Summary
Proteinkinaser är högutvecklade signalerande enzymer och byggnadsställningar som är kritiska för inter- och intracellulär signaltransduktion. Vi presenterar ett protokoll för mätning av kinasaktivitet genom användning av radioaktivt märkt adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en tillförlitlig metod som hjälper till att belysa cellsignalreglering.
Abstract
Proteinkinaser kan styra storskaliga cellförändringar som svar på komplexa stimuleringsstammar, och mycket ansträngning har gjorts för att avslöja allosteriska detaljer i deras reglering. Kinaser innefattar signaleringsnät vars defekter ofta är kännetecken för flera former av cancer och besläktade sjukdomar, vilket gör en analysplattform möjlig för manipulation av uppströms reglerande faktorer och validering av reaktionskrav som är kritiska i sökandet efter förbättrade terapeutiska medel. Här beskriver vi en grundläggande kinasassay som enkelt kan anpassas för att passa specifika experimentella frågor inklusive men inte begränsat till testning av effekterna av biokemiska och farmakologiska medel, genetiska manipuleringar såsom mutation och deletion såväl som cellodlingsförhållanden och behandlingar för att sondra Cellsignaleringsmekanismer. Denna analys utnyttjar radiomärkt [y-32P] ATP, vilket möjliggör kvantitativa jämförelser och tydlig visualisering av resultat och kan vara modIfied för användning med immunprecipiterat eller rekombinant kinas, specifika eller typifierade substrat, över ett brett spektrum av reaktionsbetingelser.
Introduction
Proteinkinaser är sofistikerade enzymer kritiska för överföring av cellulära signaler till lämpliga svar 1 . Med tanke på deras roller för att upprätthålla homeostas och förebyggande eller främjande av sjukdomstillstånd 2 fortsätter biokemiska metoder för att bedöma kinasaktivitet att vara kraftfulla verktyg för att avgränsa uppgifterna om eukaryotisk signalering 3 . Även om strategier som utnyttjar fosforspecifika antikroppar har varit mycket informativa när det gäller mätning av effekterna av olika behandlingsbetingelser på cellsignalstatus 4 möjliggör en kinasassay att mäta effekterna av olika behandlingsbetingelser direkt i termer av enzymatisk aktivitet hos en kinas av intressera. Även om det finns flera alternativ för liknande analyser som inte använder radioaktiva material 5 , fortsätter vi att förlita oss på denna metod för robust kvantifiering av resultat. därÄr två typiska tillämpningar av denna analys, båda värdefulla av olika skäl: den immunprecipiterade (IP) -kinasanalysen ( Figur 1 ) och den rekombinanta proteinkinasanalysen ( Figur 2 ).
IP-kinasassayen är oerhört användbar för att identifiera faktorer som kan aktivera specifika proteinkinaser såväl som mätningshämmande behandlingsbetingelser. I korthet transfekteras en epitopmärkt kinas av intresse i odlade eukaryota celler, utsätts för en mängd behandlingar, immunprecipiterade och analyseras för förmågan att införliva radiomärkt fosfat i ett modellsubstrat ( t.ex. myelinbaserat protein (MBP)). IP-kinasassay kan också utföras utan att tillgripa överuttryck, antingen genom immunutfällning av endogent protein eller något antal genom-redigeringstekniker. Eftersom behandlingar administreras i kultur kan denna metod detektera stimuleringar som överförs genom flera uppströmsfaktorerEller parallella vägar genom in vitro- avläsning. En stor fördel med denna metod är att den inte kräver förkunskaper om direkta uppströms eller nedströms faktorer eller fosforyleringsställen däri. Vidare, när specifika substrat för en intressant kinas av intresse har identifierats kan samma kinasassayprotokoll användas med rekombinanta komponenter för att mäta specifik aktivitet mot naturliga substrat och identifiera specifika fosforyleringsställen när de kombineras med masspektrometrianalys. Platser som identifieras på detta sätt kan valideras ytterligare med kinasassays med användning av substratmutanter. Slutligen kan denna metod också användas för att detektera och mäta autofosforylering.
Protokollet som tillhandahålls här förutsätter antingen ett optimerat proteinreningsschema eller transfektionsmetod för att uttrycka en affinitetsmärkad kinas av intresse i odlade celler. För mer detaljerade exponeringar av transfektion, lysis, immunutfällning och proteinreningsprotokollOcols, föreslår vi att vi hänvisar till Cold Spring Harbor Protocols 6 . För mer information om analysutveckling och modifiering hänvisas till Proteinfosforylering: Utvalda metoder i Enzymologi 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kinasreningsresurser och allmän immunprecipitationsledning
OBS: Kinaser för användning med denna analys kan erhållas från immunoprecipitater av odlade celler eller genom rekombinanta medel, såsom affinitetsmärkta rening 6 . Nedan finns ett allmänt protokoll för flagg-märkt immunutfällning som kan behöva modifieras beroende på kinas av intresse. Allt bör hållas på is när det är möjligt.
- Tillsätt 2 μl 1 mg / ml antikropp till 200 μl celllysat (vanligtvis ~ 1 mg / ml total proteinkoncentration) och inkubera vid 4 ° C i 1 h under rockning.
- Tvätta protein En sepharospärlor 2-3 gånger med lysbuffert (se nedan) genom kort spolning vid 4 ° C i 30 s till 1 min vid 5000 xg ("touch spin"), avlägsnande av supernatanten med en pipett och resuspendering av pärlor i buffert .
- Framställ lysisbuffert: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0,2 mM natriumortovanadat, 100 mM natriumfluorid, 50 mM p-glycerofosfat, 0,1% Triton X 100 eller 0,1% NP-40.
- Tillsätt 30 μl 50% uppslamning av protein A-sepharoskulor i lysbuffert till lysater; Inkubera vid 4 ° C i 1 h under rockning.
- Rör vid spolning vid 4 ° C för att pelletsa pärlorna och ta bort supernatanten.
- Tvätta 3 gånger med 1 ml pärlvattenbuffert (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).
- Tvätta en gång med 1x kinasreaktionsbuffert (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Ta bort så mycket buffert som möjligt utan att ta bort pärlor.
2. Initialisering av kinasreaktioner
ANMÄRKNING: För IP-kinasanalyser är ~ 15 | il av uppslamna pärlor ett typiskt startprov. För rekombinanta proteinkinasanalyser varierar typiska utgångsmängder från 0,1-1,0 μg i 1-10 för 25-50 μl slutliga reaktionsvolymer. Justera volymerna av rekombinant proteinprovS att vara lika med bufferten som de lagras i före initiering av analysen. Vid användning av höga mängder kinas innefattar ett bärarprotein, såsom BSA, att hjälpa till att bibehålla proteinstabilitet under analysens varaktighet.
- Förbered 5x kinasreaktionsbufferten som anges nedan:
50 mM HEPES pH 8,0
50 mM MgCl2
50 mM bensamidin (proteashämmare)
50 mM DTT (reduktionsmedel)
250 μM ATP (omärkt eller "kallt") - Håll kinasprövningar på is i 1,5 ml rör. Förbered följande reaktionsblandning i separata, kylda 1,5 ml rör:
21 | il H20
6 pl 5x kinasreaktionsbuffert
1 μl radiomärkt ("het") ATP
2 | il substrat (~ 5 mg / ml)
OBS: För rekombinanta kinasanalyser kan volymen justeras för att rymma renat protein. Beräkna så att den slutliga reaktionsvolymen är 30 pl. Använd detta recept för att förbereda en mästareblanda. Vid mottagning av märkt ATP, utspädd lager i H2O till en specifik aktivitet av 0,01 mCi / jil före tillsats till reaktionsblandningen. - För att initialisera analysen tillsättes hela reaktionsblandningen till kinasprov och inkuberar reaktion vid 30 ° C i 5 min till 1 h beroende på aktivitet av kinas som analyseras.
OBS! När du arbetar med en kinas vars aktivitet inte har analyserats tidigare, utför en tidskurs av kinasaktivitet med 5 minuters mellanrum mellan tidpunkter.
3. Reaktionsterminering och SDS-PAGE
- Sluta reaktionen genom att lägga på is och tillsätta 7,5 μl 5x Laemmli provbuffert 6 .
- Värm vid 100 ° C i 30 s till 2 min i värmeblock.
- Rör på spinn och ladda 20 μl per brunn på 10-15% SDS-PAGE gel. Kör gelen tillräckligt lång för att separera kinas och substrat (vanligtvis 1 h vid konstant effekt på 5 W). Se till att du håller skyddsapparaten skyddad för att begränsa exponeringen till 32
- Använd här hemlagade gelapparater, men standard kommersiellt tillgängliga mini-geler passar perfekt. Använd dimensionerna enligt följande:
Geler: 8 cm bredd, 5,5 cm längd (upplösning), 1,5 mm tjocklek.
Kombiner: 15 brunnar, 1,5 mm tjocklek, 2,9 mm bredd, 16 mm djup
4. Gelfärgning och torkning
Varning: För alla steg ska du minska den personliga exponeringen till 32 P genom att använda radioaktiv avskärmning och ha personlig skyddsutrustning. För mer information om specifika steg ingår några användbara referenser.
- Avlägsna gelén från glas / aluminiumoxidplattor och placera i 50 ml Coomassie-fläck (10% isättika, 50% metanol, 0,25% R-250 färgämne) i 1 timme på en omloppshakare inställd till 50 rpm. För detta steg använd en behållare som är något större än gelén själv. 8
- Flytta gelén från fläck till fixeringslösning (10% isättiksyraD, 20% metanol) för att de-fläckas. Klipp gelén i 600-700 ml fixeringslösning över natten på orbital shaker vid 50 rpm. Lägg bitar av skum eller knutna laboratorietorkar i behållaren med gelén för att absorbera Coomassie-färgämnet 8 , 9 .
- Avlägsna gel från fixeringslösningen och dra i 200 ml metanol i 1-2 minuter med försiktig omrörning tills gelen blir mjölkvit. Detta kommer att bidra till att förhindra sprickbildning under torkningssteget.
- Vatt en 14 cm x 14 cm kvalitativ filterpapper med metanol och placera på en plattugnsugare. Placera gelén på filterpapperssidan uppåt.
- Täck gelen med plastfolie försiktigt för att undvika rynkor och luftbubblor. Kör torktumlaren i 1,5 h vid 80 ° C. Efter att vakuumet har uppnåtts öppna locket och rulla ut eventuella luftbubblor om det behövs med en mjuk gummibroyer.
5. Autoradiogram och scintillation räknas
- Ta bort torrEd gel och fäst en autoradmarkör, fosforescerande linjal eller punkter till filterpappret på sidan av gelén. Om du använder prickar, se till att de är i ett asymmetriskt mönster. Detta kommer att anpassa gelén med filmen efter exponering och utveckling.
- Använd en Geiger-räknare för att kontrollera signalens intensitet. För svagare signaler exponering vid -70 ° C till -80 ° C med en intensifierande skärm ökar filmbandets densitet.
- I ett mörkt rum sätta torkad gel i en filmkassett med film och en intensifierande skärm i följande ordning från topp till botten: gel, film, intensifierande skärm.
- Sätt fast intensifieringsskärmen på kassettens lock och binda på gelén på plats för att göra det här steget enklare. Den intensifierande skärmen avger ljus när den bestrålas av beta-partiklarna från 32 P. Dessa ljusutsläpp tränger in i filmen mer effektivt än beta-partiklarna.
- Se till att våglängden som emitteras från intensifieringsskärmen korresponderarDammar till en våglängd som filmen är känslig för.
- Använd en Geiger-räknare för att bestämma hur länge du ska lämna exponering för: om cpm-räkningen är ~ 100 eller lägre, prova över natten vid -70 ° C. Om räkningen är ~ 10 000, börja med en 1 h exponering och optimera därifrån.
- Vid slutet av exponeringen avlägsna filmen och utvecklas i en medicinsk / röntgenfilmprocessor. Om exponeringen utfördes vid -70 till -80 ° C, antingen låta kassetten värmas till rumstemperatur för att minimera kondens på filmen eller ta bort filmen omedelbart före kondensationsformerna 10 .
- Lägg filmen över det torkade gel- / filterpapperet och justera bilden av markören / prickarna med markörerna / prickarna på den torkade gelén. Markera på bandet de band som motsvarar proteinstandarderna. Märka proteinstandarderna och vilka banor reaktionerna är för framtida referens.
- Accisera band från gelén som motsvarar band av intresse på filmen och placera demI 7 ml scintillationsflaskor. Tillsätt 4 ml scintillationsvätska och räkna med vätskescintillationsräknare. Bekräfta att räknaren är inställd för att övervaka det korrekta energispektrumfönstret för 32 P.
OBS! Var noga med att plocka ut bandet som motsvarar substratet från no-kinase kontrollbanan. Detta kommer att användas för att beräkna bakgrundsstrålning som kommer att subtraheras från samtliga provscintillationsräkningar.
6. Analys av resultat
OBS: Autoradiogrammet ger en kvalitativ visualisering av resultaten. För korrekt kvantifiering kan 32 P inkorporering mätas med en scintillationsräknare. Data uttrycks vanligtvis i termer av relativ aktivitet, såsom visas i Figur IB . Så länge som likformiga förhållanden upprätthålls för alla prover, är relativa mätningar av specifik aktivitet tillräckliga för att jämföra behandlingar.
- Vid beräkning av absoluta specifika aktivitetsvärden, utför en noggrannhetOus optimering av alla reaktionsbetingelser, inklusive kinas, substrat och kalla ATP-koncentrationer, för att säkerställa ett linjärt aktivitetsområde över en tidskurs ( t.ex. 2 x [kinas] = 2 x specifik aktivitet). För kinaser med hög specifik aktivitet, utför analyser med ökad substratkoncentration om kinasaktivitet begränsas av mängden substrat.
- Beräkna den specifika aktiviteten av kinas av intresse i enheter av nanomolfosfat överfört per minut per mg kinas.
- Subtrahera ämnen från cpm i de räknade banden.
- Beräkna nedgången av het ATP: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 där t är antalet dagar sedan referensdatumet (bör tillhandahållas av leverantören), t 1/2 är Halveringstiden av 32 P, vilken är 14,3 dagar och 0,95 reflekterar effektiviteten hos scintillationsräknaren. Exempel: Om man använder hett ATP som är 28 dagar gammal bör nedbrytningsvärdet vara 0,245.
- CalcPellomoler (pmol) av totalt ATP i analysen (vanligtvis är detta lika med mängden kall ATP i reaktionen): analysvolym (μl) x [kall ATP] (μM) = totalt ATP (pmoler). Exempel: 30 | il x 50 | iM = 1500 pmol
- Beräkna cpm / pmol ATP: [μL het ATP x (2,2 x 107) x sönderfallsfaktor] / pmol av kall ATP.
OBS: Värdet 2,2 x 10 7 omvandlar 0,01 mCi / μL ATP till cpm. - Beräkna mängden kinas i analysen i mg. För både rekombinanta kinas- och immunprecipiterade kinaser är standardmetoder såsom BCA-analyser lämpliga för att bestämma utgångskoncentrationer. Exempel: wtERK2 0,0002 μg / μl i en 50 μl kinasreaktion är 0,01 μg eller 1 x 10 -5 mg.
- Beräkna total cpm i analys. Sammansätt 30 μl reaktioner och kör 20 μl från varje reaktion på en gel. Multiplicera cpm räknat (efter blank subtraktion) med en faktor av total analysvolym / volym laddad. Fortsätter ovanståendeExempel, multiplicera alla värden med 1,5 eller 30/20.
- Beräkna den specifika aktiviteten hos det analyserade kinaset:
Total cpm i analys) / (cpm / pmol ATP) / (analystid i minuter) / (mängd kinas i mg)
OBS: Att dividera ovanstående värde med 1000 ger den specifika aktiviteten i nanomol / minut / mg
- Beräkna hur många mol fosfat som ingår i ett substrat (så länge molekylvikten är känd). Detta används för att bestämma antalet fosfositer på ett visst protein när reaktionen har gått till slut.
Total cpm i analys) / (cpm / pmol ATP)] / (mängd substrat i pmoler)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WNK1 IP-kinasanalyser
Myc-märkt WNK1 transfekterades in i HEK293-celler och immunopfälldes med en anti-Myc-antikropp 11 . Immunprecipitatet visade kinasaktivitet gentemot modellsubstratet MBP såväl som mot sig själv ( Figur 1A ). WNK1-mutanter testades sedan för kinasaktivitet mot MBP med samma metod, denna gång med användning av GST-märkta konstruktioner ( Figur IB ). Analys av mutantkinas beteende i förhållande till vildtyps avslöjade rester kritiska för optimal WNKl-aktivitet.
HEK293-celler exponerades för en panel av farmakologiska och biokemiska behandlingar. Med användning av en antikropp höjd mot en WNK1 N-terminal peptid analyserades immunprecipiterad endogen WNKl-kinasaktivitet med användning av MBP som substrat. Epidermal tillväxtfaktor (EGF), en känd aktivatEller av ERK1 / 2-signalering, nokodazol, ett läkemedel som riktar sig mot mikrotubuleldynamik, anisomycin, en inhibitor av eukaryotisk översättning och lysofosfatidinsyra (LPA), en potent mitogen, kunde inte framkalla en robust ökning av fosforylerad MBP. Däremot visades att NaCl var en regulator för WNKl-kinasaktivitet.
ERK2-rekombinanta proteinkinasanalyser
Råtta ERK2 som bär en N-terminal 6His-tagg uttrycktes i bakterieceller och affinitetsrenades med nickelharts 12 . Proteinet renades vidare genom jonbyteskromatografi på en MonoQ-kolonn, vari flera elueringsfraktioner testades för kinasaktivitet ( Figur 2A ). Eftersom ERK2 kräver dubbel fosforylering av MEK för att uppnå maximal kinasaktivitet, är ERK2 renat från bakterier i frånvaro av MEK i stor utsträckning inaktiv. Därför, för att testa fraktioner av recomBinant ERK2 för aktivitet mot MBP inkluderades en konstitutivt aktiv form av MEK1 kallad MEK1R4F i kinasreaktioner. MEKR4F har inte särskilt hög kinasaktivitet på MBP ( Figur 2 ).
Med användning av en analys liknande den som visas i figur 2A användes en MBP-kinasaktivitet för att mäta aktivitet av rekombinanta ERK2-mutanter renade från bakteriekulturer relativt vildtypprotein ( Figur 2B ). Även om ERK2 är i stånd att fosforylera MBP när den stimuleras av MEKR4F, upphäver mutation av antingen katalytisk lysin (K52R) eller en treonin proximal till de kanoniska ställena för dubbel fosforylering (T188D och T188E) dramatiskt ERK2-kinasaktivitet. ERK2-T188D och ERK2-T188E visar marginal kinasaktivitet mot en liten, flexibel peptid ( Figur 2C ), men de kan inte robust fosforylera de kända ERK2-substraten Nup153 och PDX1 ( Figur 2 D).
Figur 1: Immunfällningskinasanalyser av WNK1. ( A ) HEK293-celler transfekterades med antingen pCMV5-Myc utan ett insert eller pCMV5-Myc-WNK1, taggade proteiner immunpresipiterades med anti-Myc-antikroppen följt av kinasanalyser med användning av MBP som substrat. Autoradiografi visas till vänster och en immunoblot av immunprövipiter till höger. ( B ) Olika GST-WNK1-mutanta proteiner användes i kinasassays med MBP som substrat; MBP-fosforylering uttrycks som aktivitet relativt vildtyp WNK1. ( C ) Endogen WNK1 immunoprecipiterades från HEK293-celler behandlade med olika stimuli och analyserades för autofosforylering. Denna siffra modifierades från Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Rekombinanta proteinkinasanalyser av ERK2. ( A ) Renade ERK2-fraktioner från en MonoQ-anjonbytarkolonn användes i en kinasassay med MBP i närvaro eller frånvaro av MEK1R4F, en konstitutivt aktiv stimulator för ERK2-kinasaktivitet. ( B ) ERK2-mutanter testades för kinasaktivitet på MBP. ( C ) Aktiveringsslinga-mutanterna ERK2-T188D och ERK2-T188E uppvisar marginal kinasaktivitet mot ett litet typifierat peptidsubstrat. ( D ) Jämförelse av ERK2- eller T188D-kinasaktivitet efter aktivering av MEK1R4F med kända ERK2-substrat nukleoporin-153 (Nup153) och pankreatisk och duodenal homeobox 1 (PDX1). Fosforylerade substrat betecknas med kilar och fosforylerTed ERK2 och T188 med asterisker. Reprinted (och modifierad) med tillstånd från McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kinaser är en mångsidig familj av proteiner som har utvecklat en omfattande funktionalitet i många sammanhang och kinasanalyser har varit otroligt användbara vid studier av flera signalproteiner och har starkt bidragit till vår nuvarande förståelse av cellulär kommunikation. I synnerhet användes samma basanalys för att karakterisera två olika kinaser trots stora skillnader i struktur och aktivitet. WNK1-kinas innehåller en atypisk katalytisk ficka där den kritiska lysinen har förskjutits till en unik position och är känd för att spela roller i reglering av katjonkloridkotransportörer genom både kinas- och ställningsfunktioner. Kinasaktiviteten hos WNK1 är känd att ha ett lågt omsättningsnummer, även på dess bäst karakteriserade substrat, proteinkinaserna oxidativ stress-responsiv (OSR1) och SPS / STE20-relaterad prolinalaninrik kinas (SPAK). I motsats härtill visar ERK2 tillsammans med den närbesläktade kinasen ERK1 robust kinasaktivitet när den aktiveras
Den mest kritiska aspekten av analysen är reaktionsanordningen. För att göra korrekta tidpunktsmätningar måste särskild försiktighet ges till initiering av kinasreaktioner. Det finns fyra grundläggande krav för en kinasassay att fortsätta: kinas, substrat, ATP och en metalljon. För detta protokoll, som huvudsakligen används för eukaryotiska kinaser, används MgCl2 som en källa till magnesium. Både rekombinanta proteinkinas och IP-kinasförberedelser innehåller typiskt magnesium, vilket gör MgCl2 otillräckligt som ett reaktionsstart. På samma sätt kan tillsättning av omärkt ("kall") ATP före tillsatsen av märkt ("het") ATP initiera en reaktion otillbörligt tidigt. Vi rekommenderar att du förbereder reaktioner med hjälp av en koncentrerad kinasreaktionsbuffert som underlättar samtidig tillsats av MgCl Även om det finns viss skillnad mellan IP-kinasanalyser och rekombinanta proteinkinasanalyser, tHans experimentella paradigm som är gemensamt för båda visar hur mångsidigt denna analys kan vara. Faktum är att det finns fall då funktioner hos båda kinasassaytyperna kan blandas, liksom med studier på mitogenaktiverad proteinkinas / extracellulär signalreglerad kinas (MAPK / ERK) signalväg. I denna väg aktiveras ERK1 / 2 genom dubbelfosforylering av uppströmsfaktorn MAPK / ERK-kinas 1 (MEK1). Tidigare studier har visat att medan MEK1, liksom en konstitutivt aktiv mutant betecknad MEK1R4F, kan aktivera ERK1 / 2, har den mycket låg aktivitet mot MBP. Följaktligen uppvisar ERK1 / 2 renad från bakterieceller begränsad kinasaktivitet mot MBP om den inte behandlas med MEK1R4F, vilket skapar en robust plattform för att jämföra kinasaktiviteten hos vildtyps ERK1 / 2 till mutanta konstruktioner, såsom visas i figur 2 . Inklusion av immunprecipiterade komponenter kan lägga till ännu mer nyans, och markera kinasassayen som en mycket anpassningsbar metod för att sondra den mångfacetterade nÅtkomst av dessa viktiga signalmolekyler. Även om vissa kan hitta arbete med radioaktiva material besvärliga, är den radioaktiva märkbarheten av den radiomärkta kinasassayen en av dess stora fördelar. Dock har de senaste framstegen inom områdena naturlig produktkemi, genomik och masspektrometri skapat en efterfrågan på modifierade kinasanalyser Med avläsningar mer mottagliga för applikationer med hög genomströmning 15 . Eftersom dessa analyser utnyttjar olika märkningsmaterial görs kompromisser när det gäller noggrannhet, men dessa kan övervinnas genom att använda en radiomärkt analys för att validera skärmresultat. Eftersom vår förståelse för proteinkinassignaler ökar är det tydligt att tekniker som kan reta ut uppgifterna om kinasreglering fungerar fortsättningsvis att hjälpa till vid utveckling av verktyg och terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar alla nuvarande och tidigare medlemmar av Cobb-laboratoriet för värdefullt arbete och diskussioner, och Dionne Ware för administrativt bistånd. Dessa studier stöddes av National Institute of Health Grant R37 DK34128 och Welch Foundation Grant I1243 till MHC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 | |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 | |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 | |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 | |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 | |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 | |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector | |
| BioMax Cassette 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax MS Film 8" x 10" | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A | |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 | |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Cold Spring Harbor Protocols. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
- Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
- Autoradiography. , Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. , 3 edn, Humana Press. (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
