Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro og In Vivo evaluering af T, B og myeloide celler smittespredningshæmmende aktivitet og humorale svar fra transplanterede

Published: August 12, 2017 doi: 10.3791/55510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at fremkalde tolerance i transplantation, og vurdere in vitro og i vivo særskilt celle subsets fra modtageren smittespredningshæmmende kapacitet og immunstatus modtagerens mod donor eller eksogen antigener.

Abstract

Den største bekymring i transplantation er at opnå specifikke tolerance gennem induktion af regulerende celler. Forståelse af tolerance mekanismer kræver pålidelig modeller. Her beskriver vi modeller af tolerance over for kardiale allograft i rotte, induceret af blokade af costimulation signaler eller Opregulering af immunregulerende molekyler gennem genoverførsel. Hver af disse modeller tilladt i vivo generation af lovgivningsmæssige celler som regulerende T-celler (Tregs), regulerende B celler (Bregs) eller regulerende myeloide celler (RegMCs). I dette manuskript beskriver vi to supplerende protokoller, der er blevet brugt til at identificere og definere i in vitro og i vivo regulerende celleaktivitet for at bestemme deres ansvar i tolerance induktion og vedligeholdelse. Først, en in vitro- undertrykkende assay tilladt hurtig identifikation af celler med undertrykkende kapacitet på effektor immunrespons i en dosis afhængige måde, og kan bruges til yderligere analyse som cytokin måling eller cytotoksicitet. Andet, adoptiv overførsel af celler fra et tolerant behandlede modtageren til en nyligt bestrålede podede modtager, fremhæves tolerogenic egenskaberne af disse celler styre graft instrueret immunrespons og/eller konvertering af nye regulerende celler ( betegnes smitsomme tolerance). Disse metoder er ikke begrænset til celler med kendt fænotypiske markører og kan udvides til at omfatte enhver celle befolkning. Derudover instrueret donor allospecificity af regulerende celler (et vigtigt mål i feltet) kan vurderes ved hjælp af tredjeparts donor celler eller pode enten in vitro eller i vivo. Endelig, for at finde ud af disse regulerende celler specifikke tolerogenic kapacitet, vi leverer protokoller for at vurdere de humorale anti-donor antistof svar og modtagerens evne til at udvikle humorale svar mod nye eller tidligere kendte antigener. Modeller af tolerance beskrevet kan bruges til at karakterisere yderligere lovgivningsmæssige celler, for at identificere nye biomarkører og immunregulerende molekyler, og kan tilpasses til andre transplantation modeller eller autoimmune sygdomme i gnaver eller menneskelige.

Introduction

Hjerte allograft i rotte er en pålidelig orgel transplantation model til at vurdere tolerancen induktion behandlinger, for at dechifrere mekanismerne af tolerance induktion og vedligeholdelse, og har potentiale til at fremkalde funktionelt kompetente og dominerende regulerende celler. Protokollerne nedenfor beskriver en fuldt uoverensstemmelse heterotopisk hjerte graft fra Lewis 1W donor rotte (LEW.1W, RT1u) i en Lewis 1A modtager rotte (LEW.1A, RT1en). I denne graft kombination, akut afvisning opstår hurtigt (i ca. 7 dage) og nemt kan vurderes ved graft slå måling gennem palpering af maven. Her foreslår vi tre tilknyttede protokoller for at fremkalde tolerance over for den kardiale allograft i rotte. I disse modeller, tolerance er induceret og/eller vedligeholdes af forskellige lovgivningsmæssige celletyper. Første, blokering af CD40-CD40L interaktioner med en adenovirus kodning CD40Ig (AdCD40Ig) fremkaldt generation af CD8+ Tregs i stand til at inducere tolerance når adoptively overført til sekundære podede modtagere1. Desuden nedbrydning af CD8+ celler (med anti-CD8α antistoffer) i AdCD40Ig-behandlet modtagere genereret Bregs og RegMCs2. Dyb analyse af CD8+ Tregs egenskaber fremhævet den afgørende rolle af flere immunregulerende molekyler defineret som interleukin-34 (IL-34) og Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Overekspression af IL-34 (med en AAV vektor) fremkaldte Tregs gennem generation af RegMCs, induceret overekspression af FGL-2 Bregs, underliggende lovgivningsmæssige celler komplekse netværk.

Fordi kronisk afvisning udvikler sig langsomt og er langsigtede, er en dybtgående analyse påkrævet at skelne tolerance versus kronisk afvisning. Transplantat vurderes normalt for celle infiltration, fibrose, fortykkelse af vaskulære væg og supplement C4d aflejring af immunohistology7. Mens histologi metoder kræver animalske offer eller pode biopsi, her beskriver vi en enkel metode til at vurdere forskellige funktioner af tolereret allograft: fremkomsten og funktion af regulerende celler og anti-donor specifikt antistof svar fra blod prøve ved flowcytometri (her, vi brugte fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)).

Vedligeholdelse af tolerance over for allograft efter anholdelsen af behandlingen er generelt forbundet med induktion af regulerende celler8. I de sidste årtier, undersøgelser fokuseret på CD4+Tregs enstemmigt karakteriseret dem af de vigtigste markører Foxp3+, CD25højog CD127-9,10,11. Ligeledes flere markører blev tilskrevet CD8+ Tregs, som CD122+, CD28-, CD45RClav, PD1+, og Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. over år, udtryk for GITR, CTLA4 og cytokiner (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) var desuden tilknyttet en langsomme profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Imidlertid nye lovgivningsmæssige cellepopulationer, såsom Bregs, RegMCs eller NKTregs, mangle relevante specifikke markører. Ja, Bregs er for det meste rapporteret som umodne CD24+ celler, med tvetydige CD27 udtryk og undertiden produktionen af IL-10, TGFβ eller granzyme B22,23,24. Kompleksiteten af myeloide celler slægt kræver en kombination af flere markører til at definere deres lovgivningsmæssige eller proinflammatoriske profil såsom CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a eller CD16325,26. Endelig nogle markører er blevet rapporteret til at identificere NKTregs såsom CD11b+, CD27+, TGFβ+, men yderligere undersøgelser er nødvendige for at yderligere fænotype beskrive dem27,28,29 ,30,31,32. Således beviser af undertrykkende aktivitet er nødvendige for at legitimere yderligere fænotypiske beskrivelse til at identificere nye biomarkører, nye immunregulerende mæglere, og til at udvide anvendelsesområdet til nye celle behandlingsformer.

Vi foreslår to komplementære metoder til at evaluere den smittespredningshæmmende aktivitet af celler. Først, in vitro- metode består af dyrkning smittespredningshæmmende celler med mærket effektor T celler stimuleret af allogene donorer antigen præsentere celler (PMV'er) på forskellige nøgletal over 6 dage, og analysere effektor T celler spredning, afspejler donor-instrueret immunsuppression. Celler fra behandlede rotter kan sammenlignes direkte med celler fra naiv rotter og ubehandlede podede rotter for undertrykkende aktivitet (eller nogen andre regulerende celle befolkning), i en række suppressor: effektor nøgletal. Desuden, denne metode kræver ikke nogen transplantation, og resultaterne foreligger inden 6 dage. Andet, i vivo metode består af overføre de påtænkte regulerende celler fra et behandlet rotte til en nyligt bestrålede podede modtager. Mens B celler, myeloide celler eller T celler fra ubehandlede naive rotter er som regel ude af stand til at hæmme akut afvisning og forlænge graft overlevelse ved adoptiv overførsel, celler med forstærket smittespredningshæmmende aktivitet fra behandlet-modtagere har disse attributter 1,2,3,4,33. Lymfopeni induceres ved bestråling af modtageren anbefales at tillade adoptively overførte celler til at forblive upåvirket af blod homøostase og at mestre mere let anti-donor immunrespons. For begge metoder, in vitro- udnyttelse af allogene tredjemand PMV'er eller i vivo adoptiv overførsel af undertrykkende Tillad celler til modtagere podet med en tredjeparts-hjerte analyse af anti-donor specificitet. Der henviser til, at metoden i vivo kræver et betydeligt antal celler, dårligt repræsenteret kan celle delpopulationer vurderes mere let for undertrykkende aktivitet in vitro-33.

Humorale svar kan også måles for at vurdere tilstand af tolerance og kontrol af styret antistof svar til donor antigener. Faktisk, tolerance kan være kendetegnet ved fravær af humorale respons mod donor men bevarelse af kapacitet for modtagere at udvikle humorale respons til nye antigener og bevarelse af hukommelse svar. Først, er princippet om alloantibody påvisning baseret på anerkendelse af donor celler af modtagerens antistoffer efter inkubation af donor celletype med serum fra en podede modtageren. Andet, humorale svar rettet mod eksogene antigener kan være vurderet følgende stimulering af langsigtede tolerant modtagere med Nøglehullet Limpet Hemocyanin (KLH) emulgeret med komplet Freund's adjuvans. Tilstedeværelsen af specifikke IgM og IgG antistoffer mod antigener kan registreret 4 og 13 dage, henholdsvis efter vaccination, med enzym forbundet ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. For det tredje, bevarelse af immun hukommelse svar kan vurderes ved injektion af xenogene røde blodlegemer (RBC) på dage -7 og + 3 af transplantation og røde blodlegemer farvning med recipient serum indsamlet på dage + 8 og + 17 efter transplantation. Alle disse metoder giver mulighed for identifikation af immunoglobulin undertyper ved hjælp af specifikke sekundære antistoffer, og hurtig overtagelse af resultater i mindre end 1,5 h ved FACS farvning eller et par timer ved ELISA.

Endelig disse protokoller er designet til karakterisering af transplantation modeller, og kan være, til dels, anvendt til autoimmune sygdomsmodeller. Principperne i metoden, der kan overføres til alle arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle protokoller, som her er blevet godkendt af en etisk komité og bør udføres i en steril måde.

1. generation af Tolerance i en Model af Cardiac Allograft i Rat

  1. Lew.1W til LEW.1A allograft procedure
    1. Bedøver en donor mandlige LEW.1W rotte ved hjælp af isofluran-O2 indånding, suppleret med 1% N2O efter 5 min. sted dyret i ryggens decubitus, og desinficere maven med betadine til at udføre en torakotomi (dvs., snit i den pleural rummet af brystet).
      1. Klemme ringere og overlegen venae cavae, ligatur dem og skær dem. Derefter skæres lungepulsåren og aorta og gemme graften i kolde 0,9% NaCl.
    2. Bedøver en 250 g mandlige LEW.1A modtager rotte (på 8-12 uger) ved hjælp af isofluran-O2 indånding, suppleret med 1% N2O efter 5 min. du placere dyret i dorsale decubitus og desinficere maven med betadine til at udføre en xyphopubic laparotomi (dvs.store indsnit fra formet som et sværd proces til pubica).
      1. Externalize tarmene, klemme de abdominale blodkar, udføre en fastsat-lateral anastomose (dvs. forbindelsen mellem slutningen af en kanal og væggen i den anden) mellem graft aorta og den abdominale aorta og mellem den pulmonal arterie og abdominal vena cava og fjern klemmer.
    3. Sutur muskuløs fly og hud, og desinficere med betadine.
    4. Injicere nalbuphine (smertestillende) 6 mg/kg subkutant (s.c.) og oxytetracyklin (antibiotikum) intramuskulært (i.m.), og placere dyret under en varmelampe, indtil dyret vågner. Injicere buprenorphin (opioid) (50 µg/kg) i.m. og meloxicam (non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler) (0,3 mg/kg) s.c. transplantation og en dag efter dag.
  2. Induktion af tolerance af blokade af costimulatory interaktioner
    1. Følg trin 1.1.1. til 1.1.2.
    2. I en klassificerede A2 område af dyr facilitet, fortyndes 2 x 1010 smitsomme partikler af AdCD40Ig (en adenovirus kodning CD40Ig, en kimære molekyle som blokerer CD40-CD40L interaktioner) i Ringers laktat løsning at nå frem til en endelig mængde af 150 µL og indsprøjtes i 3 point (3 x 50 µL) i spidsen af graften ventrikel væg.
    3. Følg trin 1.1.3 til 1.1.4.
      Bemærk: AdCD40Ig behandling kan være forbundet med anti-CD8α, anti-ICOS eller anti-CD28 antistof injektioner2,35,36.
  3. Induktion af tolerance ved overekspression af en rekombinant protein
    1. Fortyndes 1 x 1012 viral genomet i rotte IL34-rekombinant AAV i Ringers laktat løsning at nå en endelige rumfang af 100 µL. bedøver en 150 g LEW.1A rotte med isofluran-O2 indånding og indsprøjtes intravenøst (i.v.) i penis venen.
    2. En måned efter AAV-IL34 injektion, udføre en LEW.1W graft på LEW.1A modtageren efter protokol 1.1.

2. in vitro- vurdering af celler smittespredningshæmmende aktivitet af blandet lymfocytter reaktioner (MLRs)

Bemærk: Smittespredningshæmmende aktivitet af celler fra behandlede tolerant rotter skal sammenlignes med den tilsvarende befolkning fra syngeneic podede modtagere eller naive rotter.

  1. Isolering af allogene PMV'er: plasmacytoid dendritiske celler (PDC'er)
    1. Bedøver en mandlig LEW.1W naive donor rotte ved hjælp af isofluran-O2 indånding, suppleret med 1% N2O efter 5 min. placere dyret i ryggens decubitus og desinficere maven med betadine til at udføre en splenektomi. Fjerne milten ved transecting fartøjer, gemme milten i koldt 1 X fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og sutur dyret.
    2. Overføre milt i en skål, Fjern 1 X PBS og perfuse med 5 mL 0,2% collagenase D. For at forbedre enzym fordøjelsen, skåret milten i små stykker og Inkuber 15 min ved 37 ° C.
    3. Tilsættes 500 µL af 0,1 M ethylendiamintetra syre (EDTA), overføre milt stykker i en sigte og knuse milt med en sprøjte stempel til at adskille cellerne. Overføre ind i et rør og cellerne vaskes med 15 mL 1 X PBS. Centrifugeres 10 min. ved 430 x g. supernatanten.
    4. Hvis du vil fjerne røde blodlegemer og blodplader, splenocyte resuspenderes i 10 mL hypotonic løsning og Ruger 5 min. ved stuetemperatur (RT). Vask med 1 X PBS og centrifugeres 10 min. ved 190 x g. udsmid supernatanten.
    5. Fjerne kollagen fibre ved at filtrere på en 100 µm væv filter. Tælle celler for at justere celle koncentration på 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% føtalt kalveserum (FCS) / 0.5 mM EDTA.
      Bemærk: Antallet af splenocytes skal være mellem 4 x 108 og 7 x 108 celler.
    6. Berige for celler af interesse ved negative valg før celle sortering. Inkuber 15 min. ved 4 ° C med 2 µg/mL renset antistoffer specifikke for T-celler (anti-TCRαβ, R7/3 klon og anti-TCRγδ, V65 klon), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon) og NK-celler (anti-CD161, 3.2.3 klon), vask med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og centrifugeres 10 min. ved 430 x g . Supernatanten.
    7. Vask med magnetiske perler 3 gange med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Bruge 3,5 µL perler/106 splenocytes, vask ved at tilføje 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, sted for 1 min på magneten, og supernatanten. Gentag to gange. Resuspend perlerne i 10 bind 1 X PBS/2% FCS/0,5 mm EDTA (f.eks 35 µL perler er fortyndet i 350 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA).
    8. Fjerne uønskede celler ved at blande splenocytes med de magnetiske perler i 10 min. ved 4 ° C under agitation, placere røret på magnet for 1 min og overføre supernatanten til en ny tube. Gentag to gange. Tælle cellerne og justere den celle koncentration på 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Bemærk: Beriget splenocytes antallet bør ligge mellem 5 x 107 og 9 x 107.
    9. Pletten celler ved hjælp af mærket antistoffer for yderligere sortering af fremdaterede: udelukke resterende T-celler (anti-TCRαβ, R7/3 klon) eller B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon), og sortere CD4+ (anti-CD4, OX35 klon) CD45R+ celler (anti-CD45R, His24 klon). Label perler med hver Ab at etablere en kompensationsmatrix på FACS. Inkuber 15 min. ved 4 ° C og vask med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Resuspend celler i en koncentration på 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm væv filter, og mærke døde celler ved at tilføje DAPI i en endelig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortere celler med en 70 µm dyse celle sorteringsanlæg, af gating på DAPI-TCR-CD45RA-CD4+CD45R+ som vist i figur 1.
  2. Isolering af responder effektor T celler (CD4 + CD25 - T-celler)
    1. Høste milt fra en ikke-behandlet ikke-podede naiv LEW.1A rotte og gemme det i koldt 1 X PBS.
    2. Overføre milt i en sigte, placeret i en skål og tilsættes 10 mL af 1 X PBS. Knuse milt med en sprøjte stempel til at adskille cellerne. Overføre cellerne i en 50 mL tube, vask med 1 X PBS og centrifugeres 10 min. ved 430 x g. udsmid supernatanten.
    3. Til at fjerne røde blodlegemer og blodplader, splenocyte resuspenderes i 10 mL hypotonic løsning for 5 min på RT, så vask i 1 X PBS og centrifugeres ved 10 min. 190 x g. supernatanten.
    4. Fjerne kollagen fibre ved at filtrere på en 100 µm væv filter. Tælle celler for at justere den celle koncentration på 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Bemærk: Antallet af splenocytes skal være mellem 3 x 108 og 5 x 108 celler.
    5. Berige celler af interesse før sorteringen. Inkuber 15 min. ved 4 ° C med 2 µg/mL renset antistoffer specifikke for CD8 celler (anti-CD8α, OX8 klon), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon), NK-celler (anti-CD161, 3.2.3 klon), myeloide celler (anti-CD11b/c, OX42 klon), gamma delta T celler (anti-TCRγδ, V65 klon). Derefter vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og centrifugeres 10 min. ved 430 x g. supernatanten.
      Bemærk: for at sortere naturlige CD8+ Tregs fra naiv rotter på samme tid som CD4+ effektor T celler, tilføjer ikke anti-CD8α Ab under nedbrydningen.
    6. Vaske de magnetiske perler 3 gange med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrevet i trin 2.1.7.
    7. Fjerne de uønskede celler ved at blande splenocytes med de magnetiske perler i 10 min. ved 4 ° C under agitation, og derefter placere røret på magnet for 1 min og overføre supernatanten til en ny tube. Gentag to gange. Tælle cellerne og justere den celle koncentration på 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Bemærk: Splenocytes nummer bør ligge mellem 5 x 107 og 8 x 107 celler.
    8. Tilføj mærket antistoffer til at sortere CD4+CD25- T-celler: anti-TCRαβ (R7/3 klon), anti-CD4 (OX35 klon), anti-CD25 (OX39 klon) og Inkuber 15 min. ved 4 ° C. Samtidig sortere CD8+CD45RClav Tregs, tilføje anti-CD45RC Ab (OX22 klon). Label perler med hver Ab til at oprette en kompensationsmatrix til videreforarbejdning på flowcytometri. Cellerne vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og supernatanten.
    9. Resuspend celler til 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm væv filter, og mærke døde celler ved at tilføje DAPI i en endelig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortere cellerne med en 70 µm dyse celle Sorteremaskine efter gating på DAPI -TCR+CD4+CD25- celler som responder celler (og om nødvendigt DAPI -TCR+CD4-CD45RClav som CD8+ Tregs smittespredningshæmmende celler) som vist i figur 2.
  3. Isolering af undertrykkende celler
    Bemærk: Opdele milten i to delprøver: sortere en B-celler, myeloide celler, NK-celler og den anden på CD4+ og CD8+ CD45RClav T celler, der skal vurdere deres undertrykkende funktion.
    Bemærk: For adoptivforældre celle overførsel, gemme 1 x 108 splenocytes til at tjene som den positive kontrol af tolerance af adoptiv overførsel, hvis det er nødvendigt.
    1. Sortering af B-celler, de myeloide celler og NK-celler
      1. Følg protokol 2.1.1 til 2.1.5.
      2. Inkuber 15 min. ved 4 ° C med 2 µg/mL T-celle-specifikke umærket antistoffer (anti-TCRαβ, R7/3 klon og anti-TCRγδ, V65 klon), vask med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og centrifugeres 10 min. ved 430 x g. udsmid supernatanten.
      3. Vask med magnetiske perler 3 gange med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrevet i trin 2.1.7.
      4. Bland splenocytes med de magnetiske perler fjerne uønskede celler og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C under agitation, og derefter placere røret på magnet for 1 min og overføre supernatanten til en ny tube. Gentag to gange. Tælle cellerne og justere den celle koncentration på 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Føje mærket antistoffer til splenocytes at sortere celler med formodede smittespredningshæmmende aktivitet såsom myeloide celler (anti-CD11b/c, OX42 klon), B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon) eller NK-celler (anti-CD161, 3.2.3 klon). Label perler med hver Ab at etablere en kompensationsmatrix på FACS. Inkuber 15 min. ved 4 ° C og vask med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspend celler i en koncentration på 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm væv filter, og mærke døde celler ved at tilføje DAPI i en endelig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortere cellerne med en 70 µm dyse celle Sorteremaskine efter gating på DAPI-CD11b/c+ til myeloide celler, CD45RA+ for B-celler, og CD161+ til NK celler som vist i figur 3.
    2. Sortering af CD4 + og CD8 + CD45RC lav T celler
      1. Følg protokol 2.2.1 til 2.2.4.
      2. For negative valg på en magnetisk kolonne, inkuberes celler 15 min. ved 4 ° C med 2 µg/mL renset antistoffer specifikke for B-celler (anti-CD45RA, OX33 klon), NK-celler (anti-CD161, 3.2.3 klon), myeloide celler (anti-CD11b/c, OX42 klon), gamma delta T celler () anti-TCRγδ, V65 klon), vask dem med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og centrifugeres 10 min. ved 430 x g. udsmid supernatanten.
      3. Vaske de magnetiske perler 3 gange med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA som beskrevet i trin 2.1.7.
      4. Fjerne de uønskede celler ved at blande splenocytes med de magnetiske perler i 10 min. ved 4 ° C under agitation, og derefter placere røret på magnet for 1 min og overføre supernatanten til en ny tube. Gentag to gange. Tælle cellerne og justere den celle koncentration på 5 x 107 celler/mL i 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Føje mærket antistoffer til cellerne til at sortere Tregs: anti-TCRαβ (R7/3 klon), anti-CD4 (OX35 klon), anti-CD45RC (OX22 klon). Label perler med hver Ab at etablere en kompensationsmatrix på FACS. Inkuber 15 min. ved 4 ° C og vask med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspend celler i en koncentration på 5 x 107 celler/mL, filter på en 60 µm væv, og mærke døde celler ved at tilføje DAPI i en endelig koncentration på 0,1 µg/mL. Sortere cellerne med en 70 µm dyse celle Sorteremaskine efter gating på DAPI-TCR+CD4+CD45RClav som CD4+Tregs og DAPI-TCR+CD4-CD45RC lav som CD8+Tregs ( figur 4).
        Bemærk: Anti-CD8α Ab (OX8 klon) kan bruges i stedet for anti-CD4 Ab, hvis T-celler udsættes fra CD4+ikke-T celler ved anti-TCR mærkning. Et overskud af CD4+Tregs skal sorteres i forventning om celledød skyldes celle spredning farvestof (CPD) mærkning.
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) mærkning af responder celler til at måle spredning
    1. Efter responder celle sortering, to gange cellerne vaskes med 1 X PBS.
    2. Resuspend celler i en koncentration på 1 x 107 celler/mL i 1 X PBS og inkuberes med 0,5 µM CFSE i 5 min på RT i mørke. Reaktionen standses ved at tilføje FCS ved 1,5 X volumen og centrifugeres 10 min. ved 430 x g ved 4 ° C. Supernatanten.
    3. To gange cellerne vaskes med komplet medium, og tælle cellerne.
      Bemærk: Forvent 30% af celler død på dette trin.
  5. CPD mærkning af CD4 + Tregs for undertrykkende assay på CD4 + effektor celler
    Bemærk: Dette trin er forpligtet til at diskriminere CFSE-CD4+Tregs fra CFSE- prolifererende responder CD4+T-celler på dag 6 i coculture af gating på CPD- celler.
    1. Efter CD4+ Tregs celle sortering, to gange cellerne vaskes med 1 X PBS.
    2. Resuspend celler i en koncentration på 1 x 107 celler/mL i 1 X PBS og inkuberes med 10 µM af CPD V450 i 20 min. på RT i mørke.
    3. To gange cellerne vaskes med komplet medium, og tælle cellerne.
      Bemærk: Forvent 30% af celler død på dette trin.
  6. Rådgivning til coculture
    1. Bruge kultur i medium bestående af: RPMI 1640 medium suppleret med beta-mercaptoethanol (5 x 10-5 M), penicillin (100 U/mL), streptomycin (0,1 mg/mL), natrium pyruvat (1 mM), Glutamin (2 mM), HEPES buffer (1 mM), ikke-essentielle aminosyrer (1 X), () FCS 10%).
    2. Kultur celler i 96-brønd U nederste plader.
    3. Føje celler i følgende rækkefølge: smittespredningshæmmende celler, responder celler og allogene celler.
    4. Holde konstant antal responder T celler og allogene pansrede mandskabsvogne og teste en vifte af Tregs nummer. For eksempel forholdet 4:4:1, 5 x 104 smittespredningshæmmende celler, 5 x 104 responder celler og 1,25 x 104 allogene celler og forholdet 2:4:1, 2,5 x 104 smittespredningshæmmende celler, 5 x 104 responder celler og 1,25 x 104 allogen celler.
    5. Vedligeholde andelen af 5 x 104 responder celler for 200 µL medium/godt.
    6. Kontrolelementer omfatte et par brønde med responder T celler uden allogene PMV'er (negativ kontrol) og responder T celler med allogen PMV'er uden lovgivningsmæssige celler (positiv kontrol) for CFSE gating på dag 6 (Se trin 2.7.6.).
  7. FACS farvning og analyse efter 6 dage af coculture
    Bemærk: Spredning af effektor celler kan vurderes på flere tidspunkter. Bemærk at udbredelsen er eksponentiel: som celledeling stigninger, flere forskelle mellem de undertrykkende betingelser og negativ kontrol kan observeres.
    1. Overføre cellerne fra 96-brønd U bundplade til 96-brønd V nederste plader og centrifugeres 1 min på 1.200 x g ved 4 ° C.
    2. Gemme supernatanten i en ny plade på-20 ° C til måling af cytokin niveauer, hvis nødvendigt.
    3. Cellerne vaskes med 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA pr. brønd og centrifugeres 1 min på 1.200 x g ved 4 ° C.
    4. Tilføje antistoffer til cellerne til yderligere gate på responder T celler: anti-TCRab (R7/3 klon) og anti-CD4 (OX35 klon). Inkuber 15 min. ved 4 ° C og vaskes to gange med 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA pr. brønd. Supernatanten.
    5. Tilsæt 100 µL af DAPI fortyndet på 0,1 µg/mL i 1 X PBS og læse pladen med en FACS analyzer.
    6. Analysere CFSE profil af gating på DAPI negative (levende celler) CPD negativ (ikke-CD4+Tregs) TCR+CD4+ celler. Unstimulated responder celler har maksimal CFSE lysstyrke som vist i figur 5 nederste venstre histogram. I nærværelse af allogene PMV'er har responder celler maksimal spredning og minimal CFSE lysstyrke (nederste, midterste). Allogene pansrede mandskabsvogne og regulerende celler har effektor celler medium spredning og CFSE lysstyrke (bund, højre).

3. in Vivo evaluering af celler smittespredningshæmmende aktivitet af adoptiv celle overførsel i et hjerte podet modtageren

Bemærk: Bestråling er nødvendig for at fjerne værtsceller og favorisere donor celle engraftment og spredning.

  1. Bestråle graft modtagere tidligt på dagen før graften til forudsætning modtageren. Bedøver rotter med im. injektion af xylazin (8 mg/kg)-ketamin (80 mg/kg) og bestråle dem ved en dosis på 4,5 Gy med X stråler.
  2. Følg protokol 2.3 at isolere cellerne af interesse.
    Bemærk: Gem 1 x 108 splenocytes til at tjene som positiv kontrol af tolerance af adoptiv overførsel, hvis det er nødvendigt.
  3. 12 timer efter bestråling (dagen før graften, om aftenen), bedøver rotter ved indånding af 4% isofluran-O2 og indgyde cellerne (5,0 x 107 T celler, 3.0 x 107 B celler, 3.0 x 107 myeloide celler eller 1,50 x 108 splenocytes som den positive kontrol af tolerance af adoptiv overførsel) i.v. i penis venen.
    Bemærk: Antallet af celler, der kræves for tolerance af adoptiv overførsel afhænger smittespredningshæmmende aktiviteten af cellerne.
  4. Den næste dag, følge protokollen 1.1 hen til præstere allograft. Følg graft evolution ved palpation gennem maven.

4. donoren påvisning af specifikt antistof

Bemærk: IgG svar rettet mod graft donor er målt ved at inkubere celler fra donor med serum af modtageren. Subtrahere baggrunden induceret af direkte farvning af LEW.1W B-celler ved at inkubere celler med syngeneic LEW.1W serum.

  1. Høste blod fra rotter og centrifugeres 15 min på 1.200 x g ved 4 ° C. Gemme serum. Serum kan opbevares ved-20 ° C eller bruges umiddelbart. Inaktivere supplement i seraene af inkubere i 30 min. ved 56 ° C.
  2. Høste milt fra en donor LEW.1W rotte og gemme det i koldt 1 X PBS. Følg trin 2.2.1. til 2.2.4. Tilføj 2 x 105 celler/brønd i en 96-brønd V bundplade. Der centrifugeres 1 min på 1.200 x g ved 4 ° C, og supernatanten.
  3. Fortynd sera seriefremstillede fra 1/10 til 1/270 i 1 X PBS (4 fortyndinger/eksempel). Inkuber celler i 1 time ved 4 ° C med 25 µL fortyndede serum/godt. Forudse antallet af donor-specifikke IgG undertyper (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) immunrespons til at analysere pr. sample (1 serum x 4 fortyndinger x 4 IgG undertyper). Cellerne vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og supernatanten.
  4. Inkuber celler med hver musen anti-rotte IgG subtype Ab fluorokrom-mærket i 30 min. ved 4 ° C, en undertype/godt.
    Bemærk: Hvis fluorokrom-mærket anti-rotte Ig Ab er ikke tilgængelig, det er muligt at bruge renset umærkede musen anti-rotte IgG subtype Ab og en fluorokrom-mærket sekundære anti-mus Ab. Beronde på tilgængelige fluorokromer og forskellige konfiguration, flere anti-rotte IgG undertyper kan testes i et godt med passende indstillinger.
  5. Cellerne vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA to gange og supernatanten.
  6. Tilsæt 100 µL af DAPI fortyndet på 0,1 µg/mL i PBS og læse pladen med en FACS analyzer.
  7. Læs den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af anti-rotte IgG subtype Ab mærket med fluorokrom på alle DAPI- celler. Subtrahere MFI opnås med naiv LEW.1A serum på LEW.1W cellerne (baggrund farvning, nederst til venstre) fra MFI opnås med seraene fra hver modtager på LEW.1W cellerne i den tilsvarende fortynding (nederste midten for ubehandlet afvisning modtagere, vise maksimal MFI og bunden lige for behandlede tolerant modtagere, der vise mellemliggende MFI) (figur 6).

5. vurdering af humorale svar til eksogene antigener (Naive og hukommelse)

Bemærk: Serum fra rotter før transplantation, behandling og vaccination bør anvendes som negative kontroller af humorale svar. Ellers kan ikke-vaccineret naive rotter bruges. Serum fra immunkompetente modtagere, dvs, transplanterede exoantigen-immuniseret og afvise modtagere, der bruges som positive kontroller af humorale svar.

  1. Evne til at udvikle humorale respons til en ny antigen (figur 7)
    Bemærk: Denne metode er en relativ kvantificering af humorale svar, da det ikke omfatter en standard. En absolut Ig kvantificering ville være muligt ved at tilføje en række fortyndinger af rotte IgG eller IgM anti-KLH Ab med kendt koncentration i trin 5.1.6.
    1. Emulgere 50 µg af KLH i 200 µL af komplet Freund's adjuvans og indsprøjtes i halen af lang-overlevende/tolerant modtagere, styre ubehandlet afvisning modtagere eller naive rotter som positiv kontrol af humorale svar.
    2. Høste blodprøver på 4 og 13 dage efter vaccination, og der centrifugeres 15 min på 1.200 x g ved 4 ° C. Gem den øverste fase er der serum. Høste serum fra ikke-vaccineret rotter for en negativ kontrol. Serum kan fryses ved-20 ° C indtil ELISA assay.
    3. Coat ELISA-plader (flad bund) med 50 µL/brønd KLH fortyndet på 10 µg/mL i 1 X PBS natten over ved 4 ° C. Kontroller, at coating-løsningen dækker alle brøndene.
    4. Fjern den overskydende ubestrøget KLH ved vask. For at vaske, Tilføj 150 µL/brønd af vaskebuffer (1 X PBS, som indeholder 0,1% Tween) og flick.
    5. Blok uspecifik binding af modtagerens Ig af inkubere i 1 timer ved 37 ° C med 100 µL/brønd af wash buffer som indeholder 10% FCS. Vask en gang.
    6. Seriefremstillede fortyndes de modtagende sera i wash buffer fra 1/40 til 1/512, tilføje 50 µL/hul i dubletter af seriel fortynding til belagt pladen og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C. Holde nogle brønde gratis serum for en negativ kontrol. Vaskes to gange.
    7. Tilsæt 50 µL 1 µg/ml af biotin-konjugerede anti-rotte IgM Ab i wells indeholdende serum høstet på dag 4 i modtagere eller 50 µL af biotin-konjugerede anti-rotte IgG i brønde med serum høstet på dag 13, og Inkuber 1 h ved 37 ° C. Vaskes to gange.
    8. Tilføje 50 µL/brønd af HRP-konjugerede streptavidin på 1 µg/mL for 45 min ved 37 ° C. Vask 3 gange.
    9. Tilsæt 50 µL af 3, 3 ', 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat for < 30 min på RT og stoppe reaktion med 25 µL af 2 M svovlsyre når positive kontrol er mættet.
    10. Læse absorbans ved 405 nm. Sammenlign ekstinktionen fremstillet med modtagerens serum til den opnåede med naive rat kontrolserum.
  2. Vurdering af hukommelse humorale respons kapacitet (figur 8)
    1. 7 dage før transplantation, injiceres i.v. 109 af xenogene RBC fortyndet i 800 µL 1 X PBS i naive rotter. Røde blodlegemer kan være fra får, hest eller andre arter.
    2. Udføre transplantation og administrere tolerogenic behandling.
    3. 3 dage efter graft, injicere igen i.v.109 RBC fortyndet i 800 µL 1 X PBS i graft modtagere og ikke-podede rotter.
    4. Høste blod prøver 5 og 14 dage efter den anden immunisering og centrifugeres 15 min på 1.200 x g ved 4 ° C til at inddrive den øverste serum fase. Serum kan opbevares ved-20 ° C eller bruges umiddelbart. Inaktivere supplement i rotte sera af inkubere 30 min ved 56 ° C før brug.
    5. Tilføj 2 x 105 RBC/brønd af en 96-brønd V bundplade. Der centrifugeres 1 min på 1.200 x g ved 4 ° C, og supernatanten omhyggeligt ved aspiration.
    6. Seriefremstillede fortyndes seraene 2-fold fra 1/10 til 1/1280 i 1 X PBS (8 fortyndinger/eksempel). Inkuber celler i 1 time ved 4 ° C med 25 µL fortyndede serum/godt. Cellerne vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA og supernatanten.
    7. Inkuber celler med RBC arter-adsorberet anti-rotten IgG eller IgM undertyper mærket med fluorokrom i 30 min. ved 4 ° C, en undertype/godt. Vurdere rotte IgM og IgG anti-RBC i serum høstet 5 og 14 dage efter immunisering, henholdsvis. Cellerne vaskes med 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA to gange og supernatanten.
      Bemærk: Hvis fluorokrom-mærket anti-rotte Ig Ab er ikke tilgængelig, det er muligt at anvende renset umærkede musen anti-rotte IgG subtype Ab og en fluorokrom-mærket sekundære anti-mus Ab.
    8. Tilsæt 100 µL af DAPI fortyndet på 0,1 µg/mL i 1 X PBS og analysere celler med en FACS analyzer.
    9. Repræsentere MFI som en funktion af fortynding for hver gruppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdering af undertrykkende aktivitet efter sortering af pansrede mandskabsvogne (figur 1), responder celler og Tregs samtidigt (figur 2), eller individuelt (figur 4), og eventuelle andre formodede regulerende celler (figur 3), kan være udført i vivo ved direkte injektion af den lovgivningsmæssige celler og in vitro- ved måling af CFSE lysstyrke (figur 5). Status for den humorale respons af modtageren mod donor (figur 6) eller eksogen antigener (tal 7 og 8) kan også være vurderet i vitro efter i vivo vaccination som skildret.

Figure 1
Figur 1 . Gating strategi for at sortere fremdaterede.
Celler blev valgt på morfologi størrelse og nøjagtighed (SSC-A/FSC-A), dubletter blev udelukket af FSC-W/FSC-Hansen og SSC-W/SSC-H parametre, levende celler blev udvalgt af gating på DAPI- celler, og fremdaterede blev valgt på TCR-CD45RA-CD4 + CD45R+ udtryk. Renheden blev vurderet ved at tilføje DAPI sorteret celler og kører på celle sorteringsanlæg med parametrene sortering. Renhed af en sjælden sorteret befolkning (mindre end 2%) bør være mere end 95%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Gating strategi at sortere CD4+CD25- responder T celler og CD8+CD45RClav Tregs.
Celler blev valgt på morfologi, dvs, størrelse og nøjagtighed (SSC-A/FSC-A), dubletter blev udelukket af FSC-W/FSC-Hansen og SSC-W/SSC-H parametre, levende celler blev udvalgt af gating på DAPI- celler, og responder celler blev valgt på TCR + CD4+CD25- udtryk. CD8+Tregs har været samtidigt sorteret efter gating på TCR+CD4--CD45RClav celler. Renheden blev vurderet ved at tilføje DAPI sorteret celler og kører på celle sorteringsanlæg med parametrene sortering. Renhed bør være mere end 95%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Gating strategi at sortere B celler, myeloide celler og NK celler.
Celler blev valgt på morfologi størrelse og nøjagtighed (SSC-A/FSC-A), dubletter blev udelukket af FSC-W/FSC-Hansen og SSC-W/SSC-H parametre, levende celler blev udvalgt af gating på DAPI- celler, og B-celler blev valgt på CD45RA+ udtryk, myeloide celler på CD11b/c+ udtryk og NK celler på CD45RA-CD11b/c-CD161høj udtryk. Renheden blev vurderet ved at tilføje DAPI sorteret celler og kører på celle sorteringsanlæg med parametrene sortering. Renhed bør være mere end 95%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Gating strategi at sortere CD8+CD45RClav og CD4+CD45RClav Tregs.
Celler blev valgt på morfologi størrelse og nøjagtighed (SSC-A/FSC-A), dubletter blev udelukket af FSC-W/FSC-Hansen og SSC-W/SSC-H parametre, levede celler blev udvalgt af gating DAPI- celler, og CD4+Tregs blev valgt på TCR + CD4+CD45RClav udtryk og CD8+Tregs på TCR+CD4-CD45RClav udtryk. Renheden blev vurderet ved at tilføje DAPI sorteret celler og kører på celle sorteringsanlæg med parametrene sortering. Renhed bør være mere end 95%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Repræsentative analyse af de in vitro- smittespredningshæmmende assay.
Responder celleproliferation blev analyseret af udvalg på morfologi størrelse og nøjagtighed (SSC-A/FSC-A), udstødelse af dubletter af FSC-W FSC- og SSC-W/SSC-H parametre, udelukkelse af døde celler og CD4+ Tregs af gating på DAPI-CPDV450 - celler, udvalg af TCR+CD4+ celler og CFSE profil analyse. CFSE gate var baseret på unstimulated CFSE-mærket responder celler. CFSEhøj celler er ikke prolifererende celler og CFSElav er celler med ≥ 1 division. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Repræsentative analyse af donor specifikke alloantibody svar.
Splenocytes fra donor rotte blev inkuberet med en vifte af fortyndede varme-inaktiverede serum fra behandlet eller ubehandlet modtagere eller naive rotte, og derefter med anti-rotte IgG-FITC. Alloantibodies er fundet ved at analysere MFI af FITC på DAPI- z celler efter SSC og FSC dubletter udstødelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 . Princippet om anti-KLH påvisningsmetoden.
Modtagerne blev immuniseret 120 dage efter transplantation med KLH suppleret med CFA, og blodprøver blev høstet 4 og 13 dage efter vaccination. KLH proteiner var belagt på 96-flat bottom wells plader og inkuberes med serumprøver fra immuniserede rotter. Biotinylated ged anti-rotte IgG eller IgM tilladt påvisning af anti-KLH Ab til stede i serum høstet 4 eller 13 dage efter vaccination. HRP-kombineret streptavidin forvandlet TMB substrat til en blå farvet produkt, der forvandler gule når reaktionen var stoppet med svovlsyre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 . Ordningen af anti-RBC påvisningsmetoden.
Modtagerne blev immuniseret 7 dage før og 3 dage efter transplantation med xenogene røde blodlegemer (RBC), og blodprøver blev høstet fra immuniseret modtagere 5 og 14 dage efter den sidste vaccination. Røde blodlegemer var inkuberes med serumprøver fra immuniserede rotter. Tilstedeværelsen af anti-RBC antistoffer på på RBC blev opdaget af farvning med mærket ged anti-rotte IgG eller IgM antistoffer og FACS Canto analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adoptiv overførsel af samlede splenocytes i en nyligt podede modtager er en effektiv måde at påvise tilstedeværelsen af reguleringsmæssige celler inducerede eller forstærkede ved en behandling. Værten bestråling-induceret forbigående lymfopeni fremmer celle overlevelse efter overførsel og etablering af tolerance. Derudover giver subletale bestråling tid til celler med tolerogenic egenskaber til at konvertere til nye lovgivningsmæssige celler under immune rekonstitution, et fænomen kaldet smitsomme tolerance34. Normalt, velbeskrevne CD4+CD25højFoxp3+CD127lav Tregs først undersøges når tolerance er observeret. Imidlertid overførsel af den negative fraktion (splenocytes forarmet i CD4+Tregs) giver nogle gange forlængelse ud over de allerede kendte regulerende celler og identifikation af nye celle populationer1,2, 3,4. I AdCD40Ig-induceret tolerance, overførsel af CD4+T celler-forarmet splenocytes afsløret opdagelsen af CD8+CD45RClav Tregs1. Desuden efterfølgende overførsel af samlede CD8+ T-celler, og derefter begrænset til CD45RClav celler, viste potentialet i sådan en metode til gradvis identificere en ny befolkning af regulerende celler. Desuden, denne strategi giver mulighed for analyse af alle befolkninger. Vi har vist, at mange regulerende celler kan eksistere side om side og endda sandsynligt, og at kompenserende mekanismer findes2,4. Hos rotter behandlet med CD40Ig, nedbrydning af CD8+ celler tilladt fremkomsten af B-celler og myeloide celler med regulerende egenskaber, og overført tolerance over for den kardiale allograft i rotte ifølge protokollen beskrevet ovenfor2. I en model for tolerance induceres ved overekspression af IL34, begge CD4+ og CD8+Tregs var i stand til at overføre tolerance4.

Donor-instrueret specificitet behandling-induceret tolerance kan vurderes på cellulære og humorale niveauer. Første, adoptiv overførsel af regulerende celler til modtagerne af en tredjepart graft vil ikke lykkes i at overføre tolerance, hvis cellerne er specifikke for den første donor graft33. Andet, undertrykkende celler bør effektivt hæmmer udbredelsen af responder celler som reaktion på stimulering af de pansrede mandskabsvogne fra den første donor af graften men ikke fra en tredje part donor2. Endelig kan humorale svar mod donor af graften skelnes fra samlede Ig produktion i modtageren ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor. Desuden bør modtageren i tilfælde af tolerance specifikke til den første graft donor kunne udvikle en ny humorale respons mod en sekundær tredjeparts-graft, en ny antigen eller en tidligere kendte antigen16.

Collagenase D behandling af milten er foretrukne og tilrådeligt at udtrække alle cellepopulationer fra orglet. Endelig, når Fænotypen af regulerende celler er så stram at cellerne er dårligt repræsenteret (< 1% af splenocytes), overførsel af den negative fraktion i forhold til overførsel af den samlede befolkning kan hjælpe skelne smittespredningshæmmende aktiviteten af denne lille befolkning. For eksempel, CD40Ig-induceret CD8+Tregs specifikke for en allogen peptid kunne være FACS farves ved hjælp af tetramers men deres lave antal tillod ikke positive adoptiv overførsel33,38. Dog adoptiv overførsel af CD8 tetramer-forarmet+CD45RClav T celler ikke gjorde overføre tolerance i forhold til samlede Tregs, fremhæve potentialet i denne delpopulation. Dette resultat blev bekræftet af en in vitro- undertrykkende eksperiment. Den smittespredningshæmmende eksperiment var faktisk også en overbevisende måde at vise Du51-specifikke Tregs evne til at undertrykke immun svar33.

Smittespredningshæmmende protokollen beskrevet ovenfor er begrænset til modtagerens effektor CD4+T-celle svar til fremdaterede fra donor. Denne protokol kan tilpasses ved at erstatte fremdaterede af cDCs eller samlede PMV'er, men at sikre, at effektor: stimulator nøgletal er egnede til at opnå en moderat spredning håndterbare af undertrykkende celler. Faktisk, et forhold af CD4+CD25-T celler: fremdaterede bør være 4:1, mens en ratio af CD4+CD25- T celler: cDCs bør 8:1, og CD4+CD25- T celler: PMV'er, 1:1 eller 1:2. Nøgletal afhænger alloreactivity mellem donor og recipient; de ovennævnte forhold er passende for en LEW.1W:LEW.1A kombination med en akut forkastelse forekommer på dag 7, men vifte af responder: stimulator nøgletal skal testes før ofringen af dyr. Endelig foretrækkes CFSE til thymidine til at analysere smittespredningshæmmende aktivitet, for sikkerhed og pålidelighed problemer. Dog sikre den mulige skelnen mellem smittespredningshæmmende celler og responder celler til CFSE analyse på dag 6 Hvis effektor CD4+CD25- T-celler er erstattet af samlede splenocytes. Ligeledes, sikre, at de resterende T celler blandt stimulator celler ikke kan formere sig efter 35 Gy bestråling.

Design af FACS farvning er baseret på tilgængeligheden af antistoffer, der er anført i tabel 3. Lignende protokoller kan tilpasses for mus modeller, at sikre mål pålydende værdi (for eksempel myeloide celler er varierende beskrevet i mus og rotter).

Den heterotopisk hjerte allograft i rotte er en solid orgel transplantation model med store muligheder for graft resultatet overvågning. Mens renal allograft model er kendetegnet ved en pludselig død af modtageren, oplyser palpering af beat styrken af cardiac graften gennem bugvæggen graft evolution39,40. En ledsagende hud graft eller et andet hjerte graft kan realiseres på hjerte allograft modtageren til at studere hukommelse svar41. Derudover er Biomolekylær engineering og biologiske eller kemiske værktøjer for udtømning af specifikke celletyper såsom B-celler (IgM KO), CD8 celler (anti-CD8α antistoffer) eller myeloide celler (clodronate Liposomer), nyttige værktøjer til at måle betydningen af sådanne celle befolkninger i induktion eller vedligeholdelse af tolerance afhængigt af tidspunktet post transplantation hvor nedbryder behandling administreres til modtager1,2,3,4.

Til dato, rotte Bregs, myeloide celler og CD8+Tregs er ikke godt beskrevet. Protokoller af tolerance induktion ovenfor foreslås som reference for karakterisering af rotte regulerende celler1,2,3,4. Yderligere kunne fænotypiske beskrivelse af disse celler og sammenligning til andre modeller af allotransplantation og andre arter bidrage til at diskriminere markører for stor interesse. Faktisk, sammenligning af Bregs fra musemodeller af tolerance og driftsmæssigt tolerante patienter fremhæve overvægt af CD5 eller CD24 markør udtryk som biomarkører for Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . I vores model for tolerance induceres ved AdCD40Ig kombineret med CD8α nedbrydning, er CD24 overexpressed i forhold til B celler mangler smittespredningshæmmende aktivitet2. Høj overførselshastighed digital gen expression RNA sekventering for nylig opstået som et innovativt værktøj til at karakterisere yderligere lovgivningsmæssige celler46.

Endelig kan protokoller til at påvise tilstedeværelsen af reguleringsmæssige celler induceret af en tolerogenic behandling tilpasses andre modeller. Her brugte vi LEW.1W til LEW.1A kombination af allograft, karakteriseret ved en graft afvisning i omkring 7 dage. Inverter kombination, som er blevet beskrevet som mere stringente og hvor akut afvisningen sker hurtigere og stærkere, kan anvendes. Autoimmun sygdomsmodeller kan også drage fordel af vores erfaring i transplantation til decifrere mekanismerne af tolerance induktion med behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev realiseret i forbindelse med projektets Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01), som er en del af programmet "Investissements d'Avenir" franske regering forvaltes af ANR (ANR-11-LABX-0016-01) og af IHU-Cesti projektet finansieres også af den " Investissements d'Avenir"franske regering program, forvaltet af den franske nationale forskning agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Projektets IHU-Cesti understøttes også af Nantes Métropole og Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Tags

Immunologi sag 126 celle sortering regulerende celler Tregs Bregs RegMCs transplantation genterapi undertrykkende assay cardiac allograft alloantibody adoptiv celle overførsel rotte
<em>In Vitro</em> og <em>In Vivo</em> evaluering af T, B og myeloide celler smittespredningshæmmende aktivitet og humorale svar fra transplanterede
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bézie, S., Usal, C.,… More

Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter