. Bepaal de specificiteit van de doelplaats van eiwitcomplex positieverdelingen.
      1. Pas de maximale (verbeterde bindingsgebeurtenissen) in de positieverdeling met een Gauss-kromme zoals in 3.2.1.3 vast maar doe op de hoogte van de achtergrondbinding (zie figuur 3 ).
      2. Bereken de specificiteit S voor de specifieke site versus de niet-specifieke DNA-achtergrond (eiwitmoleculen gebonden aan niet-specifieke DNA-plaatsen) met de volgende formule 21
        Vergelijking
        Een sp : Aantal specifieke complexen (gebied onder de Gaussische kromme)
        Een nsp : Aantal niet-specifieke complexen (gebied van de achtergrond, 0 ); De hier beschreven fractie van DNA lengte is 0,48 voor een histogram dat begint bij 0,02 DNA lengte)
        N: aantal mogelijke DNA-bindingsplaatsen (hier: N = 914 exclusief DNA-uiteinden)
  3. DNA-buighoeken
    1. Met behulp van het hoekgereedschap in een geschikte beeldanalysesoftware, meet de hoek β tussen twee lijnen die centraal langs de DNA-ruggengraat zijn geplaatst en centreren bij de eiwitpiek (zie bijv . Inzet in Figuur 4 ). Meet de hoeken voor een statistisch relevant aantal eiwit-DNA-complexen (> 50, ideaal> 100) 2 , 3 , 5 .
      OPMERKING: De DNA-bochthoek wordt gedefinieerd als 180 ° -β 2 , 3 , 5 .
    2. Met behulp van data analyse en grafische software(Zie Tabel van Materialen) een buighoekverdelingshistogram produceren door de DNA-buighoeken te bineren.
    3. Pas de buighoekverdeling aan met een Gauss-curve. Als er meer dan één maximum zichtbaar is in de verdeling, kies dan meerdere piek Gauss fit. Het middelpunt (en) van de Gaussische kromme (en) geeft de gemiddelde bochthoekstand van de specifieke soort.
    4. Als een verschuiving in de bochthoek (en) (maxima van Gaussian fit (s)) zichtbaar is voor verdelingen, bijvoorbeeld van verschillende eiwitvarianten of verschillende eiwitcomplexen, dient u een student t-test toe te passen om het significantieniveau van de veranderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Onderscheid tussen verschillende complexe types op basis van eiwitcomplexvolumes

De helicase activiteit van het prokaryotische NER helicase UvrB wordt gestimuleerd door DNA-binding 22 , 23 . UvrB vereist een ongepaarde regio in het DNA (een DNA-bubble) om correct op een van de twee single ssDNA-strengen te laden. In vivo wordt deze DNA-structuur verschaft door DNA-interacties via een ander eiwit van de NER-cascade; In in vitro experimenten kan de bubbel kunstmatig in dsDNA-fragmenten worden geïntroduceerd in de nabijheid van een doellaesie. Proteïne-eiwit interacties versterken ook DNA binding door UvrB 9 . Echter, zodra UvrB op DNA geladen is, lijkt de activiteit ervan niet te zijn afhankelijk van eiwitco-factoren 9 . Daarentegen vereist de eukaryote NER helicase XPD interactiOp met het eiwit p44, dat als XPD deel uitmaakt van het multifunctionele transcriptiefactor IIH (TFIIH) complex in vivo , voor het activeren van zijn helicase activiteit, maar deze interactie heeft geen invloed op XPD binding aan DNA 17 . Er wordt verwacht dat XPD alleen op DNA op een DNA-bubble loopt, maar niet naar de letsel verplaatst (in afwezigheid van zijn helicase-activerende co-factor). XPD zonder p44 zou bijgevolg niet kunnen interageren met en identificeren van de laesie wanneer geladen op een afstand van de lesion site. Incubaties van XPD met p44 in aanwezigheid van lesion bevattende DNA-substraat resulteren in een mix van XPD- of XPD / p44-DNA-complexen (en mogelijk een kleine soort van p44 alleen gebonden aan DNA). Om de lesie herkenning door XPD / p44 en XPD afzonderlijk te analyseren, kunnen deze verschillende complexe types onderscheiden worden op basis van hun volumes in AFM-afbeeldingen ( Figuur 2 ) 9 , zoals beschreven in Protocol 3.1 hierboven. AFM-systemen kunnen gekalibreerd worden met een bereik van pRoteinen met bekend molecuulgewicht, om een ​​lineaire relatie tussen het AFM volume en de benaderde moleculaire massa van een eiwit (complex) 20 te onthullen, waardoor een interpretatie van de gemeten volumes mogelijk is. Bindende posities op het DNA kunnen derhalve afzonderlijk worden bepaald voor helicase inactieve monomeer XPD (~ 95 kDa, consistent met de ~ 100 nm 3 klasse 2 species in Figuur 2 ) en voor helicase actieve XPD / p44 complexen (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 klasse 3 soorten), gebaseerd op hun verschillende AFM volumes.

Lesie-herkenningsbepaling uit eiwitbindende posities op DNA

Hier werden lange (916 bp) DNA-substraten die een letsel bij ~ 30% van de DNA-lengte bevatten, gebruikt. Beheersing over de exacte positie van de laesie in het DNA-substraat maakt het onderscheid mogelijk tussen specifieke (laesiegebonden, bij 30% van de DNA-lengte) en nonspeCific (lesion search) complexen afhankelijk van hun posities op het DNA. Er werden twee verschillende laesies gekozen, die doelstellingen van NER zijn; DNA-substraten bevatte ofwel een fluoresceïne (F) -adduct of een cyclobutaanpyrimidinedimer (CPD). Naast de laesieplaats bevatte het DNA een ongepaarde regio (8 nt DNA-bubble) die als laadplaats voor de helicasen diende. Deze laadplaats was op een afstand van 26 nt (voor de F bevattende DNA substraten) of 23 nt (voor de CPD bevattende substraten) ofwel 5 'of 3' van de laesie (zie tabel 1 ). Lesie herkenning leidt tot vertraagde DNA translocatie van de helicasen UvrB en XPD op de doelplaats, duidelijk in de AFM eiwitpositie verdeling op DNA als een piek in de positie van de laesie. De lesie- en bubbelposities in deze substraten kunnen op zich niet onderscheiden worden binnen de resolutie limieten van AFM-beeldvorming (<10 nm afstand). Echter, de fractie van specifieke complexen die de a vertegenwoordigenMoleculenmassa stalled bij de laesie en wijst op de erkenning van de laesie, hangt sterk af van de vraag of de laesie 3 'of 5' van de bubbel is geplaatst ( figuur 3 ) 9 .

Uit de fractie van complexen op de specifieke plaats (gebied onder de Gaussische fitpiek versus gebied van de niet-specifieke gebonden achtergrond) werd de specificiteit, S, van UvrB en XPD voor de twee onderzochte letselsoorten berekend (zie protocol 3.2 hierboven). Voor UvrB leidde 5'-laadpositie tot hogere specificiteiten (SB , F5 ~ 200 en SB, CPD5 ~ 400) dan het laden van 3 'van de laesie ( SB , F3 en SB, CPD3 ~ 100) voor Beide letselsoorten. Voor XPD werden complexen die alleen XPD (klasse 2 in figuur 2 ) bevatten en complexen die XPD bevatten, evenals het helicase-activerende cofactor eiwit p44 (klasse 3 in figuur 2 ) onderscheiden als descrIbed in de vorige sectie. Klasse 2 eiwitpieken (alleen XPD, helicase inactief) liepen niet bij voorkeur op lesion sites onafhankelijk van of ze 5 'of 3' waren geladen en onafhankelijk van het laesietype (data niet getoond). In tegenstelling toonden de positieverdelingen voor XPD / p44 (klasse 3) complexen verbeterde binding bij F-laesies voor het laden van 5 'van de laesie (S XPD / p44, F5 ~ 300 versus S XPD / p44, F3 ~ 100) maar bij CPD Laesies voor het laden van 3 'van de laesie (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 versus S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Figuur 3 ). Omdat UvrB en XPD 5'-to-3'-helicasen zijn, geven deze gegevens informatie of complexen via interacties met de laesie in de ssDNA-streng worden gestopt die ze verplaatsen (de getransloxeerde streng voor het laden van 5 'van de laesie) Of binnen de tegenovergestelde, niet-getransloiseerde streng (voor het laden van 3 'van de laesie). Het concept wordt schematisch weergegeven in

Onderzoek naar conformatieve veranderingen bij de identificatie van letsels door XPD

Het meten van de buiging die in DNA wordt geïntroduceerd op de plaats van gebonden complexen uit AFM-afbeeldingen (zie protocol 3.3 hierboven) kan belangrijke informatie over complexe conformiteitsveranderingen onthullen. DNA-buighoeken werden gemeten voor archeale XPD 5 , die geen proteïne co-factor interactie vereist voor helicase activiteit. In deze studies was een fluoresceine laesie gelegenIn de context van een DNA-bubble voor verhoogde eiwitbelading bij de laesie, bij ~ 30% van de DNA-fragmentlengte. Figuur 4 toont Gaussiaanse pasjes aan DNA-buighoekverdelingen verkregen voor eiwitcomplexen bij niet-beschadigde DNA-posities en bij 30% DNA lengte, consistent met XPD gebonden op de positie van de fluoresceine laesie (specifieke complexen). De gegevens tonen een gemiddelde bochthoek van ~ 50 ° voor niet-specifieke complexen versus ~ 65 ° voor specifieke complexen. Deze DNA-buighoekverschuiving was afhankelijk van de aanwezigheid van ATP- of ATP-patronen, wat aangeeft dat ATP (herbindend) maar niet hydrolyse nodig was voor de conformational rearrangements 5 .

Figuur 1
Figuur 1: Bereiding van DNA-substraten. Een ssDNA kloof wordt geïntroduceerd in circulair plasmide DNA door het plasmide (hier met de nickase N.BstNBI) bij cloAfzonderlijke plaatsen en het verwijderen van de afgesloten ssDNA-stretch via centrifuge-filtratie na hitte destabilisatie in aanwezigheid van een overmaat complementair oligonucleotide. Een specifiek oligonucleotide dat het kenmerk van de keuze bevat, kan dan worden gehelteerd en geligeerd in het kloofgebied. Tenslotte resulteert de spijsvertering met restrictie-enzymen (hier met SspI en BspQI) in een lineair DNA-substraat met de doelfunctie op een precies bekende positie (hier bij 30% van de DNA-fragmentlengte). Controle-analyses maken het mogelijk om de afzonderlijke stappen te testen (hieronder getoond) via agarosegel-elektroforese (zwarte pijl geeft 3000 bp aan). Nicking kan getest worden door de gewijzigde elektroforetische mobiliteit van het nicked, relaxed circular DNA (control nicking, Lane 2) versus het supercoiled plasmide (laan 1). Volledig gapping van het DNA evenals de daaropvolgende invoeging van de specifieke oligo kan getest worden door middel van spijsvertering met een restrictie-enzym dat in het kloofgebied snijdt (hier: XhoI, inLanes 2, 4 en 6), zodat een gebrek aan DNA-incisie duidelijke gapvorming aangeeft (lanes 1,2 nicked DNA, lanes 3,4 gapped DNA) en hersteld incisie geeft aan dat de specifieke oligo (lanes 5,6) . Het uiteindelijke lineaire substraat dat de specifieke functie bevat, kan van de gel na agarosegel-elektroforese worden gezuiverd en getest op homogeniteit en zuiverheid via AFM-beeldvorming. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Verschillende complexe typen onderscheiden van hun AFM-volumes. ( A ) AFM beeld van XPD / p44-DNA (grijze pijl) en XPD-DNA (zwarte pijl) complexen. ( B ) Voorbeelden van drie verschillende soorten DNA-gebonden complexen, geïnterpreteerd als p44 of loutere DNA-superstructuur (klasse 1),XPD (klasse 2, zwart kader) en XPD / p44 (klasse 3, grijs kader) complexen op basis van hun AFM-volumes (rechts weergegeven). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Verschillende lesie herkenning strategieën van prokaryotische en eukaryote NER helicasen. Lesion-herkenning bevoegde DNA-translocatie door de NER-helicasen UvrB en XPD (in complex met zijn helicase-activerende co-factor p44) vereist het laden van de eiwitten in een ongeparreerd DNA-gebied (DNA-bubble). De eiwitten bewegen dan in 5'-naar-3'-richting langs de ssDNA-streng waarop ze geladen zijn. Erkenning van een DNA-letsel (hier: CPD) door de helicasen ofwel op de getransloceerde streng (voor het laden bij 5 'bubble) of op de tegenovergestelde, niet-getransloiseerde streng (foR laden bij 3'-bubbel) resulteert in vertraagde DNA-translocatie. In de positieverdelingen blijkt dit als een piek (Gaussische fitlijnen), die aangeeft dat de binding bij de laesiepositie (bij ~ 30% van de DNA-lengte voor DNA-substraten hier getoond) wordt aangetoond. De prokaryotische NER helicase UvrB en zijn eukaryotische tegenhanger XPD tonen verschillende strategieën van CPD lesie herkenning die verschillende DNA-strandvoorkeuren aanduiden. Specifiek worden CPD-laesies herkend op de getransloceerde streng door UvrB, maar bij voorkeur op de tegenovergestelde, niet-getranslodeerde streng door XPD. Figuur gewijzigd van referentie 9 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Conformerende veranderingen in XPD-DNA complexen na lesion identificatie. De verdelingen van DNA-buighoeken geïnduceerd door XPD geven conformatieve veranderingen aan in de eiwit-DNA-complexen bij een fluoresceine laesie. Deze conformatieve herrangschikkingen waren afhankelijk van de aanwezigheid van ATP (B) of ATP-individuS (C). ( A ) Bij afwezigheid van ATP zijn niet-specifieke buighoeken (grijs) en buighoeken op de laesieplaats (specifieke buighoeken, zwart) vergelijkbaar en passen ze door een Gaussische kromme met een middelpunt van ~ 50 °. ( B , C ) In de aanwezigheid van ATP of ATP ● ● s, toont de specifieke bochthoekverdeling (zwart) een significante verschuiving (P = 2,5 x 10 -7 ) tot een gemiddelde bochthoek van ~ 65 °. Dit DNA buigen op de lesion site was onafhankelijk van het type laesie (CPD of fluoresceine adduct) of de aanwezigheid of afwezigheid van een DNA bubble 5 . Figuur is gereproduceerd uit referentie 5 . De inzet in (C) laat zien hoe de bochthoeken (180 ° -β) werden bepaald.Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

aantal volgorde Beschrijving
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 		bodem
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		F / 5 'bubble
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		F / 3 'bubble
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		F / bubble

Tabel 1: DNA-oligonucleotiden voor DNA-substraatbereiding. Alle oligonucleotiden zijn 48 nt lang en bovenste strengen (oligonucleotiden 2-6) werden op hun 5'-einde gefosforyleerd voor ligatie in het gapped DNA (zie protocol 1.1). F = fluoresceine adducted thymine, TT = cyclobutaanpyrimidine (thymine) dimer (CPD), niet-complementaire gebieden (DNA-bubble vormende gebieden) worden onderstreept. F bevattende oligonucleotiden werden verkregen uit geïntegreerde DNA Technologies (IDT), CPD bevattende oligonucleotiden werden vriendelijk verschaft door het laboratorium van Thomas Carell (Ludwig-Maximilian University Munich, Duitsland).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM statistische analyses van bindende posities van eiwitten op lange DNA-fragmenten die specifieke doelstellingsplaatsen bevatten, kunnen interessante details aantonen over de specifieke strategieën die door het eiwit gebruikt worden om deze sites 2 , 3 , 4 , 5 , 6 te herkennen. Om de resulterende positieverdelingen te interpreteren, moeten de posities van de doelen in het DNA precies bekend zijn. Dit wordt bereikt door specifieke locaties in goed gedefinieerde volgordeposities in cirkelvormig plasmide-DNA in te voeren en een fragment van het DNA, inclusief deze specifieke site, uit te breiden met behulp van restrictie-enzymtechnologie. In AFM-beeldanalyses van eiwitbindende posities kunnen alleen DNA-fragmenten met de juiste lengtes (consistent met de volledige lengte van het uitgesneden fragment) worden opgenomen, omdat alleen voor deze de positie van de doelplaats bekend is. Het is geen waardDat de hier beschreven voorbereidingsprocedure resulteert in lineaire DNA-substraten met twee onderscheidbare fragmenteinden. Positiedistributies kunnen derhalve alleen worden gemeten en geplot van 0 x DNA lengte (eiwitten gebonden bij DNA-fragmenten) tot 0,5 x DNA lengte (eiwitten gebonden in het midden van fragmenten). Bovendien, voor doelposities die niet precies in het midden van het substraat liggen, bevatten deze verdelingen altijd een kleine achtergrond van eiwitten die niet op dezelfde afstand van het andere DNA-einde zijn gebonden. Bij het aanpassen van een Gaussische kromme aan de verdeling die op de gemiddelde achtergrondhoogte (niet-gebonden eiwitten, Figuur 3 ) staat, is echter rekening gehouden met deze complexen. Als alternatief kan één van de DNA-uiteinden worden geëtiketteerd, bijvoorbeeld met kleine volume pieken van secundaire structuur die ssDNA overhangen 24 vormt . Typische resolutie limieten van deze positie analyses liggen binnen het bereik van 100-voudige voorkeur van target siTe over nonspecifieke site binding. Bovendien vormen DNA-fragmenten geen non-specifieke dsDNA-sites, maar vertegenwoordigen dsDNA pauzes. DNA-reparatie-eiwitten binden vaak aan deze gedestabiliseerde fragmenteinden, in aanvulling op de intern-geïntroduceerde specifieke doelwebsites. DNA-eindbinding kan worden onthuld door AFM-analyses en kan belangrijke informatie geven over de functie van een eiwit. Als DNA-eindbinding niet de focus van belang is, kunnen deze posities gemakkelijk uit de positieverdelingen worden weggelaten door de plots in een positie> 0 te beginnen ( bijv . 0,02 DNA lengtes).

Een van de bijzondere voordelen en, in feite, het definiëren van gemeenschappelijk eigendom van single molecule technieken is de oplossing van individuele, verschillende staten die in een monster aanwezig zijn, die veel verschillende eigenschappen en activiteiten kunnen bezitten. Zelfs in gevallen waarin de specifieke soorten van belang slechts in een steekproef zelden kunnen zijn, staan ​​deze benaderingen dus toeAparte focus op deze soort wier bijdragen zouden worden verduisterd in een ensemble-meting. Voor eiwitmonsters maakt bijvoorbeeld AFM beeldvorming het rechtstreekse onderscheid tussen verschillende soorten eiwitcomplexen mogelijk op basis van complex volume, indien de grootte van de afzonderlijke eiwitten voldoende verschilt (typische resolutie grenzen zijn ongeveer 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . AFM-systemen kunnen worden gekalibreerd om de translatie van de gemeten volumes in het molecuulgewicht van eiwitten toe te staan ​​(Protocol 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . Alternatief zijn eiwitstandaarden met bekende maten gebruikt als een directe referentie in de afbeeldingen 1 , 6 . In deSysteem dat hierin is gericht, zouden bindende posities op DNA derhalve afzonderlijk kunnen worden bepaald voor de helicase inactieve monomeer XPD en voor helicase actieve heterodimere XPD / p44 complexen. Preferentiële binding aan een laesieplaats op een goed gedefinieerde positie in het DNA aangegeven DNA-laesie-herkenning door een eiwitcomplex. Aangezien proteïne-laad- en laesiesites ruimtelijk gescheiden waren, was DNA-translocatie een vereiste voorwaarde voor laesieherkenning in de hier gebruikte DNA-substraten. Alleen de heterodimere XPD / p44-complexen waren in staat om DNA-translocatie te vertonen ( Figuur 3 ), consistent met resultaten van helicase activiteit assays 9 . AFM volume analyse kan dus belangrijke informatie verschaffen over differentiële activiteiten van verschillende eiwitcomplexvormen.

Lesie-interactie en herkenning door het helicase-actieve XPD / p44-complex resulteerde in verbeterde binding op de doelplaats als gevolg van het stoppen van helicase-translocatie ( Figuur 3 Figuur 3 ), wijst deze bevinding op dat het enzym fluoresceïne bij voorkeur op de getransloceerde streng detecteert maar CPD bij voorkeur op de tegenovergestelde, niet-getransloiseerde streng. Het prokaryotische NER-helicase UvrB herkende daarentegen zowel fluoresceïne- als CPD-laesies bij het laden van 5 'van de laesie, dwz op de getransloceerde streng ( Figuur 3 ). Deze onderscheidende verschillen in hun letselherkenningseigenschappen kunnen worden begrepen uit de verschillende structurele eigenschappen van de twee helicasen. UvrB interactieert met potentiële doelen iN het DNA via aminozuurresten aan de binnenzijde van een β-haarspeldeigenschap in het enzym waarachter de getranslodeerde streng waarschijnlijk 16 , 25 schroefdraad heeft. XPD, aan de andere kant, heeft een kleine porie in de nabijheid van een ijzerzwavel (FeS) cluster 26 . De getransloceerde DNA-streng trekt waarschijnlijk door deze porie 26 . Bulkier laesies zoals fluoresceïne kunnen helicase translocatie stoppen via interacties met residuen binnen deze porie, terwijl minder omvangrijke CPD laesies gemakkelijker kunnen worden geïdentificeerd via interacties met het FeS cluster. In het prokaryotische systeem worden twee moleculen UvrB verondersteld betrokken te zijn bij het zoeken naar doelpunten in een hetero-tetramerisch UvrA2-UvrB2-complex, waarin elk van de twee UvrB-monomeren in staat is om een ​​andere DNA-streng 27 te onderzoeken. XPD in eukaryotische NER bestaat waarschijnlijk als een enkele kopie in deTFIIH laesie herkenning complex. Flexibiliteit in lesie-interactiebenaderingen van het eukaryote enzym kan derhalve nodig zijn om herkenning van het extreem grote doelsitespectrum van het NER reparatiesysteem mogelijk te maken.

Omdat specifieke (doelgebonden gebonden) en niet-specifieke complexen kunnen onderscheiden worden in AFM-beelden op basis van hun posities op het DNA, kunnen deze verschillende complexe types afzonderlijk worden geanalyseerd en vergeleken. Enkele molecuul AFM is een van de weinige benaderingen die toegang verschaffen tot structurele eigenschappen van eiwitcomplexen die niet specifiek gebonden zijn aan DNA vanwege hun vaak voorbijgaande of veranderlijke aard. Hier werden conformatieve veranderingen op de herkenning van de doelplaats geconfigureerd en gekenmerkt door archeale XPD, gebaseerd op de buiging die in het DNA door het enzym werd geïntroduceerd. De AFM data onthulde een kleine maar duidelijke, significante verschuiving in DNA-buighoeken voor XPD gebonden op een lesion site versus XPD gebonden aan nonspecifieke DNA 5 . conformationeleVeranderingen in de DNA-gebonden eiwitten bij identificatie van de targetplaats waarschijnlijk leiden tot de werving van de NER-endonucleasen (XPG en XPF in eukaryotische NER) die excisie uitvoeren van een korte hoeveelheid ssDNA die de letsel bevat. Interessant genoeg vereist deze verschuiving en dus conformationele herrangschikking binding van ATP aan het enzym (maar niet hydrolyse). Een vergelijkbare aanpak van ATP-remming op identificatie van de targetplaats en daaropvolgende werving van UvrC-endonuclease is gerapporteerd voor UvrB in prokaryotische NER 28 , 29 .

Samengevat heeft AFM single molecule beeldvorming subtiele verschillen in de herkenning van de target site door de prokaryote en eukaryote NER helicasen aangetoond. Zodra een doellesing door de enzymen is geïdentificeerd, delen ze een soortgelijke strategie om de NER-endonucleasen via een ATP-binding geïnduceerde conformatieve herrangschikking selectief te werpen bij de letsel. De techniek van AFM in comBinatie met voorzichtig DNA-substraatontwerp om essentiële eigenschappen van het onderzochte systeem te nabootsen, kan derhalve inzicht geven in de interactie van de target site van niet alleen DNA-reparatie, maar ook DNA-bindende proteïnesystemen in het algemeen. Structurele informatie over zowel specifieke als nonspecifieke complexen met resoluties in het lage nanometerbereik (op het moleculaire niveau, beperkt door de AFM sonde) kan aanzienlijk bijdragen tot het begrijpen van de betrokken mechanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

PUC19N, CPD-bevattende oligonucleotiden en p44 werden vriendelijk verschaft door respectievelijk Samuel Wilson, Korbinian Heil en Thomas Carell, en Gudrun Michels en Caroline Kisker. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 en TE-671/4 naar IT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

Genetica Atomic Force Microscopy (AFM) Proteïne-DNA interactie DNA reparatie Nucleotide excision repair (NER) DNA lesie herkenning DNA modificatie AFM monster voorbereiding AFM volume analyse DNA binding positie analyse.
Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter