Summary
نحن تصف بروتوكول للتشريح، التثبيت، والمناعية من أجهزة الستيرويدي المنشأ في يرقات ذبابة الفاكهة والكبار الإناث لدراسة الستيرويد الحيوي الهرمونات وآلية التنظيمية. بالإضافة إلى أجهزة الستيرويدي المنشأ، ونحن تصور تعصيب أجهزة الستيرويدي المنشأ وكذلك الخلايا المستهدفة الستيرويدي المنشأ مثل الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية.
Abstract
في الكائنات متعددة الخلايا، وهبت مجموعة صغيرة من الخلايا مع وظيفة متخصصة في نشاطها الحيوي، الأمر الذي أدى إلى استجابة نظامية للنمو والتكاثر. في الحشرات واليرقات الغدة prothoracic (PG) والكبار الإناث اللعب المبيض أدوار أساسية في biosynthesizing هرمونات الستيرويد الرئيسية دعا ecdysteroids. معصب هذه الأجهزة ecdysteroidogenic من الجهاز العصبي، والتي يتم من خلالها تؤثر على توقيت الحيوي عن طريق الاشارات البيئية. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور أجهزة ecdysteroidogenic والأجهزة التفاعلية في اليرقات والكبار من ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة، والتي توفر نظام نموذج مناسب لدراسة هرمون الستيرويد الحيوي والآلية التنظيمية لها. تشريح ماهرا يسمح لنا للحفاظ على مناصب أجهزة ecdysteroidogenic وأعضائهم التفاعلية بما في ذلك الدماغ، الحبل العصبي البطني، والأنسجة الأخرى. المناعية معntibodies ضد الإنزيمات ecdysteroidogenic، جنبا إلى جنب مع البروتينات مضان المعدلة وراثيا يقودها المروجين الأنسجة محددة، وتتوفر لتسمية الخلايا ecdysteroidogenic. وعلاوة على ذلك، فإن innervations الأجهزة ecdysteroidogenic يمكن أيضا أن يكون المسمى من قبل الأجسام المضادة محددة أو مجموعة من السائقين GAL4 في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. ولذلك، فإن أجهزة ecdysteroidogenic وصلاتهم العصبية يمكن تصور في وقت واحد من قبل المناعية والتقنيات المعدلة وراثيا. وأخيرا، نحن تصف كيفية تصور الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية، التي انتشار الأسلحة النووية وصيانة تسيطر عليها ecdysteroids. هذه الطريقة تساهم في فهم شامل من الستيرويد الحيوي الهرمونات وآلية تنظيمية العصبية لها.
Introduction
في الكائنات متعددة الخلايا، وهبت مجموعة من الخلايا مع وظيفة متخصصة في نشاطها الحيوي الذي لا غنى عنه للجسم كله. لإنجاز مهامهم، كل النسيج أو العضو يعبر عن سلسلة من الجينات ذات الصلة بمهامهم والتواصل مع الأنسجة الأخرى لتنظيم أنشطتها في سياق التنمية. لتوصيف هذه الوظائف الخلوية المتخصصة والتفاعل بين الأجهزة، ونحن بحاجة إلى تحديد مجموعة من الخلايا جنبا إلى جنب مع إبقائهم أنواع أخرى من الخلايا سليمة في العمارة متعددة الخلايا.
وأحد الأمثلة على هذه الأجهزة المتخصصة هو عضو الستيرويدي المنشأ، حيث تتوسط العديد من الإنزيمات السكروز الخطوات التحويل من الكولسترول لهرمونات الستيرويد نشطة 1. وأعرب معظم هذه الجينات انزيم تحديدا في أجهزة الستيرويدي المنشأ، ويتم تنظيم المسار الحيوي بإحكام من قبل العديد من مؤثرات الخارجية من خلال المدخلات الخلطية والمدخلات العصبية. ذات مرةتفرز توليفها، هرمونات الستيرويد في الدملمف وتستهدف العديد من الأنسجة والأعضاء لتنظيم التعبير عن مجموعة متنوعة من الجينات 2. ولذلك، فإن عمل هرمون منشط يؤدي الى استجابة نظامية للحفاظ على التوازن والنمو والتكاثر.
للتحقيق في وظائف الستيرويد هرمون الحيوي والإجراءات عديد المظاهر من هرمونات الستيرويد، ذبابة الفاكهة يمكن استخدامها كنظام نموذج مناسب. خلال مراحل اليرقات والحشرات هرمون منشط، ecdysteroid، وbiosynthesized في جهاز الغدد الصماء المتخصصة تسمى الغدة prothoracic (PG) 3. في PG، عدة إنزيمات ecdysteroidogenic تحفز على وجه التحديد الخطوات تحويل متعددة من الكولسترول إلى إكديسون، التي تسيطر على طرح الريش والتحول في المراحل التنموية المناسبة 4. لذلك، وينظم تغيير ديناميكية في عيار ecdysteroidمن قبل العديد من مسارات الإشارات في استجابة لمنبهات البيئية. من ناحية أخرى، في مرحلة البلوغ، ecdysteroid يلعب أدوار أساسية في علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك الاستنساخ، والنوم، والذاكرة، وعمر 5 و 6 و 7 و 8. ومن المعروف أن ecdysteroid وbiosynthesized بنشاط في المبيض، وتنظيم تطور مراحل تكوين البويضات 6، 7، 8، 9، 10، 11. مؤخرا قمنا ذكرت أن عدد الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية (GSCs) يتأثر ecdysteroid والجنس إشارة الببتيد ردا على التزاوج المحفزات 12.
أدوات قوية من D. البطن الوراثة وبيولوجيا الخلايا، بما في ذلك معلومات الجينوم مشروحة بشكل جيد، الجينات ثنائيوقد مكنت أنظمة التعبير، وتقنيات رني المعدلة وراثيا، لنا لتحديد الجينات الضرورية لecdysteroid الحيوي في PG والمبيض 13 و 14 و 15. وبمجرد تحديد الجينات ecdysteroidogenic، وتنظيم النسخي من هذه الجينات وتعريب الديناميكية للمنتجات الجين يمكن فحص في التركيب الحيوي المسار 16. لهذا الغرض، الكمي للعكس النسخ-PCR، وتجرى RNA التهجين في الموقع، وتحليل immunohistological. ويشمل تطبيق هذه التقنيات مهمة صعبة. تشريح مفصل من PG أو المبيض. على وجه الخصوص، PG من ذبابة الفاكهة هو أصغر نسبيا من تلك الحشرات الأخرى (مثل دودة القز ويطير ضربة)، لذلك يحتاج إلى ممارسة مهارة حيوية من ذبابة الفاكهة تشريح لأخذ العينات. وعلاوة على ذلك، تحصل كل من أجهزة ecdysteroidogenic تعصيبالصورة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 17، 18، 19، 20. وهكذا، على التحليلات التشريحية دقيقة، يجب أن تبقى أجهزة ecdysteroidogenic سليمة مع الجهاز العصبي المركزي وغيرها من الأجهزة، وليس لعرقلة صلاتهم العصبية.
هنا نقدم بروتوكولات للتشريح والتصور من أجهزة الستيرويدي المنشأ في D. البطن. تعلم تقنية تشريح هو نقطة الانطلاق الرئيسية لهذه التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن تسمية بنجاح أجهزة الستيرويدي المنشأ وكذلك أعضائهم تفاعلية مع العديد من الأجسام المضادة وخطوط السائق GAL4. الاستفادة من هذه التقنيات، والمواد، وعلم الوراثة، ويمكن للمرء أن دراسة آليات شاملة من الستيرويد هرمون الحيوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم عرض المخطط العام للبروتوكولات في الشكل 1.
1. تشريح اليرقات حلقة الغدة (RG)
ملاحظة: في D. البطن، الذي ينتمي إلى ذوات الجناحين cyclorrhaphous، وPG هو داخل الغدد الصماء جهاز مركب يسمى حلقة غدة (RG، الشكل 2D). وبما أنه من غير مجد أن PG يتم فصل جراحيا من أنواع أخرى من الخلايا (مناقشته لاحقا)، والهدف العملي هو عزل وسليمة، RG التالفة عن طريق تشريح.
- إعداد اليرقات في المراحل التنموية المناسبة
ملاحظة: لمزامنة مراحل تطور D. البطن اليرقات، فمن الضروري جمع البيض ضمن إطار ضيق الوقت وجمع اليرقات في الأوقات المناسبة.- وجمع البيض لمدة 2 ساعة على لوحة أجار العنب عصير عند 25 درجة مئوية.
- جمع حديثا تحاك 1
- في نقطة زمنية مناسبة، وجمع اليرقات نظموا مع حلقة من البلاستيك القابل للتصرف لتجنب الإصابة غير مرغوب فيها. لتقليل الفارق في التقدم التنموي من اليرقات طور مرحلي 3 الثالثة، وجمع يرقات العمر 2 الثانية في 70 حائل (48 ههه) والسماح لهم تساقط في فترات ح 2. ثم، وجمع اليرقات طور مرحلي 3 الثالثة في غضون 2 ساعة بعد انسلاخ L3. هذا الإجراء يعطي 0-2 hAL3E اليرقات.
- نقل اليرقات نظموا إلى طبق مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- شطف اليرقات مع PBS لإزالة المواد الغذائية المتبقية من الجسم.
- تشريح الخشنة من اليرقات تحتتشريح المجهر
- عقد ربط فم اليرقة مع ملقط. قطع الجسم اليرقات في الثلث الأمامي من طول الجسم باستخدام المقص الصغير.
- عقد نهاية قطع من الجسم اليرقات الأمامي مع زوج واحد من الملقط. استخدام زوج آخر من ملقط، ودفع بلطف غيض من اتجه نحو داخل الجسم. هذا الإجراء يحول الجسم اليرقات الداخل الى الخارج.
ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة لتشريح 1 شارع الطور اليرقات. - كرر الخطوات 1.2.1-1.2.2 مع يرقات إضافية لمدة 5-10 دقائق.
ملاحظة: يجب أن يكون عدد اليرقات يساوي أو أقل من 20 لتوفير الوقت للتشريح.
- تشريح شرائح اليرقات
ملاحظة: هذه الطريقة تسمح الحفاظ على موقف الأنسجة لتبقى سليمة.- ترك اليرقات في الماء فقط لمدة 1 ساعة. ويجمد اليرقات بسبب الاختناق.
- وضع الجانب الظهري يرقة في قطرة من برنامج تلفزيوني على المغلفة السيليكونطبق، مع ما يصل الجانب الظهري.
ملاحظة: الجانب الظهري ديه 2 أنابيب القصبة الهوائية تشغيل طوليا. - تحت المجهر تشريح، إدراج دبوس الحشرات في تلميح الأمامي لليرقة باستخدام ملقط. تمتد الجسم اليرقات إلى الجانب الخلفي ووضع دبوس الثاني إلى الطرف الخلفي من يرقة.
ملاحظة: بالإضافة إلى دبابيس الحشرات، إبرة مصنوعة من أسلاك التنجستن يمكن أن يكون مفيدا 21. إبرة يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ في طرف ماصة من خلال التسخين لاستخدامها بوصفها إبرة تشريح. - تحت المجهر تشريح، وجعل شق صغير بالقرب من الذيل مع مقص الجزئي. من شق، وقطع بشرة الظهرية طوليا على طول خط الوسط الظهرية نحو الرأس. يجب الحرص على عدم تلف الأنسجة تحت بشرة.
- تمتد بشرة bodywall على كل جانب ومكان 4 دبابيس في كل ركن من أركان bodywall تشريح.
- إزالة جزء من الأمامية الدهون في الجسم مع ملقط، لفضح الدماغ RG جomplex تتعرض على السطح. إزالة زوج من الغدد اللعابية، إذا لزم الأمر.
- تثبيت وتلوين الأنسجة مع المناعية
- وضع الثلث الأمامي من الهيئات اليرقات (الخطوة 1.2.2) في microtube 1.5 مل مليئة 500 ميكرولتر الحل الإصلاح (4٪ امتصاص العرق في PBS). إصلاح أقل من 20 عينة في وقت واحد، وإلا PBS تعلق على عينات ثابتة قد تتسبب في التخفيف من غير المواتية تثبيتي. لتشريح شرائح، وإزالة قطرة من برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافة قطرة من حل الإصلاح.
ملاحظة: للحصول على حل الإصلاح، إما 3.7٪ الفورمالديهايد أو 4٪ امتصاص العرق ويمكن استخدام. - احتضان الأنسجة تشريح في حل الإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بدلا من ذلك لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- استبدال حل الإصلاح مع 500 ميكرولتر PBS وبسرعة شطف العينات 3 مرات. غسل العينات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT (PBS + 0.3٪ octylphenol ethoxylate) لمدة 15 دقيقة على الكرسي الهزاز في RT. لتشريح شرائح، وإزالة المسامير الحشرات ونقل العينات إلى 1.5 مل microtube.
ملاحظة: للحصول على زيادة نفاذية الأجسام المضادة في الأنسجة، ويتم التعامل مع العينات مع 500 ميكرولتر 2.0٪ PBT لمدة 1-2 ساعة على الكرسي الهزاز في RT. - استبدال PBT مع 500 ميكرولتر عرقلة الحل (2٪ ألبومين المصل البقري في PBT). احتضان هذه العينات لمدة 1.5 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
- استبدال حل حجب مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية، أي الأجسام المضادة المخفف في عرقلة الحل.
- احتضان هذه العينات بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية.
- استبدال حل الأجسام المضادة الأولية مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT وبسرعة شطف عينات 5 مرات. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة كل يوم الروك في RT.
- استبدال 0.3٪ PBT مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة صبغ مترافق المخفف في عرقلة الحل). لتلطيخ النووي، 0.5 ميكرولتر 4، 6 diamidino-(دابي، / 0.1 ملغ مل حل الأسهم) يضاف 2-phenylindole إلى 50 ميكرولتر حل. احتضان هذه العينات على الكرسي الهزاز لمدة 2 ساعة عند RT أو بدلا من ذلك في 4 درجات مئوية خلال الليل.
ملاحظة: حافظ على عينات في الظلام. - استبدال حل الأجسام المضادة مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT وشطف 5 مرات. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT.
- وضع الثلث الأمامي من الهيئات اليرقات (الخطوة 1.2.2) في microtube 1.5 مل مليئة 500 ميكرولتر الحل الإصلاح (4٪ امتصاص العرق في PBS). إصلاح أقل من 20 عينة في وقت واحد، وإلا PBS تعلق على عينات ثابتة قد تتسبب في التخفيف من غير المواتية تثبيتي. لتشريح شرائح، وإزالة قطرة من برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافة قطرة من حل الإصلاح.
- تشريح غرامة من مجمع الدماغ RG التي تحتوي على PG وتصاعد
- استخدام الماصة المتاح لنقل العينات immunostained إلى صحن مليء 0.3٪ PBT.
ملاحظة: لتجنب الفقاعات غير مريح أثناء تشريح والتركيب، يمكن استبدال 0.3٪ PBT مع برنامج تلفزيوني. - تشريح تحت المجهر، مع الاستمرار على بشرة أو الفم ربط مع زوج واحد من الملقط. باستخدام إبرة 27 G تعلق على حقنة 1 مل ك "سكين"، وقطع رأس الأمامي من المريء والعين أقراص لإزالة مجمع القرص الدماغ RG-العين من بشرة الجسم.
- سيبامعدل المريء والأمعاء من مجمع القرص الدماغ RG-العين مع ملقط. منذ المريء يمر من خلال الدماغ فوق الحبل العصبي البطني (VNC)، سحب الأمعاء إلى الجانب الخلفي.
ملاحظة: لإزالة أقراص تخيلي إضافية من العينات، وقطع الاتصالات بين الدماغ، وأقراص العين، وأقراص الساق بسكين الإبرة. - كرر الخطوات 1.5.1-1.5.4 لعينات أخرى.
ملاحظة: لمنع الحطام الأنسجة من الالتصاق للعينات، ونقل كل عينة الانتهاء إلى طبق نظيف مختلفة مليئة 0.3٪ PBT أو برنامج تلفزيوني. - نقل العينات إلى مركز شريحة زجاجية نظيفة مع micropipette.
ملاحظة: للحصول على الثانية 2 أو 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات، ويجب أن يتم اقتطاعها نهاية تلميح micropipette بشفرة حلاقة. - تحت المجهر تشريح، محاذاة عينات فردية مع الجانب الظهري امرهم باستخدام ملقط.
ملاحظة: يقع RG على الجانب الظهري من الدماغ (الشكل 2A). هذا التوافق تسهل مواصفات العينات الفردية أثناء التصوير. - إمالة شريحة زجاجية وتمحو الكثير من فائض PBT وقت ممكن. وضعت قطرة من كاشف متزايدة على جانب من الشريحة. ضع حافة الانزلاق غطاء من الجانب الآخر من الانخفاض، ووضع انزلاق الغطاء على عينات ببطء مع ملقط.
ملاحظة: هذا الإجراء يمنع عينات من التحرك خارج انزلاق الغطاء. - تخزين العينات في 4 درجات مئوية. الحفاظ على العينات في الظلام.
- استخدام الماصة المتاح لنقل العينات immunostained إلى صحن مليء 0.3٪ PBT.
2. تشريح المبيض في الإناث الكبار
- إعداد الإناث البالغات
- تغذية أنثى الذباب مع الطعام ذبابة الخميرة / الذرة القياسي لمدة 3-4 أيام لتسمين حتى المبيض. الحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- تشريح المبيض البالغات
- تخدير أنثى الذباب مع غاز CO 2 وقطعت رؤوسهم.
- نقل جثث يطير إلى طبق 3 سممليئة PBS.
- تحت المجهر تشريح، عقد القفص الصدري على الجانب الظهري باستخدام ملقط. فهم A5 جزء البطن أو A6 مع ملقط الأخرى وقشر بعيدا عن بشرة البطن نحو الجانب الخلفي. تمحو بشرة لزجة من غيض من الملقط.
- قرصة إلى قناة البيض واخراج المبيض من الجسم.
- تمشيط ونشر نصائح من المبيض مع ملقط.
ملاحظة: هذه العملية تحسن كفاءة المناعية.
- تشريح الدماغ البالغات، VNC والأعضاء التناسلية.
ملاحظة: يسمح هذا الأسلوب تعصيب من المبيض إلى أن تبقى على حالها.- تخدير أنثى الذباب مع غاز CO 2 ونقلها إلى طبق المغلفة السيليكون مليئة PBS.
- تحت المجهر تشريح، عقد خرطوم وقشر بعيدا بشرة الرأس لفضح الدماغ مع ملقط. إزالة القصبة الهوائية التي تعلق على الدماغ.
ملاحظة: المخن هو بنية بيضاء ومدورة. الدماغ يتصل VNC في الصدر. - عقد القفص الصدري على الجانب الظهري وقطع الأرجل والأجنحة مع زوج واحد من الملقط. استخدام زوج آخر من الملقط، قشر بعيدا الصدر بطني بشرة من الأسس التي قامت عليها الساقين. مرة واحدة يتعرض VNC، وإزالة إهاب الظهرية المتبقية والعضلات التي تعلق على VNC باستخدام ملقط. يجب الحرص على عدم الإضرار اتصال بين الدماغ وVNC.
- استخدام ملقط لقشر بعيدا بشرة البطن وفضح المبيض والأجهزة التفاعلية الخاصة بما في ذلك الخلايا العصبية، والمحاصيل، والأمعاء، قناة البيض، والرحم، والغدة ثانوي.
- إزالة الأنسجة المتبقية بما في ذلك القصبة الهوائية والدهون في الجسم باستخدام ملقط.
- تثبيت وتلوين الأنسجة مع المناعية
- نقل ما يقرب من 8-10 أزواج من المبيض إلى microtube 1.5 مل مليئة 250 ميكرولتر الحل الإصلاح (4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني)، واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT.
- استبدال حل الإصلاح مع 500 ميكرولتر PBS وبسرعة شطف العينات 3 مرات.
- غسل العينات 2 مرات مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT لمدة 5 دقائق كل في RT.
- استبدال PBT مع 50 ميكرولتر عرقلة الحل. احتضان هذه العينات لمدة 1 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
- استبدال حل حجب مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية.
- احتضان هذه العينات بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية.
- استبدال حل الأجسام المضادة الأولية مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT لمدة 15 دقيقة كل يوم الروك في RT.
- استبدال 0.1٪ PBT مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية. لتلطيخ النووي، إضافة 0.5 ميكرولتر دابي إلى 50 ميكرولتر الحل. احتضان هذه العينات لمدة 2 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
- استبدال حل الأجسام المضادة الثانوية مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT لمدة 15 دقيقة كل يوم الروك في RT.
ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء الغسيل في 4 درجات مئوية خلال الليل. الحفاظ على العينات في الظلام.
- تركيب عينات على الشرائح الزجاجية
- نقل العينات إلى شريحة زجاجية مع 0.1٪ PBT باستخدام micropipette.
ملاحظة: لتجنب الفقاعات غير مريح أثناء تشريح والتركيب، يمكن استبدال 0.1٪ PBT مع برنامج تلفزيوني. - لالمبيض، فصل سلاسل من ovarioles عن بعضها البعض مع ملقط تشريح تحت المجهر. لا تجرح نصائح من ovarioles تحتوي على germaria. للمجمع الجهاز الدماغ VNC الإنجاب، وإزالة إهاب المتبقية وترتيب الوضع على شريحة زجاجية.
- تمحو الكثير من فائض PBT وقت ممكن وضعت قطرة من كاشف تصاعد في وسط العينات. ضع زلة غطاء باستخدام ملقط ببطء.
- تخزين العينات في 4 درجات مئوية. الحفاظ على العينات في الظلام.
- نقل العينات إلى شريحة زجاجية مع 0.1٪ PBT باستخدام micropipette.
- مراقبة العينات تحت المجهر وجلب أجهزة الستيرويدي المنشأ في مجال الرؤية. مرة واحدة يتم إصلاح الرأي، تبديل نظام التصوير لوضع الحصول على الصور.
ملاحظة: يتم استخدام العدسات الهدف 10-20X للحصول على صور للمجمع الدماغ RG أو المبيض كله. بدلا من ذلك، يتم استخدام 40-63X العدسات الهدف (الماء أو غمر النفط) لتصور توطين التحت خلوية من البروتينات في GSCs أو innervations العصبية من PG والمبيض. - إعداد المعلمات الحصول على الصور على البرنامج المرفق. حدد مجموعة من مضان (مثل GFP وRFP). قبل إجراء مسح سريع، وضبط قوة الليزر، وحساسية للكشف عن (ربح / الأوفست)، وحجم الثقب.
ملاحظة: للحصول على الصور في ذات جودة عالية، ينبغي أن يكون الأمثل قوة المسح بالليزر وحساسية كاشف (كسب) لكل عينة. لتلخيص الشكلمن الأنسجة، وتنتقل عن طريق الضوء صورة يمكن اتخاذها بالإضافة إلى صورة الفلورسنت. - خذ مداخن Z من الصور. أثناء فحص سريع متواصل، تحريك الطائرة التنسيق مع محرك تركيز المجهر وتعيين موضع البداية ونهاية الموقف. يتم ضبط عدد من شرائح والمسافة الفاصلة بين شرائح وفقا لذلك.
- تحديد سرعة المسح الضوئي، وطريقة المسح الضوئي، ووضع المسح الضوئي ثنائي الاتجاه.
- "ابدأ بمسح حقيقية" للالحصول على الصور.
- حفظ الصورة مع تنسيق البرامج المرفقة.
ملاحظة: ملفات الصور الأصلية تحتوي على معلومات من المعلمات الحصول على الصور والمقاييس. صور المصدرة يمكن معالجتها باستخدام برامج معالجة الصور على الكمبيوتر 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كنا البروتوكولات المذكورة أعلاه لتصور أجهزة الستيرويدي المنشأ والأجهزة التفاعلية في D. اليرقات البطن والكبار الإناث. يتم عرض الخطة الشاملة للبروتوكولات في الشكل 1.
وRG، بما في ذلك PG (الشكل 2D)، هي أصغر حجما وأكثر شفافية من الدماغ، ويقع في الجانب الأمامي الظهري من الدماغ (الشكل 2A-C و3A-E). لتسمية الخلايا PG، عدة مجموعات قد ولدت أنواع مختلفة من الأجسام المضادة ضد الإنزيمات ecdysteroidogenic (أي نيفرلاند 23، Spookier 24، الكفن 20، فانتوم 25، جسد 25 عاما، والظل 26). من بينها، ويستخدم لمكافحة الكفن (SRO) الأجسام المضادة موثوق لتسمية PG بواسطة المناعية (الشكل 2C، 2E، و3C). بدلا من ذلك، binarذ الجين نظام التعبير، GAL4 / UAS النظام 27، ويمكن استخدامها للتعبير عن الجينات بروتين فلوري في الخلايا PG. من خلال تحليل المروج الوهمية الجينات ecdysteroidogenic (حركة صحة الشعوب)، ويمكن المروج-PG محددة تحفز التعبير الجيني حصرا في PG 28. لذلك، فإن الخلايا PG يمكن تصور تحديدا بالإعراب عن GFP أو طلب تقديم العروض تحت سيطرة حركة صحة الشعوب-GAL4 رقم 22 (الشكل 3D).
لتصور اتصال الخلايا العصبية بين PG والدماغ، وهي مجموعة من الخلايا العصبية يمكن أن توصف مع mCD8 :: GFP تحت سيطرة العديد من السائقين والأجسام المضادة GAL4 (الشكل 2C، 2E، 3D، و3E). تم تحسين قاعدة البيانات FlyLight المجموعات خط GAL4 لالخلايا العصبية وسم 29. من بينها، GMR45C06-GAL4 تسميات PG-إسقاط الخلايا العصبية (الشكل 2C وE). ايمmunostaining من GFP -expressing اليرقات مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP فعال في تعزيز الإشارات GFP. وعلاوة على ذلك، TRH-GAL4> mCD8 :: GFP اليرقات تظهر الجهاز العصبي فموي، التي مشروع الخلايا العصبية السيروتونين ليس فقط للPG، ولكن أيضا إلى الغدية (PV، المعى الأمامي الحشرات) وعضلات البلعوم (PM) (الشكل 3D و E) 20، 30. لذلك، من المهم جدا للحفاظ على موقف RG، والدماغ، وغيرها من الأنسجة المحيطة بها خلال تشريح فيليه (الشكل 3).
في الإناث البالغات، ويؤثر ecdysteroid المبيض جوانب كثيرة من مراحل تكوين البويضات، مثل GSC انتشار، والتمايز الكيس، والنمو غرفة البيض، والاستجابة للضغط النفسي 11. كما هو الحال في PG، وتصور الانزيمات ecdysteroidogenic في المبيض أيضا مع الاجسام المضادة المحددة المذكورة أعلاه 12، 31.كحدث المصب الذي تقوم عليه ecdysteroids الفعل، وعدد من GSCs في germarium هو تركيزنا (الشكل 4). على الرغم من أن germarium هو تجميع أنواع خلايا متعددة، يتم تحديد GSCs بواسطة المناعية مع اثنين من الأجسام المضادة علامة GSC، 1B1 وD E كادهيرين 32. لتصور تعصيب من المبيض، وتشريح المبيض جنبا إلى جنب مع الدماغ، VNC، القناة الهضمية، والمحاصيل، الرحم، والمنوية (الشكل 5). وتصور الخلايا العصبية التي كتبها mCD8 :: GFP تحت سيطرة nSyb-GAL4، وهو سائق عموم العصبية (الشكل 5B و D). هي ملطخة العضلات حول المبيض والرحم والأمعاء مع phalloidin صبغ مترافق.
الشكل 1: الخطة الشاملة للبروتوكولات. طريقتين تشريح متميزة هي APPLICقادرة على اليرقات والإناث البالغين، وهذا يتوقف على الغرض من هذه التجارب. وابتكر أساليب تصاعد أيضا وفقا لشروط العينة. تثبيت، وتلطيخ، والتصوير تقنيات شائعة أساسا لجميع العينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصور PG والخلايا العصبية PG-التصميم. (A و B) ومجمع الدماغ الدائري غدة (RG) من النوع البري 3 طور مرحلي الثالثة يرقة. في (B)، وPG هو مبين من قبل الخطوط المنقطة. هيكل الخيطية بين الدماغ وRG هو القصبة الهوائية. (C - E) وتصور وتعصيب من PG مع mCD8 ::GFP مدفوعا GMR45C06-GAL4 في جمع FlyLight. وصفت الخلايا العصبية PG وGFP إيجابي مع الأجسام المضادة لمكافحة SRO (قرمزي)، والأجسام المضادة لمكافحة GFP (الخضراء) على التوالي. يتم دمج صورة الفلورسنت مع الصورة المنقولة للضوء لتحديد الخطوط العريضة للأنسجة. في (D)، ويتضح PG، المجاميع allata (CA) والمجاميع السهمي (CC). الخلايا العصبية PG-إسقاط هي أكثر وضوحا في الصورة عالية الطاقة مع 40X عدسة الهدف (الأسهم في E) من الصورة منخفضة الطاقة مع 10X عدسة الهدف (C). شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: مشاريع الجهاز العصبي فموي لPG، وPV، ل الثانية وPM. (A و B) وتشريح شرائح من النوع البري 3 طور مرحلي الثالثة يرقة. مواقف PG، الدماغ (برازيلي)، والحبل البطني العصب (VNC)، وأقراص العين (ED)، وأقراص الجناح (WD)، البلعوم العضلات (PM)، والغدية (PV) لا تزال سليمة. (C) وPG وصفت حصرا مع الأجسام المضادة لمكافحة SRO (قرمزي). (D) والمسمى PG مع turboRFP مدفوعا حركة صحة الشعوب-GAL4 رقم 22. وصفت الخلايا العصبية السيروتونين مع مكافحة 5HT الأجسام المضادة (الخضراء). وقد تصور (E) والجهاز العصبي فموي مع mCD8 :: GFP مدفوعا TRH-GAL4. تتوقع الخلايا العصبية السيروتونين إلى PG، وPM، وPV (السهام). شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملفات / ftp_upload / 55519 / 55519fig4.jpg "/>
الشكل 4: Germaria من نوع البرية الذباب تحتوي على واحد أو اثنين أو ثلاثة GSCs. (A) لمحة عامة عن الجهاز التناسلي للأنثى. يتكون المبيض من 16-20 ovarioles التي هي سلاسل من غرف البيض. وgermarium، حيث توجد GSCs، هو في طرف كل ovariole. تقع - (B D) واحد، اثنان، أو ثلاثة GSCs في كل germarium (الدوائر المنقطة البيضاء) من النوع البري الإناث. هي ملطخة GSCs مع 1B1 الأجسام المضادة (الخضراء)، التي تصف بنية كروية تسمى spectrosome (الأسهم) وهيكل هيكل الخلية غشائي المعروفة باسم fusome. وتصور حدود الخلية مع مكافحة الأجسام المضادة D-كادهيرين E (قرمزي). شريط مقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أنثى الجهاز التناسلي وهيئات التفاعلية الخاصة بهم. (A) تم تشريح المبيض (ربوتكأ)، الوتر (الوتر)، والمحاصيل (الكروم) والدماغ (برازيلي)، بطني الحبل العصبي (VNC)، والمنوية (SP) تحت المجهر. (B - D) وتصور وتعصيب من المبيض مع mCD8 :: GFP مدفوعا nSyb-GAL4. الخلايا العصبية GFP إيجابية تمتد من VNC (السهم)، وإسقاط إلى سطح المبيض (السهام). وترد المبايض عن طريق الخطوط المنقطة. كانت ملطخة العينات مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP (الخضراء) وصبغ مترافق phalloidin (قرمزي). Phalloidin الزميلة مع الأكتين الخيطية من العضلات حول المبايض (ربوتكأ) والرحم (UT). ويظهر الرسم التوضيحي في C. شريط مقياس = 200 ميكرون.rge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
درسنا الحيوي ecdysteroid وآلية تنظيمية في D. البطن، وضعت بروتوكولا للتشريح والمناعية. يتأثر توقيت الحيوي ecdysteroid بواسطة منبهات البيئية من خلال المدخلات العصبية 33، ولذلك فمن الضروري الحفاظ على تعصيب الأجهزة ecdysteroidogenic جنبا إلى جنب مع الدماغ، VNC، والأنسجة الأخرى أثناء تشريح.
كما هو موضح أعلاه، D. البطن PG يشكل RG معقدة الغدد الصماء الجهاز مع allata المجاميع (CA) والفؤاد المجاميع (CC) (الشكل 2D). في حين أن PG تنتج ecdysteroids، وCA وCC تنتج هرمونات الأحداث وهرمون محرك للشحم، على التوالي. وكان هذا العقار التشريحية عائقا أمام الباحثين الذين يدرسون ecdysteroidogenesis في D. البطن، بالمقارنة مع غيرها من الحشرات. ومع ذلك، في العقود الماضية، ويطير الوراثة هكتارالصورة سمح لنا بالتعرف على العديد من الجينات ecdysteroidogenic التي يتم التعبير عنها على وجه التحديد في PG 4. يتم التعبير عن هذه الجينات أيضا في الخلايا الممرضة أو خلايا بصيلات من المبيض 34 و 35. الآن يمكن للمرء استخدام مجموعة فريدة من ملامح التعبير الجيني في أجهزة ecdysteroidogenic، مما يجعل من الممكن لتحديد الخلايا المناعية التي ecdysteroidogenic والتقنيات المعدلة وراثيا.
أثناء تشريح، فمن الضروري استخدام ملقط غرامة مع حواف حادة. قبل التشريح، وحواف ملقط يمكن شحذ مع طحن الحجر أركنساس لجعل حواف معا دون أي ثغرات. أثناء تشريح، والحطام أو الأنسجة المتبقية، مثل الدهون في الجسم، والأمعاء، وأقراص تخيلي، يجب إزالة أكبر قدر ممكن. على وجه الخصوص، قطعة من الدهون في الجسم عصا بسهولة إلى الأنسجة من الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك، تصاعد من العينات على الشرائح الزجاجية وينبغي أيضا أن أداءإد بعناية. قد يكون مشوش مجمع الأنسجة عندما يتم وضع زلة غطاء على عينات في وسط تصاعد لزجة. لذلك، لا بد من تشريح عدد كاف من العينات، ويجب أن يتم اختيار عينات مناسبة للتصوير، مثل تلك التي في RG أو المبيض على الجانب العلوي وتبقى الوصلات العصبية سليمة.
لأداء المناعية ناجحة والحصول على نتائج يمكن استنساخه، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على نفس الشروط للإجراءات أخذ العينات والتعامل معها. مدى المناعية يعتمد إلى حد كبير على حالة الحيوانات الفردية في وقت أخذ العينات وتثبيت. على سبيل المثال، عمر الحيوانات، ودرجات الحرارة تربية، حالة المغذيات، والوقت تشريح ينبغي النظر بعناية. للحد من أخطاء التعامل مع التثبيت في تجارب متعددة، ونحافظ بعناية عدد متساو تقريبا من العينات لتنسيق الوقت تشريح وأوقات رد الفعل التثبيت. لتثبيت الصورة olution، يتم استخدام 4٪ امتصاص العرق أو 3.7٪ الفورمالديهايد. لأن المتدهورة امتصاص العرق بسرعة مع مرور الوقت، ومسحوق لها عادة حل لجعل 10٪ محلول المخزون في برنامج تلفزيوني، ويتم تخزينها aliquots في -20 ° C. في أجزاء مأخوذة هي غير المجمدة لجعل الطازجة 4٪ حل الإصلاح قبل كل تشريح. وعلاوة على ذلك، فإن الخطوات يغسل واسعة من عينات تقلل من تلوين الخلفية غير محددة.
في خطوة من الحصول على الصور، ونحن نتابع بروتوكول الشركة المصنعة للفحص المجهري متحد البؤر. ويوفر نظام المجهر واجهة سهلة الاستخدام للباحثين والطلاب، بحيث مجموعات المثلى من الإثارة مرشحات / الانبعاثات ويتم اختيار تلقائيا عندما يتم تحديد أنواع fluorophore. في حين أن نظام المجهر هو سهل الاستخدام، ويحتاج المرء لتحسين معايير الحصول على الصور على كل عينة أو كل البؤري، عن طريق تغيير كسب كاشف، سرعة المسح الضوئي، وأرقام المسح الضوئي، وحجم الثقب.
"jove_content"> واحدة من القيود المفروضة على هذه التقنية هو أن المناعية إلى حد كبير يعتمد على نوعية الأجسام المضادة. بينما الأجسام المضادة ضد Noppera بو، نيفرلاند، والكفن تم إنشاؤها بنجاح، فشلنا في توليد العديد من الأجسام المضادة ضد غيرها من المنتجات الجينات ecdysteroidogenic، مثل يجا مجلس 36. للتغلب على هذه المشكلة يمكن تطبيق هذه التقنية الضربة القاضية في لإدراج HA-العلامة في مكان الجين مجلس يجا باستخدام كريسبر / نظام Cas9. باستخدام هذه التقنيات المعدلة وراثيا في تركيبة مع المناعية، على الأقل 3-4 البروتينات يمكن تصور في وقت واحد في PG أو المبيض. وعلى النقيض من توطين البروتين، ومع ذلك، وهي طريقة لتصور ecdysteroids الذاتية التي لم يثبت المناعية. مرة واحدة هو الضد مكافحة ecdysteroid متاحة للالمناعية، وتعريب التحت خلوية من الحيوي ecdysteroid ونقل ecdysteroid يمكن التحقيق في المستقبل. الحد الآخر هو أن ديناميات الزمنية من ecdysteroidogenesis لا يمكن فحصها في الأنسجة الثابتة. وبالنظر إلى أن عيار ecdysteroid وتقلبت على طول مراحل النمو، ونشاط أجهزة ecdysteroidogenic والخلايا العصبية إسقاط ينبغي تنظيم زمنيا استجابة لمختلف المحفزات البيئية. رصدت دراسة حديثة كا 2+ ديناميات الخلايا PG باستخدام تقنيات التصوير الحي 37. وبالنسبة للتطبيقات المستقبلية، نحن حاليا على وضع بروتوكول للتصوير المباشر لPG أو المبايض مثقف جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية إسقاط بهم. فيما يتعلق بأساليب القائمة، ويهدف هذا البروتوكول الجديد لتصور نشاط الخلايا العصبية والأجهزة المستهدفة في وقت واحد. مرة واحدة يمكن مراقبة نشاط الخلايا العصبية مع الكالسيوم 2+ مؤشر GCaMP أو CAMELEON 38، ويمكن التلاعب بها مع النهج علم البصريات الوراثي أو توليد الحرارة في الوقت المناسبق 39. وتساهم هذه الأساليب لفهم شامل من الستيرويد هرمون الحيوي وآلية تنظيمية العصبية لها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يعلن عن تضارب المصالح.
Acknowledgments
نشكر ريكو كايس وTomotsune Ameku حصول على الدعم الفني من أجل هذا العمل. ونحن ممتنون أيضا للكي إيتو، أولغا أليكسينكو، أكيكو كوتو، ماسايوكي ميورا، مركز الأوراق المالية بلومينغتون ذبابة الفاكهة، مركز اسهم كيوتو (DGRC)، وبنك دراسات الإنمائية هجين للأسهم والكواشف. وأيد هذا العمل عن طريق منح ل YSN من JSPS KAKENHI غرانت عدد 16K20945، ومؤسسة نايتو، وجائزة البحث العلمي اينو. ومنحة لRN من MEXT KAKENHI غرانت عدد 16H04792.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
