Summary
We beschrijven een protocol voor dissectie, fixatie en immunokleuring van steroidogenic organen in Drosophila larven en volwassen vrouwtjes steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme bestuderen. Naast steroïdogene organen visualiseren we de innervatie van steroidogenic organen en steroidogene doelcellen zoals kiemlijn stamcellen.
Abstract
In meercellige organismen, wordt een kleine groep cellen begiftigd met een gespecialiseerde functie in hun biogene activiteit induceren van een systemische reactie op groei en reproductie. In insecten, het larvale prothoracale klier (PG) en de volwassen vrouwelijke eierstok spelen een essentiële rol in de biosynthese van de belangrijkste steroïde hormonen genaamd ecdysteroïden. Deze ecdysteroidogenic organen geïnnerveerd door het zenuwstelsel, waar de timing van biosynthese wordt beïnvloed door omgevingsfactoren. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren ecdysteroidogenic organen en hun interactieve organen in larven en volwassenen van de fruitvlieg Drosophila melanogaster, die een geschikt model voor het bestuderen steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme biedt. Bekwame dissectie laat ons toe om de posities van ecdysteroidogenic organen en hun interactieve organen, inclusief de hersenen, de ventrale zenuw koord, en andere weefsels te behouden. Immunokleuring met eenntibodies tegen ecdysteroidogenic enzymen, naast transgene fluorescentie eiwitten aangestuurd door weefselspecifieke promoters zijn beschikbaar voor ecdysteroidogenic cellen te merken. Bovendien is de innervatie van de ecdysteroidogenic organen kan ook worden gelabeld met specifieke antilichamen of een verzameling van GAL4 drivers in verschillende soorten neuronen. Daarom kan de ecdysteroidogenic organen en hun neuronale verbindingen tegelijkertijd worden gevisualiseerd door immunokleuring en transgene technieken. Tot slot beschrijven we hoe kiemlijn stamcellen, waarvan de proliferatie en onderhoud worden gecontroleerd door ecdysteroïden te visualiseren. Deze methode draagt bij aan beter begrip van steroïde hormonen biosynthese en de neuronale reguleringsmechanisme.
Introduction
In meercellige organismen, is een groep cellen begiftigd met een gespecialiseerde functie in hun biogene activiteit die essentieel is voor het hele lichaam. Hun taken te vervullen, elk weefsel of orgaan tot expressie brengt een reeks van genen betrokken bij hun functies en communiceert met andere weefsels hun activiteiten in het kader van de ontwikkeling orkestreren. Om dergelijke gespecialiseerde celfuncties en inter-orgaan interacties te karakteriseren, moeten we een groep cellen specificeren bij andere typen cellen die in de meercellige architectuur intact.
Een voorbeeld van dergelijke speciale organen een steroïdogene orgaan, waar veel biosynthetische enzymen mediëren de omzetting stappen uit cholesterol actieve steroïde hormonen 1. De meeste van deze enzymen genen specifiek tot expressie in steroïdogene organen en de biosyntheseroute wordt strak gereguleerd door verschillende externe stimuli via humorale ingangen en neuronale ingangen. Een keergesynthetiseerd, steroïde hormonen worden uitgescheiden in de hemolymfe en zijn gericht op vele weefsels en organen voor het reguleren van de expressie van diverse genen 2. Derhalve is de werking van een steroïdhormoon induceert een systemische reactie op homeostase, groei en voortplanting te behouden.
De functies van steroïdhormoon biosynthese en pleiotrope werkingen van steroïde hormonen te onderzoeken, kan Drosophila melanogaster worden gebruikt als een geschikt modelsysteem. Tijdens de larvale stadia, het insect steroïdhormoon, ecdysteroid wordt gebiosynthetiseerd in een gespecialiseerde endocrien orgaan genoemd prothoracale gland (PG) 3. In de PG verschillende ecdysteroidogenic enzymen specifiek katalyseren de omzetting meerdere stappen van cholesterol tot ecdyson, welke controles rui en metamorfose op het juiste ontwikkelingsstadia 4. Daarom wordt een dynamische verandering in ecdysteroid titer geregelddoor velen signaalwegen in reactie op omgevingsfactoren. Aan de andere kant, in het volwassen stadium, ecdysteroid speelt een essentiële rol in de fysiologie, met inbegrip van reproductie, slaap, het geheugen en de levensduur 5, 6, 7, 8. Het is bekend dat ecdysteroid actief gebiosynthetiseerd in de eierstok, reguleren de progressie van oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. Onlangs hebben we gemeld dat het aantal kiemlijn stamcellen (GSC) wordt beïnvloed door ecdysteroid en geslacht peptide signalering in respons op stimuli paring 12.
Krachtige instrumenten van D. melanogaster genetica en celbiologie, waaronder goed geannoteerde genoominformatie, binaire genexpressiesystemen en transgene RNAi technieken hebben het mogelijk om genen te identificeren essentiële biosynthese ecdysteroid de PG en eierstok 13, 14, 15. Zodra de ecdysteroidogenic genen zijn geïdentificeerd, kunnen de transcriptionele regulatie van deze genen en het dynamische lokalisaties van genproducten in de biosyntheseroute 16 onderzocht. Daartoe kwantitatieve reverse transcriptie-PCR, RNA in situ hybridisatie en immunohistologische analyse worden uitgevoerd. De toepassing van deze technieken is voorzien van een uitdagende taak; de uitgebreide dissectie van de PG of de eierstok. Met name de PG van de fruitvlieg relatief kleiner is dan die van andere insecten (zoals de zijderups en klap vliegen), dus moet oefenen de vitale vaardigheid van fruitvlieg dissectie voor bemonstering. Bovendien zijn zowel ecdysteroidogenic organen ontvangen innervaties van het centrale zenuwstelsel (CNS) 17, 18, 19, 20. Zo accurate anatomische analyse, de ecdysteroidogenic organen komen intact naast het centraal zenuwstelsel en andere organen, de neuronenverbindingen niet te verstoren gehouden.
Hier bieden we protocollen voor de dissectie en visualisatie van steroidogenic organen in D. melanogaster. Het leren van de dissectie techniek is het belangrijk uitgangspunt voor deze experimenten. Daarnaast kan men met succes het etiket van de steroidogenic organen evenals hun interactieve organen met een aantal antilichamen en GAL4 driver lijnen. Door gebruik te maken van deze technieken, materialen en genetica, kan men de uitgebreide mechanismen van steroïde hormoon biosynthese bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De opzet van protocollen is getoond in figuur 1.
1. Dissectie van de larvale ringwartel (RG)
NB: In D. melanogaster, die behoort tot cyclorrhaphous Diptera, de PG in een samengesteld endocrien orgaan genaamd de ring pakkingbus (RG, Figuur 2D). Aangezien het niet haalbaar dat de PG operatief wordt gescheiden van andere typen cellen (later besproken), een praktisch doel om een intacte, onbeschadigde RG isoleren door ontleding.
- Voorbereiding van de larven op de juiste ontwikkelingsstadia
OPMERKING: Om de ontwikkelingsstadia van D. melanogaster larven te synchroniseren, is het nodig om eieren te verzamelen binnen een korte tijdspanne en larven te verzamelen op de juiste momenten.- Eieren verzamelen gedurende 2 uur op druivensap agar plaat bij 25 ° C.
- Verzamel pas uitgekomen 1
- Op het geschikte tijdstip, verzamel de gefaseerde larven met een wegwerp plastic lus ongewenste verwondingen te voorkomen. Een verschil in ontwikkelings progressie van de 3e instar larven minimaliseren, verzamel de 2e instar larven bij 70 Hael (48 HAH) en laat ze molt in 2 uur intervallen. Verzamel dan de 3e instar larven binnen 2 uur na de vervelling L3; Deze procedure geeft 0-2 hAL3E larven.
- Breng de organisator van larven naar een schotel gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Spoel de larven met PBS om de resterende voedsel te verwijderen uit het lichaam.
- Grof dissectie van larven onder eendissectiemicroscoop
- Houd de mond haak van een larve met een tang. Verbreken het larvale lichaam aan het voorste eenderde van de lichaamslengte behulp van micro schaar.
- Houd het afgesneden uiteinde van de voorste larvale lichaam met een pincet. Met de andere pincet, duw de punt van de kop naar de binnenzijde van het lichaam; Deze procedure maakt het larvale lichaam binnenstebuiten.
LET OP: Deze stap kan worden overgeslagen voor de dissectie van 1 st larven. - Herhaal de stappen 1.2.1-1.2.2 met extra larven gedurende 5-10 min.
OPMERKING: Het aantal larven moet gelijk zijn aan of minder dan 20 om tijd te besparen voor dissectie zijn.
- Filet dissectie van de larven
LET OP: Deze methode maakt het bijhouden van de positie van de weefsels te intact blijven.- Laat larven in het water slechts voor 1 uur. De larven worden geïmmobiliseerd als gevolg van stikken.
- Liep larve dorsale zijde in een druppel PBS op een silicium gecoatschaal met het dorsale zijde naar boven.
OPMERKING: De dorsale kant heeft 2 tracheale buizen die longitudinaal. - Onder een dissectiemicroscoop, plaats een insect pin in het voorste uiteinde van de larve behulp van een tang. Strek het larvale lichaam naar de postérieure zijde en zet een tweede pen in het achterste uiteinde van de larven.
Opmerking: Naast insect pinnen, kan een naald vervaardigd uit een wolfraamdraad nuttig 21 zijn. Een naald kan worden ingebed in een pipetpunt door verhitting voor toepassing als een dissectie naald. - Onder een microscoop ontleden, maak een kleine incisie in de buurt van de staart met micro schaar. Uit de incisie, snijd de dorsale cuticula lengterichting langs de dorsale middellijn naar de kop. Wees voorzichtig niet aan weefsels schade in de zin van de cuticula.
- Rek de lichaamswand cuticula aan weerszijden en plaats 4 kunnen op elke hoek van de lichaamswand ontleed.
- Verwijderen van een gedeelte van voorste dik lichaam met een pincet, de hersenen-RG c blootomplex worden blootgesteld op het oppervlak. Verwijdert een paar speekselklieren, indien nodig.
- Fixatie en kleuring van weefsel met immunohistochemie
- Zet het voorste eenderde van de larvale lichamen (stap 1.2.2) in een 1,5 ml microbuisjes gevuld met 500 pi de fixeeroplossing (4% paraformaldehyde in PBS). Fix minder dan 20 monsters tegelijkertijd, anders PBS toegevoegd aan de gefixeerde monsters kan een ongunstige verdunning van het fixeermiddel leiden. Voor filet dissectie, verwijderen van een daling van PBS en voeg dan een druppel fix oplossing.
LET OP: Voor fix oplossing, kan ofwel 3,7% formaldehyde of 4% paraformaldehyde worden gebruikt. - Incubeer de ontleed weefsel in de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (KT) of gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Vervang de fixeeroplossing met 500 pi PBS en snel de monsters spoel 3 keer. Was de monsters met 500 ui 0,3% PBT (PBS + 0,3% octylfenolethoxylaat) gedurende 15 minuten op een schudtafel bij RT. Voor filet dissectie, verwijder het insect pennen en de monsters over in een 1,5 ml microbuisjes.
Opmerking: Voor het vergroten van de permeabiliteit van antilichamen in weefsels worden de monsters behandeld met 500 uL 2,0% PBT 1-2 uur op een schudtafel bij kamertemperatuur. - Vervang PBT met 500 gl blokkerende oplossing (2% runderserumalbumine in PBT). Incubeer de monsters gedurende 1,5 uur op een schudtafel bij kamertemperatuur.
- Vervang de blokkerende oplossing met 50 pi het primaire antilichaamoplossing, namelijk antilichamen verdund in blokkeeroplossing.
- Incubeer de monsters overnacht op een schudtafel bij 4 ° C.
- Vervang het primaire antilichaamoplossing met 500 pl 0,3% PBT en vlug de monsters spoel 5 keer. Was de monsters 3 maal met 500 pi 0,3% PBT gedurende 15 minuten elk op een schudtafel bij kamertemperatuur.
- Vervang 0,3% PBT met 50 pi de secundaire antilichaamoplossing (dye-geconjugeerde antilichamen verdund in blokkeeroplossing). Nucleaire kleuring, 0,5 gl 4' , 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 0,1 mg / ml voorraadoplossing) wordt toegevoegd aan 50 pl oplossing. Incubeer de monsters op een rocker gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of ook bij 4 ° C overnacht.
OPMERKING: Houd de monsters in het donker. - Vervang de antilichaamoplossing met 500 pl 0,3% PBT en spoel 5 keer. Was de monsters 3 maal met 500 pi 0,3% PBT gedurende 15 min elk bij kamertemperatuur.
- Zet het voorste eenderde van de larvale lichamen (stap 1.2.2) in een 1,5 ml microbuisjes gevuld met 500 pi de fixeeroplossing (4% paraformaldehyde in PBS). Fix minder dan 20 monsters tegelijkertijd, anders PBS toegevoegd aan de gefixeerde monsters kan een ongunstige verdunning van het fixeermiddel leiden. Voor filet dissectie, verwijderen van een daling van PBS en voeg dan een druppel fix oplossing.
- Fine dissectie van de hersenen-RG complex dat de PG en montage
- Gebruik een wegwerpbare pipet om de immunogekleurde monsters over te brengen naar een schaal gevuld met 0,3% PBT.
OPMERKING: Om lastig bellen tijdens dissectie en montage te vermijden, kan 0,3% PBT worden vervangen door PBS. - Onder een dissectiemicroscoop, houdt de cuticula of mond haak met een pincet. Met behulp van een 27 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit als een "mes", snijd het voorste uiteinde van de slokdarm en het oog schijven naar de hersenen-RG-eye disc complex uit het lichaam te verwijderen cuticula.
- Sepabeoordeel de slokdarm en ingewanden uit de hersenen-RG-eye disc complex met een pincet. Aangezien de slokdarm passeert de hersenen boven de ventrale zenuw kabel (VNC), trekt de darm naar de achterste zijde.
Opmerking: Om extra denkbeeldige schijven uit de monsters, snijd de verbindingen tussen de hersenen, oog schijven, en been schijven met een naaldmes. - Herhaal de stappen 1.5.1-1.5.4 voor andere monsters.
Opmerking: Om te voorkomen weefselresten te plakken aan de monsters, overdracht elke voltooide monster op een andere schone schaal gevuld met 0,3% PBT of PBS. - Breng de monsters naar het midden van een schone glasplaatje met een micropipet.
OPMERKING: 2e of 3e instar larven moeten na een micropipettip ingekort met een scheermesje. - Onder een dissectiemicroscoop, sluiten individuele monsters met hun rugzijde door behulp van een tang.
Opmerking: Het RG bevindt zich aan de dorsale zijde van de hersenen (figuur 2A). Deze uitlijning vergemakkelijkt de specificatie van afzonderlijke monsters tijdens de beeldvorming. - Kantel een glasplaatje en veeg zo veel overtollige PBT mogelijk. Een druppel reagens montage aan een zijde van de schuif. Leg de rand van een dekglas van de andere kant van de druppel en zet het dekglas op de monsters langzaam met een tang.
Opmerking: Deze procedure voorkomt dat de monsters bewegen buiten het dekglas. - Opslaan van de monsters bij 4 ° C. Houd de monsters in het donker.
- Gebruik een wegwerpbare pipet om de immunogekleurde monsters over te brengen naar een schaal gevuld met 0,3% PBT.
2. Dissectie van de eierstok volwassen vrouwtjes
- Voorbereiding van de volwassen vrouwen
- Feed vrouwelijke vliegt met standaard gist / maïsmeel vlieg voedsel voor 3-4 dagen de tijd om vet te mesten de eierstok. Handhaven op 25 ° C.
- Dissectie van de volwassen vrouwelijke eierstok
- Verdoven vrouwelijke vliegt met CO 2 gas en sneed hun hoofden.
- Transfer fly lichamen naar een 3 cm schotelgevuld met PBS.
- Onder een dissectiemicroscoop houd de thorax aan de rugzijde behulp van een tang. Pak de abdominaalsegment A5 en A6 met de andere tang en afpellen de buik cuticula naar de achterste zijde. Veeg de kleverige cuticula van de punt van de tang.
- Knijpen een eileider en verwijder de eierstokken uit het lichaam.
- Kam en verspreiding van de tips van de eierstokken met een tang.
OPMERKING: Deze operatie verbetert de efficiëntie van immunokleuring.
- Dissectie van volwassen vrouwelijke hersenen, VNC en de voortplantingsorganen.
LET OP: Deze methode maakt het mogelijk de innervatie van de eierstokken intact worden gehouden.- Verdoven vrouwelijke vliegen met CO2 gas en overbrengen naar een silicium gecoate schaal gevuld met PBS.
- Onder een dissectiemicroscoop Houd de snuit en de kop afpellen cuticula naar de hersenen bloot met een tang. Verwijder de trachea aan de hersenen.
OPMERKING: De brain een wit en rond structuur. De hersenen wordt aangesloten op de VNC in de thorax. - Houd de thorax aan de rugzijde en snijd de poten en vleugels met een pincet. Met de andere pincet, afpellen de ventrale thorax cuticula van de bases van de benen. Zodra de VNC wordt blootgesteld, verwijder de resterende dorsale cuticula en spieren verbonden aan de VNC behulp van een tang. Zorg ervoor dat de verbinding tussen de hersenen en de VNC niet te beschadigen.
- Tang om afpellen de buik cuticula en bloot de eierstokken en de interactieve organen, inclusief neuronen, het gewas, de darm, de eileider, de baarmoeder en de accessary klier.
- Verwijder het resterende weefsels waaronder de luchtpijp en de dikke lichaam behulp van een tang.
- Fixatie en kleuring van weefsel met immunohistochemie
- Breng ongeveer 8-10 paren van de eierstokken van een 1,5 ml microbuisjes gevuld met 250 pl de fixeeroplossing (4% paraformaldehyde in PBS) en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Vervang de fixeeroplossing met 500 pi PBS en snel de monsters spoel 3 keer.
- Was de monsters 2 maal met 500 pi 0,1% PBT gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur.
- Vervang PBT met 50 pl blokkeeroplossing. Incubeer de monsters gedurende 1 uur op een schudtafel bij kamertemperatuur.
- Vervang de blokkerende oplossing met 50 pi het primaire antilichaamoplossing.
- Incubeer de monsters overnacht op een schudtafel bij 4 ° C.
- Vervang het primaire antilichaamoplossing met 500 pl 0,1% PBT. Was de monsters 3 maal met 500 pi 0,1% PBT gedurende 15 minuten elk op een schudtafel bij kamertemperatuur.
- Vervang 0,1% PBT met 50 pl secundaire antilichaamoplossing. Nucleaire kleuring, voeg 0,5 ui DAPI 50 pl van de oplossing. Incubeer de monsters gedurende 2 uur op een schudtafel bij kamertemperatuur.
- Vervang de secundaire antilichaamoplossing met 500 pl 0,1% PBT. Was de monsters 3 maal met 500 pi 0,1% PBT gedurende 15 minuten elk op een schudtafel bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De wasprocedure kan worden uitgevoerd bij 4 ° C overnacht. Houd de monsters in het donker.
- Montage van de monsters op glasplaatjes
- Breng de monsters op een glasplaatje met 0,1% PBT met behulp van een micropipet.
OPMERKING: Om lastig bellen tijdens dissectie en montage te vermijden, kan 0,1% PBT worden vervangen door PBS. - Voor de eierstok, scheiden de snaren van de ovarioles van elkaar met een tang onder de dissectiemicroscoop. Niet verwonden de uiteinden van de ovarioles met het germaria. Voor de hersenen-VNC-reproductief orgaan complex, verwijdert de resterende cuticula en regelen de positie op een glasplaatje.
- Veeg zoveel overtollige PBT mogelijk en een druppel reagens montage in het midden van de monsters. Leg een deksel slip langzaam behulp van een tang.
- Opslaan van de monsters bij 4 ° C. Houd de monsters in het donker.
- Breng de monsters op een glasplaatje met 0,1% PBT met behulp van een micropipet.
- Observeer de monsters onder de microscoop en breng de steroïdogene organen in het gezichtsveld. Zodra de weergave is bevestigd, schakelt het beeldvormingssysteem de beeldverwerving modus.
LET OP: Het 10-20x objectief lenzen worden gebruikt om de beelden van de hersenen-RG complex of de gehele eierstok te verkrijgen. Als alternatief kan de 40-63X objectieflenzen (water of olie onderdompeling) worden gebruikt voor het visualiseren van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten in GSCs of neuronale innervatie van de PG en eierstok. - Stel de parameters van het beeld acquisitie op de meegeleverde software. Selecteer de combinatie van fluorescentie (bijvoorbeeld GFP en RFP). Door snelle scanproces pas het laservermogen, de gevoeligheid van de detectoren (Versterking / Offset), en de afmeting van de pinhole.
Opmerking: Om beelden met hoge kwaliteit te verkrijgen, moet de aftasting laservermogen en de gevoeligheid van de detector (Gain) worden geoptimaliseerd voor elk monster. Om de vorm te schetsenvan de weefsels, kan een verzonden-lichtbeeld worden genomen naast een fluorescent beeld. - Neem Z stacks van de beelden. Tijdens een continue snelle scan, verplaatst het brandvlak met de focus aandrijving van de microscoop en stel de startpositie en de eindpositie. Het aantal plakken en de intervalafstand tussen segmenten worden aangepast.
- Selecteer de scansnelheid, de scan-methode, en de bidirectionele scan mode.
- "Start de echte scans" voor het overname.
- Sla de afbeelding op met het formaat van de meegeleverde software.
LET OP: Het originele beeld bestanden bevatten de gegevens van het beeld acquisitie parameters en een weegschaal. Geëxporteerde afbeeldingen kunnen worden verwerkt met behulp van een image processing software op de computer 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten de bovenstaande protocollen om steroidogenic organen en hun interactieve organen in D. melanogaster larven en volwassen vrouwen te visualiseren. De opzet van protocollen is getoond in figuur 1.
RG, inclusief PG (figuur 2D), kleiner en transparanter dan de hersenen en bevindt zich aan de voorste-dorsale zijde van de hersenen (Figuur 2A-C en 3A-E). De PG cellen te merken, hebben verschillende groepen verschillende typen antilichamen tegen ecdysteroidogenic enzymen geproduceerd (bijv Neverland 23, spookier 24, Sluier 20, Spoor 25, Onstoffelijke 25 en 26 Shadow). Hiervan heeft anti-Scherm (Sro) antilichaam betrouwbaar gebruikt om de PG labelen door immuunkleuring (figuur 2C, 2E en 3C). Als alternatief kan de Binary genexpressiesysteem, GAL4 / UAS-systeem 27, kan worden gebruikt voor fluorescent proteïne genen in PG cellen. Door de promoter analyse van het gen ecdysteroidogenic fantoom (phm), kan de PG-promoter genexpressie uitsluitend induceren in de PG 28. Daarom kan de PG cellen specifiek worden gevisualiseerd door GFP of RFP onder besturing van phm-GAL4 # 22 (Figuur 3D).
De neurale verbinding tussen PG en hersenen te visualiseren, kan een groep van neuronen met mCD8 :: GFP-gelabeld onder besturing van verschillende GAL4 drivers en antilichamen (Figuur 2C, 2E, 3D en 3E). FlyLight de database van GAL4 lijn collecties is geoptimaliseerd voor het labelen neuronen 29. Hiervan GMR45C06-GAL4 labels PG-stekende neuronen (Figuur 2C en E). de immunostaining van GFP tot expressie brengende larven met anti-GFP antilichaam effectief bij het verbeteren van GFP-signalen. Verder TRH-GAL4> mCD8 :: GFP larven tonen de stomatogastric zenuwstelsel, waarbij serotonerge neuronen project om niet alleen de PG, doch ook om de proventriculus (PV, insect voordarm) en de keelholte spieren (PM) (Figuur 3D en E) 20, 30. Daarom is het essentieel om de positie van de RG, de hersenen en andere omringende weefsels tijdens dissecties filet (figuur 3) te handhaven.
In volwassen vrouwtjes, eierstok- ecdysteroid invloed op vele aspecten van oogenesis, zoals GSC proliferatie, cyste differentiatie, ei kamer groei en stress respons 11. Zoals in de PG worden ecdysteroidogenic enzymen in de eierstok ook zichtbaar gemaakt met specifieke antilichamen boven 12, 31 beschreven.Als stroomafwaartse gebeurtenis waarop ecdysteroïden handeling, het aantal GSC in het germarium onze aandacht (figuur 4). Hoewel de germarium een samenstel van meerdere celtypen worden GSCs gespecificeerd door immuunkleuring met twee GSC marker antilichamen 1B1 en D E-cadherine 32. De innervatie van de eierstok visualiseren, is de eierstok ontleed met de hersenen, VNC, darm, gewas, uterus en spermatheca (figuur 5). Neuronen worden gevisualiseerd door mCD8 :: GFP onder de controle van nSyb-GAL4, een pan-neuronale driver (Figuur 5B en D). Spieren rond de eierstokken, uterus en darm zijn gekleurd met kleurstof geconjugeerd falloïdine.
Figuur 1: De opzet van protocollen. Twee verschillende dissectie methoden zijn applicin staat om larven en volwassen vrouwtjes, afhankelijk van het doel van de experimenten. De montagemethodes ook ontwikkeld volgens monster omstandigheden. Fixatie, vlekken, en beeldvormende technieken zijn in principe voor alle monsters. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Visualisatie van de PG en PG-projecterende neuronen. (A en B) De hersenen-ring wartel (RG) complex van het wildtype 3e instar larven. In (B), wordt de PG aangegeven met stippellijnen. De filamenteuze structuur tussen de hersenen en de RG is de luchtpijp. (C - E) De innervatie van de PG werd zichtbaar gemaakt met mCD8 ::GFP gedreven door GMR45C06-GAL4 in FlyLight collectie. De PG en GFP-positieve neuronen werden gemerkt met anti-Sro antilichaam (magenta) en anti-GFP antilichaam (groen) respectievelijk. De fluorescerende beeld wordt samengevoegd afbeelding het uitgezonden licht met de omtrek van de weefsels te geven. (D), het PG, de corpora allata (CA) en de corpora cardiaca (CC) geïllustreerd. De PG stekende neuronen prominenter afbeelding met hoog vermogen met 40X objectief (pijlen in e) de spaarstand beeld 10x objectief (C) dan. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: De stomatogastric Nervous System Projects aan de PG, het PV, een nd de PM. (A en B) De filet ontleding van een wildtype 3e instar larven. De posities van de PG, hersenen (Br), ventrale zenuw kabel (VNC), oog schijven (ED), vleugel schijven (WD), pharynx spier (PM) en proventriculus (PV) intact. (C) De PG werd uitsluitend gelabeld met anti-Sro antilichaam (magenta). (D) De PG werd gelabeld met turboRFP aangedreven door phm-GAL4 # 22. Serotonerge neuronen werden gemerkt met anti-5HT-antilichaam (groen). (E) Het stomatogastric zenuwstelsel werd zichtbaar gemaakt met mCD8 :: GFP gedreven door TRH-GAL4. Serotonerge neuronen projecteren aan de PG, de PM en de PV (pijlen). De Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
files / ftp_upload / 55.519 / 55519fig4.jpg"/>
Figuur 4: De germaria in het wild-type Vliegen met één, twee of drie GSC's. (A) Een overzicht van de vrouwelijke voortplantingsorganen. Een eierstok is samengesteld uit 16-20 ovarioles die snaren van ei kamers. De germarium, waarbij GSCs bevinden, is aan het uiteinde van elke ovariole. (B - D) één, twee of drie GSC bevinden zich in elke germarium (wit gestippelde cirkels) van het wildtype vrouwtjes. GSC worden gekleurd met antilichaam 1B1 (groen), die een bolvormige structuur genoemd spectrosome (pijlen) en een membraanachtige cytoskeletstructuur zogenaamde fusome labels. De cel grenzen worden gevisualiseerd met anti- D E-cadherine antilichaam (magenta). De Schaalstaaf = 10 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: De vrouwelijke voortplantingsorganen en hun Interactive Organen. (A) Het ovarium (Ov), darm (Gut), gewassen (Cr), hersenen (Br), ventrale zenuw kabel (VNC) en spermatheca (Sp) werden gedissecteerd onder de microscoop. (B - D) de innervatie van de eierstokken werd zichtbaar gemaakt met mCD8 :: GFP gedreven door nSyb-GAL4. GFP-positieve neuronen zich vanaf de VNC (pijl) projecteert op het oppervlak van de ovaria (pijlpunten). De eierstokken zijn geschetst door stippellijnen. De monsters werden gekleurd met anti-GFP antilichaam (groen) en kleurstof geconjugeerd phalloidin (magenta). Phalloidin associeert met de filamenteuze actine van spieren rond de eierstokken (Ov) en baarmoeder (Ut). De afbeelding wordt weergegeven in C. De schaalbalk = 200 pm.rge.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We bestudeerden ecdysteroid biosynthese en haar reguleringsmechanisme in D. melanogaster, en bedacht een protocol voor dissectie en immunokleuring. De timing van ecdysteroïdrespons biosynthese wordt beïnvloed door omgevingsfactoren tot neuronale ingangen 33, dus is het essentieel om de innervatie van de organen ecdysteroidogenic houden met de hersenen, VNC en andere weefsels tijdens dissectie.
Zoals hierboven is beschreven, de D. melanogaster PG complexeert endocrien orgaan RG de corpora allata (CA) en de corpora cardiaca (CC) (Figuur 2D). Terwijl de PG produceert ecdysteroïden, de CA en de CC produceren juveniele hormonen en adipokinetic hormoon, respectievelijk. Deze anatomische eigenschap is een belemmering voor onderzoekers bestuderen ecdysteroidogenesis in D geweest. melanogaster, in vergelijking met andere insecten. Echter, in de afgelopen decennia, vliegen genetica has liet ons toe om vele ecdysteroidogenic genen die specifiek in de PG 4 zijn uitgedrukt identificeren. Deze genen worden ook tot expressie gebracht in cellen of verpleegkundige follikel cellen van de eierstok 34, 35. Nu kan men een unieke set van genexpressieprofielen gebruiken ecdysteroidogenic organen, waardoor het mogelijk ecdysteroidogenic cellen door immunokleuring en transgene technieken specificeren.
Tijdens de dissectie, is het essentieel om fijne tang te gebruiken met scherpe randen. Voorafgaand aan dissectie, kunnen de randen van de tang worden geslepen met Arkansas slijpsteen om de randen bij elkaar te brengen zonder onderbrekingen. Tijdens dissectie, vuil of de resterende weefsels, zoals de dikke lichaam, de darm en de denkbeeldige schijven moeten worden verwijderd zoveel mogelijk. In het bijzonder, stukken van het vet lichaam gemakkelijk vast te houden aan het weefsel van belang. Daarnaast dient het aanbrengen van de monsters op objectglaasjes worden voerened zorgvuldig. Een complex van weefsels kan worden ontregeld wanneer een dekglas in kleverige fixeermiddel geplaatst op de monsters. Daarom moet een voldoende aantal monsters worden ontleed en monsters die moeten worden gekozen voor beeldvorming, zoals die waarin het RG of eierstok op de bovenste zijde en de neuronale verbindingen intact.
Succesvolle immunokleuring voeren en de reproduceerbare resultaten te verkrijgen, is het essentieel om dezelfde omstandigheden gedurende welke bemonsterings- en wegligging. De omvang van immunokleuring sterk afhankelijk van de toestand van individuele dieren bij de bemonstering en bevestiging. Zo moet de leeftijd van de dieren, het grootbrengen temperaturen, nutriënten conditie, en de dissectie tijd zorgvuldig worden overwogen. Om het hanteren onjuiste fixatie in meerdere experimenten te minimaliseren, we zorgvuldig blijven nagenoeg gelijk aantal monsters dat de tijd dissectie en fixatie reactietijden coördineren. Voor de fixatie sPLOSSING is 4% paraformaldehyde en 3,7% formaldehyde. Omdat paraformaldehyde snel afgebroken in de tijd, wordt het poeder gewoonlijk opgelost tot 10% voorraadoplossing in PBS maken en aliquots bij -20 ° C bewaard. De porties zijn ontdooid vers 4% oplossing paraat voorafgaand aan elke dissectie te maken. Bovendien is de uitgebreide wasstappen monsters verminderen de achtergrond niet-specifieke kleuring.
In de stap van het beeld acquisitie, volgen we het protocol van de fabrikant voor confocale microscopie. De microscopie systeem zorgt voor een gebruiksvriendelijke interface voor onderzoekers of studenten, zodanig dat de optimale sets van excitatie / emissie filters automatisch worden geselecteerd wanneer de aard van de fluorofoor zijn opgegeven. Terwijl de microscopie systeem is eenvoudig te gebruiken, moet men de parameters van beeldopname optimaliseren elk monster of elke brandvlak door verandering van de detectorversterking, scansnelheid, scan getallen en de pinhole grootte.
36 genereren. Om dit probleem te overwinnen, kan de knock-in techniek worden toegepast op een HA-tag in de genlocus van ouijaraad met de CRISPR / Cas9 te doorlopen. Door dergelijke transgene technieken in combinatie met immunokleuring, tenminste 3-4 eiwitten gelijktijdig kunnen worden gevisualiseerd in de PG of eierstokken. In tegenstelling tot eiwit lokalisatie echter een methode om endogene ecdysteroïden visualiseren door immuunkleuring is niet vastgesteld. Zodra anti-ecdysteroid antilichaam beschikbaar voor immunokleuring, kan de subcellulaire lokalisatie van ecdysteroïdrespons biosynthese en transport van ecdysteroid worden onderzocht in de toekomst. Een andere beperking is dat de temporele dynamiek van ecdysteroidogenesis niet gefixeerde weefsels worden onderzocht. Aangezien de ecdysteroid titer fluctueert langs de ontwikkelingsstadia, zou de activiteit van ecdysteroidogenic organen en de uitstekende neuronen tijdelijk worden gereguleerd als reactie op diverse omgevingsstimuli. Een recente studie bewaakt de Ca 2+ dynamiek van de PG cellen met behulp van live-imaging technieken 37. Voor toekomstige toepassingen, zijn we op dit moment de ontwikkeling van een protocol voor de live beeldvorming van PG of gekweekte eierstokken samen met hun uitstekende neuronen. Bij de bestaande methoden, nieuwe protocol beoogt de activiteit van neuronen en hun doelorganen gelijktijdig te visualiseren. Zodra de activiteit van neuronen kan worden bewaakt met Ca2 + indicator GCaMP of Cameleon 38 kan worden gemanipuleerd met optogenetic of thermogenetische benaderingen op het juiste momentTussen 39. Deze methoden dragen bij aan een beter begrip van steroïde hormonen biosynthese en de neuronale reguleringsmechanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Reiko Kise en Tomotsune Ameku voor hun technische ondersteuning voor dit werk. We zijn ook dankbaar voor Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, de Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) en de Developmental Studies Hybridoma Bank voor aandelen en reagentia. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan YSN van JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation, en Inoue Science Research Award; en door een subsidie aan RN uit MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
