Summary
L'obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come esporre e rimuovere il post-mortem del cervello di maiale e ghiandola pituitaria in uno stato integro, adatto per la successiva analisi macroscopica e istologica.
Abstract
Suini sono diventate sempre più popolari in larga animale ricerca traslazionale neuroscienze come sostituto economicamente ed eticamente fattibile primati non umani. La dimensione del cervello di grandi dimensioni del maiale permette l'utilizzo di convenzionali imager cervello clinica e l'uso diretto e la sperimentazione di procedure e attrezzature neurochirurgiche dalla clinica umana. Ulteriori analisi macroscopica e istologica, tuttavia, richiede l'esposizione post mortem del maiale sistema nervoso centrale (SNC) e successiva rimozione del cervello. Questo non è un compito facile, come il maiale CNS è incapsulato da una fitta, il cranio ossuto e della colonna vertebrale. L'obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come esporre e rimuovere il cervello post-mortem di suini e la ghiandola pituitaria in uno stato integro, adatto per la successiva analisi macroscopica e istologica.
Introduction
studi neuroscienze traslazionale nei suini sono diventati sempre più popolari nel corso degli ultimi due decenni. Le grandi dimensioni del cervello di maiale consente l'utilizzo di convenzionali imager cerebrali clinica e l'uso diretto e sperimentazione di procedure neurochirurgiche ed attrezzature dalla clinica umana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Negli ultimi 20 anni, maiali, specialmente maialino (ad esempio, Göttingen cavia), sono stati utilizzati per esaminare modalità di trattamento neuromodulatori, come il trapianto di cellule staminali; Vettore virale trasfezione; e la stimolazione cerebrale profonda diretta verso il morbo di Parkinson, l'obesità, la depressione, e la malattia di Alzheimer 2, 6,= "xref"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Questo è stato seguito dallo sviluppo di approcci stereotassica e chirurgici per manipolare cavia CNS 3, 18, 19, 20, 21. I cambiamenti del SNC istituiti sono state valutate in animali vivi mediante imaging cerebrale (PET 10, 13, 22, 24 e MR 23), cistometria 11, 12, 25, analisi del passo17, la valutazione neurologica 9, 17, e l'esame autoptico basato su istologia e analisi stereologica 14, 15, 17, 26, 27, 31. Tuttavia, l'analisi post-mortem richiede l'esposizione e la rimozione del cervello di maiale, che non è un compito facile, come una spessa cranio osseo e durale fibroso che copre circondano il cervello di maiale.
L'obiettivo di questo documento e video didattico è quello di descrivere come il cervello post-mortem di suini e dell'ipofisi possono essere esposti e rimossi in uno stato integro in 15-20 minuti utilizzando strumenti chirurgici non motorizzati. Il video didattico e illustrazioni fotografiche mostrano cavie di sesso maschile (età: 6 mesi, a corpo libero: 20-25 kg) utilizzato per uno studio anatomico sulla ghiandola pituitaria cavia.
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Protocol
anestesia degli animali e euthanesia è stata eseguita in conformità con i "Principi di laboratorio cura degli animali" (NIH pubblicazione n ° 86-23, rivisto 1985) e approvato dal Consiglio danese per la ricerca etica animale.
1. Strumenti
- Raccogliere gli strumenti presentati nel video ed elencati nella tabella dei materiali.
2. Decapitazione
NOTA: L'anestesia è stata indotta mediante iniezione intramuscolare di 5 mL di midazolam (5 mg / ml) e 5 ml di ketamina (25 mg / mL). 5-10 minuti più tardi, quando l'animale era profondamente sedato, una vena dell'orecchio è stata incannulata e overdose letale (100 mg / kg di peso corporeo) di pentobarbital sodio (200 mg / ml) è stato somministrato per via endovenosa. Per garantire che l'animale è stato completamente eutanasia, il dolore riflesso interdigitale è stato testato come mostrato da Ettrup et al. (2011) 20. euthanization completo è stato assicurato come descritto inl'istruzione etica sopra e seguita da una perfusione transcardial con 5 L di soluzione salina isotonica, come dimostrato da Ettrup et al. (2011) 20. Tutte le procedure vengono eseguite dimostrate postmortem, precludendo la necessità per le precauzioni necessarie per l'anestesia benessere a lungo termine e la sopravvivenza postprocedurale.
- Decapitare il maiale da un alto un'incisione circolare cervicale, utilizzando un bisturi chirurgico, appena sotto l'angolo mandibolare (Figura 1A).
- Ancora con il bisturi chirurgico, continuare l'incisione anteriormente attraverso il tessuto molle del collo, compresa la laringe e dell'esofago, finché la colonna vertebrale ossea viene raggiunto, approssimativamente al livello della giunzione cranio cervicale.
- Avanzare il taglio con un bisturi chirurgico dal lato anteriore della giunzione craniocervicale, sopra l'arco anteriore dell'atlante, e attraverso la membrana atlanto anteriore, esponendo così il canale vertebrale e il midollo spinale (Figura 1B). Allo stesso tempo chiedere un assistente di tirare il corpo del maiale lontano dalla testa di maiale per facilitare l'accesso tra la base del cranio e la prima vertebra cervicale.
- Continuare l'incisione chirurgica attraverso il sacco durale e il midollo spinale (Figura 1B). Prestare particolare attenzione per garantire che una sezione trasversale completa del midollo spinale è raggiunto.
NOTA: La mancata esecuzione del passaggio precedente può portare a trazione indesiderati sul midollo spinale e del cervello durante le seguenti fasi del processo di decapitazione. - Forza estendere la giunzione cranocervical a livello di sezione (Figura 1C). Al tempo stesso, utilizzare il bisturi chirurgico alla sezione restanti legamenti atlanto per rilasciare l'articolazione tra i condili occipitali e il processo articoli superiore dell'atlante. Separare la testa di maiale dal corpo.
Figura 1: minipig decapitazione. (A) del collo incisione (freccia, angolo mandibolare). (B) incisione attraverso i legamenti atlanto e il midollo spinale dura circondato (SC) alla giunzione craniocervicale (C1, arco anteriore dell'atlante, OC, condilo occipitale). (C) La parte posteriore dell'articolazione atlanto viene rilasciato da un'estensione forte (frecce) a livello di sezione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
3. Teschio di apertura
- Posizionare la testa di maiale su un tavolo.
- Effettuare un'incisione longitudinale dorsale con un bisturi chirurgico attraverso la pelle e il tessuto molle sottostante dal retro del muso, sul vertice della testa, e giù attraverso la parte posterioreregione occipitale.
- Esporre la parte dorsale e posteriore del cranio rimuovendo il tessuto molle situata lateralmente alla incisione iniziale con un bisturi chirurgico.
- Rilasciare il muscolo temporale bilateralmente dal cranio (Figura 2A) con un bisturi chirurgico. Assicurarsi che l'osso occipitale posteriore è pulita dei tessuti molli.
- Utilizzare l'entrata posteriore del foro occipitale per rimuovere l'osso occipitale con Kerrison osso punzone e Bone Rongeurs ed esporre il cervelletto dura coperto (Figura 2B).
- Ritorno al lato anteriore esposta del cranio e selezionare un punto di ingresso nel dell'osso frontale, proprio di fronte agli occhi. A questo punto, utilizzare uno scalpello osso con un martello per penetrare il cranio e immettere il seno frontale (Figura 2C).
- Utilizzare l'entità del seno frontale per favorire la rimozione della lamina dorsoposterior cranio esterno con una rongeur ossea o punzone ed esporre l'interno, sottilecranio lamina ossea che copre il cervello (Figura 2D).
- Aprire delicatamente la lamina interna cranio osseo anteriormente con un martello e scalpello osso per esporre cervello dura coperto (Figura 2E).
- Continuare la rimozione di osso lateralmente usando uno scalpello osseo e una rongeur osso attraverso l'osso temporale e parietale al fine di rilasciare la parte dorsoposterior finale del cranio, situato tra le parti già esposte del cervello e nel cervelletto dura coperto (Figura 2F).
NOTA: E 'spesso possibile, durante la fase finale di questa procedura, per usare lo scalpello per rompere il restante posteriore ossa del cranio da una parte all'altra, proprio come uno apre una porta.
Figura 2: apertura cranio cavia. (A) esposizione della dorsoposteriosuperficie del cranio R, tra cui la rimozione del occipitale e muscoli temporali. (B) La rimozione dell'osso occipitale (CB, dura coperta di cervelletto, OB, osso occipitale, OC, condilo occipitale, e SC, midollo spinale). (C) un martello e uno scalpello osso sono usati per penetrare il cranio anteriormente e per entrare nel seno frontale a livello degli occhi. (D) La portata del seno frontale (FS) viene utilizzato per rimuovere il cranio esterna dell'osso spessore (1), esponendo una sottile lamina ossea interna (2) che copre il cervello. (E) La rimozione del sottile lamina ossea, esponendo il cervello dura coperto (freccia). (F) Infine, un martello e uno scalpello osso vengono utilizzati per il collegamento laterale anteriore e le aperture posteriori cranio. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
4. Cervello Removal
- Utilizzare pinze chirurgiche per sollevare la dura e creare un dolce un'incisione vicino alla venoso seno longitudinale superiore utilizzando un bisturi chirurgico fine (Figura 3A).
- Utilizzare micro-forbice o un coltello dura per aprire ulteriormente la dura madre che copre la superficie dorsale del cervello.
NOTA: Particolare cura deve essere presa quando si rimuove la dura corrispondente al tentorio cerebellare (figura 3B), come conservazione di questo foglio durale impedirà successiva rimozione cervello. - Posizionare la testa di maiale verticalmente (Figura 3C).
- Utilizzare lo scalpello osso o un dissettore per rilasciare cervello ventroanterior per via smussa del bulbo olfattivo dal pavimento dura coperto della cavità cranica (Figura 3D).
- Utilizzare un bisturi chirurgico fino al punto chiasma ottico esposta (Figura 3E). Esporre e la sezione del peduncolo ipofisario ei nervi oculomotori.
- Rilasciare il tronco cerebrale ventrale sezionando LOwer nervi cranici (Figura 3F) con una multa bisturi chirurgico. Garantire che tentorio cerebellare durale stato completamente inciso (figura 3B), in quanto questa foglia durale sarà altrimenti tagliare il tronco cerebrale durante il processo di rilascio.
Figura 3: rimozione cervello cavia. Apertura (A) durale con pinze chirurgiche e un coltello dura. (B) Bisogna fare attenzione a incidere completamente la foglia durale (freccia), che si trova tra il cervello e il cervelletto. (C) La testa di maiale è in posizione verticale per una migliore visualizzazione delle strutture di base del cranio e al fine di gravità per aiutare lo spostamento previsto del cervello. (D) Un dissettore o uno scalpello osso viene usato per alleviare il bulbo olfattivo dalla sezione smussata dalla dura madre-coverebase del cranio d. (E) La dissezione viene continuata in direzione posteriore lungo la base del cranio per l'esposizione e sezionamento del chiasma ottico (freccia), gambo infundibolare e nervi oculomotori. (F) Il rilascio cervello è completato con la sezione dei nervi cranici inferiori come si allontanano dalla superficie ventrale del tronco cerebrale (III, oculomotore, IV, nervo trocleare, V, nervo trigemino e VI, abducente nervi). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
5. Rimozione pituitaria
- Identificare il peduncolo ipofisario ei suoi dintorni foglia durale (la sellae diapragma) nel pavimento cranio (Figura 4A).
- Incidere la foglia laterali durale al peduncolo ipofisario utilizzando una multa bisturi chirurgico (Figura 4B).
- Utilizzare un dissettore per rilasciare la fossauitary ed estrarlo dell'ipofisi fossa (Figura 4C).
Figura 4: rimozione pituitaria cavia. (A) La fossa pituitaria (*) è identificato nel piano cranio (1, bulbo olfattivo, 2, chiasma ottico e PF, fossa cranica posteriore). (B) La copertura durale (diagphragm Sellar, (freccia)) viene incisa lateralmente. (C) L'ipofisi (freccia) viene rilasciato con un dissettore e tirato fuori dalla fossa pituitaria. barra di scala (AC) = 10 mm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Per evitare che il materiale del tessuto si secchi, si consiglia di conservare il cervello rimosso e pituitaria in un vaso riempito di fissativo o soluzione salina isotonica immediatamente dopo l'analisi macroscopica è stata eseguita. Il materiale tessuto può essere immagazzinato nel fissativo per anni, mentre stoccaggio in soluzione salina isotonica, anche in frigorifero, porterà a decadimento dei tessuti con il tempo.
L'ipofisi rimosso può anche essere direttamente congelata per immersione in ghiaccio secco-raffreddato a liquido 2-metilbutano, mentre il cervello di maiale intatto è troppo grande per il congelamento diretta 28. Invece, si raccomanda di tagliare il cervello di maiale, come precedentemente dimostrato 28, in lastre di spessore del tessuto 9-15 mm parallele coronali che possono essere bloccate in toto e criostato sezionata in 40 sezioni micron di spessore 5, 18, 26, 28. In alternativa, specifiche aree cerebrali possono essere liberi-dissezionati dal cervello intatto rimosso o fette lastra cervello e sottoposti a ulteriore lavorazione istologica dopo vibratome sezionamento 30, paraffina / embedding metacrilato e microtomo sezionamento 6, 17, 27, o congelamento e criostato sezionamento 6, 14, 15, 25. Nel nostro ambiente, le carcasse di suino sono finalmente messi in contenitori di plastica specifici e conservati in una cella frigorifera dedicata fino a quando non vengono raccolti e trasportati ad un impianto degradanti biologica.
Con l'uso di strumenti chirurgici non motorizzati (tabella dei materiali), la tecnica descritta (figure 1 g> - 3) consente, in circa 15-20 minuti, la rimozione del cervello di maiale intatto (Figura 5AB), mentre i nervi cranici tagliate e pituitaria rimangono collegati al pavimento cranio (Figura 4A). Analogamente, l'ipofisi può essere semplicemente rimossa, intatto, dopo aver rimosso il cervello sovrastante e rilasciando il diaframma sellare durale (Figura 4 e 5C).
Il cervello risultante e / o ipofisaria (Figura 5) possono essere successivamente sottoposti ad analisi macroscopica che, a parte l'ispezione visiva diretta, possono includere dimensioni e volume misurazioni 31. Questo può essere seguito da orientata sezionando in lastre cerebrali minori 28, 29 adatto per l'analisi chimica e / o ulteriori istologica preparazione, colorazione e analisi microscopica 6,s = "xref"> 14, 15, 17, 25, 26, 27.
Figura 5: Il cervello cavia (A e B) e l'ipofisi (C). (A) del cervello, vista laterodorsal (BS, tronco cerebrale, CB, cervelletto, e CRB, cervello). (B) del cervello, vista ventrale (BS, tronco cerebrale, CB, cervelletto, e CRB, cervello). (C) pituitaria, vista posteriore (AH, adenohypophysis e NH, neurohypophysis). barra di scala (A e B) = 10 mm, (C) = 5 mm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La maggior parte degli studi di neuroscienze sperimentali vengono eseguiti in piccole specie animali, come topi e ratti, in cui l'accesso al sistema nervoso centrale è facilitato da un sottile skull- e durale spessore. Tuttavia, in animali da esperimento più grandi come maiali 1, 4, 8, pecore 32, e primati non umani, l'elevato spessore di queste strutture richiede l'uso di strumenti robusti (tabella dei materiali) e punti di ingresso appropriati per la rimozione delle ossa del cranio (Figura 2). Conoscenza di limitare foglie durali (Figure 3 e 4) è richiesto prima del SNC può accedere e il cervello rimosso in modo sicuro.
Si consiglia di lasciare la dura intatta durante la rimozione delle ossa del cranio, in quanto ciò proteggere il cervello dai danni sottostante. Precedente fissazione transcardial 20 può anche indurirsi e slightly compattare il cervello, permettendo l'osso e processo di rimozione durale da eseguire con maggiore facilità e sicurezza. Una particolarità del cranio maiale, contrariamente alle pecore e primate non umano, è la progressiva espansione del seno frontale con l'età, il che può essere vantaggioso nel processo di rimozione delle ossa del cranio (Figura 2). La tecnica presentata può di conseguenza essere utilizzato su tutte le grandi specie animali, ma solo nei suini, in particolare quelli di età superiore a 6 mesi, sarà il seno frontale essere sviluppato abbastanza per fornire un aiuto nel processo di rimozione delle ossa del cranio. Infine, completa sezionamento del midollo spinale durante il processo di decapitazione (Figura 1B) e completa sezionamento della durale tentorio cervelletto (Figura 3B) prima del rilascio cervello finale sono assolutamente necessaria per evitare danni successivi al tronco cerebrale.
In alcuni studi, può essere vantaggioso avere una parte rostrale midollo spinale cervicale attaccato al cervello.Questo può essere ottenuto posizionando l'incisione decapitazione iniziale (Figura 1A) più caudalmente sul collo, consentendo l'accesso al midollo spinale attraverso un disco intervertebrale cervicale invece della giunzione craniocervicale, come dimostrato nel video corrente. La rimozione posteriore osso dovrà quindi partire dalla lamina caudali esposto. Oltre a questo, la tecnica sarà simile, quindi è importante ricordare che il midollo spinale deve essere completamente sezionato prima della decapitazione si completa con estensione forte a livello di sezione (Figura 1). L'attuale procedura è dimostrato sugli animali non fissati, come lo studio sfondo reale ha reso necessaria l'analisi HPLC della ghiandola pituitaria derivata. Si noti, tuttavia, che la stessa tecnica viene utilizzata su animali transcardially fissata con paraformaldeide 3, 5, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 31, anche se tutte le procedure in tal caso deve essere eseguita con una buona ventilazione fornita da una cappa 20. La scelta di dissezione nativo e in toto -fixation e successiva dissezione dovrebbe quindi puramente dipendere dalla procedura di post-elaborazione richiesta (ad esempio, istologia convenzionale, immunoistochimica, HPLC, e FISH) 32.
Come discusso nei prossimi paragrafi, abbiamo preferito utilizzare strumenti chirurgici non motorizzati. Il cranio di suini di età superiore a 1-2 anni può, tuttavia, essere così robusto che la rimozione cranio con l'Instr dimostratouments non è possibile, rendendo necessario l'uso di strumenti motorizzati, quali craniotomes, seghe oscillanti, e trapani elettrici 32. In tal caso, è comunque raccomandato per seguire i passi di protocollo sopra indicati, sfruttando così i naturali punti di ingresso cranio e sviluppo seno frontale. L'accesso anteriore presentato alla base del cranio è elegante e facile, ma il rilascio smussato descritto dei bulbi olfattivi deve essere eseguita senza una guida visiva diretta (Figura 3D), in contrasto con la maggiore rilascio posteriore del cervello (Figura 3EF). La parte ventrale dei bulbi olfattivi può quindi subire qualche grado di danno incontrollata che solo può essere evitata, se necessario, forando base cranica anteriore fuori ventrale alle lampadine prima dell'avvio del processo di rilascio. Si noti che la manipolazione, in particolare del tessuto cerebrale non fissato durante la rimozione del cranio, è stato indicato per portare alla histologi cal neurone artefatto scuro, che può portare a conclusioni errate in studi neurotossicologici 33.
Il processo di rimozione cranio osso può anche essere eseguita con macchine come craniotomes, seghe oscillanti, e trapani elettrici 32. Questi possono accelerare il processo, ma anche aumentare il rischio di danneggiamento delle strutture neurali sottostanti. Tale apparecchiatura può anche essere costoso e molto probabilmente sarà disponibile per la maggior parte dei laboratori. Abbiamo quindi preferito per dimostrare la procedura corrente utilizzando apparecchi chirurgici non motorizzati (Table of Materials) che è facile da accedere e utilizzare.
La tecnica descritta ed illustrata si, se usato correttamente, attivare l'esposizione e la rimozione del cervello maiale post-mortem, pituitaria, e / o midollo spinale cervicale (Figura 5), con conseguente pezzi di tessuto che sono adatti per ulteriori analisi macroscopica"xref"> 5, 6, 19, 26, 31, sezionando in lastre cerebrali 28, e successiva analisi chimica e / o trasformazione istologica 6, 14, 15, 16, 17, 25, 26, 27, 31.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine l'aiuto sapiente della signora Trine W. Mikkelsen, la signora M. Lise montaggio, e il personale a Påskehøjgaard. The Danish Medical Research Council, la Fondazione Lundbeck, e la Novo Nordisk Foundation sostenuti finanziariamente lo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Scalpel Handle #4 | FST (Fine Science Tools) | 10008-13 | Good for skin incision and soft tissue removal |
| Non-Sterile Scalpel Blades #23 | FST | 10023-00 | |
| Scalpel Handle #7 | FST | 10007-12 | Optimal for dural incision and precision work |
| Non-Sterile Scalpel Blades #11 | FST | 10011-00 | |
| Surgical Forceps | FST | 11024-18 | The tip of the surgical forceps ensure a firm grip |
| Kerrison Bone Punch | Aesculap Neurosurgery | FF713R | Must be robust, bite size 3-5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | MD615 | Must be robust, bite size 15 x 5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | FO551R | Must be robust, bite size 25 x 15 mm |
| Bone Chisel | Lawton | 67-0335 | The size of the chisel head should not exceed 20 mm |
| Mallet (Hammer) | Millarco | 5624108 | Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm |
| Micro-Scissor | FST | 14002-14 | |
| Dissector | Aesculap Neurosurgery | OL165R | |
| Göttingen minipigs | Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark | ||
| Euthanimal | pentobarbital | ||
| Ketamine | Pfizer | ||
| Midazolam | Hameln Pharmaceuticals |
References
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