Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55508
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 4, 1,5
1Department of Biology, New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, 3Department of Computer Sciences, New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases, Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences, New Mexico State University

Summary

Yağ vücut böceklerde Merkezi metabolik organdır. Biz izole yağ vücut dokusu yanıt çeşitli uyaranlara karşı eğitim kullanıcı sağlayan bir canlı organ kültür sistemi mevcut.

Abstract

Böcek yağ vücut böcek metabolizma ve besin depolama, karaciğer ve yağ dokusu omurgalılar fonksiyonları yansıtma içinde merkezi bir rol oynar. Böcek yağ vücut dokusu genellikle böcek vücut boyunca dağıtılır. Ancak, genellikle karın içinde konsantre ve karın vücut duvarına bitişik.

Sivrisinek yağ yumurta üretimi için kritik olan sarısı proteinler tek kaynağı organıdır. Bu nedenle, sivrisinek fizyolojisi, çalışma için önemli bir sistem sivrisinek yağ vücut dokuları vitro kültürü temsil eden metabolizma ve sonuçta, yumurta üretimi. Yağ vücut kültür işlem çözümleri ve Kimyasalları, amino asit hisse senedi çözümleri, Aedes fizyolojik serum tuz stok solüsyonu (APS), kalsiyum hisse senedi çözüm ve yağ vücut kültür orta gibi hazırlanması ile başlar. İşlem yağ vücut diseksiyon, deneysel bir tedavi tarafından takip ile devam eder. Kullanımdan sonra farklı analizler çeşitli, RNA (RNA-Seq) sıralama, qPCR, Batı lekesi, proteomik ve metabolomics gibi gerçekleştirilir.

Örnek deneyimimizi, sarı humma Sivrisinek, Aedes aegypti, Dang, chikungunya ve Zika gibi arboviruses asıl bir vektör eksizyon ve kültür yağ organlarının protokolüyle göstermektedir. RNA yağ upregulate sarısı proteinlere karşı denetim bilinen fizyolojik durum altında kültürlü organları vardı bu yordamı gen ekspresyonu araştırmalar için potansiyel yarar göstermek için RNA-Seq analizi tabidir.

Introduction

Sivrisinekler sıtma, Dang Humması, chikungunya ve Zika1,2,3gibi yıkıcı insan hastalıkların vektörleridir. Yoğun uluslararası çabalara rağmen bu hastalıkları frenlemek için ve hastalık verici sivrisinek nüfus denetlemek için salgın sivrisinek kaynaklı hastalık salgınları özellikle gelişmekte olan ülkelerde hala sık görülür. Bu hastalıkların birçoğu karşı etkili aşı kullanılamıyor veya sınırlı etkinliği4,5. Salgınları önlemek için en etkili yolu sivrisinek nüfus, böcek ilacı tedaviler çoğunlukla aracılığıyla kontrol etmektir. Ancak, böcek ilacı direnç birçok sivrisinek nüfus geliştirmiş ve dünya6,7,8etrafında ortak bir sorun haline. Sivrisinek Fizyoloji çalışmanın yeni araçları ve stratejileri hastalık kontrol gelişimi için önemlidir.

Sivrisinek yağ vücut besin depolama, metabolik Homeostazı, üreme ve xenobiotic katabolizma9,10,11,12merkezi bir rol oynar. Trigliserid, glikojen ve içinde biçim-in depolama proteinler amino asitler için ana boru depolama organdır. Ayrıca sentezi için en hemolymph proteinler ve metabolitleri konumunu görür. Sivrisinekler, onlar bir kan yemek13,14bin sonra dişi içinde oluşan sarısı protein üretim tek kaynağı yağ organıdır.

Asıl hücre yağ vücut büyük, polyploid trophocyte veya adipocyte3,9,10,12türüdür. Yağ vücut dokusu loblari da kılıf halinde düzenlenmiştir ve Sivrisinek, tüm vücut bölgelerinde nerede büyük yağ vücut lobları karın vücut duvarına bitişik karın, bulunan en büyük kısmı ile bulunabilir.

Burada sunulan sivrisinek yağ vücut kültür sistemi 70 ' li yıllarda geliştirilmiştir ve yağ vücudun fizyolojisi10, özellikle de geçerli analizi teknolojileri ile birlikte çalışmak için güçlü bir araç olarak kalır. Bu tekniğin temeli karın vücut duvar ve ilişkili yağ vücut dokusu üzerinde yalıtım dayanmaktadır. Karın kütikül hidrofobik doğası float kültür orta yüzeyi ile ekli lobları karın yağ vücut dalmış neden olur. Kültürlü doku oksijenasyonu sağlamak vızıltısı ve tracheolar yapısı korunur. Şu andan itibaren bu hazırlıklar için "yağ organları" sevk edecektir İzole yağ organları daha 12 h (yayınlanmamış sonuçları) uygun ortamda inkübe zaman için geçerli kalır. Yağ vücut kültür yağ vücut Endokrinoloji Fizyoloji9,10,12,15,ve16ilgili sorular çeşitli ele almıştır değerli bir araçtır, 17.

Kültürlü yağ organları çeşitli deneysel tabi ve tedaviler, hangi zamanlaması üzerine araştırmacı tarafından karar verilebilir kontrol. Kuluçka dönemi sonunda, yağ organları olabilir toplanan ve qPCR16,17,18,19, Western Blot18 de dahil olmak üzere aşağı akım analizleri için işlenen ,20, proteomik21veya metabolomics22. Deneyler bireysel yağ organları birlikte kültürlü yüzlerce grupları için farklı ölçeklerde gerçekleştirilebilir.

Burada dahil temsilcisi sonuçları yağ amino asitler ve vitellogenesis16,17kan yemek aktivasyonu benzetimini yapmak için steroid hormon 20-hidroksi ecdysone huzurunda kültürlü organları elde edilmiştir, 23,24. Biz analiz ve değil harekete geçirmek yeni nesil sıralama analizi ile aktif yağ organları karşı farklı gen ifade karşılaştırılır.

Protocol

1. çözümler ve Kimyasalları hazırlama

ağırlığında tarafından
  1. hisse senedi çözüm Amino asit
    1. hazırla 4 X bir amino asit hisse senedi çözüm 23 , 24 ve Tablo 1 ' de verilen konsantrasyonları göre bir Erlenmeyer şişesi 20 farklı amino asit ekleme.
      Not: bazı durumlarda, amino acid(s) olabilir eriyik--dan hariç ve mannitol osmolytes eşit bir konsantrasyon korumak için eşit molar miktarda tarafından yerine.
    2. İstenen birimin çözüm üretmeye GKD 2 O uygun miktarda ekleyin.
    3. Amino asitler tamamen çözülmüş ki, emin olmak için yavaşça sıvı tamamen temizlenene kadar sürekli karıştırarak ısı; hafif bir sarı renk tonu üzerinde alacak.
      Not: pH 6-HCl bazı çözülmeye daha hidrofobik amino asitler sağlar ekleyerek azaltmak gerekli olabilir.
    4. Aliquot çözüm ve 0.2 µm ile bir şırınga filtre kullanarak filtre-steril gözenek boyutu.
    5. -20 ° c ilâ 6 ay boyunca kapalı bir kapta mağaza.
  2. APS
    Not: bkz: 25.
    1. 20 X için hisse senedi çözüm tuz, 50 mL su Tablo 2 ' de listelenen tuzları birleştirmek. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
      Not: Bu çözüm tuz tamamen erimesi için biraz ısıtmak gerekli olabilir.
    2. Steril-0.2 µm ile bir şırınga filtre kullanarak filtre boyutu gözenek ve çözüm -20, 50 mL tüp depolamak ° C.
  3. Kalsiyum hisse senedi çözüm
    1. 50 X kalsiyum hisse senedi çözüm için Kalsiyum klorür 0,90 g 100 mL su (Tablo 3) Ekle; tamamen eriyene kadar karıştırın.
    2. Steril-filtre kullanarak bir 0.2 µm gözenek boyutu ile aliquot çözüm 50 mL tüpler içine filtre ve depolamak -20 ° c
  4. Tris arabellek (pH 7,4)
    1. Tris tampon, tuz ve Tablo 4 ' te listelenmiş çözümleri birleştirmek ve GKD 2 O eklemek için ilâ 100 mL.
    2. Steril-filtre kullanarak bir 0.2 µm gözenek boyutu ve aliquot ile çözüm 50 mL tüpler içine filtre; mağaza oda sıcaklığında.
  5. Yağ vücut kültür orta
    1. yağ vücut kültür ortamı hazırlamak için yukarıda listelenen tüm çözümleri hazırlayın.
    2. 200 mL yağ vücut kültür orta yapmak için Tablo 5 birimlerinde göre onları birleştirmek.
    3. PH 7.2 NaOH veya HCl kullanarak için ayarlamak.
    4. Steril-filtre 0.2 µm gözenek boyutu ile bir şırınga filtre kullanarak çözüm.
    5. Çözüm 15 mL aliquots bölmek ve 6 aya kadar saklamak-20 ° C'de.

2. Diseksiyon için hazırlık

  1. stereomicroscope (10-20 x büyütme) aydınlatma ile hazırlamak ve iki Ultra-ince cımbız ve mikro diseksiyon makası yatıyordu.
  2. Tüm çözümler deneme için gerekli hazır olun. Oda sıcaklığında yağ vücut kültür ortamına çözülme.
    Not: Precipitants yavaşça 30'dan daha yüksek çözüm Isıtma tarafından çözülmüş ° C.
  3. Bir aspiratör ile yetişkin dişi sivrisinekler (3-7 gün sonra ortaya çıkması) toplamak ve onları anestezi karbon dioksit ya da buz kullanma
    Not: Bir kez anestezi, sivrisinekler CO 2 altında için en kısa sürede mümkün, 20 dk. alternatif olarak geçmeyen tutulmalıdır, buza anestezi ve yaklaşık 30 dk tutulur sivrisinekler
  4. 6-şey plaka ile APS 3 mL başına iyi hazırlanın.

3. Yağ vücut diseksiyon

  1. parçalara stereomicroscope odaklanmak ve rahat bir yükseklik için sandalye ayarlamak.
  2. Bir içbükey mikroskop slayt mikroskop yüzey üzerine yerleştirin ve APS iki damla merkezine ekleyin.
  3. Bir forseps kullanarak bir bacak tarafından bir sivrisinek kadar almak ve mikroskop slayt üzerinde APS yüzeye transfer.
  4. Dikkatle sivrisinek tarafından Toraks, sol elinde Forseps ile kavrama ve ventral tarafı yukarı doğru sivrisinek döndürür.
  5. Vücut tarafından Toraks sabit tutarken, sağ el Forseps ile son iki karın kesimleri tutun ve yavaşça çekin.
    Not: Son iki karın kesimleri karın ve ekli yumurtalıklar, Malpighi tübüllerin, hindgut ve midgut ayrı; Bazen kırpma karın dışarı slayt. Onlar kaldırılmamış, forseps kapalı ipuçları oluşturulan küçük deliğe yerleştirin ve kalan dokular kaldırırsınız.
  6. Doğru forseps bir kenara koyun ve bahar makas al. Bir bıçak karın Toraks aşağıda segmenti kadar delik kaydırın. Yavaşça ve hızla karın uzunlamasına kesilmiş.
    Not: kesim yapıldıktan sonra bu hemen oluşmayabilir rağmen karın dışa, genişletmek başlamalıdır.
  7. Devam yanal kesiği biraz aşağıda burada ilk kesme sona erdi ve toraks aşağıda olacak ikinci kesim yapmak.
    Not: Karın sonra Aç ve kütikül yukarı ve yağ cesetleri yan-APS içinde dalmış Toraks dan ayırmak. Karın bu beden duvarı vitro kültür yağ vücut hazırlıktır.
  8. Forseps bir çift ucu kullanarak APS çözüm yağ vücutlarından kaldırın ve oda sıcaklığında APS içeren 6-şey plaka eriyik--dan aktarmak. Doku yağ vücut kültür ilerleyen önce yaklaşık 0,5 h için dinlenmeye izin.

4. Yağ vücut kültür

  1. onları equilibrate en az 0,5 h için oda sıcaklığında yağ organları APS üzerinde kuluçkaya.
  2. Yağ cesetleri forseps ucu kullanarak transfer ve nazikçe onları dışarı APS çözüm kaldırın. Ucunu yağ vücut kültür orta düşük.
    Not: Yağ vücut orta yüzeyinde açın ve serbestçe yüzen gerekir. Yağ vücut kültür genellikle 96-şey Kaplamalar, 150-200 µL her iyi orta ile gerçekleştirilir. Bir de en çok üç bireysel yağ organları sığabilecek, ve onlar daha 12 h (yayınlanmamış kişisel sonuçlar) uygun.
  3. Kuluçka dönemi sonra yağ cesetleri ortamından aşağı akım işleme uygun Kimyasalları içeren 1.5 mL santrifüj tüpleri içine transfer.
    Not: Tipik analizleri qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western Blot 18 , içerir. 20, transcriptomics 26, proteomik 21 veya metabolomics 22.

Representative Results

Örnek olarak, bir yağ vücut kültür deneme gerçekleştirilen ve onları tüm yirmi doğal olarak meydana gelen amino asitler ve 6 h için böcek steroid hormon 20-hidroksi ecdysone (10 µM) dengeli karışımı içeren bir çözüm üzerinde kuluçka izole yağ organları teşvik . Bir denetim olarak yağ organları zaman eşit miktarda için APS üzerinde inkübe.

Kuluçka sonra toplam RNA üreticinin yönergelerini izleyerek bir tri-reaktif27 kullanarak izole edildi. Kalite ve ayıklanan RNA örnekleri miktarı Spektrofotometre, Fluorometrik Nefelometri ve özel Jel Elektroforez kullanarak değerlendirildi. RNA sıralama kütüphaneleri toplam RNA'ın 4 µg kullanarak oluşturulan ve iki farklı teknikleri kullanarak sayılabilir. Daha sonra kütüphaneler için ticari bir sağlayıcı eşleştirilmiş sonu-sıralama için gönderildik.

Bu denemenin sonuçları Tablo 6' da gösterilen. En güçlü transkripsiyon yanıt amino asit ve 20-hydroxyecdysone gösterilen genler önceki sonuçları11ile anlaşma olduğunu öncelikle sarısı protein gen olduğunu.

Şekil 1 differentially 1.256 gen ifade düzeyini gösteren bir ısı haritası genler kültürlü yağ organları iki farklı Seanslarınızdan sonra birimiyle gösterir.

Figure 1
Resim 1 . Isı haritası yağ vücut kültüründe ifade edilen genlerin. Isı haritası her gen R yazılım ortamın parçası olan heatmap paket28 kullanarak farklı kitaplıklarındaki için belirli transkript sayısına göre hesaplanmıştır. Koyu gölge daha yüksek gen ekspresyonu temsil eder. istatistiksel olarak anlamlı değişim ifade ile 1,256 gen (Q-değerleri < 0,05) gösterilir. Genlerin dendrogram (filogenetik ilişkilerinin göre) solda gösterilen ortalama ifade seviyelerine göre sıralanır. Genlerin Uyarım amino asitler (AA) ve 20-hydroxyecdysone (20E) sonra yukarı veya aşağı düzenlenmiş ifade ile yüksek sayısını not edin. APS Aedes fizyolojik serum =. Ek dosya 1 genlerin ve onların göreceli ifade düzeyleri listesi için bkz:. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Amino asit Molekül ağırlığı g/mol mM konsantrasyonu Litre başına mg MG 300 mL cilt için
Alanin 89.1 26.68 2377.19 713.16
Arginin 174.2 26.68 4647.66 1394.3
Asparagine 150.1 26.68 4004.67 1201.4
Aspartik asit 133 26.68 3548.44 1064.53
Sistein 121.16 10.68 1293.99 388.2
Glutamik asit 147.1 26.68 3924.63 1177.39
Glutamin 146 26.68 3895.28 1168.58
Glisin 75 53.32 3999 1199.7
Histidin 155.16 80 12412.8 3723.84
İsoleucine 131 10.68 1399.08 419.72
Lycine 183 26.68 4882.44 1464.73
Lösin 131 26.68 3495.08 1048.52
Fenilalanin 165 10.68 1762.2 528.66
Prolin 115 26.68 3068.2 920.46
Serin 105 53.32 5598.6 1679.58
Treonin 119 10.68 1270.92 381.28
Triptofan 204 10.68 2178.72 653.62
Tirozin 181 5.32 962.92 288.88
Valin 117 10.68 1249.56 374.87
Metiyonin 149 10.68 1591.32 477.4

Tablo 1. 4 x hisse senedi çözüm Amino asit.

Bileşen 50 ml GKD2için O eklendi gram ağırlık
NaCl 8.0 g
KCl 0,074 g
MgCl2-6 H2O 0.120 g
NaHCO3 0.0250 g

Tablo 2. 20 X tuz stok çözüm.

Bileşen 100 ml ddH2O eklendi gram ağırlık
CaCl2-2 H2O 0,90 g

g > Tablo 3. 50 x kalsiyum hisse senedi çözüm.

Bileşen Hisse senedi çözüm konsantrasyonu 100 ml arabellek için birim stok
Tris pH8.0 1 M 5 mL
EDTA 0,25 M 2 mL
NaCl NA 0.3 g
GKD2O NA 100 mL (~ 93 mL)

Tablo 4. Tris arabellek.

Bileşen 200 ml için birim stok
Amino asit hisse senedi çözüm 150 mL
Hisse senedi tuz solüsyonu 10 mL
Kalsiyum hisse senedi çözüm 4 mL
TES arabellek 10 mL
ddH2O 26 mL

Tablo 5. Yağ vücut kültür orta.

Ek açıklama Gene açıklama Kat değiştirme P-değeri
AAEL006138 Vitellogenin-B 3443 2.52E-112
AAEL006126 Vitellogenin-C 2795 8.64E-91
AAEL006563 vitellogenic Karboksipeptidaz 1002 2.17E-119
AAEL010434 Vitellogenin-A 220 1.14E-27
AAEL006542 vitellogenic Karboksipeptidaz 185 2.14E-65
AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70
AAEL000080 örnek protein 82 6.69E-188
AAEL015312 Vitellogenic cathepsin B 77 1.27E-15
AAEL009588 Nükleer reseptör 3 75 4.58E-56
AAEL010529 örnek protein 66 1.32E-29

Tablo 6. Deneysel sonuçlar.

Ek dosya 1. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Böcek organ kültür kapsamlı olarak böcek Endokrinoloji, geliştirme ve metabolizma, de belirli organ ve bakteriyel simbiont29,30,31arasındaki etkileşimi araştırmak olarak çalışmaya kullanılmıştır, 32,33,34. Vitro yağ vücut organ kültür amino asit taşıma ve düzenleme sarısı protein üretiminde Sivrisinek ve diğer Diptera16,17,35 , özellikle eğitim için kullanılan , 36. vitellogenesis işlemi sırasında sivrisinek yağ vücut yüksek özgüllük amino asit taşıyıcılar dizisi kan yemek derived amino asitler sarısı proteinler12 büyük miktarlarda sentezlemek için hemolymph almak için kullanır ,19,35,36. Yağ vücut kültür yağ vücut besin gereksinimleri bu içerik18tarif için vesile oldu.

Malzeme kalitesi ve başlangıç, dişi sivrisinekler, bu deneyler başarısı için önemlidir. Kalabalık koşullarda büyüdü ve yüksek besin diyetler genellikle beslenen sivrisinek larva en iyi sonuçları üretmek. Sivrisinek yağ vücut kültür deneysel tasarım açısından laboratuvar koşullarında oluştururken göz önünde bulundurulacak bazı önemli değişken vardır. Yağ vücut gen ekspresyonu önemli ölçüde bireysel yaşam öyküsü ve Sivrisinek11,22beslenme durumuna bağlı olarak değişir önceki çalışmalarda gösterdik. Sivrisinek kültür koşulları boyutu değişkenliği azaltmak için tek tip olmalı ve deneysel sivrisinekler beslenme hakkını saklı tutar. Ayrıca, personel diseksiyonlarının gerçekleştirme hızlı ve doğru diseksiyonu ile tutarlı sonuçlar sağlamak için eğitim. Hücre canlılığı izole yağ organlarında farklı boyama yöntemleri37,38kullanarak kontrol edilebilir.

Bir yağ vücut kültür deneme deneysel tasarım diseksiyonlarının sayısı belirli bir sürede mümkün dikkate almalıdır. Bol miktarda yağ organlarının gerekli olduğunda birden çok diseksiyon oturum veya birden fazla dissectors gerekli olabilir. Sivrisinek ve diğer böceklerin vitro yağ vücut kültür için gelecekteki uygulamaları geniş bir yelpazesi vardır. Bu potansiyel ilaç adaylarının böcek kontrolü için test etmek için özellikle faydalı olacaktır. Böceklerde yağ vücut trophocytes özel muhabir proteinlerin hızlı transgenik tekniklerin kullanılması için yağ vücut Fizyoloji çalışmanın güçlü BİYOANALİZLER geliştirmek için yeni yöntemler açılacaktır.

Disclosures

İfşa etmek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma 2014 NMSU HHMI grant #52008103 ve NSF PGR #1238731 vermek NIH grant #SC1AI109055, tarafından desteklenmiştir. NMSU bahar 2015 BIOL302 moleküler yöntemler sınıf ve Lavesh Bhatia katılımcıların yağ vücut kültür deneyleri ile teknik destek için teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Chapman & Hall. London. 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. Chandrasekar, R. , International Book Mission. South India. (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

Bulaşıcı hastalıklar sayı: 126 yağ vücut organ kültür Sivrisinek Aedes aegypti beslenme vitellogenesis
Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde <em>Aedes Aegypti</em>, bir vektör Zika virüs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chung, H. N., Rodriguez, S. D.,… More

Chung, H. N., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter