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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55519
Automatic Translation
*1, *1, *2, 3
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

Descriviamo un protocollo per la dissezione, la fissazione, e immunocolorazione di organi steroidogeniche in Drosophila larve e adulti femmine per studiare steroidi biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione. Oltre agli organi steroidogenici, visualizziamo l'innervazione degli organi steroidogeniche così come cellule bersaglio steroidogeniche come le cellule staminali germinali.

Abstract

Negli organismi multicellulari, un piccolo gruppo di cellule è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica, inducendo una risposta sistemica crescita e la riproduzione. Negli insetti, ghiandola larvale prothoracic (PG) e le femmine adulte azione ovaio ruoli essenziali biosynthesizing principali ormoni steroidei chiamati ecdysteroids. Questi organi ecdysteroidogenic sono innervati dal sistema nervoso, attraverso cui la temporizzazione della biosintesi è influenzato da stimoli ambientali. Qui si descrive un protocollo per la visualizzazione degli organi e dei loro organi ecdysteroidogenic interattivi in larve e adulti della mosca della frutta Drosophila melanogaster, che fornisce un sistema modello adatto per lo studio ormone steroide biosintesi e il suo meccanismo di regolazione. dissezione abile permette di mantenere le posizioni degli organi ecdysteroidogenic e dei loro organi interattivi compreso il cervello, il cordone nervoso ventrale, e altri tessuti. Immunocolorazione con unntibodies contro enzimi ecdysteroidogenic, insieme a proteine ​​transgeniche fluorescenza guidati dai promotori tessuto-specifici, sono disponibili per marcare le cellule ecdysteroidogenic. Inoltre, i innervazione degli organi ecdysteroidogenic possono anche essere etichettati da anticorpi specifici o una serie di driver GAL4 in vari tipi di neuroni. Pertanto, gli organi ecdysteroidogenic e le loro connessioni neuronali possono essere visualizzati simultaneamente mediante immunocolorazione e tecniche transgeniche. Infine, si descrive come visualizzare le cellule staminali germinali, la cui proliferazione e manutenzione sono controllate da ecdysteroids. Questo metodo contribuisce alla comprensione globale di steroide biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione neuronale.

Introduction

Negli organismi multicellulari, un gruppo di celle è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica che è essenziale per tutto il corpo. Assolvere i loro compiti, ogni tessuto o organo esprime una serie di geni correlati alle loro funzioni e comunica con altri tessuti orchestrare loro attività nel contesto dello sviluppo. Caratterizzare tali funzioni cellulari specializzate e interazioni tra organi, è necessario specificare un gruppo di celle insieme ad altri tipi di celle essendo mantenuta intatta nell'architettura multicellulare.

Un esempio di tali organi specializzati è un organo steroidea, dove molti enzimi biosintetici mediare le fasi di conversione di colesterolo ad ormoni steroidei attivi 1. La maggior parte di questi geni enzimatici sono specificamente espressi in organi steroidogenici, e via di biosintesi è strettamente regolata da numerosi stimoli esterni tramite ingressi umorali e ingressi neuronali. Una voltasintetizzati, ormoni steroidei sono secreti nel emolinfa e sono mirati a molti tessuti e organi per regolare l'espressione di una varietà di geni 2. Pertanto, l'azione di un ormone steroideo induce una risposta sistemica per mantenere l'omeostasi, la crescita e la riproduzione.

Per studiare le funzioni di steroidi biosintesi dell'ormone e le azioni pleiotropici degli ormoni steroidei, Drosophila melanogaster può essere utilizzato come sistema modello adatto. Durante gli stadi larvali, l'ormone steroide insetto, ecdysteroid, è biosynthesized in un organo endocrino specializzato chiamato ghiandola prothoracic (PG) 3. Nel PG, diversi enzimi catalizzano ecdysteroidogenic specificamente le molteplici fasi di conversione da colesterolo ecdysone, che controlla la muta e metamorfosi in opportuni stadi di sviluppo 4. Pertanto, un cambiamento dinamico nel titolo ecdysteroid è regolatada molte vie di segnalazione in risposta a stimoli ambientali. D'altra parte, nella fase adulta, ecdysteroid svolge ruoli essenziali nella fisiologia, compresa la riproduzione, il sonno, la memoria, e durata della vita 5, 6, 7, 8. E 'noto che ecdysteroid attivamente biosynthesized nell'ovaio, regolando la progressione dell'oogenesi 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recentemente abbiamo riportato che il numero di cellule staminali germinali (GSC) è interessato da ecdysteroid e sesso segnalazione peptide in risposta a stimoli di accoppiamento 12.

Potenti strumenti di D. melanogaster genetica e della biologia delle cellule, comprese le informazioni del genoma ben annotato-, gene binariosistemi di espressione, e tecniche transgeniche RNAi, hanno permesso di identificare geni essenziali per ecdysteroid biosintesi del PG e dell'ovaio 13, 14, 15. Una volta che i geni ecdysteroidogenic sono identificati, la regolazione trascrizionale di questi geni e le localizzazioni dinamiche dei prodotti genici può essere esaminata in via di biosintesi 16. A tale scopo, quantitativa-trascrizione inversa-PCR, RNA ibridizzazione in situ, e l'analisi immunoistochimica sono condotte. L'applicazione di queste tecniche comprende un compito impegnativo; l'elaborato dissezione del PG o l'ovaio. In particolare, il PG della mosca della frutta è relativamente inferiore a quella di altri insetti (ad esempio, il baco da seta e la mosca colpo), quindi si ha la necessità di praticare la competenza fondamentale di frutta dissezione mosca per il campionamento. Inoltre, entrambi gli organi ecdysteroidogenic ricevono innervaziones dal sistema nervoso centrale (CNS) 17, 18, 19, 20. Così, per analisi anatomiche accurate, gli organi ecdysteroidogenic dovrebbero restare inalterate con lo SNC e altri organi, non rovinare le loro connessioni neuronali.

Qui forniamo protocolli per la dissezione e la visualizzazione degli organi steroidogeniche in D. melanogaster. Imparare la tecnica di dissezione è il punto di partenza fondamentale per questi esperimenti. Inoltre, si possono etichettare correttamente gli organi steroidogenici così come i loro organi interattivi con numerosi anticorpi e linee conducente GAL4. Approfittando di queste tecniche, materiali e genetica, si possono studiare i meccanismi completi di steroidi biosintesi dell'ormone.

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Protocol

NOTA: Lo schema generale dei protocolli è mostrato in Figura 1.

1. La dissezione del larvale Anello Gland (RG)

NOTA: In D. melanogaster, che appartiene alla Ditteri cyclorrhaphous, il PG è all'interno di un organo endocrino composito chiamato ghiandola anello (RG, Figura 2D). Poiché è irrealizzabile che il PG è chirurgicamente separato da altri tipi di cellule (discussi in seguito), un obiettivo pratico è isolare intatto, RG indenne da dissezione.

  1. Preparazione di larve nelle fasi di sviluppo adeguati
    NOTA: Per sincronizzare le fasi di sviluppo di D. melanogaster larve, è necessario raccogliere le uova all'interno di una finestra temporale ristretta e per raccogliere le larve al momento opportuno.
    1. Raccogliere le uova per 2 h su una piastra di agar succo d'uva a 25 ° C.
    2. Raccogliere recente-covato 1 NOTA: L'età delle larve è rappresentato da "ore dopo l'uovo posa (Hael)", "ore dopo botola (HAH)", oppure "ore dopo L3 ecdysis (hAL3E)".
    3. Al punto di tempo appropriato, raccogliere le larve di scena con un anello di plastica monouso per evitare lesioni indesiderabile. Per ridurre al minimo la differenza nella progressione evolutiva del 3 ° instar larve, raccogliere le larve instar 2 ° a 70 HAEL (48 HAH) e consentire loro di muta in intervalli di 2 h. Poi, raccogliere le larve instar 3 ° entro 2 ore dopo l'ecdysis L3; questa procedura contiene 0-2 hAL3E larve.
    4. Trasferire le larve graduale per un piatto riempito con tampone fosfato (PBS).
    5. Risciacquare le larve con PBS per rimuovere i residui di cibo dal corpo.
  2. Dissezione grossolana di larve sotto undissezione microscopio
    1. Tenere il gancio bocca di una larva con una pinza. Recidere il corpo larvale al anterior un terzo della lunghezza del corpo con le forbici micro.
    2. Tenere l'estremità tagliata del corpo larvale anteriore con un paio di pinze. Utilizzando l'altra coppia di pinze, spingere delicatamente la punta della testa verso l'interno del corpo; questa procedura trasforma il corpo larvale esterno.
      NOTA: Questo passaggio può essere saltato per la dissezione del 1 ° instar larve.
    3. Ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.2 con larve aggiuntivo per 5-10 minuti.
      NOTA: Il numero di larve deve essere uguale o inferiore a 20 per risparmiare tempo per la dissezione.
  3. Dissezione Filetto di larve
    NOTA: Questo metodo consente di mantenere la posizione dei tessuti di rimanere intatto.
    1. Lasciare le larve in acqua solo per 1 h. Le larve sono immobilizzati a causa di asfissia.
    2. Mettere un lato larva dorsale in una goccia di PBS su un rivestito siliciopiatto, con il suo lato dorsale alto.
      NOTA: Il lato dorsale ha 2 tubi tracheali longitudinalmente.
    3. Sotto un microscopio da dissezione, inserire un perno insetto nella punta anteriore della larva mediante pinza. Allungare il corpo larvale al lato posteriore e mettere un secondo perno nella punta posteriore della larva.
      NOTA: Oltre ai pin di insetti, un ago da un filo di tungsteno può essere utile 21. Un ago può essere incorporato in un puntale attraverso il riscaldamento per l'uso come un ago da dissezione.
    4. Sotto un microscopio da dissezione, fare una piccola incisione vicino alla coda con le forbici micro. Dall'incisione, intercettato cuticola dorsale longitudinalmente lungo la linea mediana dorsale verso la testa. Fare attenzione a non danneggiare i tessuti sotto la cuticola.
    5. Allungare la cuticola bodywall su ogni lato e posizionare 4 perni ad ogni angolo della bodywall sezionato.
    6. Rimuovere una parte del grasso corporeo anteriore con una pinza, per esporre il cervello-RG complex essere esposto sulla superficie. Rimuovere una coppia di ghiandole salivari, se necessario.
  4. Fissazione e colorazione del tessuto con immunoistochimica
    1. Mettere anteriore un terzo dei corpi larvali (passo 1.2.2) in una provetta da 1,5 ml riempito con 500 microlitri della soluzione di correzione (4% paraformaldeide in PBS). Fissare meno di 20 campioni in una sola volta, tuttavia PBS acclusa ai campioni fissate possono causare una diluizione sfavorevole del fissativo. Per filetto di dissezione, rimuovere una goccia di PBS e quindi aggiungere una goccia di soluzione di correzione.
      NOTA: Per la soluzione correzione, possono essere utilizzati sia 3,7% formaldeide o paraformaldeide al 4%.
    2. Incubare i tessuti sezionati nella soluzione correzione per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) o in alternativa per 2 ore a 4 ° C.
    3. Sostituire la soluzione correzione con 500 microlitri di PBS e risciacquare velocemente i campioni per 3 volte. Lavare i campioni con 500 microlitri 0,3% PBT (PBS + 0,3% ottilfenolo etossilato) per 15 minuti su un agitatore meccanico a RT. Per filetto dissezione, rimuovere i perni insetti e trasferire i campioni in un microtubo mL 1.5.
      NOTA: Per aumentare la permeabilità di anticorpi nei tessuti, i campioni vengono trattati con 500 microlitri 2,0% PBT per 1-2 h su un agitatore meccanico a RT.
    4. Sostituire PBT con 500 microlitri soluzione bloccante (2% di siero albumina bovina in PBT). Incubare i campioni per 1,5 h su un agitatore meccanico a RT.
    5. Sostituire la soluzione di saturazione con 50 microlitri della soluzione di anticorpo primario, cioè anticorpi diluiti nella soluzione di blocco.
    6. Incubare i campioni durante la notte su una sedia a dondolo a 4 ° C.
    7. Sostituire la soluzione di anticorpo primario con 500 microlitri 0,3% PBT e risciacquare velocemente i campioni di 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,3% PBT per 15 minuti ciascuno su un bilanciere a RT.
    8. Sostituire 0,3% PBT con 50 microlitri della soluzione di anticorpo secondario (anticorpi colorante-coniugato diluito in soluzione di saturazione). Per la colorazione nucleare, 0,5 microlitri 4' , 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 0,1 mg / mL di soluzione) viene aggiunto alla soluzione di 50 microlitri. Incubare i campioni su un bilanciere per 2 ore a RT oppure a 4 ° C durante la notte.
      NOTA: Conservare i campioni al buio.
    9. Sostituire la soluzione di anticorpi con 500 microlitri 0,3% PBT e risciacquare 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,3% PBT per 15 minuti ciascuno a RT.
  5. Belle dissezione del complesso cervello RG contenente il PG e il montaggio
    1. Utilizzare una pipetta monouso per trasferire i campioni immunostained ad un piatto riempito con 0,3% PBT.
      NOTA: per evitare bolle scomodi durante la dissezione e il montaggio, lo 0,3% PBT può essere sostituito con PBS.
    2. Sotto un microscopio da dissezione, tenere premuto il gancio cuticola o bocca con una coppia di pinze. Utilizzando un ago 27 G attaccato ad una siringa da 1 ml a "coltello", tagliare la punta anteriore dei dischi esofago e degli occhi per rimuovere il complesso disco-cervello RG-occhio dalla cuticola corpo.
    3. Sepavalutare l'esofago e intestino dal complesso disco di cervello-RG-eye con una pinza. Poiché l'esofago passa attraverso il cervello di sopra del cordone nervoso ventrale (VNC), estrarre l'intestino al lato posteriore.
      NOTA: Per rimuovere i dischi aggiuntivi immaginali dai campioni, tagliare le connessioni tra il cervello, i dischi degli occhi, e dischi gamba con un coltello ago.
    4. Ripetere la procedura 1.5.1-1.5.4 per altri campioni.
      NOTA: per evitare residui di tessuto aderisca ai campioni, trasferire ciascun campione completato un piatto diverso pulita riempita con 0,3% PBT o PBS.
    5. Trasferire i campioni al centro di un vetrino pulito di vetro con una micropipetta.
      NOTA: Per 2 ° o 3 ° larve instar, la fine di una punta micropipetta deve essere troncato con una lama di rasoio.
    6. Sotto un microscopio da dissezione, allineare campioni individuali con il loro lato dorsale fino utilizzando pinze.
      NOTA: Il RG è situato sul lato dorsale del cervello (Figura 2A). Questo allineamento facilita la specifica dei singoli campioni durante l'imaging.
    7. Inclinare un vetrino e pulire il più in eccesso PBT possibile. Mettere una goccia di reagente montaggio su un lato della diapositiva. Posizionare il bordo di un vetrino dall'altro lato della goccia e mettere il vetrino sui campioni lentamente con una pinza.
      NOTA: Questa procedura impedisce i campioni di muoversi fuori vetrino.
    8. Conservare i campioni a 4 ° C. Conservare i campioni al buio.

2. La dissezione delle ovaie in Le femmine adulte

  1. Preparazione di femmine adulte
    1. Alimentazione femminile vola con il cibo fly standard di lievito / farina di mais per 3-4 giorni per ingrassare l'ovaio. Mantenere a 25 ° C.
  2. Dissezione dell'ovaio femmina adulta
    1. Anestetizzare femminile vola con gas CO 2 e tagliare le loro teste.
    2. Trasferire i corpi volare ad un piatto di 3 centimetririempito con PBS.
    3. Sotto un microscopio da dissezione, tenere il torace sul lato dorsale con pinze. Afferrare la A5 segmento addominale o A6 con gli altri pinza e staccarsi la cuticola addominale verso il lato posteriore. Pulire la cuticola appiccicosa dalla punta della pinza.
    4. Pizzicare un ovidotto ed estrarre l'ovaio dal corpo.
    5. Pettine e diffondere le punte delle ovaie con una pinza.
      NOTA: Questa operazione migliora l'efficienza di immunocolorazione.
  3. La dissezione del cervello femminile adulta, VNC e gli organi riproduttivi.
    NOTA: Questo metodo permette l'innervazione delle ovaie da conservare intatto.
    1. Anestetizzare femmina vola con gas CO 2 e trasferirli ad un piatto siliconato riempito con PBS.
    2. Sotto un microscopio da dissezione, tenere la proboscide e staccarsi la cuticola testa per esporre il cervello con una pinza. Rimuovere la trachea attaccato al cervello.
      NOTA: Il Brain è una struttura bianca e arrotondata. Il cervello si collega al VNC nel torace.
    3. Tenere il torace sul lato dorsale e tagliare le gambe e le ali con un paio di pinze. Utilizzando l'altra coppia di pinze, staccarsi la cuticola dalle basi delle gambe toracica ventrale. Una volta che il VNC è esposto, rimuovere la cuticola dorsali residuo e muscoli attaccati alle VNC con pinze. Fare attenzione a non danneggiare la connessione tra il cervello e il VNC.
    4. Utilizzare pinze a staccarsi la cuticola addominale ed esporre l'ovaio ed i loro organi interattive tra cui neuroni, il raccolto, l'intestino, l'ovidotto, utero, e la ghiandola accessary.
    5. Rimuovere i tessuti residui compresi la trachea e il grasso corporeo con pinze.
  4. Fissazione e colorazione del tessuto con immunoistochimica
    1. Trasferire circa 8-10 coppie di ovaie di una microprovetta 1,5 ml riempito con 250 microlitri della soluzione di fissaggio (4% paraformaldehyde in PBS) e incubare i campioni per 30 minuti a RT.
    2. Sostituire la soluzione correzione con 500 microlitri di PBS e risciacquare velocemente i campioni per 3 volte.
    3. Lavare i campioni 2 volte con 500 microlitri 0,1% PBT per 5 minuti ciascuno a RT.
    4. Sostituire PBT con 50 microlitri soluzione bloccante. Incubare i campioni per 1 h su un agitatore meccanico a RT.
    5. Sostituire la soluzione di saturazione con 50 microlitri soluzione di anticorpo primario.
    6. Incubare i campioni durante la notte su una sedia a dondolo a 4 ° C.
    7. Sostituire la soluzione di anticorpo primario con 500 microlitri 0,1% PBT. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,1% PBT per 15 minuti ciascuno su un bilanciere a RT.
    8. Sostituire 0,1% PBT con 50 microlitri soluzione di anticorpo secondario. Per colorazione nucleare, aggiungere 0,5 microlitri DAPI a 50 microlitri della soluzione. Incubare i campioni per 2 ore su un agitatore meccanico a RT.
    9. Sostituire la soluzione di anticorpo secondario con 500 microlitri 0,1% PBT. Lavare i campioni 3 volte con 500 microlitri 0,1% PBT per 15 min ciascuno su un bilanciere a RT.
      NOTA: La procedura di lavaggio può essere effettuato a 4 ° C durante la notte. Conservare i campioni al buio.
  5. Montaggio dei campioni su vetrini
    1. Trasferire i campioni ad un vetrino con 0,1% PBT con una micropipetta.
      NOTA: per evitare bolle scomodi durante la dissezione e di montaggio, 0,1% PBT può essere sostituito con PBS.
    2. Per dell'ovaio, separare le stringhe dei ovarioli uno dall'altro con una pinza sotto un microscopio da dissezione. Non danneggiare le punte dei ovarioli contenenti le germaria. Per il complesso organo cervello-VNC-riproduttivo, rimuovere la cuticola residuo e sistemare la posizione su un vetrino.
    3. Rimuovere tanto eccesso PBT possibile e mettere una goccia di reagente di montaggio al centro dei campioni. Posizionare un vetrino lentamente con pinze.
    4. Conservare i campioni a 4 ° C. Conservare i campioni al buio.
"> 3. Imaging con un microscopio a scansione laser confocale

  1. Osservare i campioni al microscopio e portare gli organi steroidogenici nel campo di vista. Una volta che la visualizzazione è fissa, commutare il sistema di imaging per la modalità di acquisizione dell'immagine.
    NOTA: Le 10-20x lenti dell'obiettivo sono utilizzati per ottenere le immagini del complesso cervello RG o l'intero ovaio. In alternativa, i 40-63X lenti dell'obiettivo (acqua o immersione) vengono utilizzati per visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine ​​GSCs oi innervazione neuronali del PG e dell'ovaio.
  2. Impostare i parametri di acquisizione delle immagini sul software allegato. Selezionare la combinazione di fluorescenza (ad esempio GFP e RFP). Con procedura scansione veloce, regolare la potenza del laser, la sensibilità di rivelatori (guadagno / offset), e la dimensione del foro.
    NOTA: Per acquisire immagini ad alta qualità, la potenza del laser di scansione e la sensibilità del rivelatore (guadagno) devono essere ottimizzati per ogni campione. Per delineare la formadei tessuti, a-luce trasmessa immagine può essere preso in aggiunta a un'immagine fluorescente.
  3. Prendere pile Z delle immagini. Durante una scansione veloce continuo, spostare il piano focale con l'unità di messa a fuoco del microscopio e impostare la posizione iniziale e la posizione finale. Il numero di fette e la distanza tra le sezioni intervallo vengono regolati di conseguenza.
  4. Selezionare la velocità di scansione, il metodo di scansione, e la modalità di scansione bidirezionale.
  5. "Avviare i veri scansioni" per l'acquisizione di immagini.
  6. Salvare l'immagine con il formato del software allegato.
    NOTA: I file di immagine originali contengono le informazioni dei parametri di acquisizione dell'immagine e bilancia. Immagini esportate possono essere elaborati utilizzando un software di elaborazione delle immagini sul computer 22.

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Representative Results

Abbiamo usato i protocolli di cui sopra per visualizzare gli organi steroidogenici e dei loro organi interattivi in D. melanogaster larve e adulti di sesso femminile. Lo schema generale di protocolli è mostrato in Figura 1.

RG, compreso il PG (Figura 2D), è più piccolo e più trasparente del cervello e si trova sul lato antero-dorsale del cervello (Figura 2A-C e 3A-E). Per marcare le cellule PG, molti gruppi hanno generato vari tipi di anticorpi contro enzimi ecdysteroidogenic (cioè, Neverland 23, spookier 24, copertura 20, fantasma 25, Disembodied 25 e ombre 26). Tra questi, anti-Sindone (Sro) anticorpo è affidabile utilizzato per etichettare PG mediante immunocolorazione (Figura 2C, 2E e 3C). In alternativa, il binary sistema di espressione genica, GAL4 / UAS sistema 27 può essere usato per esprimere geni delle proteine fluorescenti nelle cellule PG. Attraverso l'analisi promotore del gene phantom ecdysteroidogenic (PHM), il promotore specifico PG può indurre l'espressione genica esclusivamente nel PG 28. Pertanto, le cellule PG possono essere specificamente visualizzati esprimendo GFP o RFP sotto il controllo di PHM-GAL4 # 22 (Figura 3D).

Per visualizzare la connessione neuronale tra il PG e il cervello, un gruppo di neuroni possono essere etichettati mCD8 :: GFP sotto il controllo di vari driver e anticorpi GAL4 (figura 2c, 2e, 3D e 3E). La banca dati flylight delle collezioni della linea GAL4 è ottimizzato per i neuroni di etichettatura 29. Tra questi, GMR45C06-GAL4 etichette neuroni (Figura 2C ed E) PG-sporgente. l'immunostaining di GFP esprimente larve con l'anticorpo anti-GFP è efficace nel migliorare i segnali GFP. Inoltre, TRH-GAL4> mCD8 :: GFP larve mostrano il sistema nervoso stomatogastric, in quale progetto neuroni serotoninergici non solo il PG, ma anche al proventricolo (PV, foregut insetti) ed i muscoli faringei (PM) (Figura 3D e E) 20, 30. Pertanto, è fondamentale per mantenere la posizione del RG, il cervello e gli altri tessuti circostanti durante dissezioni filetto (Figura 3).

Nelle femmine adulte, ecdysteroid ovarico colpisce molti aspetti della ovogenesi, come il GSC la proliferazione, la differenziazione cisti, la crescita camera delle uova, e la risposta allo stress 11. Come nel PG, enzimi ecdysteroidogenic nell'ovaio vengono visualizzati anche con gli anticorpi specifici sopra descritti 12, 31.Come un evento a valle su cui ecdysteroids atto, il numero di GSCs nel germarium è il nostro fuoco (Figura 4). Sebbene la germarium è un insieme di diversi tipi di cellule, GSCs sono specificati mediante immunocolorazione con due anticorpi marcatori GSC, 1B1 e D E-caderina 32. Per visualizzare l'innervazione dell'ovaio, dell'ovaio è sezionato con il cervello, VNC, intestino, coltivazione, utero, e spermateca (Figura 5). Neuroni sono visualizzate mediante mCD8 :: GFP sotto il controllo di nSyb-GAL4, un driver pan-neuronale (Figura 5B e D). Muscoli intorno ovaio, utero, intestino e sono colorate con falloidina colorante-coniugato.

Figura 1
Figura 1: Lo schema generale di protocolli. Due metodi per dissezione distinti sono applicin grado di larve e femmine adulte, a seconda dello scopo degli esperimenti. I metodi di montaggio sono concepite in base alle condizioni del campione. Fissazione, colorazione, e di imaging tecniche sono sostanzialmente comuni a tutti i campioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Visualizzazione del PG ei neuroni PG-sporgenti. (A e B) La ghiandola cervello-ring (RG), complesso di tipo selvaggio 3 ° larva. In (B), il PG è delimitata da linee tratteggiate. La struttura filamentosa tra il cervello e il RG è la trachea. (C - E) L'innervazione del PG è stato visualizzato con mCD8 ::GFP guidato da GMR45C06-GAL4 in collezione flylight. I neuroni PG e GFP-positive sono state marcate con anticorpi anti-Sro (magenta) e anticorpo anti-GFP (verde), rispettivamente. L'immagine fluorescente viene unita l'immagine a luce trasmessa con per specificare il contorno dei tessuti. In (D), il PG, corpora allata (CA) e il corpora cardiaca (CC) sono illustrate. I neuroni PG-sporgenti sono più prominenti l'immagine ad alta potenza con 40X lente obiettivo (frecce E) l'immagine a bassa potenza con 10X lente obiettivo (C) rispetto. bar scala = 100 pm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Le Stomatogastric Progetti Sistema Nervoso al PG, PV, un ND il PM. (A e B) La dissezione filetto di un wild-type 3 ° larva. Le posizioni del PG, del cervello (Br), cordone nervoso ventrale (VNC), i dischi degli occhi (ED), i dischi ala (WD), della faringe muscolare (PM), e proventricolo (PV) rimangono intatti. (C) Il PG è stato etichettato esclusivamente con anticorpo anti-Sro (magenta). (D) Il PG è stato marcato con turboRFP guidata da PHM-GAL4 # 22. neuroni serotoninergici sono stati etichettati con 5HT anti-anticorpo (verde). (E) Il sistema nervoso stomatogastric è stata visualizzata con mCD8 :: GFP guidato da TRH-GAL4. neuroni serotoninergici proiettano al PG, il PM, e il PV (frecce). La barra di scala = 100 pm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: La Germaria di Wild-type mosche contenente uno, due, o tre GSCs. (A) Una panoramica dell'organo riproduttivo femminile. Un ovaio è composto da 16-20 ovarioli che sono stringhe di camere d'uovo. Il germarium, dove si trovano GSCs, è sulla punta di ogni ovariole. (B - D) una, due, o tre GSCs si trovano in ogni germarium (bianco cerchi punteggiati) delle femmine wild-type. GSCs sono colorate con anticorpo 1B1 (verde), che etichetta una struttura sferica chiamato spectrosome (frecce) ed una struttura citoscheletrica membranosa nota come fusome. I bordi delle celle sono visualizzate con l'anticorpo D E-caderina anti- (magenta). La barra di scala = 10 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Fo: together.within-page keep-=" 1" > Figura 5
Figura 5: la femmina organi riproduttivi ed i loro organi interattivi. (A) L'ovaio (Ov), intestino (Gut), coltivazione (Cr), cervello (Br), cordone nervoso ventrale (VNC), e spermateca (Sp) sono stati sezionati al microscopio. (B - D) L'innervazione dell'ovaio è stata visualizzata con mCD8 :: GFP guidato da nSyb-GAL4. neuroni GFP-positive estendono dal VNC (freccia), sporgente alla superficie delle ovaie (frecce). Le ovaie sono delineati da linee tratteggiate. I campioni sono stati colorati con anticorpo anti-GFP (verde) e colorante-coniugato falloidina (magenta). Falloidina associa l'actina filamentosa dei muscoli intorno alle ovaie (Ov) e l'utero (Ut). L'illustrazione è mostrato in C. La barra Scala = 200 pm.rge.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo studiato biosintesi ecdysteroid e il suo meccanismo di regolazione in D. melanogaster, ed ideato un protocollo per la dissezione e immunocolorazione. I tempi di biosintesi ecdysteroid è influenzato da stimoli ambientali attraverso ingressi neuronali 33, quindi è essenziale per mantenere l'innervazione degli organi ecdysteroidogenic insieme al cervello, VNC, e altri tessuti durante la dissezione.

Come descritto sopra, il D. melanogaster PG forma un complesso RG organo endocrino con l'allata corpora (CA) e l'cardiaca corpora (CC) (Figura 2D). Mentre il PG produce ecdysteroids, il CA e CC producono neotenina e ormone adipokinetic, rispettivamente. Questa struttura anatomica è stata un ostacolo per i ricercatori che studiano ecdysteroidogenesis in D. melanogaster, rispetto ad altri insetti. Tuttavia, negli ultimi decenni, volare genetica has ha permesso di identificare molti geni ecdysteroidogenic che sono specificamente indicato nella PG 4. Questi geni sono espressi in cellule infermiere o cellule follicolari dell'ovaio 34, 35. Ora si può usare un unico insieme di profili di espressione genica in organi ecdysteroidogenic, rendendo possibile specificare le cellule ecdysteroidogenic di immunoistochimica e tecniche transgeniche.

Durante la dissezione, è essenziale utilizzare una pinza sottile con bordi taglienti. Prima di dissezione, i bordi delle pinze possono essere affilate con una mola Arkansas per portare i bordi insieme senza interruzioni. Durante la dissezione, detriti o tessuti residui, come il grasso corporeo, l'intestino, ed i dischi imaginali, deve essere rimosso il più possibile. In particolare, i pezzi di corpo grasso facilmente attaccano al tessuto di interesse. Inoltre, il montaggio dei campioni su vetrini Occorre inoltre eseguireed attenzione. Un complesso di tessuti può iscomposti e disordinati quando un vetrino viene posto sui campioni in mezzo di montaggio appiccicoso. Pertanto, un numero sufficiente di campioni deve essere sezionato, e campioni adatti deve essere scelto per l'imaging, come quelle in cui l'RG o dell'ovaio è sul lato superiore e le connessioni neuronali rimangono intatti.

Per eseguire immunostaining successo e per ottenere risultati riproducibili, è fondamentale per mantenere le stesse condizioni per le procedure di campionamento e di manipolazione. L'entità della immunocolorazione altamente dipende dalle condizioni dei singoli animali al momento del campionamento e fissazione. Ad esempio, l'età degli animali, le temperature di allevamento, condizioni di nutrienti, e il tempo di dissezione deve essere attentamente valutata. Per ridurre al minimo gli errori di manipolazione di fissazione in molteplici esperimenti, abbiamo attentamente continuiamo quasi pari numero di campioni per coordinare il tempo di dissezione e tempi di reazione di fissazione. Per la fissazione soluzione, è usato 4% paraformaldeide o 3,7% di formaldeide. Poiché paraformaldeide viene rapidamente degradata nel tempo, la sua polvere viene sciolta a fare 10% soluzione madre in PBS, e aliquote vengono conservati a -20 ° C. Le aliquote sono scongelati per rendere la soluzione fresca correzione 4% prima di ogni dissezione. Inoltre, le ampie fasi di lavaggio di campioni ridurre la colorazione di fondo aspecifica.

Nella fase di acquisizione delle immagini, seguiamo protocollo del produttore per la microscopia confocale. Il sistema di microscopia fornisce un'interfaccia facile da usare per ricercatori o studenti, in modo tale che gli insiemi ottimali di filtri di eccitazione / emissione vengono selezionati automaticamente quando vengono specificati i tipi di fluoroforo. Mentre il sistema di microscopia è facile da usare, si ha la necessità di ottimizzare i parametri di acquisizione delle immagini su ciascun campione o ciascun piano focale, cambiando il guadagno del rivelatore, velocità di scansione, numeri di scansione, e la dimensione pinhole.

36. Per ovviare a questo problema, la tecnica di knock-in può essere applicato a inserire una HA-tag nel locus genico di bordo ouija usando il sistema CRISPR / Cas9. Usando tali tecniche transgeniche in combinazione con immunocolorazione, almeno 3-4 proteine ​​possono essere contemporaneamente visualizzati nel PG o delle ovaie. In contrasto con la localizzazione delle proteine, tuttavia, un metodo per visualizzare ecdysteroids endogeni mediante immunocolorazione non è stata stabilita. Una volta che l'anticorpo anti-ecdysteroid è disponibile per immunostaining, le localizzazioni subcellulari di biosintesi ecdysteroid e il trasporto di ecdysteroid possono essere studiate in futuro. Un'altra limitazione è che la dinamica temporale delle ecdysteroidogenesis non possono essere esaminate in tessuti fissati. Considerando che il titolo ecdysteroid è oscillato lungo gli stadi di sviluppo, l'attività degli organi ecdysteroidogenic e neuroni sporgenti deve essere temporalmente regolata in risposta a vari stimoli ambientali. Un recente studio ha monitorato il Ca 2+ dinamica delle cellule PG utilizzando tecniche di imaging in tempo reale 37. Per le applicazioni future, stiamo attualmente sviluppando un protocollo per l'imaging dal vivo di PG o ovaie coltivate insieme con i loro neuroni sporgenti. Rispetto ai metodi esistenti, questo nuovo protocollo mira a visualizzare l'attività dei neuroni e dei loro organi bersaglio contemporaneamente. Una volta che l'attività dei neuroni può essere monitorata con il Ca 2 + indicatore GCaMP o Cameleon 38, può essere manipolato con approcci optogenetic o thermogenetic al momento opportunoS 39. Questi metodi contribuiscono a una comprensione globale di steroide biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione neuronale.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo Reiko Kise e Tomotsune Ameku per il loro supporto tecnico per questo lavoro. Siamo anche grati a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, il Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e il Developmental Studies Ibridoma Banca per le scorte e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a YSN da JSPS KAKENHI Concessione Numero 16K20945, la Fondazione Naito, e il Premio Ricerca Scienza Inoue; e da una sovvenzione alla RN da MEXT KAKENHI Concessione Numero 16H04792.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

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References

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Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

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