Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Präparation, Fixierung und Immunfärbung von steroidogenen Organen in Drosophila - Larven und erwachsenen Frauen Steroidhormon - Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus zu studieren. Neben steroidogenen Organe visualisieren wir die Innervation steroidogenen Organe sowie steroidogenen Zielzellen wie Keimbahn-Stammzellen.
Abstract
In mehrzelligen Organismen wird eine kleine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, um eine systemische Reaktion auf Wachstum und Vermehrung zu induzieren. Bei den Insekten, die Larven Prothoraxdrüse (PG) und die erwachsenen weiblichen Ovar wesentliche Rollen spielen in die Biosynthese der Hauptsteroidhormone genannt ecdysteroids. Diese ecdysteroidogenic Organe werden aus dem Nervensystem innerviert, durch welche der Zeitpunkt der Biosynthese durch Umweltreize beeinflusst wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe in Larven und Erwachsene der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, die für das Studium Steroidhormon - Biosynthese und ihrer Regulationsmechanismus ein geeignetes Modellsystem zur Verfügung stellt. Geschickte Dissektion ermöglicht es uns, die Positionen der ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe einschließlich des Gehirns, der Bauchmark und andere Gewebe zu halten. Immunostaining mit einemntibodies gegen ecdysteroidogenic Enzyme, zusammen mit transgenen Fluoreszenzproteine durch gewebespezifische Promotoren angetrieben wird, stehen zur Verfügung ecdysteroidogenic Zellen zu markieren. Darüber hinaus kann die Innervation der ecdysteroidogenic Organe auch durch spezifische Antikörper oder eine Sammlung von GAL4-Treiber in verschiedenen Arten von Neuronen markiert werden. Daher können die ecdysteroidogenic Organe und die neuronale Verbindungen gleichzeitig durch Immunfärbung und transgene Techniken sichtbar gemacht werden. Schließlich beschreiben wir, wie Keimbahn-Stammzellen zu visualisieren, Proliferation und Wartung dessen werden durch ecdysteroids gesteuert. Dieses Verfahren trägt zum umfassenden Verständnis von Steroidhormon-Biosynthese und ihrem neuronalen Regulationsmechanismus.
Introduction
In mehrzelligen Organismen wird eine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, die für den ganzen Körper wesentlich ist. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, jedes Gewebe oder Organ zum Ausdruck bringt eine Reihe von Genen, die Funktionen im Zusammenhang und kommuniziert mit anderen Geweben, ihre Aktivitäten im Zusammenhang mit der Entwicklung orchestrieren. Um solche spezialisierten Zellfunktionen und Interorgan Wechselwirkungen zu charakterisieren, müssen wir zusammen mit anderen Arten von Zellen, die eine Gruppe von Zellen angeben, wobei in der vielzelligen Architektur intakt gehalten.
Ein Beispiel einer solchen spezialisierten Organe ist ein steroidogenen Organ, in dem viele Biosyntheseenzyme die Umwandlungsschritte von Cholesterin zu aktiven Steroidhormone 1 vermitteln. Die meisten dieser Gene werden in Enzym steroidogenen Organen spezifisch exprimiert wird, und die Biosyntheseweg wird eng durch viele äußere Reize über humorale Eingänge und neuronalen Eingänge geregelt. Einmalsynthetisiert, sind Steroidhormone , in die Hämolymphe sezerniert und werden in vielen Geweben und Organen gezielt für die Expression einer Vielzahl von Genen 2 zu regulieren. Daher induziert die Wirkung eines Steroidhormons eine systemische Reaktion Homöostase, Wachstum und Reproduktion zu erhalten.
Um die Funktionen von Steroidhormon - Biosynthese und die pleiotrope Wirkungen von Steroidhormonen, Drosophila melanogaster zu untersuchen kann als geeignetes Modellsystem verwendet werden. Während der Larvenstadien, das Insektensteroidhormon, Ecdysteroid, wird in einem spezialisierten endokrinen Organe biosynthetisiert genannt Prothoraxdrüse (PG) 3. In der PG, katalysieren ecdysteroidogenic mehr Enzyme spezifisch die mehrere Umwandlungsschritte von Cholesterin zu Ecdyson, die an den entsprechenden Entwicklungsstadien 4 Häutung und Metamorphose steuert. Daher wird eine dynamische Änderung der Ecdysteroid Titer geregeltviele Signalwege in Reaktion auf Umweltreize. Auf der anderen Seite, im Erwachsenenstadium spielt ecdysteroid wesentliche Rolle in der Physiologie, einschließlich der Reproduktion, Schlaf, Gedächtnis, und die Lebensdauer 5, 6, 7, 8. Es ist bekannt , dass Ecdysteroid aktiv im Ovar biosynthetisiert wird, um das Fortschreiten der Oogenese regulierende 6, 7, 8, 9, 10, 11. Vor kurzem haben wir berichtet , dass die Anzahl von Keimbahn - Stammzellen (GSCs) durch Ecdysteroid und Geschlecht Peptid Signalisierung in Reaktion auf Paarungs 12 Reize beeinflußt wird.
Mächtige Werkzeuge von D. melanogaster Genetik und Zellbiologie, einschließlich gut kommentierten Genominformationen, binary GenExpressionssysteme, und transgene RNAi - Techniken haben es uns ermöglicht , Gene wesentlich für Ecdysteroid - Biosynthese in der PG und Ovar 13, 14, 15 zu identifizieren. Sobald die ecdysteroidogenic Gene identifiziert werden, kann die Transkriptionsregulation dieser Gene und die dynamischen Lokalisierungen von Genprodukten in dem Biosyntheseweg 16 untersucht werden. Zu diesem Zweck quantitative reverse Transkription-PCR-RNA in situ Hybridisierung und immunhistologische Analysen durchgeführt. Die Anwendung dieser Techniken beinhaltet eine anspruchsvolle Aufgabe; Die aufwendige Präparation des PG oder des Ovars. Insbesondere relativ kleiner die PG des Fruchtfliege ist als die von anderen Insekten (zB die Seidenraupe und die Schmeißfliege), so muss man die lebenswichtige Fähigkeit der Fruchtfliege Präparation für die Probenahme üben. Darüber hinaus erhalten beide ecdysteroidogenic Organe Innervations aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) , 17, 18, 19, 20. So kann eine genaue anatomische Analysen sollten die ecdysteroidogenic Organe intakt zusammen mit dem ZNS und anderen Organen gehalten werden, nicht ihre neuronalen Verbindungen zu stören.
Hier bieten wir Protokolle für die Präparation und Visualisierung von steroidogenen Organe in D. melanogaster. die Dissektionstechnik Lernen ist der Schlüssel Ausgangspunkt für diese Experimente. Darüber hinaus kann man erfolgreich die steroidogenen Organe sowie deren interaktive Organe mit mehreren Antikörpern und GAL4 Treiberleitungen beschriften. Unter Ausnutzung dieser Techniken, Materialien und Genetik kann man die umfassenden Mechanismen der Steroidhormon-Biosynthese studieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Die allgemeine Systematik der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Die Dissektion der Larval Ring Gland (RG)
HINWEIS: In D. melanogaster, die cyclorrhaphous Diptera gehört, wird die PG in einem zusammengesetztes endokrinen Organe der Ring Drüse (RG, 2D) genannt. Da es nicht durchführbar ist, dass die PG chirurgisch aus anderen Arten von Zellen (später diskutiert) getrennt ist, ist ein praktisches Ziel eine intakte, unbeschädigte RG durch Dissektion zu isolieren.
- Herstellung von Larven an den entsprechenden Entwicklungsstadien
HINWEIS: Um die Entwicklungsstadien von D. melanogaster Larven zu synchronisieren, ist es notwendig , Eier innerhalb eines engen Zeitfensters zu sammeln und Larven zu den entsprechenden Zeiten zu sammeln.- Sammeln Eier für 2 h auf einem Traubensaft Agarplatte bei 25 ° C.
- Sammeln Sie frisch geschlüpften 1
HINWEIS: Das Alter der Larven wird von „Stunden nach der Eiablage (hael)“, „Stunden nach dem Schlüpfen (HAH)“ oder „Stunden nach L3 Häutung (hAL3E)“ dargestellt. - Zu gegebenem Zeitpunkt, sammeln die inszenierten Larven mit einer Einweg-Plastikschleife unerwünschte Verletzungen zu vermeiden. Um einen Unterschied in der Entwicklungsfortschreiten des 3. Larvenstadium, sammeln die 2. Larvenstadium bei 70 hael (48 HAH) zu minimieren und es ihnen ermöglichen, in 2 Stunden - Intervallen häuten. Dann sammeln die 3. Larvenstadium innerhalb von 2 h nach der L3 Häutung; Dieses Verfahren gibt 0-2 hAL3E Larven.
- Übertragen der Szene gesetzt Larven in einer Schale gefüllt mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Spülen Sie die Larven mit PBS Rest Nahrung aus dem Körper zu entfernen.
- Grobe Dissektion von Larven unter aBinokular
- Halten Sie den Mund Haken einer Larve mit einer Pinzette. Sever die Larvenkörper an dem vorderen ein Drittel der Körperlänge unter Verwendung von Mikro Schere.
- Halten Sie das abgeschnittene Ende des vorderen Larvenkörper mit einer Pinzette. Unter Verwendung der anderen Zange, drücken Sie vorsichtig die Spitze des Kopfes in Richtung der Innenseite des Körpers; Dieses Verfahren macht den Larvenkörper von innen nach außen.
HINWEIS: Dieser Schritt kann für die Präparation von 1. Larvenstadium übersprungen werden. - Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1-1.2.2 mit zusätzlichen Larven für 5-10 min.
HINWEIS: Die Anzahl der Larven sollte gleich oder weniger als 20 Mal für die Präparation zu speichern.
- Fillet Dissektion von Larven
HINWEIS: Diese Methode, die Position von Geweben ermöglicht hält intakt zu bleiben.- Lassen Larven in Wasser nur 1 Stunde. Die Larven werden wegen Erstickung immobilisiert.
- Legen Sie eine Seite Larve dorsal in einem Tropfen PBS auf einer Silizium-beschichteten upSchale mit ihrer dorsalen Seite nach oben.
HINWEIS: Die dorsale Seite hat 2 Trachealtuben laufen in Längsrichtung. - Unter einem Binokular, legt einen Insektenstift in die vordere Spitze der Larven mit einer Pinzette. Stretch den Larvenkörper auf die hinteren Seite und legt einen zweiten Stift in die hinteren Spitze der Larve.
HINWEIS: Zusätzlich zu den insekten Pins, eine Nadel aus einem Wolframdraht hergestellt sein kann 21 nützlich. Eine Nadel kann als Präpariernadel in einer Pipettenspitze durch Erhitzen zur Verwendung eingebettet werden. - Unter einem Binokular, macht einen kleinen Schnitt in der Nähe des Schwanzes mit Mikro-Schere. Aus dem Einschnitt, geschnitten in Längsrichtung des dorsal Kutikula entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung des Kopfes. Seien Sie vorsichtig, nicht Gewebe unter der Oberhaut zu beschädigen.
- Stretch den Wandkörper Kutikula auf jeder Seite und legt 4 Stifte an jeder Ecke des Wandkörpers seziert.
- Entfernen eines Teils des anterioren Fettkörper mit einer Pinzette, die Gehirn-RG c zu belichtenomplex auf der Oberfläche freigelegt werden. Entfernen Sie ein Paar Speicheldrüsen, falls erforderlich.
- Fixierung und Färbung des Gewebes mit Immunhistochemie
- Setzen Sie den anterioren ein Drittel der Larvenkörper (Schritt 1.2.2) in ein 1,5 ml Mikroröhrchen gefüllt mit 500 & mgr; l der Fixierlösung (4% Paraformaldehyd in PBS). Fix weniger als 20 Proben auf einmal, sonst PBS an die festen Proben angebracht ist, kann eine ungünstige Verdünnung des Fixiermittels verursachen. Bei Kehl Dissektion einen Tropfen PBS entfernen und dann einen Tropfen Fixier-Lösung hinzufügen.
HINWEIS: Für Fixier-Lösung, entweder 3,7% Formaldehyd oder 4% Paraformaldehyd verwendet werden kann. - Inkubiere die sezierten Gewebe in der Fixier-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT), oder alternativ für 2 Stunden bei 4 ° C.
- Ersetzen der Fixier-Lösung mit 500 & mgr; l PBS und schnell den Proben 3-mal gespült. Waschen Sie die Proben mit 500 ul 0,3% PBT (PBS + 0,3% Octylphenolethoxylat) für 15 min auf einem Schüttler bei RT. Für fillet Dissektion, entfernen die Insektenstifte und übertragen Sie die Proben in ein 1,5 ml Mikroröhrchen.
HINWEIS: Die für die Durchlässigkeit von Antikörpern in das Gewebe zu erhöhen, werden die Proben mit 500 ul 2,0% PBT für 1-2 h auf einem Schüttler bei RT behandelt. - Ersetzen PBT mit 500 & mgr; l Blockierlösung (2% Rinderserumalbumin in PBT). Inkubieren Sie die Proben für 1,5 h auf einer Wippe bei RT.
- Ersetzen die Blockierungslösung mit 50 & mgr; l der primären Antikörperlösung, dh Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt.
- Inkubiere die Proben über Nacht auf einem Schüttler bei 4 ° C.
- Ersetzen der primären Antikörperlösung mit 500 & mgr; L 0,3% PBT und schnell die Proben 5 Mal spülen. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,3% PBT für jeweils 15 Minuten auf einem Schüttler bei RT.
- Ersetzen 0,3% PBT mit 50 ul der sekundäre Antikörper-Lösung (Farbstoff-konjugierten Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt). Für die Kernfärbung, 0,5 & mgr; l 4' , 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,1 mg / ml Stammlösung) wird zu 50 & mgr; l Lösung. Inkubiere die Proben auf einem Schüttler für 2 h bei RT oder bei 4 ° C über Nacht.
HINWEIS: Bewahren Sie die Proben im Dunkeln. - Ersetzen der Antikörperlösung mit 500 & mgr; L 0,3% PBT und spülen Sie 5-mal. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,3% PBT für jeweils 15 min bei RT.
- Setzen Sie den anterioren ein Drittel der Larvenkörper (Schritt 1.2.2) in ein 1,5 ml Mikroröhrchen gefüllt mit 500 & mgr; l der Fixierlösung (4% Paraformaldehyd in PBS). Fix weniger als 20 Proben auf einmal, sonst PBS an die festen Proben angebracht ist, kann eine ungünstige Verdünnung des Fixiermittels verursachen. Bei Kehl Dissektion einen Tropfen PBS entfernen und dann einen Tropfen Fixier-Lösung hinzufügen.
- Fein Dissektion des Gehirns-RG - Komplexes mit dem PG und Befestigungs
- Verwenden, um eine Einweg-Pipette, die immunogefärbten Proben auf eine Schale mit 0,3% PBT gefüllt zu übertragen.
HINWEIS: Um unbequeme Blasen während der Präparation zu vermeiden und Montage kann 0,3% PBT mit PBS ersetzt werden. - Unter einem Binokular, hält die Kutikula oder Mundhaken mit einer Pinzette. Unter Verwendung einer 27 G-Nadel an einer 1 ml-Spritze als „Messer“, schneiden die vordere Spitze der Speiseröhre und Augenscheiben das Gehirn-RG-eye-Disc-Komplex aus Körper Kutikula zu entfernen.
- Sepabewertet die Speiseröhre und Darm aus dem Gehirn-RG-Augen-Disc-Komplex mit einer Pinzette. Da die Speiseröhre oberhalb des Bauchmark (VNC) durch das Gehirn gelangt, ziehen gut auf der hinteren Seite heraus.
HINWEIS: Zum Entfernen von zusätzlichen Imaginalscheibe aus den Proben, schneiden Sie die Verbindungen zwischen dem Gehirn, Auge Scheiben und Beinscheiben mit einem Nadelmesser. - Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.4 für andere Proben.
ANMERKUNG: Um Gewebstrümmer vom Kleben an die Proben, überträgt jede abgeschlossene Probe in einer anderen sauberen Schüssel gefüllt mit 0,3% PBS PBT oder zu verhindern. - Übertragen Sie die Proben in die Mitte eines sauberen Glasobjektträger mit einer Mikropipette.
HINWEIS: 2. oder 3. Larvenstadium, sollte das Ende einer Mikropipettenspitze mit einer Rasierklinge abgeschnitten. - Unter einem Binokular, richten einzelne Proben mit ihrer dorsalen Seite nach oben durch die Zange verwendet wird.
HINWEIS: Die RG an der dorsalen Seite des Gehirns befindet (2A). Diese Ausrichtung erleichtert die Spezifikation der einzelnen Proben während der Bildgebung. - Kippen Sie einen Objektträger aus Glas und wischen Sie so viele überschüssigen PBT wie möglich. Bringe einen Tropfen Befestigungs Reagenz auf einer Seite der Folie. Platzieren Sie den Rand eines Deckglas von der anderen Seite des Tropfens und setzt das Deckglas auf den Proben langsam mit einer Pinzette.
Hinweis: Dieses Verfahren verhindert, dass außerhalb des Deckglases der Proben bewegen. - Lagern Sie die Proben bei 4 ° C. Halten Sie die Proben im Dunkeln.
- Verwenden, um eine Einweg-Pipette, die immunogefärbten Proben auf eine Schale mit 0,3% PBT gefüllt zu übertragen.
2. Die Dissektion der Ovar in Erwachsener Weibliche Person
- Herstellung von erwachsenen Weibchen
- Feed weibliche Fliegen mit Standard-Hefe / cornmeal Fliegenfutter für 3-4 Tage, um den Eierstock mästen. Pflegen bei 25 ° C.
- Dissektion der erwachsenen weiblichen Ovar
- Anesthetize Weibchen mit CO 2 -Gas fliegen und abgeschnitten ihre Köpfe.
- Übertragen Fliegenkörper in eine 3-cm-Schalemit PBS gefüllt.
- Unter einem Binokular, halten Sie den Thorax auf der Seite dorsal mit einer Pinzette. Fasst das Abdominalsegment A5 oder A6 mit den anderen Zangen und schält die abdominale Kutikula in Richtung der hinteren Seite entfernt. Wischen Sie die klebrige Kutikula von der Spitze der Zange ab.
- Klemmen Sie einen Eileiter und nehmen Sie den Eierstock aus dem Körper.
- Kamm und verbreiten die Spitzen der Ovarien mit einer Pinzette.
HINWEIS: Dieser Vorgang verbessert die Effizienz der Immunfärbung.
- Dissektion der erwachsenen weiblichen Gehirn, VNC und Fortpflanzungsorgane.
HINWEIS: Diese Methode ermöglicht die Innervation des Ovar intakt gehalten werden.- Anesthetize Weibchen mit CO 2 -Gas fliegen und sich auf eine Silizium-beschichtete Schal mit PBS gefüllt.
- Unter einem Binokular, halten Sie die Rüssel und ziehen den Kopf Kutikula entfernt das Gehirn mit einer Pinzette zu belichten. Entfernen Sie die Luftröhre an das Gehirn gebunden.
HINWEIS: Die brain ist eine weiße und gerundete Struktur. Das Gehirn verbindet sich mit dem VNC im Thorax. - Halten Sie den Thorax auf der dorsalen Seite und geschnitten, um die Beine und Flügel mit einer Pinzette aus. Unter Verwendung der anderen Zange, schälen die ventralen Thorax Cuticula von den Basen der Beine weg. Sobald das VNC ausgesetzt ist, entfernen, die Rest dorsalen Kutikula und die VNC mit einer Pinzette befestigt Muskeln. Achten Sie darauf, nicht die Verbindung zwischen dem Gehirn und dem VNC zu beschädigen.
- Verwenden einer Pinzette, um die Bauch Kutikula abzulösen und setzen die Ovar und ihre interaktive Organe, einschließlich Neuronen, die Ernte, dem Darm, der Eileiter, der Gebärmutter und der Mithelfer Drüse.
- Entfernen Sie die Restgewebe einschließlich Luft- und Fettkörper mit einer Pinzette.
- Fixierung und Färbung des Gewebes mit Immunhistochemie
- Übertragung von ca. 8-10 Paare der Ovarien in ein 1,5 ml Mikroröhrchen gefüllt mit 250 & mgr; l der Fixierlösung (4% paraformaldehyde in PBS), und die Proben für 30 min bei RT inkubiert.
- Ersetzen der Fixier-Lösung mit 500 & mgr; l PBS und schnell den Proben 3-mal gespült.
- Waschen Sie die Proben 2 mal mit 500 & mgr; l 0,1% PBT für jeweils 5 Minuten bei RT.
- Ersetzen PBT mit 50 & mgr; l Blockierungslösung. Inkubiere die Proben für 1 h auf einem Schüttler bei RT.
- Ersetzen der Blockierungslösung mit 50 & mgr; l der primären Antikörperlösung.
- Inkubiere die Proben über Nacht auf einem Schüttler bei 4 ° C.
- Ersetzen der primären Antikörperlösung mit 500 & mgr; l 0,1% PBT. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,1% PBT für jeweils 15 Minuten auf einem Schüttler bei RT.
- Ersetzen 0,1% PBT mit 50 ul sekundärer Antikörperlösung. Für die Kernfärbung, mit 0,5 & mgr; l DAPI bis 50 & mgr; l der Lösung. Inkubieren Sie die Proben für 2 h auf einer Wippe bei RT.
- Ersetzen der sekundäre Antikörperlösung mit 500 & mgr; l 0,1% PBT. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,1% PBT für jeweils 15 Minuten auf einem Schüttler bei RT.
HINWEIS: Der Waschvorgang kann über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden. Halten Sie die Proben im Dunkeln.
- Montage der Proben auf Glasobjektträger
- Übertragen Sie die Proben auf einen Glasobjektträger mit 0,1% PBT mit einer Mikropipette.
HINWEIS: Um unbequeme Blasen während der Präparation zu vermeiden und Montage kann 0,1% PBT mit PBS ersetzt werden. - Für die Ovarien, trennen die Saiten der Ovariolen voneinander mit einer Pinzette unter einem Binokular. Sie nicht die Spitzen der Ovariolen verletzen die germaria enthält. Für den Gehirn-VNC-Fortpflanzungsorgan Komplex, den Rest Kutikula entfernen und die Position auf einem Glasobjektträger anordnen.
- Wischen so viel überschüssiges PBT wie möglich ab und einen Tropfen Befestigungs Reagenz in der Mitte der Proben gelegt. Legen Sie ein Deckglas langsam mit einer Pinzette.
- Lagern Sie die Proben bei 4 ° C. Halten Sie die Proben im Dunkeln.
- Übertragen Sie die Proben auf einen Glasobjektträger mit 0,1% PBT mit einer Mikropipette.
- Beachten Sie die Proben unter dem Mikroskop und bringen die steroidogenen Organe im Blickfeld. Sobald die Ansicht festgelegt ist, schaltet das Abbildungssystem auf den Bildaufnahme-Modus.
HINWEIS: Die 10-20x Objektivlinsen verwendet werden, um die Bilder des Gehirns-RG-Komplex oder das gesamte Ovar zu erhalten. Alternativ werden die 40-63X Objektivlinsen (Wasser oder Eintauchen in Öl) zur Sichtbarmachung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen in GSCs oder der neuronalen Innervation des PG und die Ovarien eingesetzt. - Stellen Sie die Parameter der Bildaufnahme auf der beiliegenden Software auf. Wählen Sie die Kombination aus Fluoreszenz (zB GFP und RFP). Durch die schnelle Scan-Verfahren, stellen Sie die Laserleistung, die Empfindlichkeit der Detektoren (Gain / Offset) und die Größe der Lochblende.
HINWEIS: Zum Erwerb von Bildern mit hohen Qualität, die Scan-Laserleistung und die Empfindlichkeit des Detektors (Gain) sollten für jede Probe optimiert werden. Umreißen die Formdas Gewebes, ein übertragenes Lichtbild kann zusätzlich zu einem Fluoreszenzbild aufgenommen werden. - Nehmen Z Stapel der Bilder. Während einer kontinuierlichen Schnellabtastrichtung, bewegen, um die Brennebene mit dem Fokusantrieb des Mikroskops und stellen die Ausgangsposition und die Endposition. Die Anzahl der Scheiben und der Intervallabstand zwischen den Scheiben werden entsprechend angepasst.
- Wählen Sie die Scan-Geschwindigkeit, die Scan-Methode und die bidirektionale Scan-Modus.
- „Starten Sie die wirklichen Prüfungen“ für die Bildaufnahme.
- Speichern Sie das Bild mit dem Format der beigefügten Software.
HINWEIS: Die Original-Bilddateien enthalten die Informationen der Bildaufnahmeparameter und Skalen. Exportierte Bilder können 22 unter Verwendung einer Bildverarbeitungssoftware auf dem Computer verarbeitet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir haben die oben genannten Protokolle zu steroidogenen Organe und deren interaktive Organe in D. melanogaster Larven und erwachsenen Frauen sichtbar zu machen. Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die RG, einschließlich des PG (Figur 2D), ist kleiner und transparenter als das Gehirn und wird an der anterior-dorsalen Seite des Gehirns (2A-C und 3A-E) angeordnet sind . Um die PG - Zellen haben mehrere Gruppen erzeugen verschiedene Arten von Antikörpern gegen ecdysteroidogenic Enzyme (dh Never 23, spookier 24, Ummantelung 20, 25 Phantom, Disembodied 25 und Schatten 26) kennzeichnet. Unter ihnen anti-Shroud (Sro) -Antikörper wird zuverlässig verwendet , um das PG zu Etikett durch Immunofärbung (2C, 2E und 3C). Alternativ kann die binary Genexpressionssystem, GAL4 / UAS - System 27, kann verwendet werden , Fluoreszenzproteingen in PG - Zellen zu exprimieren. Durch die Promotor - Analyse des Gen ecdysteroidogenic Phantoms (phm) kann die PG-Promotor - spezifische Genexpression ausschließlich in der PG 28 induzieren. Daher können die PG - Zellen spezifisch durch Exprimieren GFP oder RFP unter der Kontrolle von phm-GAL4 # 22 (Abbildung 3D) sichtbar gemacht werden.
Um die neuronale Verbindung zwischen dem PG und dem Gehirn sichtbar zu machen , eine Gruppe von Neuronen kann mit mCD8 :: GFP unter der Kontrolle von verschiedenen GAL4 - Treiber und Antikörper (2C, 2E, 3D und 3E) gekennzeichnet werden. Die FlyLight Datenbank von GAL4 Linie Sammlungen wird für die Kennzeichnung Neuronen 29 optimiert. Unter ihnen Etiketten GMR45C06-GAL4 PG projizierenden Neurone (2C und E). die immunostaining von GFP - exprimierenden Larven mit anti-GFP - Antikörper ist bei der Verbesserung der GFP - Signale wirksam. Darüber hinaus TRH-GAL4> mCD8 :: GFP Larven zeigen das stomatogastrischen Nervensystem, bei der serotonergen Neuronen Projekt nicht nur auf dem PG, sondern auch auf die proventriculus (PV, Insekten foregut) und die Rachenmuskeln (PM) (3D und E) 20, 30. Daher ist es wichtig , die Position des RG, das Gehirn und die anderen umgebenden Gewebe während fillet Dissektionen (Abbildung 3) zu halten.
Bei erwachsenen Frauen betrifft ovarian ecdysteroid viele Aspekte der Oogenese, wie GSC Proliferation, Differenzierung Zyste, Eikammer Wachstum und Stressantwort 11. Wie in der PG, sind ecdysteroidogenic Enzyme im Ovar auch mit den spezifischen Antikörpern oben beschriebenen 12, 31 visualisiert.Als nachgeschalteter Ereignis , auf dem Gesetz Ecdysteroiden, ist die Anzahl der in dem GSCs Germarium Des Fokus (Figur 4). Obwohl das Germarium eine Anordnung von mehreren Zelltypen, wird GSCs durch Immunfärbung mit zwei GSC Markers Antikörper angegeben, 1B1 und D E-Cadherin - 32. Um die Innervation des Ovar zu visualisieren, wird das Ovar mit dem Gehirn, VNC, Darm, Ernte, Uterus und Spermatheka (Abbildung 5) seziert entlang. Neurone wird visualisiert durch mCD8 :: GFP unter der Kontrolle von nSyb-GAL4, ein pan-neuronalen - Treiber (5B und D). Muskeln um die Ovarien, Uterus und Darm sind mit Farbstoff-Phalloidin gefärbt.
Abbildung 1: Das Gesamtschema von Protokollen. Zwei verschiedene Dissektion Methoden sind applicLage Larven und erwachsene Frauen, über den Zweck der Versuche abhängig. Die Befestigungsverfahren sind auch nach Probenbedingungen entwickelt. Fixieren, Färben und Imaging-Techniken sind im Allgemeinen, die für alle Proben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Darstellung des PG und der PG projizierenden Neurone. (A und B) , um der Gehirn-Ring Drüse (RG) -Komplex des Wildtyp 3. Larvenstadiums. In (B) wird die PG durch gestrichelte Linien skizziert. Die fadenförmigen Struktur zwischen dem Gehirn und dem RG ist die Luftröhre. (C - E) Die Innervation des PG wurde mit mCD8 visualisiert ::GFP angetrieben durch GMR45C06-GAL4 in FlyLight Sammlung. Die PG und GFP-positive Neurone wurden mit anti-Sro Antikörper (magenta) markiert und anti-GFP-Antikörper (grün), respectively. Das Fluoreszenzbild wird mit dem übertragenen Lichtbild verschmolzen den Umriss von Geweben zu spezifizieren. In (D), der PG, die Corpora allata (CA) und die Corpora cardiaca (CC) veranschaulicht. Die PG projizierenden Neurone sind noch ausgeprägter in der High-Power-Bild mit 40-facher Objektivlinse (Pfeile E) als die Low-Power-Bild mit 10-fach Objektiv (C). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Das stomatogastrischen Nervous System Projects zum PG, PV, ein nd die Uhr. (A und B) der Hohlkehle Dissektion eines Wildtyp 3. Larvenstadium. Die Positionen des PG, Gehirn (Br), Bauchmark (VNC), Augenscheiben (ED), Flügelscheiben (WD), pharyngealen Muskel (PM) und proventriculus (PV) intakt bleiben. (C) wurde die PG ausschließlich mit anti-Sro Antikörper (magenta) markiert. (D) Der PG wurde mit turboRFP gekennzeichnet angetrieben von phm-GAL4 # 22. Serotonergen Neuronen wurden mit Anti-5-HT-Antikörper (grün) markiert. (E) Das stomatogastrischen Nervensystem wurde mit mCD8 :: GFP angetrieben von TRH-GAL4 visualisiert. Serotonergen Neuronen projizieren zum PG, der PM und der PV (Pfeile). Der Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
files / ftp_upload / 55519 / 55519fig4.jpg“/>
Abbildung 4: Die Germaria von Wildtyp - Flies mit einem, zwei oder drei GSCs. (A) Ein Überblick über die weiblichen Fortpflanzungsorgane. Ein Ovar besteht aus 16-20 Ovariolen, die Strings von Eikammern sind. Das Germarium, wo GSCs befindet, ist an der Spitze jeden Ovariole. (B - D) ein, zwei oder drei GSCs sind in jedem Germarium (weiße gestrichelte Kreise) der Wildtyp - Weibchen entfernt. GSCs ist mit 1B1-Antikörper (grün) gefärbt, das eine kugelförmige Struktur der spectrosome (Pfeile) und eine membranartige Struktur Zytoskelett bekannt als die fusome genannt Etikett. Die Zellgrenzen sind mit anti- D E-Cadherin - Antikörper (magenta) sichtbar gemacht. Die Skalenbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Die weiblichen Geschlechtsorgane und ihre Interactive Organe. (A) Das Ovar (Ov), gut (Gut), Kropf (Cr), Gehirn (Br), Bauchmark (VNC) und Spermatheca (Sp) wurde unter dem Mikroskop zerlegt. (B - D) Die Innervation des Ovars wurde mit mCD8 :: GFP visualisiert angetrieben von nSyb-GAL4. GFP-positive Neurone erstrecken sich von dem VNC (Pfeil), Projizieren auf die Oberfläche der Ovarien (Pfeilspitzen). Die Eierstöcke sind durch gestrichelte Linien skizziert. Die Proben wurden mit Anti-GFP-Antikörper (grün) und Farbstoff-konjugiertes Phalloidin (magenta) gefärbt. Phalloidin Mitarbeiter mit dem fadenförmigen Aktin der Muskeln um die Ovarien (Ov) und der Gebärmutter (Ut). Die Darstellung ist in C. Der Maßstabsbalken = 200 & mgr; m gezeigt.rge.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir studierten ecdysteroid Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus in D. melanogaster, und ein Protokoll für die Präparation und Immunfärbung entwickelt. Der Zeitpunkt der Ecdysteroid - Biosynthese wird durch Umweltreize durch neuronale Eingänge 33, beeinflußt , so ist es wesentlich , die Innervation der ecdysteroidogenic Organe zusammen mit dem Gehirn, VNC und anderen Geweben während der Präparation zu erhalten.
Wie oben beschrieben, bildet die D. melanogaster PG einen komplexen endokrinen Organ RG mit der Corpora allata (CA) und der Corpora cardiaca (CC) (Figur 2D). Während die PG ecdysteroids produziert, produzieren die CA und die CC juvenile Hormone und Hormon adipokinetic sind. Diese anatomische Eigenschaft hat ein Hindernis für Forscher gewesen ecdysteroidogenesis in D studieren. melanogaster, im Vergleich zu anderen Insekten. Doch in den letzten Jahrzehnten, Fliegengenetik has uns erlaubt , viele ecdysteroidogenic Gene zu identifizieren , die in dem PG 4 spezifisch exprimiert werden. Diese Gene werden auch in Nährzellen Follikelzellen oder des Ovars 34, 35 ausgedrückt. Nun kann man einen einzigartigen Satz von Genexpressionsprofilen in ecdysteroidogenic Organen verwenden, so dass es möglich ecdysteroidogenic Zellen durch Immunfärbung und transgene Techniken zu spezifizieren.
Bei der Präparation ist es wichtig, feine Pinzette mit scharfen Kanten zu verwenden. Vor der Präparation können die Ränder der Zange mit einem Arkansas Schleifstein geschärft werden, um die Kanten zusammen ohne Lücken zu bringen. Während der Präparation, Schutt oder Restgewebe, wie der Fettkörper, der Darm und die Imaginalscheibe, sollten so weit wie möglich entfernt werden. Insbesondere Stücke des Fettkörpers haften leicht an das Gewebe von Interesse. Darüber hinaus sollte die Lagerung der Proben auf Glasobjektträger auch durchführen werdensorgfältig ed. Ein Komplex von Gewebe kann in Unordnung gebracht werden, wenn ein Deckglas auf den Proben in sticky Eindeckmediums platziert wird. Daher muß eine ausreichende Anzahl von Proben präpariert werden, und geeignete Proben müssen die RG oder der Eierstock für die Bildgebung, wie beispielsweise solche, in denen gewählt werden, ist auf der obersten Seite und die neuronalen Verbindungen intakt bleiben.
Um eine erfolgreiche Immunfärbung durchführen und die reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, die gleichen Bedingungen für die Probenahme und Verfahren für den Umgang zu pflegen. Das Ausmaß der Immunfärbung hängt stark von dem Zustand der einzelnen Tiere zum Zeitpunkt der Probennahme und Fixierung. Zum Beispiel kann das Alter der Tiere, die Aufzucht Temperaturen, Nährstoffzustandes und die Dissektion Zeit sorgfältig in Betracht gezogen werden sollte. Um Bedienungsfehler der Fixierung in mehreren Experimenten zu minimieren, halten wir sorgfältig fast gleiche Anzahl von Proben, die die Dissektion Zeit und Fixierung Reaktionszeiten zu koordinieren. Zur Fixierung solution, 4% Paraformaldehyd oder Formaldehyd 3,7% verwendet wird. Da Paraformaldehyd schnell im Laufe der Zeit abgebaut wird, wird ihr Pulver in der Regel um 10% Stammlösung in PBS gelöst und Aliquots bei -20 ° C gelagert werden. Die Aliquots sind nicht gefrorene jede Dissektion der frische 4% fix Lösung vor zu machen. Darüber hinaus reduzieren die umfangreichen Waschschritte der Proben den Hintergrund nicht-spezifische Färbung.
Im Schritt der Bildaufnahme, folgen wir dem Protokoll des Herstellers für die konfokale Mikroskopie. Das Mikroskopiesystem bietet eine benutzerfreundliche Schnittstelle für Forscher oder Studenten, so dass die optimalen Sätze von Anregungs / Emissionsfilter automatisch ausgewählt werden, wenn die Arten von Fluorophor angegeben sind. Während das Mikroskopiesystem ist einfach zu bedienen, muss man die Parameter der Bildaufnahme auf jeder Probe oder jede Brennebene optimieren, indem die Detektorverstärkung, Abtastgeschwindigkeit, Abtastzahlen ändert und die Lochgröße.
36 verschiedene Antikörper gegen andere ecdysteroidogenic Genprodukten, wie Ouijabrett erzeugen. Verwendung des CRISPR / Cas9 Systems , um dieses Problem zu überwinden, die Knock-in - Technik kann einen HA-Tag eingefügt in dem Genlocus der ouija Platte aufgebracht werden. Durch die Verwendung solcher transgener Techniken, die in Kombination mit Immunfärbung, mindestens 3-4 Proteine können gleichzeitig in der PG oder Ovar visualisiert werden. Im Gegensatz zur Proteinlokalisierung, ein Verfahren, jedoch endogenes Ecdysteroide sichtbar zu machen durch Immunfärbung wurde nicht nachgewiesen. Sobald anti-Ecdysteroid-Antikörper zur Immunfärbung zur Verfügung steht, können die subzelluläre Lokalisierungen von Ecdysteroid-Biosynthese und der Transport von Ecdysteroid in Zukunft untersucht werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass die zeitliche Dynamik der ecdysteroidogenesis nicht in festen Geweben zu untersuchen. Bedenkt man, dass die Ecdysteroid Titer entlang der Entwicklungsstadien schwankt, sollte die Aktivität von ecdysteroidogenic Organe und die vorstehenden Neuronen zeitlich als Reaktion auf verschiedene Umweltreize geregelt werden. Eine kürzlich durchgeführte Studie überwacht , um die Ca 2+ Dynamik der PG - Zellen 37 Live - Bildgebungstechniken verwendet wird . Für zukünftige Anwendungen, entwickeln wir derzeit ein Protokoll für die Live-Bildgebung von PG oder kultivierten Ovarien zusammen mit ihren hervorstehend Neuronen. Im Hinblick auf bestehende Methoden, Ziele dieses neue Protokoll die Aktivität von Neuronen und deren Zielorgane gleichzeitig zu visualisieren. Sobald die Aktivität von Neuronen 38 mit dem Ca 2+ Indikatoren GCaMP oder Cameleon überwacht wird, kann es zu gegebener Zeit mit optogenetische oder thermogene Ansätzen manipuliert werdens 39. Diese Verfahren tragen zu einem umfassenden Verständnis der Steroidhormon-Biosynthese und ihren neuronalen Regulationsmechanismus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Reiko Kise und Tomotsune Ameku für ihre technische Unterstützung für diese Arbeit. Wir sind auch dankbar, dass Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) und der Entwicklungsstudien Hybridoma Bank für Aktien und Reagenzien. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YSN von JSPS KAKENHI Grantnummer 16K20945, The Naito-Stiftung und Inoue Wissenschaft Forschungspreis unterstützt; und durch einen Zuschuss zu RN von MEXT KAKENHI Grantnummer 16H04792.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
