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Biology

Système de Culture ou organe de corps gras chez Aedes Aegypti, vecteur de Virus Zika

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

Le corps gras est l’organe central métabolique chez les insectes. Nous présentons un système de culture d’organes vivants qui permet à l’utilisateur afin d’étudier les réactions du tissu adipeux isolées à divers stimuli.

Abstract

Le tissu adipeux insecte joue un rôle central dans le métabolisme des insecte et d’entreposage d’éléments nutritifs, reflétant les fonctions du foie et des tissus adipeux chez les vertébrés. Le tissu adipeux insectes est généralement réparti dans tout le corps de l’insecte. Toutefois, il est souvent concentrée dans l’abdomen et attaché à la paroi abdominale du corps.

Le corps adipeux de moustique est la seule source de protéines de jaune d’oeuf, lesquelles sont essentielles pour la production de œufs. Par conséquent, la culture in vitro de tissus adipeux moustique représente un système important pour l’étude de la physiologie de moustique, métabolisme et, finalement, la production de œufs. Le processus de culture de tissu adipeux commence par la préparation de solutions et réactifs, y compris les acides aminés des solutions mères, Aedes sel solution stock de sérum physiologique (APS), solution stock de calcium et milieu de culture de tissu adipeux. Le processus se poursuit avec la dissection des corps gras, suivie d’un traitement expérimental. Après le traitement, une variété de différentes analyses peut être effectuée, y compris les ARN (RNA-Seq) le séquençage, qPCR, Western blots, protéomique et métabolomique.

Dans notre expérience de l’exemple, nous montrons le protocole par le biais de l’excision et de la culture du corps gras de la fièvre jaune du moustique, Aedes aegypti, principal vecteur d’arbovirus dont la dengue, chikungunya et Zika. L’ARN des corps gras, cultivées dans des conditions physiologiques connues pour réguler positivement les protéines jaune contre le contrôle ont fait l’objet de RNA-Seq analyse pour démontrer l’utilité potentielle de cette procédure pour les enquêtes de l’expression génique.

Introduction

Les moustiques sont vecteurs de maladies dévastatrices, y compris le paludisme, dengue, chikungunya et Zika1,2,3. Malgré d’intenses efforts internationaux pour lutter contre ces maladies et de contrôler les populations de moustiques transmettant la maladie, les épidémies de maladies transmises par les moustiques restent les mêmes, en particulier dans les pays en développement. Des vaccins efficaces contre bon nombre de ces maladies sont soit indisponibles, soit d’efficacité limitée4,5. Le moyen le plus efficace pour prévenir les poussées est de contrôler les populations de moustiques, principalement grâce à l’utilisation des traitements insecticides. Cependant, résistance aux insecticides a développé de nombreuses populations de moustiques et deviennent un problème commun autour du monde6,7,8. L’étude de la physiologie de moustique est essentiel au développement de nouveaux outils et stratégies pour contrôler la maladie.

Le tissu adipeux moustique joue un rôle central dans l’entreposage d’éléments nutritifs, l’homéostasie métabolique, la reproduction et catabolisme des xénobiotiques9,10,11,12. C’est l’organe de stockage principal pour les triglycérides, de glycogène et les acides aminés sous forme de protéines de réserve. Il fonctionne également comme le lieu de synthèse pour la plupart des protéines de l’hémolymphe et des métabolites. Chez les moustiques, le tissu adipeux est la seule source de production de protéines d’oeuf qui se produit chez les femelles après qu’ils prennent un repas de sang13,14.

Le type de cellules principales du tissu adipeux est le grand, polyploïde trophocyte ou adipocytes3,9,10,12. Le tissu adipeux est organisé en lobes ou gaines et peut être trouvé dans toutes les parties du corps du moustique, avec la plus grande partie située dans l’abdomen, où les grands lobes de corps gras sont attachés à la paroi abdominale du corps.

Le système de culture de tissu adipeux moustique présenté ici a été développé dans les années 70 et reste un outil puissant pour l’étude de la physiologie corps gras10, surtout en combinaison avec les technologies actuelles d’analyse. La Fondation de cette technique repose sur l’isolation des murs organe abdominales et le tissu adipeux associé. La nature hydrophobe de la cuticule abdominale provoque de flotter à la surface du milieu de culture, avec les lobes ci-jointe du tissu adipeux abdominal immergé. Les stigmates et la structure tracheolar sont maintenues, assurant l’oxygénation des tissus cultivés. Désormais, nous allons nous référer à ces préparations comme « corps gras ». Isolées des corps gras restent viables pendant plus de 12 h incubés dans le milieu approprié (résultats non publiés). La culture de tissu adipeux est un outil précieux qui a abordé diverses questions au sujet de corps gras endocrinologie et physiologie9,10,12,15,16, 17.

Les corps gras peut être soumises à divers expérimental et traitements, le calendrier qui peut être décidé par l’enquêteur. À la fin de la période d’incubation, les corps gras peuvent être collectées et traitées pour les analyses en aval, y compris qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, protéomique21ou22de la métabolomique. Des expériences peuvent être effectuées à différentes échelles, de différents corps gras à des groupes de centaines qui peuvent être cultivées ensemble.

Les résultats représentatifs inclus ici proviennent de corps gras mis en culture en présence d’acides aminés et l’ecdysone 20-hydroxy-hormone stéroïde pour simuler l’activation de la farine de sang de la vitellogenèse16,17, 23,24. Nous avons analysé et comparé l’expression différentielle des gènes de non-activé par rapport à des corps gras activés via l’analyse de la séquence de génération.

Protocol

1. préparation des Solutions et réactifs

  1. solution mère de l’acide aminé
    1. Prepare a 4 X acide aminé solution mère 23 , 24 par pesage et Ajouter les 20 acides aminés différents dans un erlenmeyer selon les concentrations indiquées au tableau 1.
      Remarque : Dans certains cas, acides aminés peuvent être exclus de la solution et remplacé par molaires égales de mannitol à maintenir une concentration égale d’osmolytes.
    2. Ajouter la quantité appropriée de ddH 2 O pour produire le volume souhaité de solution.
    3. Pour s’assurer que les acides aminés ont complètement dissoutes, chauffer doucement en remuant continuellement jusqu'à ce que le liquide soit tout à fait clair, il faudra une légère teinte jaune.
      Remarque : Il peut être nécessaire pour ramener le pH à 6 en ajoutant HCl pour permettre à certains des acides aminés hydrophobes plus de dissoudre.
    4. Partie aliquote de la solution et stérile-filtre à l’aide d’un filtre de seringue avec un 0,2 µm taille de pore.
    5. Magasin dans un récipient étanche à-20 ° C jusqu'à 6 mois.
  2. APS
    Remarque : voir 25.
    1. Pour le 20 X sel solution mère, combiner les sels figurant au tableau 2 dans 50 mL d’eau. Remuer jusqu'à dissolution complète.
      Remarque : Il peut être nécessaire de chauffer légèrement la solution pour dissoudre complètement les sels.
    2. Filtre stérile à l’aide d’un filtre de seringue avec un 0,2 µm taille de pore et conserver la solution dans un tube de 50 mL à -20 ° C.
  3. Solution stock de calcium
    1. pour les 50 X solution stock de calcium, d’ajouter 0,90 g de chlorure de calcium pour 100 mL d’eau (tableau 3) : remuer jusqu'à dissolution complète.
    2. à l’aide d’une seringue stérile filtre filtrer avec une taille de pores de 0,2 µm, aliquote de la solution dans les tubes de 50 mL et conserver à -20 ° C.
  4. Tampon Tris (pH 7,4)
    1. pour les Tris de la mémoire tampon, mélanger le sel et les solutions énumérées dans le tableau 4 et ajouter ddH 2 O à 100 mL.
    2. à l’aide d’une seringue stérile filtre filtrer avec une taille de pores de 0,2 µm et une aliquote de la solution dans les tubes de 50 mL ; conserver à température ambiante.
  5. Milieu de culture de tissu adipeux
    1. pour préparer le milieu de culture de tissu adipeux, préparer toutes les solutions énumérées ci-dessus.
    2. Les combiner selon les volumes dans le tableau 5 de faire 200 mL de milieu de culture de tissu adipeux.
    3. Ajuster le pH à 7,2 avec NaOH ou HCl.
    4. Stérile-filtrer la solution à l’aide d’un filtre de seringue avec une taille de pores de 0,2 µm.
    5. Diviser la solution en aliquotes de 15 mL et conserver à-20 ° C jusqu'à 6 mois.

2. Préparation pour la Dissection

  1. préparer un stéréomicroscope (grossissement de x 10-20) avec éclairage et étalez deux pincettes ultra-fin et une paire de ciseaux de dissection micro.
  2. Préparer toutes les solutions nécessaires pour l’expérience. Décongeler le milieu de culture de corps gras à température ambiante.
    NOTE : Précipitants peuvent être dissous en chauffant doucement la solution ne dépassant pas 30 ° C.
  3. Avec un aspirateur, recueillir les moustiques femelles adultes (3-7 jours après la levée) et anesthésier les à l’aide de dioxyde de carbone ou Ice.
    Remarque : Une fois anesthésié, les moustiques doivent rester sous CO 2 le moins longtemps possibles, ne dépassant ne pas 20 min. par ailleurs, les moustiques peuvent être anesthésiés sur glace et conservées pendant environ 30 min.
  4. Préparer un plateau de 6 puits avec 3 mL de APS / puits.

3. La Dissection de corps gras

  1. concentrer le stéréomicroscope dissection et ajuster la présidence à une hauteur confortable.
  2. Placer une lame de microscope concaves sur la surface de microscope et ajouter deux gouttes de APS au centre.
  3. Ramasser un moustique par une jambe à l’aide d’une pince et les transfère à la surface de l’APS sur la lame de microscope.
  4. Soigneusement attraper le moustique par le thorax, avec la pince dans la main gauche et tournez le moustique de sorte que la face ventrale est à la hausse.
  5. Tout en tenant le corps soutenue par le thorax, saisir les deux derniers segments abdominaux, avec la pince dans la main droite et tirez doucement.
    Remarque : Les deux derniers segments abdominaux seront séparera de l’abdomen et les ovaires ci-joint Malpighi tubules, intestin et strié ; parfois, la récolte se glisser hors de l’abdomen. Si elles n’ont pas été supprimées, insérez l’extrémité fermée de la pince dans le petit trou créé et supprimer les autres tissus.
  6. Annulée la pince droite et ramasser les ciseaux de printemps. Glisser une lame dans le trou dans l’abdomen jusqu'à le segment inférieur du thorax. Doucement et rapidement coupé l’abdomen sur la longueur.
    Remarque : Une fois que la coupe a été faite, l’abdomen devrait commencer à étendre vers l’extérieur, bien que cela ne peut pas se produire immédiatement.
  7. Procéder à la deuxième coupe, qui sera une coupe latérale du thorax et légèrement sous où s’est terminée la première coupe.
    Remarque : L’abdomen devrait ensuite ouvrir et se dissocier de la cage thoracique, avec la cuticule vers le haut et les corps gras côté immergés au sein de l’APS. Cette paroi abdominale du corps est la préparation des corps gras pour in vitro culture.
  8. Soulever les corps gras de la solution APS avec la pointe d’une paire de pinces et de la solution de les transférer sur la plaque de 6 puits contenant APS à température ambiante. Permettre le tissu se reposer pendant environ 0,5 h avant de passer à la culture de tissu adipeux.

4. Culture de tissu adipeux

  1. Incuber les corps gras sur l’APS à température ambiante pendant au moins 0,5 h s’équilibrer les.
  2. Transférer les corps gras à l’aide de la pointe de la pince et faire doucement sortir la solution APS. Abaissez l’extrémité dans le milieu de culture de tissu adipeux.
    Remarque : Le tissu adipeux doit ouvrir sur la surface du milieu et flotter librement. La culture de tissu adipeux est généralement effectuée dans des plaques de 96 puits, avec 150-200 µL de milieu dans chaque puits. On peut bien s’intégrer jusqu'à trois corps individuels de gras, et ils sont viables pendant plus de 12 heures (résultats personnels non publiés).
  3. Après la période d’incubation, transférer les corps gras du milieu dans les tubes à centrifuger de 1,5 mL contenant les réactifs appropriés pour le traitement en aval.
    Remarque : Les analyses typiques incluent qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western blotting 18 , 20, 26 de la transcriptomique, protéomique 21 ou métabolomique 22.

Representative Results

À titre d’exemple, nous avons effectué une expérience de culture de tissu adipeux et stimulé isolées des corps gras en incubant eux sur une solution contenant un mélange équilibré de tous les vingt acides aminés naturels et l’ecdysone la 20-hydroxy-hormones stéroïdes d’insectes (10 µM) pendant 6 h . Comme contrôle, corps gras ont été incubées sur APS pour un montant égal de temps.

Après incubation, l’ARN total a été isolé à l’aide d’un tri-réactif27 suivant les instructions du fabricant. La qualité et la quantité des échantillons d’ARN extraits ont été évalués à l’aide d’un spectrophotomètre, dosage fluorimétrique et électrophorèse sur gel d’agarose. Les bibliothèques de séquençage de RNA ont été générés à l’aide de 4 µg d’ARN total et ont été quantifiés à l’aide de deux techniques différentes. Par la suite, les bibliothèques ont été envoyés à un fournisseur commercial de bout-à-pas apparié.

Les résultats de cette expérience sont indiqués au tableau 6. Les gènes montrant la plus forte réponse transcriptionnelle d’acides aminés et la 20-hydroxyecdysone étaient principalement jaunes gènes des protéines, qui est en accord avec les précédents résultats11.

La figure 1 montre une carte thermique indiquant les niveaux d’expression de gène de 1 256 différentiellement exprimés gènes provenant des corps gras après deux traitements différents.

Figure 1
Figure 1 . Carte de chaleur des gènes exprimés dans la culture de tissu adipeux. La carte thermique a été calculée sur le nombre de relevés de notes spécifiques pour chaque gène dans les différentes bibliothèques utilisant le heatmap paquet28 qui fait partie de l’environnement du logiciel R. La nuance plus foncée représente l’expression génétique plus élevée. 1 256 gènes avec une variation statistiquement significative dans l’expression (Q-valeurs < 0,05) sont indiquées. Les gènes sont classés en fonction de leurs niveaux d’expression moyenne, indiquée par le dendrogramme sur la gauche (pas selon leurs relations phylogénétiques). Remarque le nombre élevé de gènes à expression vers le haut ou vers le bas-réglé après stimulation par les acides aminés (AA) et de la 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes physiologique. Voir 1 de fichier supplémentaire pour obtenir une liste des gènes et leurs niveaux d’expression relative. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Acide aminé Poids moléculaire g/mol mM Concentration mg par litre mg pour volume 300 mL
Alanine 89,1 26.68 2377.19 713.16
Arginine 174,2 26.68 4647.66 1394.3
Asparagine 150,1 26.68 4004.67 1201.4
Acide aspartique 133 26.68 3548.44 1064.53
Cystéine 121.16 10.68 1293.99 388,2
Acide glutamique 147,1 26.68 3924.63 1177.39
Glutamine 146 26.68 3895.28 1168.58
Glycine 75 53.32 3999 1199.7
Histidine 155,16 80 12412.8 3723.84
Isoleucine 131 10.68 1399.08 419.72
Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73
Leucine 131 26.68 3495.08 1048.52
Phénylalanine 165 10.68 1762.2 528.66
Proline 115 26.68 3068.2 920.46
Sérine 105 53.32 5598.6 1679.58
Thréonine 119 10.68 1270.92 381.28
Tryptophane 204 10.68 2178.72 653.62
Tyrosine 181 5.32 962.92 288,88
Valine 117 10.68 1249.56 374.87
Méthionine 149 10.68 1591.32 477,4

Le tableau 1. 4 x solution mère de l’acide aminé.

Composant Poids en grammes, on ajoutés 50 ml FD2O
NaCl 8,0 g
KCl 0,074 g
MgCl2-6 H2O 0,120 g
NaHCO3 0,0250 g

Le tableau 2. 20 X sel solution mère.

Composant Poids en grammes, on ajoutés 100 ml ddH2O
CaCl2-2 H2O 0,90 g

g > tableau 3. 50 x solution stock de calcium.

Composant Concentration de la solution mère Stock de volume pour 100 ml de tampon
Tris pH8.0 1 M 5 mL
EDTA 0,25 M 2 mL
NaCl NA 0,3 g
ddH2O NA 100 ml (~ 93 mL)

Tableau 4. Tampon Tris.

Composant Stock de volume de 200 ml
Solution mère de l’acide aminé 150 mL
Solution de sel de Stock 10 mL
Solution Stock de calcium 4 mL
Tampon TES 10 mL
ddH2O 26 mL

Tableau 5. Milieu de culture de tissu adipeux.

Annotation Description de gène Changement de pli P-valeur
AAEL006138 La vitellogénine-B 3443 2.52E-112
AAEL006126 La vitellogénine-C 2795 8.64E-91
AAEL006563 carboxypeptidase vitellogène 1002 2.17E-119
AAEL010434 La vitellogénine-A 220 1.14E-27
AAEL006542 carboxypeptidase vitellogène 185 2.14E-65
AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 protéine hypothétique 82 6.69E-188
AAEL015312 Vitellogène cathepsine B 77 1.27E-15
AAEL009588 récepteur nucléaire 3 75 4.58E-56
AAEL010529 protéine hypothétique 66 1.32E-29

Tableau 6. Des résultats expérimentaux.

Fichier supplémentaires 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Culture d’organes insectes a été largement utilisée pour étudier les insecte endocrinologie, le développement et le métabolisme, ainsi qu’étudier l’interaction entre les organes spécifiques et symbiotes bactériens29,30,31, 32,33,,34. In vitro culture organotypique de corps gras a été utilisée spécifiquement pour étudier le transport des acides aminés et la régulation de la production de protéines du jaune d’oeuf dans les moustiques et autres diptères16,17,35 , 36. au cours du processus de la vitellogenèse, le corps adipeux de moustique utilise un tableau d’acides aminés de haute spécificité transporteurs d’importer des farines de sang provenant des acides aminés de l’hémolymphe de synthétiser de grandes quantités de protéines de jaune d’oeuf12 ,19,35,,36. La culture de tissu adipeux a été déterminant pour délimiter les besoins nutritionnels de corps gras dans ce contexte18.

La qualité des matières premières, les moustiques femelles, est essentielle pour le succès de ces expériences. Les larves de moustiques levées dans des conditions sous surpeuplées et régimes alimentaires riches en nutriments se nourrissent généralement produisent les meilleurs résultats. Il y a certaines variables importantes à considérer lors de l’établissement des conditions de culture de tissu adipeux de moustique en laboratoire sur le plan expérimental. Nous avons montré dans des études précédentes que l’expression des gènes corps gras varie considérablement selon l’histoire de la vie individuelle et l’état nutritionnel des moustiques11,22. Les conditions de culture de moustiques doivent être uniformes pour réduire la variabilité de la taille et des réserves nutritionnelles des moustiques expérimentales. En outre, le personnel effectuant des dissections devrait être formé pour assurer les dissections rapides et précises pour des résultats constants. La viabilité des cellules dans des corps gras isolés peut être vérifiée à l’aide de différentes coloration méthodes37,38.

Le protocole expérimental d’une expérience de culture de tissu adipeux devrait prendre en considération le nombre de dissections possible dans un laps de temps donné. Lorsque de grandes quantités de corps gras sont nécessaires, plusieurs séances de dissection ou dissecteurs multiples peuvent être nécessaires. Il y a un large éventail d’applications futures pour in vitro culture de tissu adipeux dans les moustiques et autres insectes. Il sera particulièrement utile pour tester les candidats potentiels de drogue pour le contrôle des insectes. L’utilisation des techniques transgéniques chez les insectes pour exprimer les protéines spécifiques de journaliste dans le tissu adipeux trophocytes ouvrira de nouvelles méthodes pour développer les bioessais puissants pour l’étude de la physiologie du tissu adipeux.

Disclosures

Nous n’avons rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par grant NIH #SC1AI109055, la subvention NMSU HHMI #52008103 2014 et NSF PGR accordent #1238731. Nous remercions les participants de la classe NMSU Spring 2015 BIOL302 moléculaire méthodes Lavesh Bhatia, pour leur soutien technique avec les expériences de culture de tissu adipeux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Maladies infectieuses numéro 126 corps gras culture d’organes les moustiques Aedes aegypti nutrition vitellogénèse
Système de Culture ou organe de corps gras chez <em>Aedes Aegypti</em>, vecteur de Virus Zika
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Chung, H. N., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).

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