Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg
* These authors contributed equally

Introduction

La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica potente per l'analisi delle interazioni proteine-DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Richiede solo basse quantità di materiale di campionamento per visualizzare direttamente campioni eterogenei con una risoluzione a livello di singola molecola. L'eterogeneità può derivare da diversi stati conformazionali o oligomerici di una proteina. In particolare, nel contesto di campioni di proteine-DNA, i complessi proteici possono mostrare diverse stoichiometrie e / o conformazioni indotte dal legame del DNA in generale o che si legano ad un sito target specifico all'interno del DNA. I campioni eterogenei possono anche contenere due (o più) diversi tipi di proteine ​​e diversi complessi proteiciForme ( ad esempio , costituite da un solo tipo di proteine ​​contro complessi eteromerici) possono interagire in modo diverso con il DNA. Gli studi qui discussi sfruttano l'imaging AFM in aria su campioni statici e secchi di proteine ​​di riparazione del DNA legate a lunghi frammenti di DNA (~ 900 base paia, bp) che contengono una lesione che rappresenta un obiettivo di queste proteine. L'elevata risoluzione molecolare di AFM consente di distinguere tra diversi tipi di complessi proteici e di determinare le posizioni di legame delle proteine ​​sui frammenti del DNA. Importante, le lesioni vengono introdotte nei substrati del DNA a posizioni ben definite. Poiché la posizione del sito di lesione nel DNA è nota, le distribuzioni di proteine ​​legate al DNA forniscono una visione delle proprietà di riconoscimento delle diverse lesioni (differenti) dei complessi proteici (diversi), ad esempio , quanto bene riconoscono un particolare tipo di lesione A DNA non danneggiato) 2 , 3 , , 5 , 6 . Le loro posizioni sul DNA permettono anche la distinzione tra i complessi proteici legati specificamente alle lesioni e ai complessi legati in modo non specifico altrove sul DNA. La caratterizzazione separata di questi diversi tipi complessi (complessi legati specificamente al complesso lesionario o non specifico) possono rivelare potenziali variazioni conformazionali nei complessi indotti dall'identificazione del sito di destinazione.

Le proteine ​​di riparazione del DNA concentrate qui sono le elicasi che sono responsabili del riconoscimento delle lesioni nel percorso di riparazione delle escisioni del nucleotide (NER). Nei batteri, il NER è ottenuto dalle proteine ​​UvrA, UvrB e UvrC. UvrA è responsabile della rilevazione iniziale delle lesioni in un complesso di scansione DNA di UvaA 2 / UvrB 2 . Alla verifica della lesione da UvrB questo complesso si converte in UvrB monomerico legato al sito della lesione e questo complesso specifico può quindi reclutare la pRocaryotic NER endonucleasi UvrC. UvrC eccisce un breve tratto (12-13 nt) di DNA a singolo filamento (ssDNA) contenente la lesione. Il tratto mancante viene poi riempito dalla DNA polimerasi. Infine, la ligasi DNA sigilla il tratto appena sintetizzato con il DNA originale 9 , 10 . Negli eucarioti, la maggior parte delle proteine ​​della cascata NER fa parte del complesso multimerico di trascrizione II H (TFIIH). Dopo la rilevazione iniziale della lesione attraverso il complesso trimerico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH viene reclutato nel sito di destinazione del DNA. Quando XPD all'interno del complesso verifica la presenza di una lesione target NER, le endonucleasi eerichee NER XPG e XPF vengono reclutate per accusare un breve tratto (24-32 nt) di ssDNA contenente la lesione 9 , 10 . Qui, in particolare, sono state studiate le elicasi UvrB e XPD da NER prokaryotico e eucariotico. Queste elicasi richiedono una regione non distinta nellaDNA (una bolla del DNA) per filettare su uno dei due singoli filamenti del DNA e successivamente traslocare lungo questa fili alimentata da idrolisi ATP. Oltre alle lesioni del DNA, una bolla del DNA è stata quindi introdotta nei substrati che funge da luogo di caricamento per le proteine.

La procedura per la preparazione di substrati specifici del DNA della lesione è stata descritta in precedenza 11 . Richiede un costrutto circolare del DNA (plasmide) con due siti di restrizione strettamente distanziati per un nickase. Nel contesto di questo studio è stato utilizzato il plasmide pUC19N (2729 bp) (creato dal laboratorio di S. Wilson, NIEHS). Questo plasmide contiene tre siti di restrizione strettamente distanziati per la nickel Nt.BstNBI che costituiscono un tratto di 48 nucleotidi (nt). Dopo l'incubazione con il nickase, il tratto di ssDNA tra questi siti può essere rimosso e sostituito da un oligonucleotide contenente qualsiasi caratteristica di destinazione. Dopo ogni passaggio, la digestione enzimatica completa viene testata mediante gel agarosioelettroforesi. Il DNA circolare nichelato può essere distinto a causa della sua minore mobilità elettroforetica rispetto al plasmide originale supercoiled. Lo scorrimento del DNA e la sostituzione del tratto rimosso con l'oligonucleotide specifico del substrato possono essere valutati tramite la digestione con un enzima di restrizione che incide il substrato esclusivamente all'interno della regione tra i nicchie. La linearizzazione del plasmide circolare da parte dell'enzima verrà quindi soppressa per il DNA scompattato e ripristinato dopo l'inserimento del oligonucleotide specifico. Infine, due siti di restrizione endonucleasi (idealmente taglienti singoli) consentono la generazione di un substrato lineare del DNA, con lunghezza come desiderato e con il sito target specifico in una posizione definita, nonché una bolla del DNA a distanza dalla lesione in 5 'O 3' direzione.

Il riconoscimento delle lesioni da parte delle elicasi NER può essere studiato tramite l' imaging AFM. La traslocazione del DNA degli alligati a tIl sito della lesione è visibile come un picco nella distribuzione della posizione proteica sul DNA e indica il riconoscimento della lesione. Poiché la traslocazione del DNA di queste elicasi è inoltre direzionale, con polarità 5'-3 ', la dipendenza del riconoscimento della lesione sulla posizione del sito di carico (bolla del DNA a monte oa valle della lesione) indica anche se la lesione è preferenzialmente riconosciuta Sullo strato ssDNA traslocato o al contrario, non traslocato , 5 , 9 . Nelle sezioni seguenti vengono introdotti i metodi utilizzati e saranno discussi brevemente i principali risultati di questi esperimenti. Importante, analogo al lavoro esemplare sulla riparazione del DNA mostrato qui, l'imaging AFM può essere applicato allo studio di diversi sistemi interattivi del DNA, come la replicazione del DNA o la trascrizione 8 , 12 , 13 , 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione del campione

  1. Preparazione dei substrati del DNA 11
    1. Generare un gap di ssDNA nel plasmide
      1. Completamente digerire un campione del plasmide (qui: modificato pUC19, pUC19N) in un tubo di reazione con una appropriata nickasi (qui: Nt.BstNBI) seguita da inattivazione del calore enzimatico, utilizzando condizioni secondo il protocollo del produttore (si veda la figura 1 per uno schema presentazione). Iniziare con ~ 50 μL e ~ 500 nM plasmide per una resa sufficiente.
      2. Verificare il plasmide di nicking mediante elettroforesi di agarosio su campioni diluiti (~ 20 nM) 15 . Indossare guanti per la protezione contro il colorante vincolante utilizzato per la visualizzazione del DNA.
        NOTA: Le differenti mobilitazioni elettroforetiche permettono di distinguere tra il DNA plasmidico circolare (rivelato) e il DNA circolare supercoiled ( Figura 1 ).
      3. Rimuovere il tratto ssDNA inciso (tra i siti nick) dal plasmide daIncubazione con un eccesso di 10 volte l'oligonucleotide complementare (oligonucleotide 1 nella tabella 1 ) agitando a 300 giri / min per 30 minuti vicino alla temperatura di fusione dell'oligonucleotide (qui: 68 ° C per pUC19N) in un blocco termico ( Figura 1 ).
      4. Separare il plasmide gapped dai frammenti di DNA più piccoli usando un filtro da taglio di peso molecolare di 50 kDa (MWCO) mediante centrifugazione per 10 min a 10.000 xg in una centrifuga da tavola ( Figura 1 ). Per estrarre il DNA concentrato dal filtro, invertire il filtro e inserire in un nuovo tubo di reazione da 1,5 ml. Centrifugare per 3 min a 1.000 x g.
      5. Riempire il campione di DNA concentrato risultante a 500 μL con acqua deionizzata e filtrata, aggiungere un ulteriore eccesso di 5 volte l'oligonucleotide complementare e ripetere le fasi 1.1.1.3 e 1.1.1.4 almeno 3 volte.
      6. Test per la completa eliminazione del DNA mediante incubazione con un idoneo enzima di restrizione (qui: XhoI o BglII) utilizzando conditiIn base alla descrizione del costruttore. Utilizzare campioni di DNA diluiti (nicked versus gapped) (~ 20 nM). Eseguire un'elettroforesi con gel agarosio per distinguere tra il plasmide linearizzato (che non contiene ssDNA gap) e il DNA non inciso (DNA gapped) utilizzando il DNA nicked come controllo positivo (include una scala del DNA per riferimento, figura 1 ). Indossare i guanti.
    2. Riempire il divario con gli oligonucleotidi ssDNA modificati
      1. Incollare il plasmide gapped mediante incubazione con un eccesso di 25 volte di un oligonucleotide fosforilato 5 'che contiene i siti specifici di scelta, incubandosi a ~ 45 ° C per 4 ore ( figura 1 ). Qui usiamo 48 ssDNA nt contenenti una lesione, o una dimina addizionata di fluoresceina o un dimero pirimidina ciclobutano (CPD), e in aggiunta una breve sequenza non complimentale (8 nt) per produrre le bolle del DNA (cfr. Tabella 1 ).
      2. Collegare in modo covalente l'inserto ricotto con il plasmide per incubatoCon la ligasi del DNA di T4 per notte a temperatura ambiente secondo il protocollo del produttore ( Figura 1 ). Per questa reazione, aggiungere ATP contenente una soluzione concentrata di buffer tampone per produrre opportune condizioni di tampone per la ligasi ( ad esempio , utilizzare buffer di reazione UvrB: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM ATP).
      3. Prova per l'inserimento dell'ogigonucleotide specifico nel plasmide gapped mediante digestione di campioni diluiti con un idoneo enzima di restrizione (come al punto 1.1.1.6) secondo il protocollo del produttore seguita da un'elettroforesi del gel agarosio (come al punto 1.1.1.6, figura 1 ).
    3. Preparazione del substrato lineare del DNA
      1. Digestare il DNA plasmidico modificato con gli enzimi di restrizione (idealmente con un unico sito di restrizione nel plasmide) utilizzando le condizioni come raccomandato dal produttore ( Figura 1 ). Questa fase produce frammenti lineari che contengonoLa modifica inserita in una posizione definita. Qui usa il taglio SspI e BspQI alle posizioni 613 e 255 bp rispettivamente a monte ea valle dell'inserto, ottenendo un frammento di DNA di 916 bp contenente il sito specifico di lesione a ~ 30% della lunghezza del DNA.
        NOTA: Per gli esperimenti di imaging AFM come descritto qui, i frammenti di DNA con lunghezze tra ~ 200 bp e ~ 2000 bp sono substrati adatti.
      2. Isolare il frammento di bersaglio mediante elettroforesi del gel agarosico e l'estrazione del gel utilizzando un kit commerciale. Indossare guanti protettivi.
      3. Facoltativamente, tagliare il gel agarosio con uno scalpello per separare la scala del DNA e corsie del campione diluito (prime due corsie) dalle corsie contenenti il ​​DNA concentrato da purificare. Soltanto esporre la parte del gel con le prime due corsie all'irraggiamento UV, posizionando solo questa parte del gel su un tavolo UV.
        1. Tagliare la banda corrispondente al frammento di scelta con un bisturi. Riagganciare le due parti del gel (fuori dalla linguetta UVle). Utilizzare la posizione della fascia eccitata dal campione diluito come orientamento per la posizione della banda del substrato DNA desiderato. Considera la concentrazione più elevata tagliando fette leggermente più ampie rispetto al controllo diluito.
          NOTA: Poiché qui è stato studiato il riconoscimento delle lesioni UV, l'introduzione di ulteriori lesioni UV mediante irraggiamento UV è stata accuratamente evitata nel substrato del DNA da questo approccio.
      4. Calcolare la concentrazione del DNA c dall'assorbimento a 260 nm misurata con uno spettrofotometro UV-Vis utilizzando la legge di Lambert-Beer con un coefficiente di estinzione molare media di ε 260nm ~ 6.700 M - 1 cm - 1 per bp:
        Equazione
        Dove L è la lunghezza del percorso (lunghezza della camera di misura, tipicamente 1 cm).
    </ Li>
  2. Espressione e purificazione delle proteine
    1. Esprimono in modo recombinante UvrB in E. coli e purificano la proteina mediante l' affinità standard di chitin perline 15 e la cromatografia di esclusione di dimensioni 15 come descritto in precedenza 16 .
      NOTA: Il gene uvrB da Bacillus caldotenax era stato clonato nel vettore pTYB1.
    2. Esprimere XPD in E. coli e purificare la proteina mediante l' affinità standard 15 del nickel IDA e la cromatografia di esclusione di dimensioni 15 seguita da una cromatografia di scambio anionico 15 , come descritto in precedenza 17 .
      NOTA: Il gene per Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum proteina del gruppo D (XPD) era stato clonato nel vettore pBADM11. C. thermophilum p44 era un regalo gentile del laboratorio di Caroline Kisker, espresso e puricoCome descritto 17 .

2. Esperimento AFM

  1. preparazione del campione
    1. Facoltativamente, pre-incubare il substrato del DNA a 65 ° C per 10 minuti in un blocco termico per rimuovere i potenziali cristalli di sale microscopico che potrebbero essere formate durante lo stoccaggio nel frigorifero.
    2. Preparare tampone di reazione a una concentrazione di 10 volte (tamponi 10x).
      NOTA: il tampone di reazione XPD a concentrazione 1x conteneva 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 2 mM ATP; 1x buffer di reazione UvrB conteneva 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT e 1 mM ATP.
    3. Pre-incubare le proteine ​​ad una concentrazione più elevata in condizioni di incubazione appropriate per aumentare la formazione del complesso. Pre-diluire un piccolo volume ( ad esempio , 1 μL) delle singole proteine ​​in tampone di reazione di proteina 1x alla concentrazione desiderata e mescolare piccoli volumi ( ad esempio , 1 μL) di tHa soluzioni proteiche individuali in un tubo di reazione di 0,5 mL.
      1. Mettere il tubo in un blocco termico per le temperature di incubazione superiori alla temperatura ambiente. Scegliere un rapporto di concentrazione in funzione della stechiometria complessa prevista, sia di equimolarità che di corrispondenti concentrazioni. Qui incubare 1 μl di XPD (20 μM in 1 x tampone di reazione XPD) e 1 μl p44 (20 μM in 1x tampone di reazione XPD) a 10 μM ciascuno per 10 minuti a 37 ° C.
    4. Incubare i campioni ad adeguate concentrazioni di proteine ​​e DNA in tampone di reazione proteica in un tubo di reazione da 0,5 mL. Qui usi 500 nM UvrB o 1 μM XPD + 1 μM p44 e 100 nM DNA. Pipettare piccoli volumi per salvare materiale, ad esempio 0,25-0,5 μL di proteine ​​(pre-diluito a una concentrazione di 10 volte di incubazione) e DNA in un volume totale di 2,5-5 μL di tampone di reazione di proteine ​​1x. Qui, incubare per 30 minuti a 37 ° C in un blocco termico. Spin giù in un tubo di reazione brevemente (~ 1 s) in un centrifugo da tavoloE per garantire la miscelazione di piccoli volumi.
  2. Deposizione di campione
    1. Preparare un substrato mica: tagliare un pezzo di mica di circa 1 x 1 cm 2 da strisce più grandi usando un bisturi. Strizza gli strati superiori del pezzo minerale mica multistrato usando nastro adesivo per rivelare una superficie di substrato liscia, piatta e atomica.
      NOTA: il pezzo di mica può essere riutilizzato per più esperimenti rimuovendo ulteriormente gli strati.
    2. Preparare il tampone di deposizione AFM con acqua deionizzata e filtrata, ad esempio 25 mM HEPES pH 7,5, 25 mM Na-acetato, 10 mM Mg-acetato. Filtro attraverso un filtro da siringa da 0,02 μm.
      NOTA: I cationi divalenti nel tampone di deposizione servono a chelare le molecole del DNA caricate negativamente alla superficie di mica, che è anche caricata negativamente al pH neutro. Se la concentrazione di ioni di Mg 2+ relativamente elevata nel buffer di deposizione costituisce un problema per un determinato sistema proteico-DNA, in alternativa,La superficie della mica può essere pre-caricata con amino gruppi usando la chimica a base di silatrane per fornire cariche posteriori positive per l'ancoraggio 18 . La deposizione di campione può quindi essere effettuata in un tampone che non contiene solo o basse quantità di cationi bivalenti.
    3. Diluire il campione (vedere 2.1) per la deposizione immediata sulla mica nel tampone di deposizione. Depositare un piccolo volume (qui: 20 μL).
      NOTA: i fattori di diluizione dipendono dalla concentrazione del campione. Qui, diluire i campioni 50-100x. In linea di principio, il DNA di 1 nM ha una buona copertura superficiale per ~ 1.000 bp.
    4. Risciacquare immediatamente il campione da tre a quattro volte con qualche millilitro di acqua filtrata, deionizzata, spazzare via l'eccesso di liquido e soffiare in un leggero flusso di azoto. L'intero processo dalla deposizione di campioni ai campioni essiccati può essere effettuato entro meno di 30 s.
    5. Fissare il pezzo di mica su uno scivolo a microscopio con nastro adesivo ai suoi bordi.
      NOTA: diversi sistemi AFM hanno dRequisiti diversi per fissare il campione sul palco. Altri AFM dispongono di stadi magnetici e le parti di mica sono fissate su dischi magnetici, ad esempio con colla termica. I dettagli del sistema AFM utilizzato qui si trovano nella tabella dei materiali.
  3. AFM imaging
    1. Posizionare il campione (vedi 2.2.5) centralmente sullo stadio AFM e fissare lo scivolo a microscopio sul palco con i pattini magnetici.
    2. Inserire la punta AFM nel supporto della punta. Usare i cantilever con una sonda AFM tagliente (<10 nm) adatta per l'immagine oscillante e intermittente della modalità di contatto in aria. Utilizzare le sonde AFM, ad esempio, come indicato nella tabella dei materiali . Qui (dipende da AFM), fissare la punta nel supporto sotto un morsetto stringendo la vite di serraggio (dito stretto). Inserire il supporto della punta nella testina di misura AFM. Riposiziona la testa sulla schiena per questo passo.
    3. Posizionare la testata di misurazione AFM sulla parte superiore del campione. I dettagli dipendono dal modello AFM. Qui, mAssicuratevi che la testa sia stabile con le gambe all'interno delle fessure del palco. Assicurarsi che la mica si trovi sul palco in cui la punta AFM si sposterà direttamente sopra di essa. Le viti a micrometro a destra dello stadio consentono un posizionamento fine del campione.
    4. Allineare il laser AFM sul retro del cantilever per una resistenza ottimale del segnale dal fotorivelatore sensibile alla posizione su cui si riflette il laser. I dettagli dipendono dal modello AFM.
      1. Qui ruotare le ruote sul lato destro e posteriore della testina di misura AFM per regolare le posizioni x e y del laser AFM per dirigere centralmente sull'estremità della sommità. Guarda il segnale di riflessione nella finestra video AFM (se disponibile, qui: premere l'icona della fotocamera e scegliere l'ingresso: Svideo).
      2. Una volta posizionata in modo crudo, ottimizzare il segnale di somma del rilevatore (Sum in Sum e Deflection Meter window nel software AFM) regolando bene la posizione del laser con le due ruote (rimanere alla fine del cantilever, il segnale sumL dipende dal tipo AFM e dal tipo di cantilever, qui: obiettivo per somma> 5).
    5. Segnare il segnale di differenza dai diodi superiori e inferiori dell'array del rilevatore (qui: segnale di deflessione nella finestra Sum e Deflection Meter), orientando la riflessione laser AFM sul centro rivelatore (qui: ruotare la ruota a sinistra della misura AFM capo).
      NOTA: Le deviazioni da zero indicano quindi la deflessione del cantilever a causa di interazioni di superficie, che sono tradotte in informazioni di altezza da parte dell'AFM.
    6. Determinare la frequenza della risonanza a cantilena con una frequenza di sintonia implementata nel software AFM (qui: comando automatico in Master Panel / Tune). Scegliere un'ampiezza corrispondente ad un ingresso da 1 V per il piezo che guida l'oscillazione a cantilever. Impostare la frequenza di oscillazione leggermente (5%) inferiore alla frequenza di risonanza e zero la fase dell'oscillazione.
    7. Avvicinare la punta alla superficie del campione usando il grezzo impegno modE (qui: comando Engage nella finestra del pannello principale) fino a raggiungere l'impostazione di protezione (set-point). Utilizzare il taglio del ~ 2% dell'ampiezza di oscillazione a livello libero come set-point (qui, immettere Set Point 980 mV nel pannello Master).
    8. Fine impegnare la punta AFM con la superficie del campione abbassando il setpoint utilizzando il software AFM. Obiettivo per l'imaging in modalità repulsiva con la fase di oscillazione a cantilever (fase in somma e finestra del deflettore) appena sotto la fase a livello libero (prima di impegnarsi, qui tipicamente ~ 70). Qui, utilizzare punti tipici tipici finali sull'ordine del 70-80% dell'ampiezza del livello libero (1 V).
    9. Prima della scansione, selezionare i segnali da registrare nel pannello canale master. Scegli l'altezza (Ht) e l'ampiezza (Am).
    10. Inizia la scansione del campione (qui: comando Do Scan nella finestra del pannello principale). Utilizzare una velocità di scansione di 2,5 μm / s (velocità di scansione del comando in Master Panel) in aree di immagine di 4 μm x 4 μm o 8 μm x 8 μm (inserire la dimensione di scansione nel Master PaneL) con risoluzioni di pixel di 2.048 o 4.096 (punti di scansione e linee di scansione nel pannello master) rispettivamente.
    11. Salvare il file di immagine (comando Salva immagine nel pannello master) senza modifiche apportate (scegliere Nessuno nel pannello canale master / Salva piani adatta).
    12. Per ulteriori analisi, elaborare l'immagine salvata. Caricare l'immagine (comando Sfoglia dati salvati nel menu Analisi AFM). Aprire il pannello Modifica (premere M nella parte superiore dell'immagine). Applicare un piano di dimensioni x e y all'immagine in altezza (estensione HtR) (comando XY nella finestra di Planefit nel pannello Modifica, scegliere Ordine 3). Quindi appiattire l'immagine (comando Flatten in finestra Flatten in Pannello Modifica) scegliendo Ordine Ordine 3.
    13. Esportare l'immagine come file TIFF (premere Comandi nella sezione superiore dell'immagine, scegliere Esportazione TIFF 2x corrispondente a 2.048 pixel di risoluzione) per ulteriori analisi.

3. Analisi AFM

  1. Volume del complesso proteico
    1. Pre-Selezionare complessi proteina-DNA rilevanti attraverso l'ispezione visiva diretta delle immagini nel software AFM, utilizzando un adeguato schema di colori per ottimizzare le diverse apparenze di complessi di dimensioni diverse (vedere colori e dimensioni differenti di diversi complessi in figura 2 ; qui: schema di colori SeaLandAndFire in L'AFMsoftware). Per i campioni XPD, i possibili complessi comprendevano XPD / p44-DNA e XPD-DNA e p44-DNA, con dimensioni decisamente diverse a causa delle masse molecolari relativamente grandi e diverse di XPD (~ 95 kDa) e p44 (~ 40 kDa) .
    2. Misurare i volumi di picchi di proteine ​​individuali sul DNA per verificare il tipo complesso. Ciò può essere ottenuto con diversi software di immagine (qui: lo strumento di sezione del software AFM).
      1. Misurare l'altezza (h) e il diametro (d) delle sezioni di picco di proteine ​​con i cursori della finestra di sezione. Misurare il diametro vicino alla base della sezione delle particelle.
      2. Determinare il volume (V) del piselloKs utilizzando semplici modelli matematici, ad esempio utilizzando la seguente formula, basata su un modello a sfera sferica:
        Equazione
    3. Trasformare i volumi misurati in una massa molecolare approssimativa della proteina.
      1. Inizialmente calibrare il sistema AFM per la conversione di volume a peso molecolare (MW) utilizzando una gamma di proteine ​​con peso molecolare noto (qui: sono stati condotti complessivamente 12 esperimenti con 25 e 851 punti dati su 5 diverse proteine ​​in monomerica, dimerica , Stati trimerici o tetramerici) 4 , 19 , 20 . Le proteine ​​di deposito e di immagine (come descritto sopra, in 2.2 e 2.3) e misurare i loro volumi come sopra descritto (3.1.2). Tracciare i volumi sopra i loro pesi molecolari noti. Il grafico risultante mostrerà una relazione lineare tra V e MW, l'equazione per cui può essere ottenuta daUna linea adatta ai dati. Per il sistema AFM utilizzato qui, è stata ottenuta la seguente relazione 19 :
        Equazione
        NOTA: questo passaggio non deve essere ripetuto prima di ogni misurazione, ma viene eseguito solo una volta. La calibrazione da volume a MW può essere applicata alle immagini ottenute in condizioni di imaging simile utilizzando sonde AFM con diametri leggermente variabili.
      2. Sulla base dei loro volumi misurati (3.1.2) e della calibrazione V-to-MW (3.1.3.1), determinare il MW approssimativo dei complessi proteici 20 , che fornisce informazioni sul suo contenuto molecolare. Ad esempio , per i campioni XPD / p44 sono stati ottenuti ~ 50 kDa, ~ 100 kDa e ~ 140 kDa, coerenti con i complessi p44-DNA (o picchi causati da semplice sovrastruttura del DNA), picchi di XPD e picchi XPD / p44 .
  2. Posizioni complesse di proteine ​​sul DNA
    1. Determinare il DNALunghezze di frammento.
      1. Traccia i frammenti di DNA nelle immagini AFM, ad esempio con la funzione di linea libera di un idoneo software di analisi delle immagini (vedere ad esempio Tabella dei materiali) e misurare la lunghezza della linea.
        NOTA: escludere gli aggregati del DNA così come i frammenti tagliati dai margini dell'immagine.
      2. Staccare e tracciare le lunghezze del DNA dall'intero esperimento in un istogramma, utilizzando un'adeguata analisi dei dati e software di grafica ( ad esempio , vedere tabella dei materiali ).
      3. Adattare le distribuzioni di lunghezza con una curva Gaussian nell'analisi dei dati e software di grafica per determinare la lunghezza dei frammenti di DNA. Per conoscere la posizione del sito di DNA inserito (vedere 1.1), includere solo i frammenti di DNA con la giusta lunghezza entro due deviazioni standard dal centro della curva Gauss (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), dove z è un fattore normale e x c e w sono il centro eMassima piena larghezza massima della Gaussiana) in ulteriori analisi.
        NOTA: La lunghezza del DNA al centro della curva di Gauss deve essere vicina alla lunghezza teorica del frammento di DNA (calcolato con 0,34 nm / bp). Le lunghezze fino al 10% più corte del valore teorico sono tipiche e sono probabilmente causate da limiti di risoluzione AFM.
    2. Determinare le posizioni di picchi di proteine ​​sui substrati del DNA.
      1. Misurare la distanza dei picchi proteici dal finale più stretto del DNA come descritto al punto 3.2.1.1 e dividere per la lunghezza totale del DNA per ottenere distanze in unità di frazione della lunghezza del DNA.
      2. Bin e tracciare le distanze misurate in un istogramma utilizzando un'adeguata analisi dei dati e software di grafica (si veda ad esempio , figura 3 ). Come regola generale, scegliere una dimensione del contenitore che fornisce circa √n i contenitori per n punti dati.
        NOTA: poiché non si distinguono qui i brani del DNA, la trama solo alla frazione della lunghezza del DNA 0,5 (centro del DNA fragmentment). Poiché il legame del DNA non è il focus dello studio, escludere le estremità del DNA dalle analisi iniziando a rimuovere i dati di posizione leggermente dopo la posizione 0 ( ad esempio , qui: il frammento di una frazione di lunghezza del DNA di 0,02).
    3. Determinare la specificità del sito di destinazione dalle distribuzioni di posizione complesse di proteine.
      1. Adattare il massimo (incrementato occorrenza di legame) nella distribuzione di posizione con una curva di Gauss come al punto 3.2.1.3, ma in piedi sull'altezza del legame di sfondo (v. Figura 3 ).
      2. Calcolare la specificità S per il sito specifico rispetto allo sfondo del DNA non specifico (molecole proteiche legate a siti di DNA non specifici) con la seguente formula 21
        Equazione
        A sp : Numero di complessi specifici (area sotto la curva gaussiana)
        A nsp : numero di complessi non specifici (area dello sfondo, 0 ); La frazione della lunghezza del DNA qui riportata è di 0,48 per un istogramma a partire da 0,02 di lunghezza del DNA)
        N: numero di possibili siti di legame del DNA (qui: N = 914 escluse le estremità del DNA)
  3. Angoli di curvatura del DNA
    1. Utilizzando l'utensile ad angolo in un idoneo software di analisi delle immagini, misurare l'angolo β tra due linee posizionate centralmente lungo la spina dorsale del DNA e centrando al picco della proteina (vedere ad esempio , inserto in figura 4 ). Misurare gli angoli per un numero statisticamente rilevante di complessi protein-DNA (> 50, idealmente> 100) 2 , 3 , 5 .
      NOTA: L'angolo di curvatura del DNA è definito come 180 ° -β 2 , 3 , 5 .
    2. Utilizzando l'analisi dei dati e il software di grafica(Vedi Tabella dei Materiali) producono un istogramma di distribuzione angolare della curvatura, facendo in modo che gli angoli di curvatura del DNA venissero creati.
    3. Adattare la distribuzione dell'angolo di curvatura con una curva di Gauss. Se nella distribuzione è visibile più di un massimo, scegliere più punti di picco di Gauss. Il centro (s) della curva Gaussian (s) dà (s) lo stato di angolo di curvatura media della specie particolare.
    4. Se uno spostamento nell'angolo (i) di curvatura (maxima di adattamento Gaussiano) è evidente per le distribuzioni, ad esempio, di diverse varianti di proteine ​​o di diverse specie di proteine ​​complesse, applicare un test t studente per valutare il livello di significatività del i cambiamenti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Distinguere tra diversi tipi complessi basati su volumi complessi di proteine

L'attività elicolare dell'elicasica NER prokaryotica UvrB è stimolata dal legame del DNA 22 , 23 . UvrB richiede una regione non distinta nel DNA (una bolla del DNA) per caricare correttamente su uno dei due singoli fili di ssDNA. In vivo , questa struttura del DNA è fornita dalle interazioni del DNA attraverso un'altra proteina della cascata NER; In esperimenti in vitro , la bolla può essere introdotta artificialmente in frammenti dsDNA in prossimità di una lesione target. Le interazioni proteico-proteiche aumentano anche il legame del DNA con UvrB 9 . Tuttavia, una volta che UvrB è caricato sul DNA, la sua attività non sembra dipendere dai co-fattori proteici 9 . Al contrario, l'elicottero eucariotico NER XPD richiede interazioneOn con la proteina p44, che come XPD fa parte del complesso multi-subunità di trascrizione IIH (TFIIH) in vivo , per l'attivazione della sua attività di elicasi, ma questa interazione non influenza il legame di XPD al DNA 17 . Si prevede che solo XPD si caricherà sul DNA a una bolla del DNA, ma non si trasloca alla lesione (in assenza del suo co-fattore di attivazione di elicasi). XPD senza p44 non deve pertanto essere in grado di interagire con l'identificazione della lesione quando viene caricata a distanza dal sito della lesione. Le incubazioni di XPD con p44 in presenza di lesioni contenenti il ​​substrato del DNA comportano un mix di complessi XPD o XPD / p44-DNA (e possibilmente una specie minore di p44 da sola legata al DNA). Per analizzare separatamente il riconoscimento delle lesioni da XPD / p44 e XPD, questi diversi tipi complessi possono essere distinti in base ai loro volumi nelle immagini AFM ( Figura 2 ) 9 , come descritto nel precedente protocollo 3.1. I sistemi AFM possono essere calibrati utilizzando una gamma di pRotelle con peso molecolare noto per rivelare una relazione lineare tra il volume AFM e la massa molecolare approssimativa di una proteina (complesso) 20 , consentendo un'interpretazione dei volumi misurati. Le posizioni di legame sul DNA potrebbero quindi essere determinate separatamente per XPR monomerico inattivo elicasi (~ 95 kDa, coerente con le ~ 100 nm 3 specie di classe 2 in Figura 2 ) e per complessi XPD / p44 attivi con elicasi (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 specie di classe 3), in base ai diversi volumi AFM.

Determinazione del riconoscimento delle lesioni dalle posizioni di legame delle proteine ​​sul DNA

Qui sono stati impiegati substrati di DNA lunghi (916 bp) contenenti una lesione a ~ 30% della lunghezza del DNA. Il controllo sulla posizione esatta della lesione all'interno del substrato del DNA consente la distinzione tra specifici (legati alla lesione, al 30% della lunghezza del DNA)(Ricerca della lesione) complessi dipendenti dalle loro posizioni sul DNA. Sono state scelte due diverse lesioni, che sono obiettivi di NER; I substrati del DNA contenevano o un addotto di fluoresceina (F) o un dimero di pirimidina ciclobutano (CPD). Oltre al sito della lesione, il DNA conteneva una regione non associata (8 nt bolla del DNA) che serviva come luogo di carico per le elicasi. Questo sito di caricamento era situato a una distanza di 26 nt (per i substrati del DNA contenente F) o 23 nt (per i substrati contenenti CPD) 5 'o 3' dalla lesione (vedi tabella 1 ). Il riconoscimento delle lesioni porta alla translocazione staminale del DNA degli elicasi UvrB e XPD nel sito di destinazione, apparente nella distribuzione della posizione della proteina AFM sul DNA come picco alla posizione della lesione. Le posizioni della lesione e delle bolle in questi substrati non possono per se distinguersi entro i limiti di risoluzione dell'immagine AFM (<10 nm di distanza). Tuttavia, la frazione di complessi specifici che rappresenta l'aIl supporto di molecole bloccate alla lesione e indica il riconoscimento delle lesioni dipende fortemente dal fatto che la lesione sia stata posizionata 3 'o 5' dalla bolla ( figura 3 ) 9 .

Dalla frazione di complessi del sito specifico (area sotto il picco di misura Gaussian rispetto all'area del background vincolato non specificamente) è stata calcolata la specificità, S, UvrB e XPD per i due tipi di lesioni investigati (cfr. Protocollo 3.2 sopra). Per UvrB, il carico di 5 'dalla posizione della lesione ha determinato specifiche più elevate (S B, F5 ~ 200 e S B, CPD5 ~ 400) rispetto al carico 3' dalla lesione (S B, F3 e S B, CPD3 ~ 100) Entrambi i tipi di lesione. Per XPD sono stati distinti complessi che contengono solo XPD (classe 2 in figura 2 ) e complessi contenenti XPD così come la proteina co-fattore p44 (classe 3 in figura 2 ) che attiva l'elicasiNella sezione precedente. I picchi di proteina della classe 2 (solo XPD, elicasi inattivi) non localizzarono preferenzialmente nei siti di lesione indipendentemente dal fatto che siano stati caricati 5 'o 3' e indipendenti dal tipo di lesione (dati non mostrati). Al contrario, le distribuzioni di posizione per i complessi XPD / p44 (classe 3) hanno mostrato una maggiore legame alle lesioni F per caricare 5 'dalla lesione (S XPD / p44, F5 ~ 300 versus S XPD / p44, F3 ~ 100) Lesioni per il caricamento 3 'dalla lesione (S XPD / p44, CPD3 ~ 600 contro S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Figura 3 ). Poiché UvrB e XPD sono 5'-a-3 'elicasi, questi dati forniscono informazioni su se i complessi sono bloccati attraverso interazioni con la lesione all'interno del filo di ssDNA che essi traslocano (lo strato traslocato, per caricare 5' dalla lesione) O all'interno del fusto opposto, non traslocato (per il caricamento 3 'dalla lesione). Il concetto è schematicamente illustrato in

Indagare i cambiamenti conformazionali sulla identificazione delle lesioni da XPD

La misurazione della curvatura introdotta nel DNA sul sito dei complessi legati da immagini AFM (vedi Protocollo 3.3 sopra) può rivelare importanti informazioni sulle modifiche complesse conformazionali. Gli angoli di curvatura del DNA sono stati misurati per XPD 5 arcaico, che non richiede un'interazione co-fattore di proteine ​​per l'attività di elicasi. In questi studi, una lesione fluoresceina era localizzata direcNel contesto di una bolla del DNA per una maggiore carica delle proteine ​​alla lesione, a ~ 30% della lunghezza del frammento di DNA. La figura 4 mostra i parametri Gaussiani per le distribuzioni di angolo di curvatura del DNA ottenute per i complessi proteici a posizioni non specificate (non danneggiate) del DNA e al ~ 30% della lunghezza del DNA, coerenti con il rilascio di XPD alla posizione della lesione fluoresceina (complessi specifici). I dati dimostrano un angolo di curvatura media di ~ 50 ° per complessi non specifici contro ~ 65 ° per complessi specifici. Questo spostamento dell'angolo della curva del DNA era dipendente dalla presenza di ATP o di ATP, indicando che l'ATP (re-) legame, ma non l'idrolisi, era necessaria per i riarrangiamenti conformazionali 5 .

Figura 1
Figura 1: Preparazione dei substrati del DNA. Un divario di ssDNA viene introdotto nel DNA plasmidico circolare premendo il plasmide (qui con il nickname N.BstNBI) a cloE rimuovere il tratto di ssDNA incluso mediante filtrazione da centrifuga dopo destabilizzazione del calore in presenza di un eccesso di oligonucleotide complementare. Un oligonucleotide specifico contenente la caratteristica di scelta può quindi essere annealed e legato nella regione gap. Infine, la digestione con gli enzimi di restrizione (qui con SspI e BspQI) produce un substrato lineare di DNA con la caratteristica di bersaglio in una posizione ben precisa (qui al 30% della lunghezza del frammento di DNA). I controlli di controllo consentono di testare le singole fasi (sotto riportate) mediante elettroforesi con agarosio (freccia nera indica 3000 bp). Il nicking può essere testato dalla alterazione della mobilità elettroforetica del DNA circolare (controllo di battuta, corsia 2), inatteso e rilassato, rispetto al plasmide supercoppiato (corsia 1). La completa eliminazione del DNA e l'inserimento successivo dell'oligo specifico possono essere testati mediante digestione con un enzima di restrizione che taglia nella regione di gap (qui: XhoI, inLe corsie 2, 4 e 6) in modo che una mancanza di incisione del DNA indichi la formazione di spazi (corsie 1,2 nicked DNA, corsie 3,4 DNA colpite) e l'incisione riposizionata indica l'inserimento dell'oligo specifico (corsie 5,6) . Il substrato lineare finale che contiene la caratteristica specifica può essere purificato dal gel dopo l'elettroforesi del gel agarosio e testato per omogeneità e purezza tramite l' imaging AFM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Distinguere diversi tipi complessi dai volumi AFM. ( A ) AFM di XPD / p44-DNA (freccia grigia) e XPD-DNA (freccia nera) complessi. ( B ) Esempi di tre diversi tipi di complessi legati al DNA, interpretati come p44 o semplici sovrastrutture del DNA (classe 1),XPD (classe 2, frame nero) e XPD / p44 (classe 3, struttura grigia) basati sui volumi AFM (mostrati a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Differenti strategie di riconoscimento delle lesioni delle elicasi NER prokaryotiche e eucariotiche. La traslocazione competente del DNA di riconoscimento delle lesioni dalle elicasi NER UvrB e XPD (in complesso con il suo co-fattore di attivazione di elicasi p44) richiede il caricamento delle proteine ​​in una regione del DNA non associata (bolla del DNA). Le proteine ​​si muovono poi in direzione 5'-3 'lungo il filo di ssDNA su cui sono caricate. Riconoscimento di una lesione del DNA (qui: CPD) da parte delle elicasi sia sul filo traslocato (per il caricamento a 5 'bolla) o sul lato opposto, non traslocato (perR caricamento a 3 'bolla) si traduce in una translocazione staminale del DNA. Nelle distribuzioni di posizione questo si presenta come un picco (linee di misura Gaussiane), che indica una maggiore legatura nella posizione della lesione (a ~ 30% della lunghezza del DNA per i substrati del DNA qui mostrati). L'elicottero NER prokaryotico UvrB e il suo equivalente eucariotico XPD mostrano diverse strategie di riconoscimento delle lesioni CPD che indicano diverse preferenze di filamenti di DNA. In particolare, le lesioni CPD sono riconosciute sul filo traslocato da UvrB, ma preferibilmente sul filo opposto, non traslocato da XPD. Figura modificata dal riferimento 9 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Cambiamenti conformi nei complessi XPD-DNA dopo l'identificazione della lesione. Le distribuzioni degli angoli di curvatura del DNA indotti da XPD indicano cambiamenti conformazionali nei complessi proteina-DNA a una lesione fluoresceina. Questi riarrangiamenti conformazionali dipendevano dalla presenza di ATP (B) o di ATP (S) (C). ( A ) In assenza di ATP, gli angoli di curvatura non specifici (grigi) e gli angoli di piegatura sul sito della lesione (angoli di curvatura specifici, neri) sono simili e sono adattati da una curva gaussiana con centro a ~ 50 °. ( B , C ) In presenza di ATP o ATP duranteS, la distribuzione dell'angolo di curva specifico (nero) mostra uno spostamento significativo (P = 2,5 x 10 -7 ) ad un angolo di curvatura medio di ~ 65 °. Questo flessione del DNA nel sito della lesione era indipendente dal tipo di lesione (CPD o adduzione del fluoresceina) o dalla presenza o dall'assenza di una bolla del DNA 5 . La figura è stata riprodotta dal riferimento 5 . L'inserto in (C) mostra come sono stati determinati gli angoli di curvatura (180 ° -β).Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

numero sequenza descrizione
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC 		parte inferiore
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC 		F / 5 '
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		F / 3 'bolla
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC 		CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC 		CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC 		F / bolla

Tabella 1: oligonucleotidi del DNA per il preparato del substrato del DNA. Tutti gli oligonucleotidi sono lunghi 48 nt e sono stati ottenuti fosforilati a fili superiori (oligonucleotidi 2-6) alla loro estremità 5 per la legatura nel DNA colato (vedi protocollo 1.1). F = la timina adduta di fluoresceina, TT = dimer di ciclobutano pirimidina (timina) (CPD), regioni non complementari (regioni di formazione delle bolle di DNA). F contenenti oligonucleotidi sono stati ottenuti da Integrated DNA Technologies (IDT), gli oligonucleotidi contenenti CPD sono stati gentilmente forniti dal laboratorio di Thomas Carell (Ludwig-Maximilian University Munich, Germania).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analisi statistiche AFM di posizioni di legame di proteine ​​su lunghi frammenti di DNA che contengono siti target specifici possono rivelare dettagli interessanti sulle strategie particolari impiegate dalla proteina per riconoscere questi siti 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Per interpretare le distribuzioni di posizione risultanti, le posizioni degli obiettivi nel DNA devono essere conosciute con precisione. Ciò è ottenuto introducendo siti specifici in posizioni di sequenza ben definite nel DNA plasmidico circolare e tagliando un frammento del DNA compreso questo sito specifico, utilizzando la tecnologia di restrizione enzimatica. Nelle analisi di AFM delle posizioni di legame delle proteine ​​possono essere inclusi solo frammenti di DNA con lunghezze corrette (in linea con la piena lunghezza del frammento tagliato), perché solo per questi è nota la posizione del sito di destinazione. Vale la penaChe la procedura di preparazione qui descritta produce substrati lineari di DNA con due estremità di frammenti indistinguibili. Le distribuzioni di posizione possono pertanto essere misurate e tracciate da 0 x lunghezza del DNA (proteine ​​legate alla fine del frammento di DNA) fino a 0,5 x lunghezza del DNA (proteine ​​legate al centro dei frammenti). Inoltre, per le posizioni di bersaglio che non si trovano esattamente al centro del substrato, queste distribuzioni contengono sempre un piccolo fondo di proteine ​​non specificamente associate alla stessa distanza dall'altra estremità del DNA. Tuttavia, il montaggio di una curva gaussiana alla distribuzione distribuita sulla base dell'altezza media di sfondo (proteine ​​legate in modo non specifico, figura 3 ) rappresenta questi complessi. In alternativa, una delle estremità del DNA può essere etichettata, ad esempio con piccoli picchi di volume dalla struttura secondaria che crea sgargianti ssDNA 24 . I limiti di risoluzione tipici di queste analisi di posizione sono nell'intervallo di 100 volte la preferenza di target siOltre il legame non specifico del sito. Inoltre, i frammenti del DNA finiscono non costituiscono siti non specifici dsDNA, ma rappresentano invece interruzioni di dsDNA. Le proteine ​​di riparazione del DNA spesso si legano a queste finestre di frammento destabilizzate, oltre ai siti specifici di destinazione specifici introdotti internamente. Il legame del DNA può essere rivelato mediante analisi AFM e può fornire importanti informazioni sulla funzione di una proteina. Se il legame del DNA finale non è al centro dell'interesse, queste posizioni possono essere comunque facilmente omesse dalle distribuzioni di posizione iniziando le trame in una posizione> 0 ( es . Qui 0,02 lunghezze del DNA).

Uno dei vantaggi particolari e, in effetti, la proprietà comune e definita delle tecniche di singola molecola è la risoluzione di singoli stati diversi presenti in un campione che possono possedere proprietà e attività molto diverse. Anche nei casi in cui la particolare specie di interesse possa essere solo infrequente in un campione, questi approcci consentono cosìConcentrarsi separatamente su questa specie i cui contributi sarebbero rimasti in una misura di insieme. Per i campioni di proteine, per esempio, l'imaging AFM consente la distinzione diretta tra diversi tipi di complessi proteici basati su un volume complesso, se le dimensioni delle singole proteine ​​differiscono sufficientemente (limiti di risoluzione tipici sono di circa 20 kDa) 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . I sistemi AFM possono essere calibrati per consentire la traduzione dei volumi misurati in peso molecolare di proteine ​​(Protocollo 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . In alternativa, le norme proteiche con dimensioni noti sono state utilizzate come riferimento diretto nelle immagini 1 , 6 . NelSistema focalizzato su di essi, posizioni vincolanti sul DNA potrebbero quindi essere determinate separatamente per il XPD monomerico inattivo dell'elicasina e per i complessi XPD / p44 eterodimerici attivi con elicasi. Collegamento preferenziale a un sito di lesione in una posizione ben definita nel DNA riconosciuto dalla lesione del DNA da un complesso proteico. Poiché i siti di caricamento delle proteine ​​e lesioni venivano separati spazialmente, la traslocazione del DNA era un requisito necessario per il riconoscimento delle lesioni nei substrati del DNA qui impiegati. Solo i complessi eterodimeri XPD / p44 erano in grado di traslocazione del DNA ( Figura 3 ), coerenti con i risultati dei test di attività di elicasi 9 . L'analisi del volume di AFM può quindi fornire importanti informazioni sulle attività differenziali di forme complesse di proteine.

L'interazione e il riconoscimento della lesione da parte del complesso XPD / p44 attivo con elicasi hanno determinato una maggiore legatura nel sito di destinazione a causa della stallo della traslocazione di elicasi ( Figura 3 figura 3 ), questa constatazione indica che l'enzima rileva preferibilmente la fluoresceina sul filo traslocato, ma CPD preferibilmente sul filo opposto, non traslocato. L'elicottero NER prokaryotico UvrB, invece, ha preferenzialmente riconosciuto sia le lesioni di fluoresceina che CPD al momento del caricamento da 5 'dalla lesione, cioè sul filo traslocato ( Figura 3 ). Queste differenze distintive nelle loro proprietà di riconoscimento delle lesioni possono essere intese dalle diverse proprietà strutturali delle due elicasi. UvrB interagisce con i potenziali bersagli iN il DNA attraverso residui di aminoacidi all'interno di una caratteristica β-forcella nell'enzima dietro la quale il filo traslocato è probabilmente filettato 16 , 25 . XPD, d'altro canto, ospita un piccolo poro in prossimità di un cluster di ferro-zolfo (FeS) 26 . Il filo di DNA ricostituito probabilmente attraversa questo poro 26 . Le lesioni più complesse come la fluoresceina possono bloccare la traslocazione di elicasi mediante interazioni con i residui all'interno di questo poro, mentre meno lesioni CPD ingombranti possono essere identificate più facilmente attraverso interazioni con il cluster FeS. Nel sistema prokaryotico, si crede che due molecole di UvrB siano coinvolte nella ricerca di un sito di destinazione in un complesso UvrA 2 -UvrB 2 etero-tetramerico in cui ciascuno dei due monomeri UvrB è in grado di indagare un diverso filamento di DNA 27 . XPD in eucariotica NER probabilmente esiste come una singola copia nellaComplesso di riconoscimento della lesione TFIIH. La flessibilità negli approcci di interazione lesionica dell'enzima eucariotica può pertanto essere necessaria per consentire il riconoscimento dello spettro di siti target estremamente ampio del sistema di riparazione NER.

Dato che i fotogrammi AFM possono essere distinti in base ai loro posizionamenti sul DNA, i singoli complessi specifici possono essere analizzati separatamente e confrontati. La singola molecola AFM è uno degli approcci molto pochi che consentono di accedere alle proprietà strutturali di complessi proteici legati non specificamente al DNA a causa della loro natura spesso transienti o variabili. Qui, i cambiamenti conformazionali sul riconoscimento del sito di destinazione sono stati visualizzati e caratterizzati in XPD arcaico basato sulla flessione introdotta nel DNA dall'enzima. I dati AFM hanno rivelato un piccolo ma distinto e significativo spostamento negli angoli di curvatura del DNA per il rilascio di XPD in un sito di lesione rispetto a XPD legato al DNA nonspecifico 5 . conformazionaleI cambiamenti nelle proteine ​​legate al DNA sull'identificazione del sito di destinazione probabilmente innescano l'assunzione delle endonucleasi NER (XPG e XPF in eucariotica NER) che effettuano l'escissione di un breve tratto di ssDNA contenente la lesione. È interessante notare che questo cambiamento e quindi la riorganizzazione conformazionale hanno richiesto l'associazione di ATP all'enzima (ma non all'idrolisi). Un approccio analogo di ATP-rebinding su identificazione del sito di destinazione e successivo reclutamento di endonucleasi UvrC è stato riportato per UvrB in prokaryotic NER 28 , 29 .

In sintesi, l'imaging a singola molecola AFM ha rivelato sottili differenze nel riconoscimento del sito di destinazione da parte delle elicasi NER prokaryotiche e eucariotiche. Una volta che una lesione target è stata identificata dagli enzimi, condividono una strategia simile di reclutamento delle endonucleasi NER mediante re-arrangiamenti conformazionali indotti da ATP in modo selettivo alla lesione. La tecnica di AFM in comBination con attento disegno del substrato del DNA per imitare le proprietà essenziali del sistema esaminato può quindi fornire informazioni sulle interazioni di siti di destinazione di non solo la riparazione del DNA, ma i sistemi proteici legati al DNA in generale. Le informazioni strutturali su complessi specifici e non specifici con risoluzioni nel campo di bassa nanometro (a livello molecolare, limitate dalla sonda AFM) possono contribuire in modo significativo alla comprensione dei meccanismi coinvolti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

PUC19N, oligonucleotidi contenenti CPD e p44 sono stati gentilmente forniti da Samuel Wilson, Korbinian Heil e Thomas Carell, e rispettivamente da Gudrun Michels e Caroline Kisker. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 e TE-671/4 a IT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

Genetica edizione 123 Microscopia a forza atomica (AFM) interazione tra proteine ​​e DNA riparazione del DNA riparazione di escissione dei nucleotidi (NER) riconoscimento delle lesioni del DNA modifica del DNA preparazione dei campioni AFM analisi del volume AFM analisi della posizione del binding DNA.
Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.… More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter