Summary
קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.
Abstract
קינאזות חלבונים מסוגלים לשלוט בשינויים תאיים בקנה מידה גדול בתגובה למערכים מורכבים של גירויים, ומאמץ רב הופנה לחשוף פרטים אלסטריים של הרגולציה שלהם. קינאזות הן רשתות איתות אשר פגמים הם לעתים קרובות סימני ההיכר של צורות רבות של סרטן ומחלות נלוות, מה שהופך פלטפורמת assay מקובל מניפולציה של גורמים רגולטוריים במעלה הזרם ואת האימות של דרישות התגובה קריטי בחיפוש אחר טיפול משופר. כאן, אנו מתארים assay קינאז בסיסי שניתן להתאים בקלות כדי להתאים שאלות ניסיוניות ספציפיות, כולל אך לא מוגבל לבדיקת ההשפעות של סוכני ביוכימי ופרמקולוגי, מניפולציות גנטיות כגון מוטציה ומחיקה, כמו גם התנאים תרבות התא וטיפולים בדיקה מנגנוני איתות תא. Assay זה מנצל radiolabeled [γ- 32 P] ATP, המאפשר השוואות כמותיות הדמיה ברורה של התוצאות, והוא יכול להיות modאם נעשה שימוש עם קינאז immunoprecipitated או רקומביננטי, מצעים ספציפיים או מאופיינים, בכל רחבי מגוון רחב של תנאי תגובה.
Introduction
קינאזות חלבון הן אנזימים מתוחכמים קריטיים להעברת אותות סלולריים לתגובות הולמות 1 . בהתחשב בתפקידים שלהם בשמירה על הומאוסטזיס ומניעה או קידום של מצבי מחלה 2 , שיטות ביוכימיות להערכת פעילות קינאז ממשיכות להיות כלים רבי עוצמה לתיאור הפרטים של איתות אוקריוטי 3 . למרות אסטרטגיות ניצול נוגדנים ספציפיים phospho כבר אינפורמטיבי מאוד במונחים של מדידת ההשפעות של תנאי טיפול שונים על מצב איתות תא 4 , assay קינאז מאפשר למדוד את ההשפעות של תנאי טיפול שונים ישירות במונחים של פעילות אנזימטית של קינאז של ריבית. אמנם יש מספר אפשרויות עבור מבחני דומים שאינם משתמשים בחומרים רדיואקטיביים 5 , אנו ממשיכים להסתמך על שיטה זו quantitation חזק של תוצאות. שםהם שני יישומים טיפוסיים של assay זה, שניהם בעלי ערך מסיבות שונות: assay immunoprecipitated (IP) קינאז ( איור 1 ) ואת assay חלבון רקומביננטי קינאז ( איור 2 ).
Assay IP Kinase הוא שימושי מאוד עבור זיהוי גורמים המסוגלים להפעיל קינאזות חלבון ספציפיים, כמו גם לאמוד תנאי טיפול מעכב. בקצרה, קינאז אפיטופ מתויג של עניין הוא transfected לתאי eukaryotic תרבותי, נתון למגוון של טיפולים, immunoprecipitated, assayed על היכולת לשלב פוספט radiolabeled לתוך מצע מודל ( למשל myelin בסיסי חלבון (MBP)). Assay IP kinase יכול להתבצע גם מבלי להזדקק overexpression, או על ידי immunoprecipitation של חלבון אנדוגני או כל מספר של טכניקות עריכת הגנום. בגלל טיפולים מנוהלים בתרבות, שיטה זו יכולה לזהות גירויים המועברים באמצעות גורמים במעלה מרוביםאו מסלולים מקבילים על ידי readout במבחנה . אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא כי היא אינה דורשת ידע מוקדם של גורמים במעלה או במורד הזרם ישיר או אתרי זרחן בו. יתר על כן, לאחר מצעים ספציפיים עבור קינאז של עניין זוהו, אותו פרוטוקול assay קינאז ניתן להשתמש עם רכיבים רקומביננטי למדוד פעילות ספציפית כלפי מצעים טבעיים לזהות אתרי זרחן ספציפיים בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה. אתרים המזוהים בצורה זו ניתן לאמת עוד עם מבחני קינאז ניצול מוטציות המצע. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות ולמדוד autophosphorylation.
פרוטוקול בתנאי כאן מניח או מטוהרים חלבון אופטימיזציה או שיטת transfection להביע קינאז מתויג זיקה של עניין בתרבית תאים. לקבלת תערוכות מפורטות יותר של transfection, תמוגה, immunoprecipitation, ואת חלבון טיהור מגןOcols, אנו מציעים להתייחס פרוטוקול הקרה האביב הארבור 6 . לקבלת מידע נוסף לגבי פיתוח assay ושינוי, עיין פרוטאין זרחון: שיטות נבחרות אנזימולוגיה 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קינאז טיהור משאבים כללי Immunoprecipitation צינור
הערה: קינאזות לשימוש עם assay זה עשוי להיות שמקורו immunoprecipitates של תאים בתרבית או על ידי אמצעים רקומביננטי כגון זיקה מתוייגים טיהור 6 . להלן פרוטוקול כללי דגל תיוג immunoprecipitation כי ייתכן שיהיה שונה בהתאם kinase של עניין. הכל צריך להישמר על הקרח במידת האפשר.
- הוסף 2 μL של נוגדן 1 מ"ג / מ"ל ל 200 μL של lysates התא (בדרך כלל ~ 1 מ"ג / מ"ל ריכוז החלבון הכולל) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה בעת נדנדה.
- לשטוף חלבון חרוזי sepharose 2-3 פעמים עם חיץ תמוגה (ראה להלן) על ידי ספינינג בקצרה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 1 x ב 5000 xg ("מגע ספין"), הסרת supernatant עם פיפטה, חרוזים resuspending במאגר .
- הכן חיץ תמוגה: 50 מ"מ HEPES pH 7.7, 150 מ"מ NaCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 1 מ"מ EGTA, 10% גליצרול, 0.2 mM נתרן orthovanadate, 100 מ"מ נתרן פלואוריד, 50 מ"מ β-glycerophosphate, 0.1% Triton X 100 או 0.1% NP-40.
- הוסף 30 μL של 50% slurry של חלבון חרוזי sepharose במאגר תמוגה כדי lysates; דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בזמן נדנדה.
- מגע ספין ב 4 ° C כדי גלולה חרוזים ולהסיר את supernatant.
- לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף חרוז (1 M NaCl, 20 מ"מ טריס pH 7.4).
- לשטוף פעם עם 1x kinase התגובה חיץ (10 מ"מ HEPES pH 8.0, 10 מ"מ MgCl 2 ). הסר חיץ ככל האפשר מבלי להסיר חרוזים.
2. אתחול תגובות קינאז
הערה: עבור מבחני קינאז IP, ~ 15 μL של חרוזים מושעה הוא מדגם מתחיל טיפוסי. עבור מבחני קינאז חלבון רקומביננטי, כמויות החל טיפוסי החל מ 0.1-1.0 מיקרוגרם ב 1-10 עבור 25-50 μL נפח התגובה הסופית. התאם את הכרכים של מדגם חלבון רקומביננטיS להיות שווה עם המאגר הם מאוחסנים לפני אתחול assay. בעת שימוש בכמויות גבוהות של קינאז, לכלול חלבון המוביל כגון BSA כדי לסייע בשמירה על יציבות החלבון למשך assay.
- הכן את חיץ התגובה 5x kinase להלן:
50 מ"מ HEPES pH 8.0
50 מ"מ MgCl 2
50 מ"מ Benzamidine (מעכב פרוטאז)
50 מ"מ DTT (סוכן הפחתת)
250 מיקרומטר ATP (ללא תווית, או "קר") - שמור דגימות קינאז על הקרח צינורות 1.5 מ"ל. הכינו את תערובת התגובה הבאה, צינורות צוננים 1.5 מ"ל נפרד:
21 μL H 2 O
6 μL 5x חיץ התגובה kinase
1 μolabel μL ("חם") ATP
2 מצע μL (~ 5 מ"ג / מ"ל)
הערה: עבור מבחני קינאז רקומביננטי, נפח עשוי להיות מותאם כדי להתאים חלבונים מטוהרים. חישוב כזה נפח התגובה הסופית היא 30 μL. השתמש מתכון זה להכין הוריםלְעַרְבֵּב. עם קבלת ATP שכותרתו, לדלל מלאי H 2 O לפעילות ספציפית של 0.01 mCi / μL לפני הוספת תערובת התגובה. - כדי לאתחל את assay, להוסיף תערובת התגובה כולה מדגם kinase ו דגירה תגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות עד 1 שעות בהתאם לפעילות של kinase להיות assayed.
הערה: כאשר אתה עובד עם קינאז שפעילותו לא נבדקה בעבר, בצע את מהלך הזמן של פעילות קינאז עם מרווחי 5 דקות בין נקודות זמן.
3. סיומת תגובה SDS-PAGE
- להפסיק את התגובה על ידי לשים על קרח הוספת 7.5 μL 5x Laemmli חיץ מדגם 6 .
- מחממים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 2 דקות בבלוק חום.
- מגע ספין לטעון 20 μL לכל טוב על 10-15% SDS-PAGE ג'ל. הפעל ג'ל מספיק זמן כדי להפריד בין קינאז המצע (בדרך כלל 1 שעות על כוח קבוע של 5 W) הקפד לשמור על מנגנון ג 'ל מוגן להגביל את החשיפה 32
- הנה, להשתמש במכשירים ג'ל תוצרת בית, אבל סטנדרטי מינימלי זמין מסחרית ג'ל מתאימים לחלוטין. השתמש בממדים באופן הבא:
ג'לים: רוחב 8 ס"מ, אורך 5.5 ס"מ (פתרון), עובי 1.5 מ"מ.
מסרקים: 15 בארות, עובי 1.5 מ"מ, רוחב 2.9 מ"מ, עומק 16 מ"מ
4. מכתים ג'ל וייבוש
זהירות: עבור כל השלבים הקפד להפחית את החשיפה האישית ל -32 P באמצעות שימוש במיגון רדיואקטיבי ובביגוד בציוד מגן אישי. לקבלת מידע נוסף על שלבים ספציפיים, כלול הפניות מועילות.
- הסר את הג'ל מזכוכית / צלחות אלומינה מקום ב 50 מ"ל כתם קומסי (10% חומצה אצטית קרח, 50% מתנול, 0.25% R-250 צבע) במשך שעה 1 על שייקר מסלולית להגדיר 50 סל"ד. עבור שלב זה להשתמש במיכל כי הוא מעט גדול יותר מאשר ג 'ל עצמו. 8
- להזיז את הג'ל מ כתם לפתרון פתרון (10% aci aci קרחוניד, 20% מתנול) כדי דה-כתם. סלע את הג'ל ב 600-700 מ"ל של פתרון תיקון לילה על שייקר מסלולית ב 50 סל"ד. מקום חתיכות של קצף או מגבונים מעבדה מרוכזת במיכל עם ג'ל לספוג את צבע קומסי 8 , 9 .
- הסר ג'ל מ תיקון פתרון ולספוג 200 methanol מ"ל עבור 1-2 דקות עם תסיסה עדינה עד ג 'ל הופך לבן חלבי. זה יסייע למנוע פיצוח במהלך שלב ייבוש.
- רטוב 14 ס"מ x 14 חתיכת ס"מ של נייר סינון איכותי עם מתנול ומקום על משטח ואקום מייבש ואקום. הנח את הג'ל על הצד הקדמי של נייר המסנן ופנה כלפי מעלה.
- מכסים את הג'ל בעטיפת פלסטיק בזהירות, כדי למנוע קמטים בועות אוויר. הפעל את המייבש עבור 1.5 שעות ב 80 ° C. לאחר הוואקום הושג לפתוח את המכסה לגלגל את כל בועות אוויר במידת הצורך עם ברכה גומי רך.
5. אוטורדיוגרמה וספירת סינטילציה
- הסר את הגשםג'ל אד ולצרף סמן autorad, סרגר זרחני או נקודות על נייר הסינון בצד של הג'ל. אם באמצעות נקודות לוודא שהם נמצאים דפוס אסימטרי. זה יהיה ליישר את הג'ל עם הסרט לאחר החשיפה והפיתוח.
- השתמש מונה גייגר לבדוק את עוצמת האות. עבור חלשות אותות חלש ב -70 מעלות צלזיוס ל -80 מעלות צלזיוס עם מסך הגברת תגדיל את צפיפות הלהקה הסרט.
- בחדר חשוך לשים ג'ל יבש בתוך קלטת הסרט עם הסרט ואת המסך הגובר בסדר הבא מלמעלה למטה: ג'ל, הסרט, מסך מגביר.
- צרף את המסך הגובר למכסה של הקלטת ואת הקלטת ג'ל במקום לעשות צעד זה יותר קל. המסך החזק פולט אור כאשר מוקרן על ידי חלקיקי בטא מ 32 P. אלה פליטות האור לחדור את הסרט בצורה יעילה יותר מאשר חלקיקי בטא.
- ודא את אורך הגל הנפלט corres המסך הגוברתבריכות לאורך גל הסרט הכי רגיש.
- השתמש מונה גייגר כדי לקבוע כמה זמן לעזוב את החשיפה עבור: אם ספירת cpm הוא ~ 100 או למטה, לנסות לילה ב -70 ° C. אם הספירה היא ~ 10,000, להתחיל עם חשיפה 1 שעות ו לייעל משם.
- בסיום החשיפה להסיר את הסרט ולפתח במעבד הסרט הרפואי / רנטגן. אם החשיפה בוצעה ב -70 ל -80 מעלות צלזיוס, או לאפשר את הקלטת לחמם לטמפרטורת החדר כדי למזער עיבוי על הסרט או להסיר את הסרט מיד לפני צורות עיבוי 10 .
- הנח את הסרט על נייר ג'ל יבש / מסנן וליישר את התמונה של הסמן / נקודות עם סמנים / נקודות על ג'ל יבש. סמן על הסרט להקות המתאימות לסטנדרטים של חלבון. תווית את הסטנדרטים חלבון אשר נתיבים התגובות הן לעיון בעתיד.
- הבלו את להקות מן הג'ל התואמות להקות של עניין על הסרט ומניחים אותםב 7 מ"ל בקבוקונים scintillation. הוסף 4 מ"ל של נוזל נצנוץ לספור עם נוזל נצנץ נוזל. אישור הדלפק מוגדר לפקח על חלון ספקטרום האנרגיה הנכון עבור 32 P.
הערה: הקפד גם לבלו את הלהקה התואמת את המצע משלב הבקרה no-kinase. זה ישמש לחישוב קרינת הרקע כי יהיה מנוכה מכל ספירת scintillation.
6. ניתוח התוצאות
הערה: autoradiogram מספק הדמיה איכותית של התוצאות. עבור quantitation מדויק, 32 P שילוב ניתן למדוד עם הדלפק נצנץ. הנתונים מתבטאים בדרך כלל במונחים של פעילות יחסית, כפי שמוצג באיור 1 ב . כל עוד נשמרים תנאים אחידים לכל הדגימות, מדידות יחסית של פעילות ספציפית מספקות כדי להשוות בין טיפולים.
- בעת חישוב ערכי פעילות ספציפיים מוחלטים, בצע קריטריוןOus אופטימיזציה של כל תנאי התגובה, כולל קינאז, המצע, ריכוזי ה- ATP קר, על מנת להבטיח טווח ליניארי של פעילות על פני זמן הקורס ( למשל 2 x [קינאז] = 2 x פעילות ספציפית). עבור קינאזות עם פעילות ספציפית גבוהה, לבצע מבחני עם ריכוז המצע מוגברת במקרה פעילות קינאז מוגבל על ידי כמות המצע.
- חישוב הפעילות הספציפית של kinase עניין ביחידות של פוספט ננומלס מועבר לכל min לכל קינאז מ"ג.
- החסר החסר מן הדקה ב להקות ספור.
- לחשב את ריקבון ה- ATP החם: [1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 כאשר t הוא מספר הימים מאז תאריך ההתייחסות (אמור להינתן על ידי הספק), t 1/2 הוא מחצית חיים של 32 P, שהוא 14.3 ימים, ו 0.95 משקף את היעילות של הדלפק נצנץ. דוגמה: אם אתה משתמש ATP חם כי הוא בן 28 ימים, הערך ריקבון צריך להיות 0.245.
- Calc(Polololes (pmol) של ATP הכולל assay (בדרך כלל זה שווה את כמות ATP קר התגובה): נפח assay (μL) x [קר ATP] (מיקרומטר) = סך ATP (pmols). דוגמה: 30 μL x 50 מיקרומטר = 1500 pmol
- חישוב CPM / pmol ATP: [μL של ATP חם x (2.2 x 10 7 ) x גורם דעיכה] / pmol של ATP קר.
הערה: הערך של 2.2 x 10 7 ממיר 0.01 mCi / μL של ATP ל- cpm. - חישוב כמות של קינאז ב assay ב מ"ג. עבור קינאז רקומביננטי ו קינאזות immunoprecipitated, שיטות סטנדרטיות כגון מבחני BCA מתאימים כדי לקבוע ריכוז מתחיל. דוגמה: wtERK2 0.0002 מיקרוגרם / μL בתגובת 50 kinase μL הוא 0.01 מיקרוגרם, או 1 x 10 -5 מ"ג.
- חישוב סך מחיר לאלף הופעות ב- assay. להרכיב 30 תגובות μL ולהפעיל 20 μL מכל תגובה על ג'ל. הכפל את cpm נספר (לאחר חיסור ריק) על ידי גורם של נפח assay הכולל / נפח טעון. המשך האמור לעיללדוגמה, להכפיל את כל הספירות על ידי 1.5, או 30/20.
- חישוב הפעילות הספציפית של קינאז assayed:
סה"כ CPM ב assay) / (cpm / pmol ATP) / (זמן assay בדקות) / (כמות של kinase ב מ"ג)
הערה: חלוקת הערך הנ"ל ב -1,000 תשואות הפעילות הספציפית בננו-מולים / דקה / מ"ג
- חישוב כמה מולס של פוספט משולבים לתוך המצע (כל עוד המשקל המולקולרי שלה ידוע). זה משמש כדי לקבוע את מספר phosphosites על חלבון מסוים לאחר התגובה יש הלך להשלמה.
סך כל cpm assay) / (cpm / pmol ATP)] / (כמות של המצע ב pmols)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WNK1 IP מבחני kinase
Myc- מתויג WNK1 היה transfected לתוך תאים HEK293 ו immunoprecipitated עם נוגדן אנטי Myc 11 . פעילות immunoprecipitate immunoprecipitate כלפי המודל המצע MBP כמו גם כלפי עצמו ( איור 1 א ). מוטציות WNK1 נבדקו אז עבור פעילות kinase לכיוון MBP באותה שיטה, הפעם העסקת GST-tagged בונה ( איור 1 ב ). ניתוח של התנהגות קינאז מוטציה יחסית wildtype חשף שאריות קריטי עבור פעילות WNK1 אופטימלית.
תאי HEK293 נחשפו לפאנל של טיפולים תרופתיים וביוכימיים. באמצעות נוגדנים שהועלו כנגד פפטיד N-Terminal של WNK1, פעילות אנדוגנית winK1 Kinase אנדוגנית נחקרה באמצעות MBP כתשתית. גורם גדילה אפידרמיס (EGF), אקטיבציה ידועהאו של ERK1 / 2, nocodazole, תרופה שמכוונת לדינמיקה של microtubule, anisomycin, מעכב של תרגום לאוקריוטיקה וחומצה lysophosphatidic (LPA), מיטוגן רב עוצמה, לא היו מסוגלים לעורר עלייה חזקה ב- MBP זרחני. לעומת זאת, NaCl הוכח להיות הרגולטור של פעילות KNase WNK1.
ERK2 רקומביננטי חלבון מבחני קינאז
חולדה ERK2 נושאת N- מסוף 6His התגלה לידי ביטוי תאים חיידקים זיקה מטוהרים עם שרף ניקל 12 . חלבון היה מטוהרים נוספת על ידי יון חילופי כרומטוגרפיה על עמוד MonoQ, שבו כמה שברים elution נבדקו פעילות kinase ( איור 2 א ). בגלל ERK2 דורש זרחון כפול על ידי MEK כדי להגיע לפעילות מקסימלית קינאז, ERK2 מטוהרים מן החיידקים בהיעדר MEK הוא פעיל במידה רבה. לכן, על מנת לבדוק שברים של recomBinant ERK2 עבור פעילות כלפי MBP, צורה אקטיבית מכוננת של MEK1 הנקראת MEK1R4F נכללה בתגובות קינאז. יש לציין כי MEKR4F אינו מעגן פעילות קינאז גבוהה ב- MBP ( איור 2 ).
באמצעות assay דומה לזו שמוצג באיור 2A , פעילות קינאז MBP שימש למדוד פעילות של מוטציות ERK2 רקומביננטי מטוהרים תרבויות חיידקים יחסית חלבון wildtype ( איור 2 ב ). למרות ERK2 הוא מסוגל phosphorylate MBP כאשר מגורה על ידי MEKR4F, מוטציה של ליזין קטליטי (K52R) או thronon proximal לאתרים הקנוניים של זרחון כפול (T188D ו T188E) באופן דרמטי מבטל פעילות קינאז ERK2. ERK2-T188D ו ERK2-T188E להציג פעילות קינאז השולית לעבר פפטיד קטן וגמיש ( איור 2 ג ), עם זאת, הם אינם מסוגלים phosphorylate חזק מצעים ידועים ERK2 Nup153 ו PDX1 ( איור 2 ד).
איור 1: מבחני kinase Immunoprecipitation של WNK1. ( A ) HEK293 התאים היו transfected עם pCMV5-Myc ללא הוספה או pCMV5-Myc-WNK1, חלבונים מתויגים היו immunoprecipitated עם נוגדן אנטי Myc ואחריו מבחני קינאז באמצעות MBP כמו המצע. אוטורדיוגרפיה מוצגת בצד שמאל, ו immunoblot של immunoprecipitates בצד ימין. ( ב ) חלבונים מוטנטים שונים GST-WNK1 שימשו מבחני קינאז עם MBP כמו המצע; MBP זרחון מתבטא בפעילות יחסית wtykpe wildtype. ( C ) אנדוגני WNK1 היה immunoprecipitated מ HEK293 תאים שטופלו גירויים שונים assayed עבור autophosphorylation. נתון זה שונה מ- Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מבחני קינאז חלבון רקומביננטי של ERK2. ( א ) מטוהרים ERK2 שברים מתוך עמודת Monion אניון החליפין שימשו assay קינאז עם MBP בנוכחות או היעדר MEK1R4F, ממריץ פעיל קונסטיטטיבי של פעילות קינאז ERK2. ( B ) נבדקו מוטציות ERK2 לפעילות קינאז ב- MBP. ( C ) מוטציות לולאה ההפעלה ERK2-T188D ו ERK2-T188E להציג פעילות קינאז השולית לעבר מצע פפטיד קטן מאופיינת. ( D ) השוואה של ERK2 או T188D פעילויות kinase לאחר ההפעלה על ידי MEK1R4F עם מצעים ידועים ERK2 nucleoporin-153 (Nup153) ו הלבלב ואת התריסריון התריסריון 1 (PDX1). מצעים זרחניים מסומנים על ידי טריזים ו phosphorylaTed ERK2 ו T188 על ידי כוכביות. הודפס מחדש (ושונה) באישור McReynolds et al. , 2016 12 (זכויות יוצרים 2016 האגודה האמריקנית לכימיה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קינאזות הם משפחה מגוונת של חלבונים אשר התפתחו פונקציונליות נרחבת בהקשרים רבים, מבחני קינאז כבר שימושי מאוד בחקר חלבונים איתות כמה תרמו רבות להבנתנו הנוכחית של התקשורת הסלולרית. יש לציין, אותו assay הבסיסי שימש אפיון שני קינאזות שונות למרות הבדלים גדולים במבנה ופעילות. קינאז WNK1 מכיל כיס קטליטי לא טיפוסי שבו ליזין קריטי עברה לתפקיד ייחודי ידוע לשחק תפקידים של cotransporters קטיון כלוריד דרך שתי פונקציות kinase ו פיגומים. פעילות הקינאז של WNK1 ידועה כמספר מחזור נמוך, אפילו על המצעים המאופיינים ביותר שלה, החלבון קינאז חמצון תגובה 1 (OSR1) ו SPS / STE20 הקשורים פרלין אלנין עשירים קינאז (SPAK). לעומת זאת, ERK2, יחד עם קינאז קשור ERK1, מציג פעילות קינאז חזקה כאשר מופעל
ההיבט הקריטי ביותר של assay הוא הרכבה התגובה. על מנת לבצע מדידות נקודת זמן מדויקות, יש לתת טיפול מיוחד לאתחול תגובות קינאז. ישנם ארבעה דרישות בסיסיות assay kinase להמשיך: קינאז, המצע, ATP, יון מתכת. עבור פרוטוקול זה, המשמש בעיקר עבור קינאזות eukaryotic, MgCl 2 משמש כמקור של מגנזיום. גם חלבון רקומביננטי קינאז ותכנות IP kinase בדרך כלל מכילים מגנזיום, טיוח MgCl 2 מספיק כמו מתגובת תגובה. כמו כן, תוספת של ATP ללא תוויות ("קר") ATP לפני תוספת של ATP ("חם") מסומן יכול ליזום תגובה לא מתאימה מוקדם. אנו ממליצים להכין תגובות באמצעות חיץ התגובה ריכוז kinase המאפשר תוספת בו זמנית של MgCl אמנם יש כמה הבחנה בין מבחני קינאז IP ו מבחני קינאז רקומביננטי חלבון, לאהוא פרדיגמה ניסיונית משותפת לשני מדגים כיצד צדדי assay זה יכול להיות. ואכן, ישנם מקרים שבהם תכונות של שני סוגי assay kinase עשוי להיות מעורבב, כמו עם מחקרים על קינאז חלבון המופעל על ידי מיטוגן / תאיים האות- reginulated קינאז (MAPK / ERK) נתיב איתות. במסלול זה, ERK1 / 2 מופעלים על ידי זרחן כפול על ידי גורם הזרם MAPK / ERK kinase 1 (MEK1). מחקרים קודמים הראו כי בעוד MEK1, כמו גם מוטציה פעיל מכונן בשם MEK1R4F, הוא מסוגל להפעיל ERK1 / 2, זה פעילות נמוכה מאוד כלפי MBP. כתוצאה מכך, ERK1 / 2 מטוהרים מתאי חיידקים להציג פעילות קינאז מוגבל כלפי MBP אלא אם מטופלים עם MEK1R4F, יצירת פלטפורמה חזקה להשוואת פעילות קינאז של wildtype ERK1 / 2 על מבנים מוטנטיים, כפי שמוצג באיור 2 . הכללה של רכיבים immunoprecipitated יכול להוסיף ניואנס אפילו יותר, הדגשת assay קינאז כשיטה להתאמה מאוד כדי לחקור את n רב פניםבשעה של אלה מולקולות איתות חשוב. בעוד כמה עשויים למצוא עבודה עם חומרים רדיואקטיביים cumbersome, tractability כמותי של assay kinase radiolabeled הוא אחד היתרונות העיקריים שלה.עם זאת, ההתקדמות האחרונה בתחומים של כימיה המוצר הטבעי, גנומיקה, ספקטרומטריית מסה יצרו דרישה מבחני קינאז שונה עם readouts יותר אמין ליישומי התפוקה גבוהה 15 . בגלל מבחני אלה לנצל את חומרי תיוג שונים, פשרות נעשים במונחים של דיוק, אבל אלה ניתן להתגבר באמצעות assay radiolabeled כדי לאמת את תוצאות המסך. כמו ההבנה שלנו של חלבון קינאז איתות עולה, עדיין ברור כי טכניקות מסוגל להקניט את הפרטים של פונקציות רגולטוריות kinase ימשיך לסייע בפיתוח של כלים וטיפולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והעברתיים של מעבדת קוב עבור עבודה ודיונים יקרי ערך, ו Dionne Ware עבור סיוע מנהלי. מחקרים אלה נתמכו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט R37 DK34128 ו Welch קרן גרנט I1243 ל MHC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 | |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 | |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 | |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 | |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 | |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 | |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector | |
| BioMax Cassette 8 x 10" | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax MS Film 8" x 10" | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A | |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 | |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 | |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Cold Spring Harbor Protocols. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
- Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
- Autoradiography. , Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. , 3 edn, Humana Press. (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
