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Developmental Biology

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55519
* These authors contributed equally

Summary

Se describe un protocolo para la disección, la fijación y la inmunotinción de órganos androgénica en Drosophila larvas y adultos hembras para estudiar la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. Además de los órganos androgénica, visualizamos la inervación de los órganos androgénica, así como células diana androgénica, tales como las células madre de línea germinal.

Abstract

En los organismos multicelulares, un pequeño grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica, la inducción de una respuesta sistémica a crecimiento y reproducción. En los insectos, la glándula larval prothoracic (PG) y las hembras adultas de juego ovario papeles esenciales en la biosíntesis de los principales hormonas esteroides llamados ecdysteroids. Estos órganos ecdysteroidogenic están inervados desde el sistema nervioso, a través del cual la temporización de la biosíntesis se ve afectada por las señales ambientales. Aquí se describe un protocolo para la visualización de órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos en larvas y adultos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, que proporciona un sistema modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. disección hábil nos permite mantener las posiciones de los órganos ecdysteroidogenic y sus órganos interactivos, incluyendo el cerebro, el cordón nervioso ventral, y otros tejidos. La inmunotinción con unantibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, junto con las proteínas de fluorescencia transgénicos conducidos por promotores específicos de tejido, están disponibles para marcar las células ecdysteroidogenic. Por otra parte, la inervación de los órganos ecdysteroidogenic también pueden marcarse por anticuerpos específicos o una colección de controladores de GAL4 en diversos tipos de neuronas. Por lo tanto, los órganos ecdysteroidogenic y sus conexiones neuronales pueden ser visualizadas simultáneamente por inmunotinción y técnicas transgénicas. Por último, se describe cómo visualizar las células madre de línea germinal, cuya proliferación y mantenimiento son controlados por ecdysteroids. Este método contribuye a la comprensión global de la biosíntesis de la hormona esteroide y su mecanismo de regulación neuronal.

Introduction

En los organismos multicelulares, un grupo de células está dotado de una función especializada en su actividad biogénica que es esencial para todo el cuerpo. Para cumplir su cometido, cada tejido u órgano expresa una serie de genes relacionados con sus funciones y se comunica con otros tejidos para orquestar sus actividades en el contexto del desarrollo. Para caracterizar este tipo de funciones celulares especializadas y las interacciones entre órganos, tenemos que especificar un grupo de células junto con otros tipos de células que se mantienen intactos en la arquitectura multicelular.

Un ejemplo de tales órganos especializados es un órgano steroidogenic, donde muchos enzimas biosintéticas median los pasos de conversión de colesterol a las hormonas esteroides activos 1. La mayoría de estos genes de enzimas se expresan específicamente en órganos esteroidogénicas, y la ruta de biosíntesis está estrechamente regulada por muchos estímulos externos a través de entradas humorales y entradas neuronales. Una vezsintetizados, las hormonas esteroides se secretan en la hemolinfa y se dirigen a muchos tejidos y órganos para la regulación de la expresión de una variedad de genes 2. Por lo tanto, la acción de una hormona esteroide induce una respuesta sistémica a mantener la homeostasis, el crecimiento y la reproducción.

Para investigar las funciones de la biosíntesis de la hormona esteroide y las acciones pleiotrópicos de las hormonas esteroides, Drosophila melanogaster se puede utilizar como un sistema modelo adecuado. Durante las etapas larvales, la hormona esteroide insecto, ecdiesteroide, se biosintetiza en un órgano endocrino especializada llamada la glándula prothoracic (PG) 3. En el PG, varias enzimas ecdysteroidogenic catalizan específicamente los múltiples pasos de conversión de colesterol a ecdisona, que controla la muda y la metamorfosis en las etapas de desarrollo apropiadas 4. Por lo tanto, se regula un cambio dinámico en el título de ecdiesteroidepor muchas vías de señalización en respuesta a señales ambientales. Por otra parte, en la etapa adulta, ecdiesteroide desempeña papeles esenciales en la fisiología, incluyendo la reproducción, el sueño, la memoria, y la vida útil 5, 6, 7, 8. Se sabe que ecdiesteroide se biosintetiza activamente en el ovario, la regulación de la progresión de la ovogénesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recientemente hemos informado de que el número de células madre de línea germinal (GSCS) se ve afectada por la señalización de péptido ecdiesteroide y sexo en respuesta a los estímulos de acoplamiento 12.

Las potentes herramientas de D. melanogaster genética y la biología celular, incluyendo información sobre el genoma bien anotado, gen binariosistemas de expresión, y técnicas de ARNi transgénicos, nos han permitido identificar genes esenciales para la biosíntesis de ecdisteroide en el PG y el ovario 13, 14, 15. Una vez identificados los genes ecdysteroidogenic, la regulación transcripcional de estos genes y las localizaciones dinámicas de productos génicos puede ser examinado en la ruta de biosíntesis 16. Para este propósito, la transcripción-PCR cuantitativa en inversa, ARN hibridación in situ, y el análisis inmunohistoquímico se llevan a cabo. La aplicación de estas técnicas incluye una tarea difícil; la elaborada disección de la PG o el ovario. En particular, la PG de la mosca de la fruta es relativamente menor que la de otros insectos (por ejemplo, el gusano de seda y la mosca de golpe), por lo que uno tiene que practicar la habilidad vital de mosca de la fruta de disección para el muestreo. Además, ambos órganos reciben inervación ecdysteroidogenics desde el sistema nervioso central (CNS) 17, 18, 19, 20. Por lo tanto, para los análisis anatómicos precisos, los órganos ecdysteroidogenic deben mantenerse intacta junto con el sistema nervioso central y otros órganos, para no interrumpir sus conexiones neuronales.

Aquí nos proporcionan protocolos para la disección y la visualización de los órganos androgénica en D. melanogaster. El aprendizaje de la técnica de disección es el punto de partida clave para estos experimentos. Además, se puede etiquetar con éxito los órganos esteroidogénicas, así como sus órganos interactivos con varios anticuerpos y líneas Gal4 conductor. Tomando ventaja de estas técnicas, materiales, y la genética, se puede estudiar los mecanismos integrales de la biosíntesis de la hormona esteroide.

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Protocol

NOTA: El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1.

1. La disección de la larval anillo prensaestopas (RG)

NOTA: En D. melanogaster, que pertenece a Diptera cyclorrhaphous, el PG está dentro de un órgano endocrino compuesto llama la glándula anillo (RG, la Figura 2D). Puesto que es inviable que el PG se separa quirúrgicamente de otros tipos de células (discutidos más adelante), un objetivo práctico es aislar un RG intacto, sin daños por disección.

  1. Preparación de larvas en las etapas de desarrollo apropiadas
    NOTA: Para sincronizar las etapas de desarrollo de las larvas de D. melanogaster, es necesario recoger los huevos dentro de una estrecha ventana de tiempo y para recoger las larvas en los momentos adecuados.
    1. Recoger los huevos durante 2 h en una placa de agar de zumo de uva a 25 ° C.
    2. Recoger recién eclosionadas 1 NOTA: La edad de las larvas está representado por "horas después de la puesta de huevos (hael)", "horas después de la eclosión (HAH)", o "L3 horas después de la ecdisis (hAL3E)".
    3. En el punto de tiempo apropiado, recoger las larvas por etapas con un bucle de plástico desechable para evitar lesiones indeseable. Para minimizar una diferencia en la progresión del desarrollo de las larvas instar 3 rd, recoger las larvas instar 2 nd a 70 Hael (48 HAH) y permitir que se mudan en intervalos de 2 h. Después, recoger las larvas instar 3 rd dentro de 2 h después de la ecdisis L3; Este procedimiento da 0-2 larvas hAL3E.
    4. Transferencia de las larvas por etapas para un plato lleno de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    5. Enjuagar las larvas con PBS para eliminar la comida residual del cuerpo.
  2. Disección grueso de las larvas bajo unamicroscopio de disección
    1. Mantenga el gancho de la boca de una larva con unas pinzas. Cortar el cuerpo de la larva en la parte anterior de un tercio de la longitud del cuerpo utilizando micro tijeras.
    2. Mantenga el extremo cortado del cuerpo de la larva anterior con un par de fórceps. Usando el otro par de pinzas, empuje suavemente la punta de la cabeza hacia el interior del cuerpo; este procedimiento convierte el cuerpo de la larva de adentro hacia afuera.
      NOTA: Este paso se puede omitir para la disección de 1 st estadio las larvas.
    3. Repita pasos 1.2.1-1.2.2 con larvas adicional durante 5-10 min.
      NOTA: El número de larvas debe ser igual o inferior a 20 para ahorrar tiempo para la disección.
  3. Disección filete de larvas
    NOTA: Este método permite mantener la posición de los tejidos permanezca intacto.
    1. Deja larvas en el agua sólo durante 1 h. Las larvas son inmovilizado debido a la asfixia.
    2. Ponga un lado larva dorsal en una gota de PBS en un recubrimiento de silicio-plato, con el lado dorsal hacia arriba.
      NOTA: El lado dorsal tiene 2 tubos traqueales que discurre longitudinalmente.
    3. Bajo un microscopio de disección, inserte una clavija de insecto en la punta anterior de la larva usando fórceps. Estirar el cuerpo de las larvas en el lado posterior y poner un segundo pasador en la punta posterior de la larva.
      NOTA: Además de pasadores de insectos, una aguja hecho de un alambre de tungsteno puede ser útil 21. Una aguja puede ser embebido en una punta de pipeta a través del calentamiento para su uso como una aguja de disección.
    4. Bajo un microscopio de disección, hacer una pequeña incisión cerca de la cola con micro tijeras. A partir de la incisión, corte la cutícula dorsal longitudinalmente a lo largo de la línea media dorsal hacia la cabeza. Tenga cuidado de no dañar los tejidos debajo de la cutícula.
    5. Estirar la cutícula bodywall en cada lado y colocar 4 pines en cada esquina de la bodywall diseccionado.
    6. Quitar una parte de la grasa corporal anterior con pinzas, para exponer el cerebro-RG complex ser expuesto en la superficie. Retirar un par de glándulas salivales, si es necesario.
  4. La fijación y tinción de tejido con inmunohistoquímica
    1. Poner el tercio anterior de los cuerpos de larvas (paso 1.2.2) en un microtubo de 1,5 ml lleno con 500! L de la solución de arreglo (4% de paraformaldehído en PBS). Fijar menos de 20 muestras a la vez, de lo contrario PBS asociadas a las muestras fijadas puede causar una dilución desfavorable del fijador. Para disección filete, eliminar una gota de PBS y a continuación, añadir una gota de solución de arreglo.
      NOTA: Para solución de arreglo, ya sea 3.7% de formaldehído o paraformaldehído al 4% pueden ser usados.
    2. Incubar los tejidos disecados en la solución de corrección para 30 min a temperatura ambiente (RT) o, alternativamente, durante 2 horas a 4 ° C.
    3. Reemplazar la solución de arreglo con 500 l de PBS y enjuague rápidamente las muestras 3 veces. Lavar las muestras con 500 l 0,3% PBT (PBS + 0,3% de etoxilato de octilfenol) durante 15 min en un agitador a RT. Para disección filete, quitar los pasadores de insectos y la transferencia de las muestras en un microtubo ml 1.5.
      NOTA: Para aumentar la permeabilidad de los anticuerpos en los tejidos, las muestras se tratan con 500 l 2,0% PBT durante 1-2 h en un agitador a temperatura ambiente.
    4. Reemplazar PBT con 500! L de solución (2% de albúmina de suero bovino en PBT) de bloqueo. Se incuban las muestras durante 1,5 h en un agitador a temperatura ambiente.
    5. Reemplazar la solución de bloqueo con 50! L de la solución de anticuerpo primario, es decir, anticuerpos diluidos en la solución de bloqueo.
    6. Se incuban las muestras durante la noche en un agitador a 4 ° C.
    7. Reemplazar la solución de anticuerpo primario con 500 l 0,3% PBT y enjuague rápidamente las muestras 5 veces. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,3% PBT durante 15 min cada uno en un eje de balancín a TA.
    8. Reemplazar 0,3% PBT con 50! L de la solución de anticuerpo secundario (anticuerpos de tinte conjugado diluido en la solución de bloqueo). Para la tinción nuclear, 0,5 l de 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, / ml de solución madre 0,1 mg) se añade a 50 solución l. Se incuban las muestras en un agitador durante 2 horas a RT o, alternativamente, a 4 ° C durante la noche.
      NOTA: Mantener las muestras en la oscuridad.
    9. Reemplazar la solución de anticuerpos con 500 l 0,3% PBT y enjuagar 5 veces. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,3% PBT durante 15 min cada uno a TA.
  5. Disección Fine del complejo cerebro-RG contiene el PG y el montaje
    1. Usar una pipeta desechable para transferir las muestras inmunoteñidas a un plato lleno de 0,3% PBT.
      NOTA: Para evitar burbujas de inconvenientes durante la disección y de montaje, 0,3% PBT se puede reemplazar con PBS.
    2. Bajo un microscopio de disección, mantenga la cutícula o la boca gancho con un par de pinzas. Usando una aguja de 27 G unida a una jeringa de 1 ml como un "cuchillo", cortar la punta anterior de los discos de esófago y del ojo para eliminar el complejo disco-RG-ojo cerebro de la cutícula cuerpo.
    3. SEPAcalificar el esófago y el intestino del complejo disco-RG-ojo cerebro con fórceps. Desde el esófago pasa a través del cerebro por encima del cordón nervioso ventral (VNC), extraiga el intestino para el lado posterior.
      NOTA: Para quitar los discos imaginales adicionales de las muestras, cortar las conexiones entre el cerebro, ojo discos y discos de la pierna con un cuchillo de aguja.
    4. Repita los pasos 1.5.1-1.5.4 para otras muestras.
      NOTA: Para evitar restos de tejido se pegue a las muestras, transferir cada muestra completado a un plato limpio diferente lleno de 0,3% PBT o PBS.
    5. Transferir las muestras al centro de un portaobjetos de vidrio limpio con una micropipeta.
      NOTA: Para 2 nd o 3 rd larvas instar, al final de una punta de la micropipeta debe estar truncado con una hoja de afeitar.
    6. Bajo un microscopio de disección, alinee las muestras individuales con su lado dorsal hacia arriba mediante el uso de fórceps.
      NOTA: El RG está situado en el lado dorsal del cerebro (Figura 2A). Esta alineación facilita la especificación de muestras individuales durante la exploración.
    7. Incline un portaobjetos de vidrio y limpie tanto el exceso de PBT como sea posible. Ponga una gota de reactivo de montaje en un lado de la corredera. Coloque el borde de una hoja de la cubierta desde el otro lado de la gota y poner la hoja de la cubierta en las muestras lentamente con unas pinzas.
      NOTA: Este procedimiento impide que las muestras se mueva fuera de la hoja de la cubierta.
    8. Almacenar las muestras a 4 ° C. Mantener las muestras en la oscuridad.

2. La disección del ovario en Las hembras adultas

  1. Preparación de las hembras adultas
    1. Alimentación moscas hembra con comida estándar elevado de levadura / harina de maíz durante 3-4 días para engordar el ovario. Mantener a 25 ° C.
  2. La disección de los ovarios de mujeres adultas
    1. Anestesiar hembra vuela con CO 2 gas y cortó sus cabezas.
    2. Transferencia cuerpos volar a un plato de 3 cmlleno de PBS.
    3. Bajo un microscopio de disección, mantenga el tórax en el lado dorsal con unas pinzas. Agarre la A5 segmento abdominal o A6 con las otras pinzas y retire la cutícula abdominal hacia el lado posterior. Limpiar la cutícula pegajosa de la punta de las pinzas.
    4. Pellizcar un oviducto y sacar el ovario del cuerpo.
    5. Peinar y separar las puntas del ovario con fórceps.
      Nota: Esta operación mejora la eficiencia de la inmunotinción.
  3. La disección del cerebro femenino adulto, VNC y órganos reproductores.
    NOTA: Este método permite que la inervación del ovario que se mantiene intacta.
    1. Anestesiar hembra vuela con CO 2 gas y transferirlos a un plato de silicio recubierto lleno de PBS.
    2. Bajo un microscopio de disección, mantenga la trompa y retire la cutícula cabeza para exponer el cerebro con unas pinzas. Retire la tráquea conectado al cerebro.
      NOTA: El Brain es una estructura blanco y redondeado. El cerebro se conecta a la VNC en el tórax.
    3. Mantenga el tórax en el lado dorsal y cortar las patas y las alas con un par de fórceps. Usando el otro par de pinzas, retire la cutícula tórax ventral desde las bases de las patas. Una vez que el VNC se expone, eliminar la cutícula dorsal residual y los músculos correspondientes a las utilizando fórceps VNC. Tenga cuidado de no dañar la conexión entre el cerebro y el VNC.
    4. El uso de fórceps para despegar la cutícula abdominal y exponer el ovario y sus órganos interactivos, incluyendo las neuronas, la cosecha, el intestino, el oviducto, útero y la glándula accessary.
    5. Eliminar los tejidos residuales incluyendo la tráquea y la grasa corporal usando fórceps.
  4. La fijación y tinción de tejido con inmunohistoquímica
    1. Transferir aproximadamente 8-10 pares de los ovarios a un microtubo de 1,5 ml lleno con 250! L de la solución de arreglo (4% paraformaldehyde en PBS) e incubar las muestras durante 30 min a TA.
    2. Reemplazar la solución de arreglo con 500 l de PBS y enjuague rápidamente las muestras 3 veces.
    3. Se lavan las muestras 2 veces con 500! L 0,1% PBT durante 5 min cada uno a TA.
    4. Reemplazar PBT con 50! L de solución de bloqueo. Se incuban las muestras durante 1 h en un agitador a temperatura ambiente.
    5. Reemplazar la solución de bloqueo con 50! L de la solución de anticuerpo primario.
    6. Se incuban las muestras durante la noche en un agitador a 4 ° C.
    7. Reemplazar la solución de anticuerpo primario con 500 l 0,1% PBT. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,1% PBT durante 15 min cada uno en un eje de balancín a TA.
    8. Reemplazar 0,1% PBT con una solución de anticuerpo secundario 50 l. Para la tinción nuclear, añadir 0,5! L de DAPI 50! L de la solución. Se incuban las muestras durante 2 h en un agitador a temperatura ambiente.
    9. Reemplazar la solución de anticuerpo secundario con 500 l 0,1% PBT. Se lavan las muestras 3 veces con 500! L 0,1% PBT durante 15 min cada uno en un eje de balancín a TA.
      NOTA: El procedimiento de lavado se puede hacer a 4 ° C durante la noche. Mantener las muestras en la oscuridad.
  5. El montaje de las muestras en portaobjetos de vidrio
    1. Transferir las muestras a un portaobjetos de vidrio con 0,1% PBT utilizando una micropipeta.
      NOTA: Para evitar burbujas de inconvenientes durante la disección y de montaje, 0,1% PBT se puede reemplazar con PBS.
    2. Para el ovario, se separan las cadenas de los ovarioles una de la otra con unas pinzas bajo un microscopio de disección. No dañar las puntas de los ovariolas que contienen los germaria. Para el complejo órgano cerebro-VNC-reproductiva, eliminar la cutícula residual y organizar la posición sobre un portaobjetos de vidrio.
    3. Limpiar tanto el exceso de PBT como sea posible y poner una gota de reactivo de montaje en el centro de las muestras. Colocar una hoja de la cubierta lentamente utilizando fórceps.
    4. Almacenar las muestras a 4 ° C. Mantener las muestras en la oscuridad.
"> 3. Imaging con un microscopio confocal de barrido láser

  1. Observar las muestras bajo el microscopio y llevar a los órganos androgénica en el campo de visión. Una vez que la vista se fija, cambiar el sistema de imágenes en el modo de adquisición de imágenes.
    NOTA: Los 10-20x lentes del objetivo se utilizan para obtener las imágenes del complejo cerebro-RG o todo el ovario. Alternativamente, los 40-63X lentes de objetivo (agua o inmersión en aceite) se utilizan para la visualización de la localización subcelular de las proteínas en GSCs o las inervaciones neuronales del PG y el ovario.
  2. Configurar los parámetros de adquisición de imágenes en el software adjunto. Seleccione la combinación de la fluorescencia (por ejemplo, GFP y RFP). Por procedimiento de escaneo rápido, ajustar la potencia del láser, la sensibilidad de los detectores (Ganancia / Offset), y el tamaño del agujero de alfiler.
    NOTA: Para obtener imágenes de alta calidad, la potencia del láser de barrido y la sensibilidad del detector (Ganancia) deben optimizarse para cada muestra. Para delinear la formade los tejidos, a-luz transmitida imagen puede tomarse además de una imagen fluorescente.
  3. Tome pilas Z de las imágenes. Durante una exploración rápida continua, mover el plano focal con el mando de enfoque del microscopio y establecer la posición inicial y la posición final. El número de rebanadas y la distancia de intervalo entre las rebanadas se ajustan en consecuencia.
  4. Seleccione la velocidad de exploración, el método de exploración, y el modo de exploración bidireccional.
  5. "Comenzar las exploraciones reales" para la adquisición de imágenes.
  6. Guarda la imagen con el formato del software adjunto.
    NOTA: Los archivos de imagen originales contienen la información de los parámetros de adquisición de imágenes y escalas. Imágenes exportadas pueden procesarse utilizando un software de procesamiento de imágenes en el ordenador 22.

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Representative Results

Se utilizaron los protocolos anteriores para visualizar los órganos androgénica y sus órganos interactivos en D. melanogaster larvas y adultos hembras. El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1.

El RG, incluyendo el PG (Figura 2D), es más pequeño y más transparente que el cerebro y se encuentra en el lado anterior-dorsal del cerebro (Figura 2A-C y 3A-E). Para etiquetar las células PG, varios grupos han generado varios tipos de anticuerpos contra enzimas ecdysteroidogenic (es decir, Neverland 23, fantasmagóricos 24, la cubierta 20, Phantom 25, Disembodied 25, y la sombra 26). Entre ellos, anti-Cubierta (Sro) anticuerpo se usa de forma fiable para etiquetar el PG por inmunotinción (Figura 2C, 2E, y 3C). Alternativamente, el binarsistema de expresión génica y, GAL4 sistema / UAS 27, se puede utilizar para expresar genes de proteínas fluorescentes en células PG. A través del análisis promotor del gen fantasma ecdysteroidogenic (phm), el promotor-PG específica puede inducir la expresión génica exclusivamente en el PG 28. Por lo tanto, las células PG se pueden visualizar específicamente mediante la expresión de GFP o RFP bajo el control de phm-GAL4 # 22 (Figura 3D).

Para visualizar la conexión neuronal entre el PG y el cerebro, un grupo de neuronas puede marcarse con mCD8 :: GFP bajo el control de diversos controladores y anticuerpos GAL4 (Figura 2C, 2E, 3D y 3E). La base de datos FlyLight de las colecciones de la línea de GAL4 está optimizado para las neuronas de etiquetado 29. Entre ellos, GMR45C06-GAL4 etiquetas de las neuronas (Figura 2C y E) PG-proyección. el immunostaining de larvas que expresan GFP con anticuerpo anti-GFP es eficaz en la mejora de las señales de GFP. Por otra parte, GAL4-TRH> mCD8 :: GFP larvas muestran el sistema nervioso stomatogastric, en el que las neuronas serotoninérgicas del proyecto, no sólo para el PG, sino también para el proventrículo (PV, intestino anterior insectos) y los músculos de la faringe (PM) (Figura 3D y E) 20, 30. Por lo tanto, es crítico para mantener la posición de la RG, el cerebro, y los otros tejidos circundantes durante las disecciones de filete (Figura 3).

En las hembras adultas, ecdiesteroide de ovario afecta a muchos aspectos de la ovogénesis, como la proliferación GSC, diferenciación quiste, el crecimiento cámara de huevos, y la respuesta al estrés 11. Como en el PG, enzimas ecdysteroidogenic en el ovario también se visualizan con los anticuerpos específicos descritos anteriormente 12, 31.Como un evento aguas abajo sobre la cual ecdysteroids acto, el número de GSCs en la germarium es nuestro enfoque (Figura 4). Aunque el germarium es un conjunto de múltiples tipos de células, GSCs se especifican por inmunotinción con dos anticuerpos marcadores SGC, 1B1 y D E-cadherina 32. Para visualizar la inervación del ovario, el ovario se disecciona a lo largo con el cerebro, VNC, intestino, cultivo, el útero y espermateca (Figura 5). Las neuronas se visualizaron por mCD8 :: GFP bajo el control de nSyb-GAL4, un conductor de pan-neuronal (Figura 5B y D). Los músculos de todo el ovario, útero, intestino y se tiñeron con faloidina conjugada con tinte.

Figura 1
Figura 1: El esquema general de protocolos. Dos métodos de disección distintas son appliccapaz de larvas y hembras adultas, dependiendo de la finalidad de los experimentos. Los métodos de montaje también se conciben de acuerdo con condiciones de la muestra. Fijación, tinción y técnicas de imagen son básicamente comunes a todas las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Visualización de la PG y las neuronas PG-salientes. (A y B) El complejo glándula tórica cerebro (RG) de la de tipo salvaje 3 rd larva instar. En (B), el PG se describe por líneas de puntos. La estructura filamentosa entre el cerebro y el RG es la tráquea. (C - E) La inervación de la PG se visualizó con mCD8 ::GFP impulsado por GMR45C06-GAL4 en la recopilación de FlyLight. Las neuronas PG y GFP-positivas se marcaron con anticuerpo anti-Sro (magenta) y el anticuerpo anti-GFP (verde), respectivamente. La imagen fluorescente se fusiona la imagen de luz transmitida con especificar el contorno de los tejidos. En (D), el PG, el corpora allata (CA) y la corpora cardiaca (CC) se ilustran. Las neuronas PG-salientes son más prominentes imagen de alta potencia con 40X lente objetivo (flechas en E) la imagen de baja potencia con 10X lente objetivo (C) que. Barra de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Los stomatogastric Proyectos sistema nervioso para el PG, el PV, una nd la PM. (A y B) La disección filete de una de tipo salvaje 3 rd larva instar. Las posiciones de la PG, cerebro (Br), cordón nervioso ventral (VNC), ojo discos (ED), los discos de ala (WD), faríngea muscular (PM), y proventrículo (PV) permanecen intactos. (C) El PG se marcó exclusivamente con el anticuerpo anti-Sro (magenta). (D) El PG se marcó con turboRFP impulsado por phm-GAL4 # 22. las neuronas serotoninérgicas se marcaron con anti-5HT anticuerpo (verde). (E) El sistema nervioso stomatogastric se visualizó con mCD8 :: GFP impulsado por TRH-GAL4. las neuronas serotoninérgicas se proyectan hacia el PG, el PM y el PV (flechas). La barra de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: El germaria de las moscas de tipo salvaje que contiene uno, dos, o tres GSCs. (A) Una visión general del órgano reproductor femenino. Un ovario se compone de 16-20 ovariolas que son cadenas de cámaras de huevos. El germarium, donde se encuentran GSCs, está en la punta de cada ovariole. (B - d) uno, dos, o tres GSCs se encuentran en cada germarium (círculos punteados blancas) de las hembras de tipo salvaje. GSCs se tiñen con anticuerpo 1B1 (verde), que las etiquetas de una estructura esférica llamado los spectrosome (flechas) y una estructura del citoesqueleto membranosa conocida como la fusome. Los límites de las celdas se visualizaron con anticuerpo D E-cadherina anti- (magenta). La barra de escala = 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: La hembra órganos reproductivos y sus órganos interactivos. (A) El ovario (Ov), gut (intestino), cultivo (Cr), cerebro (Br), cordón nervioso ventral (VNC), y espermateca (Sp) se diseccionaron bajo el microscopio. (B - D) La inervación del ovario se visualizó con mCD8 :: GFP impulsado por nSyb-GAL4. neuronas positivas para GFP se extienden desde el VNC (flecha), que sobresale a la superficie de los ovarios (puntas de flecha). Los ovarios se describen por líneas de puntos. Las muestras se tiñeron con anticuerpo anti-GFP (verde) y el colorante conjugado faloidina (magenta). Faloidina se asocia con la actina filamentosa de los músculos alrededor de los ovarios (Ov) y el útero (UT). La ilustración se muestra en C. La barra de escala = 200 m.rge.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se estudió la biosíntesis ecdisteroide y su mecanismo de regulación en D. melanogaster, e ideó un protocolo para la disección y la inmunotinción. El momento de la biosíntesis de ecdiesteroide se ve afectada por las señales ambientales a través de entradas neuronales 33, por lo que es esencial para mantener la inervación de los órganos ecdysteroidogenic junto con el cerebro, VNC, y otros tejidos durante la disección.

Como se describió anteriormente, el D. melanogaster PG forma un complejo RG órgano endocrino con el allata corpora (CA) y la cardiaca corpora (CC) (Figura 2D). Mientras que el PG produce ecdysteroids, la CA y de la CC producen hormonas juveniles y la hormona adipokinetic, respectivamente. Esta propiedad anatómica ha sido un impedimento para los investigadores que estudian en ecdysteroidogenesis D. melanogaster, en comparación con otros insectos. Sin embargo, en las últimas décadas, volar genética has nos permitió identificar muchos genes ecdysteroidogenic que se expresan específicamente en el PG 4. Estos genes se expresan también en células de la enfermera o células del folículo del ovario 34, 35. Ahora se puede utilizar un único conjunto de perfiles de expresión génica en los órganos ecdysteroidogenic, por lo que es posible especificar células ecdysteroidogenic por inmunotinción y técnicas transgénicas.

Durante la disección, es imprescindible el uso de unas pinzas finas con bordes afilados. Antes de la disección, los bordes de las pinzas se pueden afilar con una piedra de afilar de Arkansas para traer los bordes juntos sin espacios. Durante la disección, los residuos o los tejidos residuales, tales como la grasa corporal, el intestino, y los discos imaginales, debe ser eliminado tanto como sea posible. En particular, piezas de la grasa corporal se adhieren fácilmente al tejido de interés. Además, el montaje de las muestras sobre portaobjetos de vidrio también se debe realizared con cuidado. Un complejo de tejidos puede ser desarreglado cuando una hoja de cubierta se coloca sobre las muestras en medio de montaje pegajosa. Por lo tanto, un número suficiente de muestras debe ser diseccionado, y las muestras adecuadas debe ser elegido para formación de imágenes, tales como aquellos en los que el RG o el ovario es en el lado superior y las conexiones neuronales se mantienen intactos.

Para llevar a cabo la inmunotinción con éxito y para obtener los resultados reproducibles, es crítico mantener las mismas condiciones para los procedimientos de muestreo y la manipulación. El grado de inmunotinción depende en gran medida de la condición de los animales individuales en el momento de muestreo y fijación. Por ejemplo, la edad de los animales, las temperaturas de crianza, el estado de nutrientes, y el tiempo de disección debe ser considerado cuidadosamente. Para minimizar los errores de manejo de fijación en múltiples experimentos, mantenemos cuidadosamente casi igual número de muestras para coordinar el tiempo de disección y los tiempos de reacción de fijación. Para la fijación solución, se utiliza paraformaldehído al 4% o 3,7% de formaldehído. Debido paraformaldehído se degrada rápidamente con el tiempo, su polvo se disuelve normalmente para hacer 10% solución madre en PBS, y se guardan partes alícuotas a -20 ° C. Las alícuotas son no congelada para hacer la solución fresca fix 4% antes de cada disección. Por otra parte, las extensas etapas de lavado de las muestras de reducir la tinción de fondo no específica.

En la operación de adquisición de imágenes, seguimos el protocolo del fabricante para la microscopía confocal. El sistema de microscopía proporciona una interfaz fácil de usar para los investigadores o estudiantes, de tal manera que los conjuntos óptimos de filtros de excitación / emisión se seleccionan automáticamente cuando se especifican los tipos de fluoróforo. Mientras que el sistema de microscopía es fácil de usar, es necesario optimizar los parámetros de adquisición de imágenes de cada muestra o cada plano focal, cambiando la ganancia del detector, velocidad de exploración, los números de exploración, y el tamaño del agujero de alfiler.

36. Para superar este problema, la técnica knock-in se puede aplicar para insertar una HA-tag en el locus del gen de la ouija utilizando el sistema de CRISPR / Cas9. Mediante el uso de tales técnicas transgénicas en combinación con inmunotinción, al menos 3-4 proteínas pueden ser visualizadas simultáneamente en el PG o el ovario. En contraste con la localización de proteínas, sin embargo, un método para visualizar ecdysteroids endógenos por no se ha establecido la inmunotinción. Una vez que el anticuerpo anti-ecdiesteroide está disponible para la inmunotinción, las localizaciones subcelulares de la biosíntesis de ecdiesteroide y el transporte de ecdiesteroide pueden ser investigados en el futuro. Otra limitación es que la dinámica temporal de ecdysteroidogenesis no pueden ser examinadas en tejidos fijados. Teniendo en cuenta que el título de ecdiesteroide se fluctuó a lo largo de las etapas de desarrollo, la actividad de los órganos ecdysteroidogenic y las neuronas de proyección debe ser regulada temporalmente en respuesta a varios estímulos ambientales. Un estudio reciente monitoreó el Ca 2+ dinámica de las células PG utilizando técnicas de imagen en directo 37. Para futuras aplicaciones, actualmente estamos desarrollando un protocolo para la obtención de imágenes en vivo de PG o los ovarios cultivadas junto con sus neuronas que se proyectan. Con respecto a los métodos existentes, este nuevo protocolo tiene como objetivo visualizar la actividad de las neuronas y los órganos destinatarios simultáneamente. Una vez que la actividad de las neuronas se puede controlar con el Ca 2 + indicador GCaMP o Cameleon 38, puede ser manipulado con enfoques optogenéticos o thermogenetic en el momento apropiados 39. Estos métodos contribuyen a una comprensión global de la biosíntesis de la hormona esteroide y su mecanismo de regulación neuronal.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Agradecemos a Reiko Kise y Tomotsune Ameku por su apoyo técnico a este trabajo. Agradecemos también a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, el Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de las acciones y los reactivos. Este trabajo fue apoyado por becas a YSN de JSP KAKENHI la subvención Número 16K20945, La Fundación Naito, y el Premio de Investigación de Ciencias Inoue; y con una donación a RN de MEXT KAKENHI la subvención Número 16H04792.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

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Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

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