Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları

Published: May 24, 2017 doi: 10.3791/55501
* These authors contributed equally

Introduction

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), protein-DNA etkileşimlerinin analizi için güçlü bir tekniktir 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Tek molekül düzeyinde bir çözünürlükle heterojen örnekleri doğrudan görselleştirmek için yalnızca düşük miktarda numune malzemesi gerekir. Heterojenlik, bir proteinin farklı konformasyonel veya oligomerik durumlarından kaynaklanabilir. Özellikle, protein-DNA örnekleri bağlamında, protein kompleksleri genel olarak DNA bağlanması veya DNA içindeki spesifik bir hedef bölgeye bağlanma ile uyarılan farklı stoikiometri ve / veya konformasyonlar gösterebilir. Heterojen numuneler ayrıca iki (veya daha fazla) farklı protein türü ve farklı protein kompleksi içerebilirFormlar ( örn . Heteromerik komplekslere karşı yalnızca bir protein türünü kapsar) DNA ile farklı etkileşime girebilirler. Burada tartışılan çalışmalar, bu proteinlerin bir hedefini temsil eden bir lezyon içeren uzun (~ 900 baz çiftli, bp) DNA fragmanlarına bağlı DNA onarım proteinlerinin statik, kurutulmuş örnekleri üzerindeki havadaki AFM görüntülemesini kullanmaktadır. AFM'nin yüksek, moleküler çözünürlüğü, farklı protein kompleksleri türleri arasında ayrım yapmayı ve proteinlerin DNA fragmanları üzerindeki bağlanma yerlerini belirlemeyi sağlar. Önemli olan, lezyonlar, DNA substratlarına iyi tanımlanmış pozisyonlarda eklenir. DNA'daki lezyon yerinin konumu bilindiğinden, DNA'ya bağlı olan proteinlerin dağılımı, (farklı) protein komplekslerinin (farklı) lezyon tanıma özelliklerine, örneğin belirli bir lezyon tipini ne kadar iyi tanıdıklarını (karşılaştırıldığında) Hasar görmemiş DNA'ya) 2 , 3 , , 5 , 6 . DNA'daki pozisyonları ayrıca lezyonlara spesifik olarak bağlanan protein kompleksleri ile DNA'nın başka yerlerinde spesifik olmayan şekilde bağlanmış olan kompleksler arasındaki ayrımı da mümkün kılar. Bu farklı karmaşık türlerin (lezyona spesifik olmayan komplekslere spesifik olarak bağlanan kompleksler) ayrı karakterizasyonu, hedef bölge tanımlamasında indüklenen komplekslerde potansiyel konformasyonel değişiklikleri ortaya çıkarabilir.

Burada odaklanan DNA tamir proteinleri, nükleotid eksizyon tamiri (NER) yolunda lezyonun tanınmasından sorumlu helikazlardır. Bakterilerde NER, UvrA, UvrB ve UvrC proteinleriyle elde edilir. UvrA, bir UvaA 2 / UvrB 2 DNA tarama kompleksinde başlangıç ​​lezyon algılamasından sorumludur. UvrB lezyon doğrulamasının ardından bu kompleks, lezyon yerinde bağlı monomerik UvrB'ye dönüşür ve bu spesifik kompleks pRokaryotik NER endonükleaz UvrC. UvrC, lezyonu içeren kısa (12-13 nt) bir tek sarmallı DNA (ssDNA) uzatır. Eksik streç daha sonra DNA polimeraz ile doldurulur. Son olarak, DNA ligazı yeni sentezlenmiş gerdirmeyi orijinal DNA 9 , 10 ile sızdırmaz hale getirir. Ökaryotlarda, NER basamaklarının çoğunun proteinleri büyük, multimerik transkripsiyon faktörü II H (TFIIH) kompleksinin bir parçasıdır. Trimerik CEN2-XPC-HR23B kompleksi yoluyla ilk lezyon algılamasından sonra, TFIIH DNA hedef bölgeye yönlendirilir. Kompleks içindeki XPD, bir NER hedef lezyon varlığını doğruladığında, ökaryot NER endonükleazlar XPG ve XPF, lezyon 9 , 10 içeren kısa (24-32 nt) bir ssDNA serisini tüketmek üzere görevlendirilir. Burada, özellikle sırasıyla prokaryotik ve ökaryotik NER'den gelen UvrB ve XPD helikazları incelenmiştir. Bu helikazlar, eşleştirilmemiş bir bölge gerektirir.DNA (bir DNA kabarcığı) iki DNA tek sarmalından birine bağlanıp daha sonra ATP hidroliziyle beslenen bu sarmal boyunca yer değiştirir. DNA lezyonlarına ilaveten, proteinler için yükleme yeri olarak işlev gören substratlara bir DNA kabarcığı ilave edildi.

Spesifik lezyon DNA substratlarının hazırlanması prosedürü daha önce 11 açıklanmıştır. Bir lümen için iki birbirine yakın aralıklı kısıtlama bölgeleri olan dairesel bir DNA yapısı (plazmid) gerektirir. Bu çalışma bağlamında plazmid pUC19N (2729 bp) kullanıldı (S. Wilson laboratuarı, NIEHS tarafından hazırlandı). Bu plazmit, 48 nükleotit (nt) bir gerilimi çerçeve içine alan Nt.BstNBI nickazı için birbirine yakın mesafeli üç sınırlama bölgesi içerir. Lipaz ile inkübe edildikten sonra, bu alanlar arasındaki ssDNA'nın uzantısı uzaklaştırılabilir ve herhangi bir hedef özelliği içeren bir oligonükleotid ile değiştirilebilir. Her adımdan sonra, enzimatik sindirim, agaroz jeliElektroforez. Yuvarlak dairesel DNA, orijinal süper-sargılı plazmid ile karşılaştırıldığında daha düşük elektroforetik hareketliliğinden dolayı ayırdedilebilir. DNA'nın boşluk bırakılması ve çıkarılan gerilmenin spesifik alt tabaka oligonükleotidiyle değiştirilmesi, alt tabakayı münhasıran çentikler arasındaki bölgede kesen bir kısıtlama enzimi ile sindirim yoluyla değerlendirilebilir. Dolayısıyla, dairesel plazmitin enzim tarafından doğrusallaştırılması, çakıştırılmış DNA için bastırılacak ve spesifik oligonükleotidin eklenmesinden sonra restore edilecektir. Son olarak, iki endonükleaz sınırlama alanı (ideal olarak tek kesiciler), arzu edilen uzunlukta ve belirlenmiş bir konumda spesifik hedef alanı ve aynı zamanda lezyondan belirli bir mesafede bulunan bir DNA kabarcık ile, doğrusal bir DNA substratının oluşturulmasına izin verir. 'Veya 3' yönünde.

Lezyonların NER helikazları tarafından tanınması AFM görüntüleme yoluyla araştırılabilir. Tepedeki helikazların duraklatılmış DNA translokasyonuLezyon bölgesi, DNA üzerindeki protein pozisyon dağılımında zirve olarak görünür ve lezyon tanımayı gösterir. Bu helikazların DNA translokasyonu ayrıca yönlü, 5'-3 'polarite ile lezyon tanımanın yükleme yerine (DNA kabarcık yukarı akış veya lezyonun aşağısında) bağımlılığı da lezyonun öncelikli olarak tanınıp onaylanmadığını gösterir Translokasyona uğratılmış veya tersine, translokasyona uğramamış ssDNA iplikçikleri 5 , 9 . Sonraki bölümlerde, kullanılan yöntemler tanıtılacak ve bu deneylerden elde edilen önemli bulgular kısaca tartışılacaktır. Önemli olarak, burada gösterilen DNA tamiri ile ilgili örnek çalışmalara benzeyen AFM görüntüleme, DNA replikasyonu veya transkripsiyon 8 , 12 , 13 , 14 gibi farklı DNA etkileşen sistemlerin çalışmasına uygulanabilir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Numune Hazırlama

  1. DNA substratlarının hazırlanması 11
    1. Plazmidde bir ssDNA boşluğu üretme
      1. Üreticinin protokolüne göre koşulları kullanarak, enzim ısısı inaktivasyonunu takiben uygun bir lümenli bir reaksiyon tüpünde (burada: Nt.BstNBI) plazmidden bir numuneyi (burada modifiye edilmiş pUC19, pUC19N) tamamen sindirin (şematik için Şekil 1'e bakın) sunum). Yeterli bir verim için ~ 50 uL ve ~ 500 nM plazmid ile başlayın.
      2. Seyreltilmiş numuneler (~ 20 nM) üzerinde agaroz jel elektroforezi ile plazmit nicking doğrulayın. DNA görselleştirme için kullanılan DNA bağlayıcı boyaya karşı koruma için eldivenler takın.
        NOT: Farklı elektroforetik hareketlilik, çentikli (rahat) ve süper-sargılı dairesel plazmid DNA'yı birbirinden ayırır ( Şekil 1 ).
      3. Kesilen ssDNA gerilimini (nick alanları arasında) plazmiddenBir ısı bloğundaki oligonükleotidin erime sıcaklığının (burada pUC19N için 68 ° C) 300 rpm'de çalkalanarak tamamlayıcı oligonükleotitin ( Tablo 1'deki oligonükleotid l'in) ~ 10 kat fazlasıyla inkübe edildi ( Şekil 1 ).
      4. Bir masa santrifüjünde 10,000 xg'de 10 dakika süreyle santrifüje edilerek 50 kDa molekül ağırlığı kesilmiş (MWCO) filtre kullanarak daha küçük DNA fragmanlarından ayrılmış plazmid ayrılır ( Şekil 1 ). Filtreden konsantre DNA'yı çıkarmak için filtreyi tersine çevirin ve yeni bir 1.5 mL reaksiyon tüpüne yerleştirin. 1,000 x g'de 3 dakika santrifüjleyin.
      5. Elde edilen konsantre DNA örneğini, iyonu alınmış, filtrelenmiş su ile 500 uL'ye doldurun, ek bir ~ 5 misli fazla tamamlayıcı oligonükleotid ilave edin ve adımlar 1.1.1.3 ve 1.1.1.4'ü en az 3 kez tekrarlayın.
      6. Conditi kullanarak uygun bir restriksiyon enzimi (burada: XhoI veya BglII) ile kuluçka yapılarak DNA'nın tamamen boşluğunu test edinÜreticinin açıklamasına göre. Seyreltilmiş (çentikli ve boşluklu) DNA örnekleri (~ 20 nM) kullanın. Pozitif kontrol olarak çizgili DNA kullanarak doğrusallaştırılmış plasmid (hiçbir ssDNA boşluğu içermeyen) ve kesilmiş DNA (boşluk bırakılmış DNA) arasında ayrım yapmak için bir agaroz jel elektroforezi çalıştırın (referans için bir DNA merdiveni ekleyin, Şekil 1 ). Eldiven giy.
    2. Aralığı değiştirilmiş ssDNA oligonükleotidleri ile doldurma
      1. Çakıştırılmış plazmid, ~ 45 ° C'de 4 saat süreyle inkübe edilerek ( Şekil 1 ) seçilen spesifik hedef bölgeyi içeren 5 'fosforillenmiş bir oligonükleotitin 25 misli fazlalığı ile inkübasyon yoluyla tavlanır. Burada, DNA kabarcıkları üretmek için flöresin adisyonlu timin veya siklobutan pirimidin dimer (CPD) ve ayrıca kısa (8 nt) bir lezyon içeren 48 nts ssDNA kullanın (bkz. Tablo 1 ).
      2. Tavlanmış ekin plazmaya kuvertür bağlanması için incubaT4 DNA ligazı ile oda sıcaklığında üreticinin protokolüne göre gece boyunca eklendi ( Şekil 1 ). Bu reaksiyon için, ligaz için uygun tampon koşulları üretmek için konsantre tampon stok solüsyonu içeren ATP ilave edin ( örn. , UvrB reaksiyon tamponu: 50 mM Tris-HC1 pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCI, 5 mM DTT, 1 mM ATP).
      3. Seyreltilmiş örneklerin uygun bir kısıtlama enzimi (1.1.1.6'da olduğu gibi) ile imalatçının protokolüne göre sindirerek spesifik oligonükleotidin çakıştırılmış plasmid içine sokulması için test edin ve bunu takiben bir agaroz jel elektroforezi (1.1.1.6, Şekil 1 ).
    3. Doğrusal DNA substratının hazırlanması
      1. Üreticinin önerdiği koşulları kullanarak modifiye plazmid DNA'yı (ideal olarak plazmitteki tek bir kısıtlama bölgesi olan) restriksiyon enzimleri ile sindirin ( Şekil 1 ). Bu adım,Yerleştirilen modifikasyonun tanımlanmış bir konuma getirilmesi. Burada, DNA uzunluğunun ~% 30'unda spesifik lezyon bölgesi içeren 916 bp'lik bir DNA fragmanına neden olan, sırasıyla 613 ve 255 bp'lik sıranın yukarı ve aşağı kısımlarında kesme SspI ve BspQI kullanınız.
        NOT: Burada açıklanan AFM görüntüleme deneyleri için, ~ 200 bp ile ~ 2000 bp arasında uzunluklardaki DNA parçaları uygun substratlardır.
      2. Hedef parçayı, ticari bir kit kullanarak agaroz jel elektroforezi ve jel ekstraksiyonu yoluyla izole edin. Koruyucu eldiven giyin.
      3. İsteğe bağlı olarak, saflaştırılacak konsantre DNA içeren şeritlerden DNA merdiveni ve seyreltilmiş numune şeritlerini (ilk iki şerit) ayırmak için bir neşterle agaroz jelini kesin. Sadece jelin bir kısmını bir UV masasına yerleştirerek ilk iki şeritteki jel bölümünü UV radyasyona maruz bırakın.
        1. Bir bisturi ile seçilen parçaya tekabül eden bandı kesin. İki jel parçasını yeniden birleştirin (UV sekmesinden çıkarın)le). İstenilen DNA substratının bandı konumu için seyreltilmiş numunedeki eksize bandın pozisyonunu kullanın. Seyreltik kontrol için olduğundan biraz daha geniş dilim keserek daha yüksek konsantrasyonu hesaplayın.
          NOT: Burada, UV-lezyonlarının tanınması araştırıldığından UV ışınlaması yoluyla ilave UV lezyonlarının sokulması DNA substratında bu yaklaşımla dikkatle önlenmiştir.
      4. 260 nm ~ 6,700 M - 1 cm - 1 bp'de bir çift sicimli DNA (dsDNA) ortalama molar sönme katsayısı ile Lambert-Beer yasasını kullanarak bir UV-Vis spektrofotometre ile ölçülen 260 nm'lik absorbsiyona ait DNA konsantrasyonunu hesaplayın:
        Denklem
        Burada L yol uzunluğudur (ölçüm odası uzunluğu, tipik olarak 1 cm'dir).
    </ Li>
  2. Proteinlerin ekspresyonu ve saflaştırılması
    1. E. coli içinde rekombinant şekilde UvrB'yi eksprese edin ve proteini , daha önce tarif edildiği gibi 16 standart kütin boncuk eğilimi 15 ve boyut uzaklaştırma kromatografisi yoluyla saflaştırın 16 .
      NOT: Bacillus caldotenax'tan uvrB geni pTYB1 vektörüne klonlanmıştı.
    2. E. coli'de XPD'yi eksprese edin ve proteini standart nikel IDA afinitesi 15 ve boyut uzaklaştırma kromatografisi 15, ardından anyon değişim kromatografisi 15 , daha önce tarif edildiği gibi 17 ile saflaştırın.
      NOT: Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum D grubu protein (XPD) geni, pBADM11 vektörüne klonlanmıştı . C. thermophilum p44, Caroline Kisker'in laboratuvarından bir tür armağan, ifade edildi ve puriAçıklandığı gibi atılmış 17 .

2. AFM Deneyi

  1. örnek hazırlama
    1. İsteğe bağlı olarak, buzdolabında saklanırken oluşabilecek olası mikro-tuzlu kristalleri çıkarmak için, DNA alt-tabakasını bir ısı bloğunda 65 ° C'de önceden inkübe edin.
    2. Reaksiyon tamponu (leri) 10 kat konsantrasyonda (10x tampon) hazırlayın.
      NOT: 1x konsantrasyonda XPD reaksiyon tamponu 20 mM Tris-HC1 pH 7.5, 10 mM KC1, 5 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 2 mM ATP; 1x UvrB reaksiyon tamponu, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT ve 1 mM ATP ihtiva etti.
    3. Kompleks oluşumunu arttırmak için proteinleri uygun inkübasyon koşullarında daha yüksek bir konsantrasyonda ön inkübe edin. 1x protein reaksiyonu tamponu içindeki tek tek proteinlerin küçük bir hacmini ( örn. , 1 μL) önceden istenen konsantrasyona kadar seyreltin ve küçük hacimlerde ( örn. , 1 μL) t0.5 mL reaksiyon tüpünde bireysel protein solüsyonları.
      1. Tüp, oda sıcaklığından daha yüksek inkübasyon sıcaklıkları için bir ısı bloğuna yerleştirilir. Beklenen kompleks stokiyometriye, ya eşmolar ya da buna tekabül eden konsantrasyonlara bağlı olarak bir konsantrasyon oranı seçin. Burada, 1 uL XPD'yi (1 x XPD reaksiyon tamponu içinde 20 uM) ve 10 uM'de her biri için 10 dakika 37 ° C'de 1 uL p44 (1x XPD reaksiyonu tamponu içinde 20 uM) inkübe edin.
    4. 0.5 mL reaksiyon tüpünde protein reaksiyonu tamponu içinde uygun protein ve DNA konsantrasyonlarında örnekleri inkübe edin. Burada, 500 nM UvrB veya 1 uM XPD + 1 μM p44 ve 100 nM DNA kullanın. Malzemeyi, örneğin 0.25-0.5 μL protein (önceden 10 kat inkübasyon konsantrasyonuna seyreltilmiş olarak) ve DNA'yı 2.5-5 μL 1x protein reaksiyon tamponunun toplam hacminde kaydetmek için küçük hacimlerde pipetleyin. Burada, bir ısı bloğunda 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bir tepkime tüpünde bir masa santrifüjünde kısaca (~ 1 s) döndürünE küçük hacimlerin karıştırılmasını sağlamak.
  2. Örnek depozisyon
    1. Bir mika alt tabakası hazırlayın: bir bisturi yardımıyla daha büyük şeritlerden yaklaşık 1 x 1 cm 2 lik bir mika kesin. Çok katmanlı mika mineral parçasının üst katmanlarını yapışkan bantla soyarak temiz, düz ve atomik olarak pürüzsüz bir yüzey elde edin.
      NOT: Mika parçası daha fazla tabaka (ları) soyarak çoklu denemeler için yeniden kullanılabilir.
    2. AFM çökelme tamponunu deiyonize filtrelenmiş su, örneğin 25 mM HEPES pH 7.5, 25 mM Na-asetat, 10 mM Mg-asetat ile hazırlayın. 0.02 μm şırınga filtresi ile filtre edin.
      NOT: Biriktirme tamponundaki çift değerli katyonlar, negatif yüklü DNA moleküllerini, nötr pH'da negatif yüklü mika yüzeyine kenetlemek için kullanılır. Eğer çökelme tamponundaki nispeten yüksek Mg2 + iyon konsantrasyonu, belirli bir protein-DNA sistemi için bir sorun teşkil ediyorsa, alternatif olarak,Mika yüzeyi ankraj 18 için pozitif yüzey yükleri sağlamak için silatran bazlı kimya kullanarak amino grupları ile önceden yüklenebilir. Numune birikimi, daha sonra, az ya da çok miktarda iki değerli katyon içeren bir tamponda gerçekleştirilebilir.
    3. Depolama tamponu içindeki mika üzerine derhal çökelmek için numuneyi seyreltin (2.1'e bakın). Küçük bir hacim bırakın (burada: 20 μL).
      NOT: Seyreltme faktörleri numune konsantrasyonuna bağlıdır. Burada, numuneleri 50-100x seyreltin. Bir kural olarak, ~ 1 nM DNA ~ 1,000 bp için iyi bir yüzey kaplaması sağlar.
    4. Numuneyi, birkaç mililitre süzülmüş, iyonsuzlaştırılmış su ile üç ila dört kez tekrar durulayın, fazla sıvıyı lekeleyip nazik bir nitrojen akışı ile kurutun. Numune biriktirme işleminden kurutulmuş numunelere kadar olan süreç 30 saniyeden daha kısa sürede gerçekleştirilebilir.
    5. Mika parçasını, kenarlarında yapışkan bant kullanarak mikroskop slayt üzerinde düzeltin.
      NOT: Farklı AFM sistemlerinde dNumunenin sahneye sabitlenmesi için gereken şartlar. Diğer AFM'ler manyetik aşamalara sahiptir ve mika parçaları manyetik disklere, örneğin termal tutkal kullanılarak sabitlenir. Burada kullanılan AFM sisteminin ayrıntıları Malzeme Tablosu'nda bulunabilir.
  3. AFM görüntüleme
    1. Numuneyi (bkz. 2.2.5) AFM aşamasında merkezi olarak yerleştirin ve manyetik pedlerle sahnedeki mikroskop slaydı sabitleyin.
    2. AFM ucunu uç tutucuya yerleştirin. Havada titreşen, aralıklı temas modu görüntülemesi için keskin (<10 nm) bir AFM probu bulunan konsolları kullanın. Örneğin, Malzeme Tablosunda listelenen gibi AFM probları kullanın. Burada (AFM'ye bağlıdır) kelepçe vidasını sıkıştırarak (parmakla sıkıştırın) ucu tutucuya bir kelepçe altına sabitleyin. Uç tutucuyu AFM ölçüm kafasına takın. Bu adım için başını sırt üstünde dinlendirin.
    3. AFM ölçüm kafasını numunenin üzerine yerleştirin. Ayrıntılar AFM modeline bağlıdır. Burada, mKafanın sahne girintileri içindeki bacaklarıyla stabil durduğundan emin olun. Mika'nın, AFM ucunun doğrudan üzerinde bulunduğu sahnede bulunduğundan emin olun. Sahnenin sağındaki mikrometre vidaları, numunenin hassas konumlandırılmasına olanak tanır.
    4. Lazerin üzerine yansıdığı konuma duyarlı fotodetektöre optimum sinyal gücü için konsolun arkasındaki AFM lazerini hizalayın. Ayrıntılar AFM modeline bağlıdır.
      1. Burada, AFM lazerinin x ve y konumlarını konsolun ucuna merkezi olarak yönlendirmek için AFM ölçüm kafasının sağ tarafındaki ve arkasındaki tekerlekleri çevirin. AFM video penceresindeki yansıma sinyalini izleyin (varsa, burada: kamera simgesine basın ve girişi seçin: Svideo).
      2. Kaba bir şekilde yerleştirildikten sonra, iki tekerleğin lazer konumunu ince ayarlayarak (konsolun sonundaki toplam sinyali) dedektör toplam sinyalini (Toplamda Sum ve Sapma Ölçer penceresinde AFM yazılımı) optimize edinL AFM ve konsol türüne, burada: toplamı hedefliyor> 5).
    5. AFM lazer yansımasını dedektör merkezine (burada: tekerleği AFM ölçümünün sol tarafında çevirin) yönlendirerek detektör dizisinin üst ve alt diyotlarından gelen fark sinyalini sıfırlayın (burada: Toplam ve Sinyal Saptır penceresinde Saptırma sinyali penceresi) kafa).
      NOT: Daha sonra sıfırdan sapmalar, AFM tarafından yükseklik bilgilerine çevrilen yüzey etkileşimlerinden dolayı kirişin sapmasına işaret eder.
    6. Kanton rezonans frekansını, AFM yazılımında uygulanan bir frekans tonu ile belirleyin (burada: Master Panel / Tune penceresinde komut otomatik ayarlama). Konsol salınımını sağlayan piezo için 1 V girişine karşılık gelen bir genlik seçin. Osilasyon frekansını rezonans frekansından biraz düşük (% 5) ve osilasyon fazını sıfırlayın.
    7. Ham kavrama modunu kullanarak ucu örnek yüzeyine yaklaştırınKoruyucu ayar (ayar noktası) ulaşılana kadar (burada: Ana Panelde Engage komut penceresi). Serbest düzey salınım amplitüdünün ayar noktası olarak ~% 2 kesimini kullanın (burada, Ana Panelde Ayar Noktası 980 mV girin).
    8. AFM yazılımını kullanarak ayar noktasını düşürerek AFM ucu numune yüzeyi ile iyice tutun. Serbest düzey aşamanın hemen altındaki konsol salınım fazı (Toplam Faz ve Sapma Ölçer penceresinde) (çekmeden önce, burada tipik olarak ~ 70) ile itici mod görüntüleme için amaç edin. Burada, serbest seviye amplitüdünün (1 V)% 70-80'i düzeyinde tipik nihai ayar noktalarını kullanın.
    9. Taramadan önce, Ana Kanal Panelinde kayıt için sinyalleri seçin. Yüksekliği (Ht) ve genliği (Am) seçin.
    10. Örnek taramaya başlayın (burada: Ana Panelde Tarama Yap penceresi). 4 μm x 4 μm veya 8 μm x 8 μm görüntü yüzey alanlarına 2,5 μm / s (Master Panel'de komut Tarama Hızı) gibi bir tarama hızı kullanın (Master Pane'de Tarama Boyutu girinL) 2,048 piksel çözünürlüğü veya 4,096 (Master Panel'de Tarama Noktaları ve Tarama Satırı) ile sırasıyla.
    11. Resim dosyasını herhangi bir değişiklik yapmadan kaydedin (Ana Kanal Panelinde Yok seçeneğini seçin / Düzlemi Kaydet).
    12. Daha fazla analiz için kayıtlı görüntüyü işleyin. Görüntüyü yükleyin (AFM Analiz menüsünde Kayıtlı Veri Göz At komutunu kullanın). Değiştirme Panelini açın (resmin üst bölümünde M tuşuna basın). Yükseklik görüntüsüne x ve y boyutlarında bir planefit uygulayın (uzantı HtR) (Modify Panel'deki Planefit penceresindeki XY komutunu, Planefit Order 3'ü seçin). Daha sonra Düzleştir Siparişini seçerek görüntüyü düzleştirin (Düzleştirme Penceresinde Düzleştir komutu Modify Panelinde Düzleştir komutunu seçin).
    13. Görüntüyü bir TIFF dosyası olarak dışa aktarın (daha fazla analiz için resmin üst kısmındaki Komutlara basın, 2,048 piksel çözünürlüğüne karşılık gelen TIFF Dışa Aktarma 2x seçeneğini seçin).

3. AFM Analizi

  1. Protein kompleks hacmi
    1. öncesiFarklı büyüklükteki komplekslerin farklı görünümlerini en üst düzeye çıkarmak için uygun bir renk şeması kullanarak, AFM yazılımındaki görüntülerin doğrudan görsel denetimi ile ilgili protein-DNA komplekslerini seçin (bkz. Şekil 2'deki farklı komplekslerin farklı renkleri ve boyutları; burada renk şeması SeaLandAndFire AFM yazılımı). XPD örnekleri için muhtemel kompleksler XPD (~ 95 kDa) ve p44 (~ 40 kDa) nispeten büyük, farklı moleküler kitleleri nedeniyle XPD / p44-DNA'nın yanı sıra XPD-DNA ve p44-DNA'yı da içeriyordu. .
    2. Kompleks türünü doğrulamak için DNA'daki tek tek protein zirvelerinin hacimlerini ölçün. Bu, farklı görüntü yazılımlarıyla (burada: AFM yazılımının kesit aracı) başarılabilir.
      1. Kesit penceresi imleçleri ile protein tepe kesitlerinin yüksekliğini (h) ve çapını (d) ölçün. Partikül bölümünün tabanına yakın çapı ölçün.
      2. Bezelye hacmini (V) belirleyinKs, basit bir matematiksel model kullanarak, örneğin , aşağıdaki formülü kullanarak, küresel bir başlık modelini temel alan:
        Denklem
    3. Ölçülen hacimleri, yaklaşık protein molekül kütlesi haline getirin.
      1. Başlangıçta, bilinen molekül ağırlığına sahip bir dizi protein kullanarak moleküler ağırlığa (MW) dönüştürme hacmi için AFM sistemini kalibre edin (burada: 25 ve 851 veri noktası arasındaki toplam 12 deney, monomerik, dimerik olarak 5 farklı protein üzerinde gerçekleştirildi. , Trimerik ya da tetramerik haller) 4 , 19 , 20 . Biriktirme ve görüntü proteinleri (yukarıda tarif edildiği gibi 2.2 ve 2.3'te) ve yukarıda tarif edildiği gibi hacimlerini ölçün (3.1.2). Bilinen molekül ağırlığının üzerine hacim çizin. Ortaya çıkan grafik V ve MW arasında doğrusal bir ilişki gösterecektir, denklemi şu şekilde elde edilebilir:Verilere uyan bir çizgi. Burada kullanılan AFM sistemi için aşağıdaki ilişki elde edilmiştir 19 :
        Denklem
        NOT: Bu adım her ölçümden önce tekrarlanmasına gerek yoktur, ancak yalnızca bir kez yapılır. MW kalibrasyon hacmi, hafifçe değişen çaplara sahip AFM probları kullanılarak benzer görüntüleme koşulları altında elde edilen görüntülere uygulanabilir.
      2. Ölçülen hacimlerine (3.1.2) ve V'den MW'a kalibrasyona (3.1.3.1) dayanarak, moleküler içeriği hakkında bilgi veren protein komplekslerinin yaklaşık MW'sını belirleyin. Örneğin , XPD / p44 örnekleri için, p44-DNA kompleksleri (veya yalnızca DNA üst yapısından kaynaklanan tepe noktaları) ile tutarlı olarak, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa ve ~ 140 kDa, XPD tek zirveleri ve XPD / p44 zirveleri elde edildi .
  2. DNA üzerinde protein kompleks pozisyonları
    1. DNA'yı belirleParça uzunlukları.
      1. DNA parçalarını AFM görüntülerinde takip edin, örneğin uygun bir görüntü analiz yazılımının serbest el çizgisi fonksiyonuyla (bkz. Malzeme Tablosu) ve çizginin uzunluğunu ölçün.
        NOT: DNA yığınlarının yanı sıra görüntü kenar boşluklarına göre kesilmiş parçaları çıkarın.
      2. Uygun veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak ( örn . Malzeme Tablosu'na bakınız ) tüm deneyin DNA uzunluklarını histogramda çizin ve çizin .
      3. DNA parçalarının uzunluğunu belirlemek için veri analizi ve grafik yazılımında uzunluk dağılımlarını bir Gauss eğrisi ile uydurun. Eklenen DNA hedef alanının konumunu bilmek için (bkz. 1.1), Gauss eğrisinin merkezinden iki standart sapma içinde doğru uzunluktaki DNA fragmanlarını ekleyin (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), burada z bir norm faktörüdür ve x c ve w merkezi,Gaussian'ın tam maksimum yarı genişliği) daha ileri analizlerde.
        NOT: Gauss eğrisinin merkezindeki DNA uzunluğu, DNA fragmanının teorik uzunluğuna yakın olmalıdır (0.34 nm / bp kullanılarak hesaplanmıştır). Teorik değerden% 10 daha kısa olan uzunluklar tipiktir ve muhtemelen AFM çözünürlük limitlerinden kaynaklanmaktadır.
    2. DNA substratlarındaki protein doruklarının konumlarını belirleyin.
      1. 3.2.1.1'de açıklandığı gibi yakın DNA fragmanı ucundaki protein zirvelerinin mesafesini ölçün ve DNA uzunluğunun fraksiyonu birimlerinde mesafeler elde etmek için toplam DNA uzunluğuna bölün.
      2. Ölçülen mesafeleri uygun bir veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak bir histogramda çizin (bkz . Şekil 3 ). Kural olarak, n veri noktası için yaklaşık √ n kutu veren bir kutu boyutu seçin.
        NOT: Burada DNA uçları ayırt edilemediğinden sadece DNA uzunluğunun fraksiyonu için 0.5 (DNA fragmanı merkeziMENT). DNA bitiş bağlama çalışmanın odak noktası olmadığından, 0 konumundan biraz sonra konum verilerini boşaltmaya başlayarak DNA bitiş analizlerini hariç tutun ( ör . Buradaki: 0,02'lik bir DNA uzunluk fraksiyonundan binleme).
    3. Protein kompleksi konum dağılımlarından hedef alan özgüllüğünü belirleyin.
      1. 3.2.1.3'deki gibi bir Gauss eğrisi ile konum dağılımındaki azami (güçlendirilmiş bağlanma olaylarını) uyuz, ancak arka plan bağlamanın yüksekliğine dayandırın (bkz. Şekil 3 ).
      2. Spesifikliği belirlemek için spesifik alana karşı S spesifik olmayan DNA zeminine (spesifik olmayan DNA sahalarına bağlı protein molekülleri) karşı hesaplayın 21
        Denklem
        A sp : Belirli komplekslerin sayısı (Gauss eğrisinin altındaki alan)
        A nsp: Belirgin olmayan komplekslerin sayısı (arka planın alanı, 0 ); Burada kapsanan DNA uzunluğunun fraksiyonu 0.02 DNA uzunluğunda başlayan bir histogram için 0.48'dir)
        N: olası DNA bağlama alanları sayısı (burada: DNA uçları hariç N = 914)
  3. DNA eğilme açıları
    1. Açı aletini uygun bir görüntü analiz yazılımında kullanarak, DNA omurgası boyunca merkezi olarak yerleştirilen ve protein zirvesine ortalanmış iki çizgi arasındaki açı β'yı ölçün (bkz . Ör. , Şekil 4'te yer alan ). İstatistiksel olarak ilgili sayıda protein-DNA kompleksi (> 50, ideal olarak> 100) için açılar ölçün 2 , 3 , 5 .
      NOT: DNA bükme açısı 180 ° -β 2 , 3 , 5 olarak tanımlanır.
    2. Veri analizi ve grafik yazılımı kullanma(Malzeme Tablosuna bakınız), DNA bükülme açısını binleyerek bükülme açısı dağılım histogramı üretmektedir.
    3. Eğilme açısı dağılımını bir Gauss eğrisi ile uydurun. Dağılımda birden fazla maksimum belirgindir, çoklu pik Gauss uyumu seçin. Gauss eğrisinin merkez (leri), belirli türlerin ortalama eğilme açısı durumunu verir.
    4. Örneğin farklı protein varyantlarının veya farklı protein kompleks türlerinin dağılımları için viraj açısında (Gauss fit (ler) in maxima) bir kayma belirgindeyse, bir protein testinin önem derecesini değerlendirmek için bir öğrenci t testi uygulayın. değişir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein kompleks hacimlerine dayanan farklı karmaşık tipleri ayırt etme

Prokaryot NER helikaz UvrB'nin helikaz aktivitesi DNA bağlanması 22 , 23 tarafından uyarıldı. UvrB, iki adet tek ssDNA diziliminden birinin üzerine doğru yüklemek için DNA'da (DNA kabarcığı) eşleştirilmemiş bir bölgenin olmasını gerektirir. In vivo , bu DNA yapısı, NER basamağının başka bir proteini yoluyla DNA etkileşimleri tarafından sağlanır; In vitro deneylerde kabarcık, bir hedef lezyona yakın dsDNA fragmanlarına yapay olarak eklenebilir. Protein-protein etkileşimleri UvrB 9 ile DNA bağlanmasını da geliştirir. Bununla birlikte, UvrB DNA'ya yüklendikten sonra, onun aktivitesi protein faktörlerine bağımlı görünmemektedir 9 . Ökaryotik NER helikaz XPD'nin aksine, etkileşim gerektirirXPD gibi çoklu altbirim transkripsiyon faktörü IIH (TFIIH) kompleksinin bir parçası olan ve helikaz aktivitesinin aktivasyonu için p44 proteini ile birlikte, ancak bu etkileşim XPD'nin DNA'ya 17 bağlanmasını etkilemez. Tek başına XPD'nin bir DNA balonunda DNA üzerine yüklemesi beklenir, ancak lezyona translokasyon yapmaz (helikaz aktive edici faktörü yoksa). P44 içermeyen XPD, lezyon alanından belirli bir mesafede yüklendiğinde lezyonla etkileşime girip, lezyonu tanımlayamamalıdır. XPD'nin DNA substrat içeren lezyon varlığında p44 ile kuluçkalanması, XPD- veya XPD / p44-DNA komplekslerinin bir karışımına (ve muhtemelen DNA'ya bağlı tek başına p44'ün küçük bir türünü) getirir. Lezyon tanımayı XPD / p44 ve XPD ile ayrı ayrı analiz etmek için, bu farklı karmaşık tipler, yukarıdaki Protokol 3.1'de anlatıldığı gibi AFM görüntülerindeki ( Şekil 2 ) 9 hacimlerine dayanarak ayırt edilebilir. AFM sistemleri bir dizi p kullanılarak kalibre edilebilirÖlçülen hacimlerin yorumlanmasına olanak tanıyan, bir protein (kompleks) 20'nin yaklaşık molekül kütlesi ile AFM hacmi arasında lineer bir ilişki ortaya çıkarmak için bilinen molekül ağırlığına sahip roteinler. DNA üzerindeki bağlanma pozisyonları, helikaz inaktif monomerik XPD'si (~ 95 kDa, Şekil 2'de ~ 100 nm 3 sınıf 2 türüne uygun olarak) ve helikaz aktif XPD / p44 kompleksleri için (~ 135 kDa, ~ 150 nm 3 sınıf 3 tür), farklı AFM hacimlerine dayanmaktadır.

DNA üzerindeki protein bağlama pozisyonlarından lezyon tanıma tayini

Burada, DNA uzunluğunun ~% 30'unda lezyon içeren uzun (916 bp) DNA substratları kullanılmıştır. Lezyonun DNA substratı içindeki tam konumu üzerindeki kontrolü, spesifik (lezyona bağlı, DNA uzunluğunun ~% 30'u) ve nonspes arasındaki ayrımı mümkün kılmaktadırDNA üzerinde konumlarına bağlı olarak cific (lezyon arama) kompleksleri. NER'in hedefi olan iki farklı lezyon seçildi; DNA substratları, bir floresein (F) adüktü veya bir siklobütan pirimidin dimer (CPD) içeriyordu. Lezyon yerinin yanı sıra, DNA helisazlar için yükleme yeri olarak görev yapan eşlenmemiş bir bölge (8 nt DNA kabarcığı) içeriyordu. Bu yükleme sahası, lezyonun 5 'veya 3' 'sinden 26 nt (DNA substrat içeren DNA için) veya 23 nt (CPD içeren substratlar için) mesafede idi (bkz. Tablo 1 ). Lezyonun tanınması lezyonun pozisyonunda zirve olarak DNA üzerindeki AFM protein konum dağılımında belirgin olarak hedef bölgedeki UvrB ve XPD helikazlarının duraklatılmış DNA translokasyonuna yol açar. Bu tabakalardaki lezyon ve kabarcık pozisyonları, AFM görüntülemenin çözünürlük sınırları (<10 nm mesafe) içinde ayrı ayrı ayrılamaz. Ancak, spesifik komplekslerin fraksiyonlarınıLezyonda duran moleküllerin dağılımı ve lezyonun kabarcığa 3 'veya 5' yerleştirilip yerleştirilmediğine bağlı olarak lezyon tanımayı gösterir ( Şekil 3 ) 9 .

Spesifik bölgedeki kompleks fraksiyonundan (spesifik olarak bağlanmamış zemin alanına karşı Gauss fit zirvesi altındaki alan), araştırılan iki lezyon türü için UvrB ve XPD'nin özgüllüğü S'dir (bkz. Protokol 3.2). UvrB için, lezyon konumundan 5 'yüklemenin , lezyondan (S B, F3 ve S B, CPD3 ~ 100) yüklenenden daha yüksek özgünlüklere (S B, F5 200 ve S B, CPD5 400) yol açtığı Her iki lezyon türü. XPD için sadece XPD'yi ( Şekil 2'deki sınıf 2) ve XPD'yi içeren komplekslerin yanı sıra helikaz aktive edici yardımcı faktör protein p44 ( Şekil 2'deki sınıf 3) içeren kompleksler, tanımÖnceki bölümde aynıydı. Sınıf 2 protein zirveleri (sadece XPD, helikaz inaktif) lezyon yerlerinde, lezyon türünün bağımsız olarak 5 'veya 3' yüklü olup olmamasından bağımsız olarak lokalize olmamıştır (veriler gösterilmemiştir). Aksine, XPD / p44 (sınıf 3) kompleksleri için pozisyon dağılımları, lezyondan 5 'yükleme için F lezyonlarında (S XPD / p44, F5-300'e karşı S XPD / p44, F3 ~ 100) kuvvetli bağlanma gösterirken, CPD'de Lezyondan 3 'yüklemek için lezyonlar (S XPD / p44, CPD3 ~ 600'e karşı S XPD / p44, CPD5 ~ 100, Şekil 3 ). UvrB ve XPD, 5'-3 'helikazları oldukları için, bu veriler, komplekslerin ssDNA kolundaki lezyonla etkileşimler yoluyla (direkt olarak lezyondan 5' yüklemek için translokasyon edilmiş iplikçik) translasyonlu olup olmadığı hakkında bilgi verir. Veya (lezyondan 3'ü yüklemek için) zıt, translokasyonsuz iplikçik içinde. Konsept şematik olarak

XPD ile lezyon tanımlamasında konformasyonel değişikliklerin araştırılması

AFM görüntülerinden bağlanan komplekslerin bulunduğu yerdeki DNA'ya giren bükülmenin ölçülmesi (yukarıdaki Protokol 3.3'e bakınız) karmaşık yapısal değişiklikler hakkında önemli bilgileri ortaya çıkarabilir. DNA eğilme açısı, helikaz aktivitesi için protein faktör faktör etkileşimi gerektirmeyen, arkacıl XPD 5 için ölçüldü. Bu çalışmalarda, bir fluorescein lezyonu direk olarak bulunduDNA fragmanı uzunluğunun yaklaşık% 30'unda, lezyonda artan protein yüklemesi için bir DNA kabarcığı bağlamında. Şekil 4, spesifik lezyon (spesifik kompleksler) pozisyonunda bağlı XPD ile tutarlı, spesifik olmayan (hasar görmemiş) DNA pozisyonlarında ve ~% 30 oranında DNA uzunluğunda protein kompleksleri için elde edilen DNA bükme açısı dağılımlarına Gauss uyumu göstermektedir. Veriler, spesifik olmayan kompleksler için ~ 50 ° 'lik ortalama viraj açısı ile spesifik kompleksler için ~ 65 °' lik eğilme açısı göstermektedir. Bu DNA bükülme açısı kayması, ATP'nin veya ATP'nin varlığına bağlıydı; bu da, konformasyonel yeniden düzenlenmeler için hidroliz değil ATP'nin (yeniden) bağlanmasının gerekli olduğunu gösterdi.

Şekil 1
Şekil 1: DNA substratlarının hazırlanması. Bir ssDNA boşluğu, plazmiti (buradaki nickase N.BstNBI ile) cloAralıklı alanlar yerleştirin ve fazladan bir oligonükleotid varlığında ısı istikrarsızlaştırmasından sonra santrifüj filtrasyonu vasıtasıyla kapalı ssDNA genliğini kaldırın. Seçme özelliğini ihtiva eden spesifik bir oligonükleotid daha sonra tavlanır ve boşluk bölgesine lige edilebilir. Son olarak, sınırlama enzimleri (burada SspI ve BspQI ile sindirim), kesin olarak bilinen bir konumda (burada DNA fragmanı uzunluğunun% 30'unda) hedef özelliğe sahip doğrusal bir DNA substratına neden olur. Kontrol denemeleri , agaroz jel elektroforeziyle (siyah ok 3000 bp'yi gösterir) bireysel adımların (altta gösterilmiştir) test edilmesini sağlar. Takma, sünger sarılmış plazmite karşı (lane 1), çentikli, rahat dairesel DNA'nın değişen elektroforetik hareketliliği (kontrol lamlaması, şerit 2) tarafından test edilebilir. DNA'nın komple delikli olmasının yanı sıra spesifik oligo'nun eklenmesi, boşluk bölgesini kesen bir sınır enzimiyle sindirim yoluyla test edilebilir (burada: XhoI, inDNA sokması eksikliği boşluk oluşumunu (yol çizgileri 1,2 zararlı DNA, yol şeridi 3,4 delikli DNA) ve yeniden durmuş insizyonun spesifik oligo'nun eklenmesine işaret ettiğini (yollar 2, 4 ve 6) . Spesifik özelliğin bulunduğu son lineer substrat agaroz jel elektroforezinden sonra jelden arındırılabilir ve AFM görüntüleme yoluyla homojenlik ve saflık açısından test edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Farklı karmaşık türleri AFM hacimlerinden ayırt etme. ( A ) XPD / p44-DNA (gri ok) ve XPD-DNA (siyah ok) komplekslerinin AFM görüntüsü. ( B ) DNA'ya bağlı üç kompleksin tipine ait örnekler, p44 veya sadece DNA üstyapısı (sınıf 1) olarak yorumlanır,AFM hacimlerine (sağda gösterilen) göre XPD (sınıf 2, siyah çerçeve) ve XPD / p44 (sınıf 3, gri çerçeve) kompleksleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: Prokaryotik ve ökaryotik NER helikazlarının farklı lezyon tanıma stratejileri. NER helikazları UvrB ve XPD'nin (helikaz aktive edici yardımcı faktör p44 ile kompleks halinde) lezyon tanıma yetkili DNA translokasyonu proteinlerin eşleştirilmemiş bir DNA bölgesinde (DNA kabarcığı) yüklenmesini gerektirir. Proteinler daha sonra yükledikleri ssDNA şeridi boyunca 5'-3 'yönünde hareket eder. Ya translokasyon iplikçik üzerinde (5 'kabarcıkta yükleme için) ya da zıt, translokasyona uğramamış iplikçik üzerinde (Şekil 1'de) helikazlar tarafından bir DNA lezyonunun (burada CPD) tanımlanmasıR 3 'balonunda yükleme) duraklatılmış DNA translokasyonu ile sonuçlanır. Pozisyon dağılımlarında bu, lezyon konumunda (burada gösterilen DNA substratları için DNA uzunluğunun ~% 30'unda) artmış bağlanmayı gösteren zirve (Gauss fit hatları) olarak gösterilir. Prokaryot NER helikaz UvrB ve ökaryot muadili XPD, farklı DNA strand tercihlerini gösteren farklı CPD lezyonu tanımlama stratejileri göstermektedir. Spesifik olarak, CPD lezyonları, translokasyon edilmiş iplikçikte UvrB tarafından, ancak tercihan XPD'ye göre zıt, non-translokasyonlu iplikte tanınır. Şekil 9'dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: Lezyon tanımlama üzerine XPD-DNA komplekslerinde konformasyonel değişiklikler. XPD ile indüklenen DNA bükülme açılarının dağılımı, bir floresein lezyonundaki protein-DNA komplekslerinde konformasyonel değişiklikleri gösterir. Bu konformasyonel yeniden düzenlenmeler ATP (B) veya ATPƔS (C) varlığına bağlıydı. ( A ) ATP yokluğunda, lezyon alanındaki spesifik olmayan eğilme açısı (gri) ve bükülme açısı (belirli eğme açısı, siyah) benzerdir ve yaklaşık ~ 50 ° merkezli bir Gauss eğrisi ile uyuşur. ( B , C ) ATP veya ATPƔS varlığında spesifik bükülme açısı dağılımı (siyah) ~ 65 ° 'lik ortalama bir bükülme açısına göre önemli bir kayma gösterir (P = 2.5 x 10-7 ). Lezyon yerinde bükülen bu DNA, lezyon türüne (CPD veya flöresein adükt) veya DNA kabarcıklarının varlığından veya yokluğundan bağımsızdır5. Şekil, referans 5'den tekrar edildi. (C) 'deki girinti eğilme açılarının (180 ° -β) nasıl belirlendiğini göstermektedir.Ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55501/55501fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu şekli daha büyük görmek için lütfen tıklayınız.

numara sıra açıklama
1 GGTCGACTCTAGAGGATCAGATCT
GGTACCTCTAGACTCGAGGCATGC
alt
2 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAGTCGFCC
F / 5 'kabarcık
3 / Phos / GCAFGCCTCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC
F / 3 'kabarcık
4 / Phos / GCATGCCTCGTCAAATCTGGT
ACCAGATCTGATCCTCTAGAT-TCGACC
CPD / 5'bubble
5 / Phos / GCATGCT-TCGAGTCTAGAGGT
ACCAGATCTCTAAAGTAAGAGTCGACC
CPD / 3'bubble
6 / Phos / GCA TGCCTCGAGTCTAGACTCF
TTCCATCTGATCCTCTAGAGTCGACC
Kabarcık

Tablo 1: DNA substrat hazırlığı için DNA oligonükleotidleri. Tüm oligonükleotidler 48 nt uzunluğundadır ve çakışan DNA'ya ligasyon için kendi 5 'ucunda fosforile edilmiş üst bükümler (oligonükleotidler 2-6) elde edilmiştir (bkz. Protokol 1.1). F = flüsein addudu timin, TT = siklobütan pirimidin (timin) dimer (CPD), tamamlayıcı olmayan bölgeler (DNA kabarcık oluşturma bölgeleri) altı çizilmiştir. F ihtiva eden oligonükleotidler Integrated DNA Technologies (IDT) 'den elde edildi, CPD içeren oligonükleotidler Thomas Carell'in laboratuarı (Ludwig-Maximilian University Munich, Almanya) tarafından sağlandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Belirli hedef alanları içeren uzun DNA fragmanları üzerindeki proteinlerin bağlanma pozisyonlarının AFM istatistiksel analizleri, proteinin bu siteleri tanıması için kullanılan stratejilere ilginç ayrıntılar 2 , 3 , 4 , 5 , 6 gösterebilir. Ortaya çıkan konum dağılımlarını yorumlamak için DNA'daki hedeflerin pozisyonları tam olarak bilinmelidir. Bu, iyi tanımlanmış dizi pozisyonlarında belirli siteleri dairesel plazmid DNA'ya sokarak ve bu spesifik bölge de dahil olmak üzere DNA'nın bir fragmanını kısıtlama enzimi teknolojisi kullanarak keserek sağlanır. Protein bağlama pozisyonlarının AFM görüntü analizlerinde sadece doğru uzunluklara sahip DNA fragmanları (kesilen fragmanın tam uzunluğu ile tutarlı) dahil edilebilir çünkü bunlar için sadece hedef bölgenin konumu bilinmektedir. Buna değmezBurada açıklanan hazırlama prosedürünün, iki ayırt edilemez parçacık ucuna sahip doğrusal DNA substratlarına yol açtığından. Pozisyon dağılımları sadece 0 x DNA uzunluğundan (DNA fragman uçlarında bağlanan proteinler) 0,5 x DNA uzunluğuna (fragmanların merkezine bağlı proteinler) kadar ölçülebilir ve çizilebilir. Ayrıca, substratın tam merkezinde yer almayan hedef pozisyonlar için, bu dağılımlar her zaman, diğer DNA ucundan aynı mesafede spesifik olmayan şekilde bağlanmış küçük bir protein zemini içerir. Bununla birlikte, ortalama arka plan yüksekliğine (normal olmayan proteinlere bağlı, Şekil 3 ) dayanan dağılıma bir Gauss eğrisinin yerleştirilmesi bu kompleksleri açıklamaktadır. Alternatif olarak, DNA uçlarından biri, örneğin ssDNA çıkıntıları 24'ü oluşturan ikincil yapıdan küçük hacim tepeleri ile etiketlenebilir. Bu konum analizlerinin tipik çözünürlük sınırları, hedef si'nin 100 kat tercihi aralığı içindedirSpesifik olmayan alan bağlama üzerinde. Buna ek olarak, DNA fragment uçları, spesifik olmayan dsDNA siteleri oluşturmaz, bunun yerine dsDNA kopuklarını temsil eder. DNA onarımı proteinleri, çoğunlukla, iplikçiğin içine sokulan spesifik hedef bölgeleri ek olarak, bu dengesizleştirilmiş fragman uçlarına bağlanır. DNA son bağlanma, AFM analizleri ile açığa çıkabilir ve bir proteinin fonksiyonu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. DNA uç bağlama ilgi odağı değilse, ancak, bu konumlar> 0 ( örneğin 0.02 DNA uzunlukları) bir konumda çizimleri başlatarak, konum dağılımları kolayca atlanabilir.

Asıl avantajlardan biri ve aslında tek molekül tekniklerinin tanımlayıcı, ortak özelliği, bir numunede bulunan ve çok farklı özelliklere ve aktivitelere sahip olabilen bireysel, farklı durumların çözünürlüğüdür. Belli türde ilgi çekici örneklerin yalnızca seyrek görülebildiği durumlarda bile bu yaklaşımlar,Topluluk ölçüsünde katkısı azaldık bu tür üzerinde ayrı bir odaklanma. Örneğin, protein numuneleri için, AFM görüntüleme, bireysel proteinlerin boyutları yeterince farklıysa (tipik çözünürlük sınırları yaklaşık 20 kDa civarındaysa), 1 , 4 , 6 , 7 , 9 , 12 . AFM sistemleri, ölçülen hacimlerin protein molekül ağırlığına çevirilmesine izin vermek üzere kalibre edilebilir (Protokol 3.1.3.1) 4 , 8 , 19 , 20 . Alternatif olarak, bilinen boyutlarda protein standartları, görüntüler 1 , 6'da doğrudan referans olarak kullanılmıştır. İçindeBurada odaklanmış sistem, DNA üzerindeki bağlanma pozisyonları, helikaz inaktif monomerik XPD ve helikaz aktif heterodimerik XPD / p44 kompleksleri için ayrı ayrı belirlenebilir. DNA'daki iyi tanımlanmış bir konumda bir lezyon alanına tercihli bağlanma, bir protein kompleksi tarafından DNA lezyonunun tanınmasını gösterdi. Protein yükleme ve lezyon bölgeleri uzamsal olarak ayrıldığından, burada kullanılan DNA substratlarında lezyonun tanınması için DNA translokasyonu, gerekli bir ön gereklilikti. Sadece heterodimerik XPD / p44 kompleksleri, helikaz aktivite tahlillerinin sonuçları ile tutarlı olan DNA translokasyonuna ( Şekil 3 ) sahipti. AFM hacim analizi bu nedenle farklı protein kompleks formlarının diferansiyel aktiviteleri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Lezyon etkileşimi ve helikaz aktif XPD / p44 kompleksi tarafından tanınması, helikaz translokasyonunun durdurulması nedeniyle hedef bölgede bağlanmanın artmasına neden olmuştur ( Şekil 3 yani translokasyon edilmiş iplikçik üzerinde ( Şekil 3 ) hem flöresin hem de CPD lezyonlarını tercih etmiştir. Lezyon tanıma özelliklerinde bu belirgin farklılıklar, iki helikazın farklı yapısal özelliklerinden anlaşılabilir. UvrB potansiyel hedeflerle etkileşir iTranslokasyon ipliğinin arkasında muhtemelen dişli olan enzimdeki bir β-saç tokası özelliğindeki amino asit artıkları vasıtasıyla DNA 16 , 25 . XPD, diğer yandan demir-kükürt (FeS) kümesine yakın küçük bir gözenek barındırır 26 . Yer değiştiren DNA ipliği muhtemelen bu gözenek 26 boyunca geçer. Floresein gibi bulkier lezyonlar bu gözenek içindeki kalıntılarla etkileşimler yoluyla helikaz translokasyonunu durdurabilirken, daha az hacimli CPD lezyonları FeS kümesiyle etkileşimler yoluyla daha kolay tespit edilebilir. Prokaryotik sistemde iki UvrB molekülünün, iki UvrB monomerinin her birinin farklı bir DNA iplikçik 27'yi araştırabileceği bir hetero-tetramerik UvrA2-UvrB2 kompleksinde hedef alan araştırmasına dahil olduğu düşünülmektedir. Ökaryotik NER'deki XPD, muhtemelenTFIIH lezyon tanıma kompleksi. Ökaryotik enzimin lezyon etkileşim yaklaşımlarındaki esneklik, NER tamir sisteminin son derece geniş hedef alanı spektrumunun tanınmasını sağlamak için gerekli olabilir.

AFM görüntülerinde, DNA üzerindeki konumlarına bağlı olarak spesifik (hedef alana bağlı) ve spesifik olmayan kompleksler ayırt edilebildiğinden, bu farklı kompleks türleri ayrı ayrı analiz edilebilir ve karşılaştırılabilir. Tek moleküllü AFM, çoğu kez geçici veya değişken doğası nedeniyle DNA'ya spontan olmayan şekilde bağlanmış protein komplekslerinin yapısal özelliklerine erişim sağlayan çok az sayıda yaklaşımdan biridir. Burada, hedef alan tanımada konformasyonel değişiklikler görselleştirildi ve DNA tarafından enzim tarafından tanıtılan bükülmeye dayanan arkadan XPD'de karakterize edildi. AFM verileri, spesifik olmayan DNA 5'e bağlı XPD'ye karşı bir lezyon alanına bağlı XPD için DNA bükülme açılarında küçük fakat belirgin önemli bir kayma ortaya koydu. KonformasyonalDNA'ya bağlı proteinlerin hedef sitenin belirlenmesindeki değişiklikler muhtemelen lezyonu içeren kısa bir ssDNA'nın ekstremitesini gerçekleştiren NER endonükleazlarının (ökaryotik NER'deki XPG ve XPF) alımını tetikler. İlginçtir ki, bu kayma ve dolayısıyla konformasyonel yeniden düzenleme, ATP'nin enzime bağlanmasını gerektirir (ancak hidroliz olmaz). Prokaryotik NER 28 , 29'da UvrB için hedef bölge belirleme ve ardından UvrC endonükleazın alınması üzerine ATP yeniden bağlamaya benzer bir yaklaşım bildirilmiştir.

Özetle, AFM tek molekül görüntüleme, prokaryotik ve ökaryotik NER helikazları tarafından hedef bölgenin tanınmasında belirgin farklılıklar ortaya koymuştur. Bir hedef lezyon enzimler tarafından tanımlandıktan sonra, lezyona seçici olarak ATP bağlanması ile uyarılan konformasyonal re-düzenlemeler yoluyla NER endonükleazları işe almak için benzer bir stratejiyi paylaşırlar. Com'daki AFM tekniğiAraştırılan sistemin temel özelliklerini taklit etmek için dikkatli bir DNA substratı tasarımıyla bınleme, sadece DNA onarımı değil, genel olarak DNA bağlayıcı protein sistemlerinin hedef site etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilir. Düşük nanometre aralıklarındaki çözünürlüklerle (moleküler seviyede, AFM probuyla sınırlı olarak) spesifik ve spesifik olmayan kompleksler üzerine yapısal bilgiler, ilgili mekanizmaların anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

PUC19N, CPD içeren oligonükleotidler ve p44 sırasıyla Samuel Wilson, Korbinian Heil ve Thomas Carell, ve Gudrun Michels ve Caroline Kisker tarafından nazikçe sağlandı. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 ve TE-671 / 4'ten BT'ye hibelerle desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 mL block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 mL tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 mL and 1.5 mL Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Tags

Genetik Sayı 123 Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) protein-DNA etkileşimi DNA tamiri nükleotid eksizyon onarımı (NER) DNA lezyonu tanıma DNA modifikasyonu AFM numune hazırlama AFM hacim analizi DNA bağlama pozisyonu analizi.
Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I.More

Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter