Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fett kroppen kultur organsystem i Aedes Aegypti, en vektor av zikaviruset

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

Fett kroppen är centrala metaboliska organ i insekter. Vi presenterar en levande kultur organsystem som ger användaren möjlighet att studera Svaren isolerade fett vävnad på olika stimuli.

Abstract

Insekt fett kroppen spelar en central roll i insekt metabolism och näringsämnen lagring, spegling funktioner i lever och fettvävnad hos ryggradsdjur. Insekt fett vävnad är vanligtvis fördelade i insekt kroppen. Det är dock ofta koncentrerade i buken och bifogas kroppen bukväggen.

Mygga fett kroppen är den enda källan till äggula proteiner, som är kritiska för äggproduktion. Därför i vitro kultur mygga fett kroppsvävnader representerar en viktig system för studier av mygga fysiologi, metabolism, och slutligen, äggproduktion. Fett kroppen kultur processen börjar med beredning av lösningar och reagenser, inklusive aminosyra stamlösningar, Aedes fysiologisk koksaltlösning salt stamlösning (APS), kalcium stamlösning och fett kroppen odlingsmedium. Processen fortsätter med fett kroppen dissektion, följt av en experimentell behandling. Efter behandling, kan en mängd olika analyser utföras, inklusive RNA sekvensering (RNA-Seq), qPCR, Western blotting, proteomik och metabolomik.

I vårt exempel experiment visar vi protokollet genom excision och kultur av fett organ från den gula feber Myggan, Aedes aegypti, en rektor vektor av arboviruses bland annat denguefeber och chikungunya Zika. RNA från fett organ odlade under ett fysiologiskt tillstånd känt att upregulate äggula proteiner kontra kontroll var föremål för RNA-Seq analys att demonstrera den potentiella nyttan av detta förfarande för utredningar av genuttryck.

Introduction

Myggor är vektorer av förödande mänskliga sjukdomar, inklusive malaria, denguefeber, chikungunya och Zika1,2,3. Trots intensiva internationella ansträngningar att stävja dessa sjukdomar och att kontrollera sjukdom-sändning mygga populationer, är epidemiska utbrott moskitburen sjukdomar fortfarande vanligt, särskilt i utvecklingsländerna. Effektiva vacciner mot många av dessa sjukdomar är antingen inte tillgänglig eller begränsad effekt4,5. Det mest effektiva sättet att förhindra utbrott är att styra mygga populationer, främst genom användning av insektsmedel behandlingar. Insektsmedel motstånd har dock utvecklats i många mygga populationer och blivit ett vanligt problem runt den värld6,7,8. Studien av mygga fysiologi är avgörande för utvecklingen av nya verktyg och strategier för att bekämpa sjukdomar.

Mygga fett kroppen spelar en central roll i näringsämnen lagring, metabolisk homeostas, reproduktion och xenobiotiska katabolism9,10,11,12. Det är den huvudsaklig lagring orgeln för triglycerider, glykogen och aminosyror i form av lagring proteiner. Det fungerar också som plats för syntes för de flesta hemolymph proteiner och metaboliter. I myggor är fett kroppen den enda källan till äggula proteinproduktion som förekommer hos kvinnor efter de ta en blodmjöl13,14.

Den huvudsakliga celltypen av fett kroppen är stor, polyploida trophocyte eller fettceller3,9,10,12. Fett vävnad är uppdelad i loberna eller slidor och kan hittas i alla delar av kroppen av mygga, med den största delen ligger i buken, där stora loberna i fett kroppen bifogas kroppen bukväggen.

Mygga fett kroppen kultur systemet presenteras här utvecklades i ' 70-talet och är fortfarande ett kraftfullt verktyg för att studera fett kroppen fysiologi10, särskilt i kombination med nuvarande teknik för analys. Grunden för denna teknik är baserad på isoleringen av buken kropp väggarna och den associerade fett vävnaden. Den hydrofoba karaktären av buken nagelband orsakar det att flyta på ytan av odlingssubstratet, med bifogade loberna av buk fett kroppen nedsänkt. De externa och tracheolar struktur upprätthålls, att säkerställa syresättning av odlade vävnad. Hädanefter hänvisar vi till dessa preparat som ”fett organ”. Isolerade fett organ förblir lönsamt för mer än 12 h när inkuberas i lämpligt medium (opublicerade resultat). Fett kroppen kultur är ett värdefullt verktyg som har tagit upp en mängd frågor om fett kroppen endokrinologi och fysiologi9,10,12,15,16, 17.

Odlade fett organ kan utsättas för olika experimentella och styra behandlingar, tidpunkten för som kan beslutas av prövaren. I slutet av inkubationstiden, kan fett organ samlas in och bearbetas för nedströms analyser, inklusive qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, proteomik21eller metabolomik22. Experiment kan utföras på olika skalor, från enskilda fat organ till grupper av hundratals som kan vara odlade tillsammans.

De representativa resultat ingår här härleddes från fett organ odlade i närvaro av aminosyror och den steroid hormon 20-hydroxy ecdysone att simulera blodmjöl aktiveringen vitellogenesis16,17, 23,24. Vi analyserade och jämförde differentiell genuttrycket av inte-aktiverat kontra aktiverade fett organ via nästa generations sekvensering analys.

Protocol

1. förbereda lösningar och reagenser

  1. aminosyra stamlösning
    1. Förbered a 4 X aminosyra stamlösning 23 , 24 genom vägning och att lägga till 20 olika aminosyror i en Erlenmeyerkolv enligt de koncentrationer som anges i tabell 1.
      Obs: I vissa fall amino acid(s) kan uteslutas från lösningen och ersättas med lika molar mängder mannitol att upprätthålla en lika koncentration av osmolytes.
    2. Lägg till lämplig mängd ddH 2 O att producera önskad volym lösning.
    3. Att säkerställa att aminosyrorna har helt upplöst, värm försiktigt under omrörning kontinuerligt tills vätskan är helt klar, det tar på en gul färgton.
      Obs: Det kan vara nödvändigt att minska pH till 6 genom att lägga till HCl för att tillåta att vissa av de mer hydrofoba aminosyrorna att upplösa.
    4. Alikvot lösningen och sterila-filter med en spruta filter med ett 0,2 µm porstorlek.
    5. Förvaras i slutna behållare vid-20 ° C i upp till 6 månader.
  2. APS
    Obs: se 25.
    1. För 20 X salt stamlösning, kombinera salter som anges i tabell 2 i 50 mL vatten. Rör om tills helt upplöst.
      Obs: Det kan vara nödvändigt att något värma lösningen för att fullständigt lösa salterna.
    2. Steril-filter med en spruta filter med ett 0,2 µm porstorlek och förvara lösningen i en 50 mL tub på -20 ° C.
  3. Kalcium stamlösning
    1. för 50 X kalcium stamlösning, lägga till 0,90 g kalciumklorid i 100 mL vatten (tabell 3), rör om tills helt upplöst.
    2. Steril-filter med hjälp av en spruta med porstorlek 0,2 µm, alikvotens filtrera lösningen till 50 mL rör och förvaras vid -20 ° C.
  4. Tris buffert (pH 7,4)
    1. för Tris buffert, kombinera salt och lösningar som anges i tabell 4 och Lägg till ddH 2 O upp till 100 mL.
    2. Steril-filter med hjälp av en spruta filtrera med 0,2 µm porstorlek och alikvot lösningen till 50 mL tuber, förvara i rumstemperatur.
  5. Fett kroppen odlingsmedium
    1. för att förbereda fett kroppen odlingsmediet, förbereda alla lösningar ovan.
    2. Kombinera dem enligt volymerna i tabell 5 att göra 200 mL fett kroppen odlingsmedium.
    3. Justera pH-värdet till 7,2 med NaOH eller HCl.
    4. Steril-filter om lösningen med en spruta filter med porstorlek 0,2 µm.
    5. Dela upp lösningen i 15 mL alikvoter och förvaras vid-20 ° C i upp till 6 månader.

2. Förbereda för dissektion

  1. förbereda ett stereomikroskop (10-20 x förstoring) med belysning och lägga ut två ultrafina pincett och en mikro dissektion sax.
  2. Förbereda alla lösningar nödvändiga för experimentet. Tina upp fett kroppen odlingssubstratet rumstemperatur.
    Obs: Precipitants kan upplösas genom att försiktigt värma lösningen på högst 30 ° C.
  3. Med en insugningsventil, samla vuxna kvinnliga myggor (3-7 dagar efter uppkomst) och söva dem med koldioxid eller ice.
    Obs: En gång sövda, myggor bör hållas under CO 2 kortast tid möjligt, inte överstiger 20 min. Alternativt, myggor kan vara sövda på is och hållas för cirka 30 min.
  4. Förbereda en 6-well platta med 3 mL APS per brunn.

3. Fett kroppen dissektion

  1. fokusera dissekera stereomikroskopet och justera stolen till en bekväm höjd.
  2. Placera en konkav objektglas på Mikroskop yta och tillsätt två droppar APS till stadens.
  3. Plocka upp en mygga av ett ben med hjälp av en pincett och överföra det till APS ytan på objektglas.
  4. Försiktigt grepp mygga av bröstkorgen, med tången i vänster hand och rotera Myggan så att den ventrala sidan är uppåt.
  5. Medan du håller kroppen stadig av bröstkorgen, förstå de två sista buk segment, med hjälp av tången i höger hand och dra försiktigt.
    Obs: De två sista buk segment kommer att separera från buken och den bifogade äggstockarna, Malpighian tubuli, hindgut och midgut; grödan kommer ibland glida ut ur buken. Om de inte har avlägsnats, infoga stängda tips på tången i det lilla hålet som skapade och ta bort återstående vävnader.
  6. Upphäva rätt tången och plocka upp våren saxen. Skjut ett blad i hålet i buken upp till segmentet nedanför bröstkorgen. Snabbt och försiktigt skär buken på längden.
    Obs: När snittet gjorts, buken bör börja expandera utåt, om detta inte kan inträffa omedelbart.
  7. Fortsätt att göra andra snittet, som kommer att vara ett laterala snitt nedanför bröstkorgen och något nedanför där det första snittet slutade.
    Obs: Buken bör sedan öppna upp och ta avstånd från bröstkorgen, med nagelbanden upp och fett organ sida-inbäddat i APS. Denna kropp bukväggen är fett kroppen förberedelserna för in vitro- kultur.
  8. Lyft de fet organ från APS lösningen med spetsen av ett par pincett och överföra dem från lösningen till 6-väl plattan som innehåller APS i rumstemperatur. Tillåta vävnad vila i cirka 0,5 h innan den fett kroppen kultur.

4. Fett kroppen kultur

  1. Inkubera fett organ på APS i rumstemperatur i minst 0,5 h temperera dem.
  2. Överför de fet organ använda spetsen på tången och lyfta försiktigt dem ur APS lösningen. Lägre spetsen i fett kroppen odlingsmediet.
    Obs: Fett kroppen bör öppna på ytan av mediet och flyta fritt. Den fet kroppen kulturen utförs vanligtvis i 96 brunnar-plattor, med 150-200 µL av medium i varje brunn. En väl ryms upp till tre enskilda fett organ, och de är lönsamt för mer än 12 h (opublicerade personliga resultat).
  3. Efter inkubationstiden överföra de fet organ från mediet i 1,5 mL centrifugrör som innehåller lämpliga reagenser för nedströms behandling.
    Observera: Typiska analyser ingår qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western blotting 18 , 20, transkriptomik 26, proteomik 21 eller metabolomik 22.

Representative Results

Som ett exempel, vi utförde ett fett kroppen kultur experiment och stimuleras isolerade fett organ av inkubering på en lösning som innehåller en balanserad blandning av alla tjugo naturligt förekommande aminosyror och den insekt steroid hormon 20-hydroxy ecdysone (10 µM) för 6 h . Som en kontroll inkuberades fett organ på APS för en lika stor mängd tid.

Efter inkubation isolerades de total-RNA med en tri-reagens27 följa tillverkarens instruktioner. Kvalitet och kvantitet av extraherade RNA-prover bedömdes med hjälp av en spektrofotometer och fluorometric kvantitering agaros gelelektrofores. RNA-sekvensering bibliotek genererades med hjälp av 4 µg totalt RNA och kvantifierades använder två olika tekniker. Därefter skickades biblioteken till en kommersiell leverantör för Parade slutet-sekvensering.

Resultatet av detta experiment visas i tabell 6. Gener som visar den starkaste transkriptionell Svaren aminosyra och 20-hydroxyecdysone var primärt äggula protein gener, som är överens med tidigare resultat11.

Figur 1 visar en intensitetskarta visar gen uttrycksnivåerna av 1 256 differentially uttryckt gener från odlade fett kroppar efter två olika behandlingar.

Figure 1
Figur 1 . Stresskartan gener uttrycks i fett kroppen kultur. Stresskartan beräknades på grundval av antalet särskilda avskrifter för varje gen i olika bibliotek använder heatmap paketet28 som ingår i R programvarumiljö. Den mörka nyansen representerar högre genuttryck. 1.256 gener med statistiskt signifikant variation i uttryck (Q-värden < 0,05) visas. Generna är ordnade enligt deras genomsnitt uttryck nivåer, indikeras av dendrogram till vänster (inte enligt deras släktskapsförhållanden). Observera antalet gener med upp - eller ner-reglerade uttryck efter stimulering med aminosyror (AA) och 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fysiologisk koksaltlösning. Se kompletterande fil 1 för en lista av gener och deras relativa nivåer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Aminosyra Molekylär vikt g/mol mM koncentration mg per Liter mg för 300 mL volym
Alanin 89,1 26.68 2377.19 713.16
Arginin 174,2 26.68 4647.66 1394.3
Asparagin 150.1 26.68 4004.67 1201.4
Asparaginsyra 133 26.68 3548.44 1064.53
Cystein 121.16 10,68 1293.99 388.2
Glutaminsyra 147,1 26.68 3924.63 1177.39
Glutamin 146 26.68 3895.28 1168.58
Glycin 75 53.32 3999 1199.7
Histidin 155.16 80 12412.8 3723.84
Isoleucin 131 10,68 1399.08 419.72
Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73
Leucin 131 26.68 3495.08 1048.52
Fenylalanin 165 10,68 1762.2 528.66
Proline 115 26.68 3068.2 920.46
Serin 105 53.32 5598.6 1679.58
Treonin 119 10,68 1270.92 381,28
Tryptofan 204 10,68 2178.72 653.62
Tyrosin 181 5,32 962.92 288.88
Valin 117 10,68 1249.56 374.87
Metionin 149 10,68 1591.32 477,4

Tabell 1. 4 x aminosyra stamlösning.

Komponent Vikt i gram tillsätts 50 ml ddH2O
NaCl 8,0 g
KCl 0,074 g
MgCl2-6 H2O 0,120 g
NaHCO3 0.0250 g

Tabell 2. 20 X salt stamlösning.

Komponent Vikt i gram tillsätts 100 ml ddH2O
CaCl2-2 H2O 0,90 g

g > tabell 3. 50 x kalcium stamlösning.

Komponent Koncentration av stamlösning Volym lager för 100 ml buffert
Tris pH8.0 1 M 5 mL
EDTA 0,25 M 2 mL
NaCl NA 0,3 g
ddH2O NA till 100 mL (~ 93 mL)

Tabell 4. Tris buffert.

Komponent Volym lager för 200 ml
Aminosyra stamlösning 150 mL
Salt stamlösning 10 mL
Kalcium stamlösning 4 mL
TES buffert 10 mL
ddH2O 26 mL

Tabell 5. Fett kroppen odlingsmedium.

Anteckning Gen Beskrivning -Faldig förändring P-värde
AAEL006138 Vitellogenin-B 3443 2.52E-112
AAEL006126 Vitellogenin-C 2795 8.64E-91
AAEL006563 vitellogenic karboxypeptidas 1002 2.17E-119
AAEL010434 Vitellogenin-A 220 1.14E-27
AAEL006542 vitellogenic karboxypeptidas 185 2.14E-65
AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 hypotetiska protein 82 6.69E-188
AAEL015312 Vitellogenic cathepsin B 77 1.27E-15
AAEL009588 nukleär receptor 3 75 4.58E-56
AAEL010529 hypotetiska protein 66 1.32E-29

Tabell 6. Experimentella resultat.

Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Insekt orgelkultur användes flitigt studera insekt endokrinologi, utveckling och ämnesomsättningen, samt för att undersöka samspelet mellan specifika organ och bakteriell symbionter29,30,31, 32,33,34. In vitro fett kroppen orgelkultur användes specifikt för att studera aminosyra transport och reglering av äggula proteinproduktionen i myggor och andra Diptera16,17,35 , 36. under processen för vitellogenesis, mygga fett kroppen använder en matris av hög-specificitet aminosyra transportörer för att importera blodmjöl framställda aminosyror från hemolymph att syntetisera stora mängder äggula proteiner12 ,19,35,36. Fett kroppen kulturen var avgörande för avgränsningen av fett kroppen näringsbehov i detta sammanhang18.

Kvaliteten på utgångsmaterialet, kvinnliga myggor, är avgörande för framgången för dessa experiment. Mygglarver upp i under-trångt villkor och utfodras på hög näringsämnen Dieter vanligtvis ger bästa resultat. Det finns några viktiga variabler att överväga vid fastställandet av mygga fett kroppen odlingsbetingelser i laboratoriet experimental designmässigt. Vi visade i tidigare studier som fett kroppen genuttrycket varierar betydligt beroende på individuell livshistoria och näringsstatus av mygga11,22. Mygga kultur villkoren bör vara enhetliga för att minska variationen i storlek och näringsmässiga reserver av experimentella myggor. Dessutom bör personal som utför dissektionerna utbildas för att säkerställa snabb och noggrann dissektioner med konsekventa resultat. Cellernas viabilitet i isolerade fett organ kan kontrolleras med hjälp av olika färgning metoder37,38.

Experimentell design av ett fett kroppen kultur experiment bör beakta antalet dissektioner möjligt under en viss tidsperiod. När stora mängder fett organ krävs behövas flera dissektion sessioner eller flera analysera. Det finns ett brett utbud av framtida ansökningar om in vitro- fett kroppen kultur i myggor och andra insekter. Det kommer att vara särskilt användbart för att testa potentiella läkemedelskandidater för insektskontroll. Användningen av transgena tekniker i insekter att uttrycka särskilda reporter proteiner i fett kroppen trophocytes kommer att öppna upp nya metoder för att utveckla kraftfulla bioassays för studien av fett kroppen fysiologi.

Disclosures

Vi har inget att redovisa.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av NIH grant #SC1AI109055, de 2014 NMSU HHMI grant #52008103 och NSF PGR bevilja #1238731. Vi tackar deltagarna för NMSU våren 2015 BIOL302 molekylära metoder klassen och Lavesh Bhatia för deras tekniska support med fett kroppen kultur experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Chapman & Hall. London. 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. Chandrasekar, R. , International Book Mission. South India. (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

Fråga 126 orgelkultur fett kroppen infektionssjukdomar myggor Aedes aegypti nutrition vitellogenesis
Fett kroppen kultur organsystem i <em>Aedes Aegypti</em>, en vektor av zikaviruset
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, H. N., Rodriguez, S. D.,… More

Chung, H. N., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter