Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Protokoller til visualisering steroidogeniske organer og deres interaktive organer med Immunfarvning i bananfluen Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55519
Automatic Translation
*1, *1, *2, 3
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en protokol for dissektion, fiksering og immunfarvning af steroidogene organer i Drosophila larver og voksne kvinder at studere steroidhormon biosyntese og dens reguleringsmekanisme. Foruden steroidogene organer, vi visualisere innervation steroidogene organer samt steroidogene målceller såsom germlinie stamceller.

Abstract

I flercellede organismer, er en lille gruppe af celler udstyret med en specialiseret funktion i deres biogene aktivitet, inducere en systemisk reaktion på vækst og reproduktion. I insekter, larve prothoracic kirtel (PG) og de voksne kvindelige æggestok play væsentlige roller i biosyntese de vigtigste steroid hormoner kaldet ecdysteroid. Disse ecdysteroidogenic organer innerveret fra nervesystemet, hvorigennem timingen af ​​biosyntesen påvirkes af miljømæssige signaler. Her beskriver vi en protokol til visualisering ecdysteroidogenic organer og deres interaktive organer i larver og voksne i bananfluen Drosophila melanogaster, som giver en egnet modelsystem til at studere steroid hormon biosyntese og dens reguleringsmekanisme. Dygtige dissektion giver os mulighed for at opretholde holdninger ecdysteroidogenic organer og deres interaktive organer, herunder hjernen, den ventrale nerve ledning, og andre væv. Immunfarvning med enntibodies mod ecdysteroidogenic enzymer, sammen med transgene fluorescens-proteiner drevet af vævsspecifikke promotorer, er tilgængelige til at mærke ecdysteroidogenic celler. Desuden kan de innervationer af ecdysteroidogenic organer også mærkes med specifikke antistoffer eller en samling af GAL4 bilister i forskellige typer af neuroner. Derfor kan ecdysteroidogenic organer og deres neuronforbindelser visualiseres samtidigt af immunfarvning og transgene teknikker. Endelig beskriver vi, hvordan at visualisere kimcellelinje stamceller, hvis proliferation og vedligeholdelse styres af ecdysteroid. Denne fremgangsmåde bidrager til omfattende forståelse af steroidhormon biosyntese og dens neuronal reguleringsmekanisme.

Introduction

I flercellede organismer, er en gruppe af celler udstyret med en specialiseret funktion i deres biogene aktivitet, der er afgørende for hele kroppen. At opfylde deres opgaver, hvert væv eller organ udtrykker en række gener relateret til deres funktioner, og kommunikerer med andre væv til at organisere deres aktiviteter i forbindelse med udvikling. At karakterisere sådanne specialiserede cellulære funktioner og inter-organ-vekselvirkninger, skal vi angive en gruppe af celler sammen med andre typer af celler holdes intakt i flercellede arkitektur.

Et eksempel på sådanne specialiserede organer er en steroidogeniske organ, hvor mange biosynteseenzymer medierer trinene konvertering fra cholesterol til aktive steroidhormoner 1. De fleste af disse enzymgener udtrykkes specifikt i steroidogene organer og biosyntesevejen er stramt reguleret af mange ydre stimuli via humorale input og neuronale input. Enkelt gangsyntetiserede, steroidhormoner udskilles i hæmolymfe og er målrettet mod mange væv og organer til regulering af ekspression af en række gener 2. Derfor virkningen af ​​et steroid hormon inducerer en systemisk reaktion på opretholde homøostase, vækst og reproduktion.

For at undersøge funktionerne af steroidhormon biosyntese og pleiotropiske virkninger af steroidhormoner, kan Drosophila melanogaster anvendes som et egnet modelsystem. Under larvestadierne, insektet steroidhormon, ecdysteroid, biosyntetiseres i en specialiseret endokrine organ kaldet prothoracic kirtel (PG) 3. I PG, flere ecdysteroidogenic enzymer specifikt katalyserer de multiple omdannelsestrin fra cholesterol til ecdyson, som styrer molting og metamorfose på de passende udviklingsstadier 4. Derfor er en dynamisk ændring i ecdysteroid titer reguleretaf mange signalveje som reaktion på miljømæssige signaler. På den anden side, i det voksne stadium, ecdysteroid spiller væsentlige roller i fysiologi, herunder reproduktion, søvn, hukommelse og levetid 5, 6, 7, 8. Det er kendt, at ecdysteroid aktivt biosyntetiseres i ovariet, regulering af progressionen af oogenesen 6, 7, 8, 9, 10, 11. For nylig har vi rapporteret, at antallet af germlinie stamceller (GSCS) påvirkes af ecdysteroid og køn peptid signalering som respons på parring stimuli 12.

Kraftfulde værktøjer D. melanogaster genetik og cellebiologi, herunder godt kommenteret genom information, binær genekspressionssystemer og transgene RNAi teknikker, har gjort det muligt at identificere gener essentielle for ecdysteroid biosyntese i PG og ovarie 13, 14, 15. Når ecdysteroidogenic gener er identificeret, kan den transkriptionelle regulering af disse gener og de dynamiske lokaliseringer af genprodukter undersøges i biosyntesevejen 16. Til dette formål, kvantitativt-revers transkription-PCR, RNA in situ hybridisering og immunohistologisk analyse udføres. Anvendelsen af ​​disse teknikker omfatter en udfordrende opgave; den omfattende dissektion af PG eller æggestokkene. Især PG af bananfluen er relativt mindre end for andre insekter (f.eks avlen og spyflue), så er man nødt til at praktisere den vitale færdigheder af frugt flyve dissektion for prøvetagning. Endvidere begge ecdysteroidogenic organer modtager innervations fra centralnervesystemet (CNS) 17, 18, 19, 20. Således for nøjagtige anatomiske analyser, de ecdysteroidogenic organer bør holdes intakt sammen med CNS og andre organer, for ikke at forstyrre deres neuronale forbindelser.

Her giver vi protokoller for dissektion og visualisering af steroidogene organer i D. melanogaster. At lære dissektion teknikken er det centrale udgangspunkt for disse eksperimenter. Derudover kan man med held mærke de steroidogene organer samt deres interaktive organer med flere antistoffer og GAL4 driver linjer. At udnytte disse teknikker, materialer og genetik, kan man studere de omfattende mekanismer steroidhormon biosyntese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: generelle opbygning af protokoller er vist i figur 1.

1. Dissektion af Larver Ring kirtel (RG)

BEMÆRK: I D. melanogaster, som tilhører cyclorrhaphous Diptera, PG er inden for en sammensat endokrint organ kaldet ringen kirtel (RG, figur 2D). Da det er umuligt at PG kirurgisk er adskilt fra andre typer af celler (omtalt senere), et praktisk mål er at isolere et intakt, ubeskadiget RG ved dissektion.

  1. Fremstilling af larver på de passende udviklingsstadier
    BEMÆRK: For at synkronisere de udviklingsmæssige stadier af D. melanogaster larver, er det nødvendigt at indsamle æg inden for et snævert tidsvindue og til at indsamle larver på passende tidspunkter.
    1. Indsamle æg til 2 timer på en drue-saft agarplade ved 25 ° C.
    2. Indsamle nyudklækket 1 BEMÆRK: alder af larver er repræsenteret ved "timer efter æglægning (hæl)", "timer efter udklækning (HAH)", eller "timer efter L3 skalskifte (hAL3E)".
    3. På et passende tidspunkt, indsamle den gradvise larver med en engangs plastik loop for at undgå uønsket skade. For at minimere en forskel i udviklingsmæssig progression af 3. stadiums larver, indsamle den 2. stadiums larver ved 70 hæl (48 HAH) og tillade dem at molt i 2 timers intervaller. Derefter, indsamle den 3. stadiums larver inden 2 timer efter den L3 skalskifte; denne procedure giver 0-2 hAL3E larver.
    4. Overfør den trinvise larver til en skål fyldt med phosphatpufret saltvand (PBS).
    5. Skyl larverne med PBS for at fjerne tilbageværende fødevarer fra kroppen.
  2. Grov dissektion af larver under endissektionsmikroskop
    1. Hold munden krog af en larve med pincet. Overskære larve legeme ved den forreste tredjedel af kroppens længde hjælp af mikro saks.
    2. Hold den afskårne ende af den forreste larvestadiet krop med en pincet. Bruge den anden tang, forsigtigt skubbe spidsen af ​​hovedet mod det indre af legemet; denne procedure vender larvestadiet krop indefra og ud.
      BEMÆRK: Dette trin kan springes over for dissektion af 1. stadie larver.
    3. Gentag trin 1.2.1-1.2.2 med yderligere larver i 5-10 min.
      BEMÆRK: Antallet af larver skal være lig med eller mindre end 20 for at spare tid til dissektion.
  3. Mørbrad dissektion af larver
    BEMÆRK: Denne metode tillader at holde positionen af ​​væv til at forblive intakt.
    1. Lad larver i vand kun i 1 time. Larverne immobiliseres på grund af kvælning.
    2. Sætte en larve dorsalsiden med en dråbe PBS på en silicium-belagtfad, med dens dorsale side op.
      BEMÆRK: Den dorsale side har 2 tracheale rør kører langs.
    3. Under et dissektionsmikroskop, indsætte et insekt stift ind i det forreste spids af larve med pincet. Stræk larve krop til den bageste side og sætte en anden stift i bageste spids på larve.
      BEMÆRK: Ud over insekt stifter, kan en nål fremstillet af en wolframtråd være nyttigt 21. En nål kan indlejres i en pipettespids ved opvarmning til anvendelse som et dissekerende nål.
    4. Under et dissektionsmikroskop, lave et lille snit i nærheden af ​​halen med mikro saks. Fra snittet, sender den dorsale kutikula længderetningen langs den dorsale midtlinie mod hovedet. Pas på ikke at beskadige væv under neglebånd.
    5. Strække bodywall cuticula på hver side og placere 4 ben i hvert hjørne af det dissekerede bodywall.
    6. Fjerne en del af forreste fedt kroppen med pincet for at synliggøre hjernen-RG complex blive eksponeret på overfladen. Fjern et par spytkirtler, hvis det er nødvendigt.
  4. Fiksering og farvning af væv med immunohistokemi
    1. Sætte den forreste tredjedel af larve- organer (trin 1.2.2) i et 1,5 ml mikrorør fyldt med 500 pi rettelsen opløsning (4% paraformaldehyd i PBS). Fix mindre end 20 prøver på én gang, ellers PBS knyttet til de faste prøver kan forårsage en ugunstig fortynding af fiksativ. For mørbrad dissektion, fjerne en dråbe PBS og derefter tilføje en dråbe fix opløsning.
      BEMÆRK: fix opløsning, kan enten 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehyd anvendes.
    2. Inkubere de dissekerede væv i fix opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) eller alternativt i 2 timer ved 4 ° C.
    3. Erstatte fix opløsning med 500 pi PBS og hurtigt skylles prøverne 3 gange. Vask prøverne med 500 pi 0,3% PBT (PBS + 0,3% octylphenolethoxylat) i 15 minutter på en rocker ved RT. For mørbrad dissektion, fjern insekt stifter og overføre prøver til et 1,5 ml mikrorør.
      BEMÆRK: forøge permeabiliteten af ​​antistoffer i væv, behandles prøverne med 500 pi 2,0% PBT i 1-2 timer på en rocker ved stuetemperatur.
    4. Erstat PBT med 500 pi blokerende opløsning (2% bovint serumalbumin i PBT). Inkuber prøverne i 1,5 timer på en rocker ved stuetemperatur.
    5. Erstatte blokeringsopløsningen med 50 pi det primære antistof opløsning, dvs. antistoffer fortyndet i blokeringsopløsningen.
    6. Inkuber prøverne natten over på en rocker ved 4 ° C.
    7. Udskifte den primære antistofopløsning med 500 pi 0,3% PBT og hurtigt skylles prøverne 5 gange. Vask prøverne 3 gange med 500 pi 0,3% PBT i 15 minutter hver på en rocker ved stuetemperatur.
    8. Erstatte 0,3% PBT med 50 pi det sekundære antistof opløsning (dye-konjugerede antistoffer fortyndet i blokeringsopløsningen). For nuklear farvning, 0,5 pi 4' , 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,1 mg / ml stamopløsning) sættes til 50 pi opløsning. Inkuber prøverne på en rocker i 2 timer ved stuetemperatur eller alternativt ved 4 ° C natten over.
      BEMÆRK: Hold prøverne i mørke.
    9. Erstatte antistofopløsningen med 500 pi 0,3% PBT og skyl 5 gange. Vask prøverne 3 gange med 500 pi 0,3% PBT i 15 minutter hver ved stuetemperatur.
  5. Fint dissektion af hjernen-RG kompleks indeholdende PG og montering
    1. Brug en engangspipette at overføre immunfarvede prøver til et fad fyldt med 0,3% PBT.
      BEMÆRK: For at undgå generende bobler under dissektion og montage, kan 0,3% PBT erstattes med PBS.
    2. Under et dissektionsmikroskop, holde kutikula eller munden krog med en pincet. Under anvendelse af en 27 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte som en "kniv", sender den forreste spids af spiserøret og øje diske til fjernelse af hjernen-RG-eye disc komplekset fra legemet kutikula.
    3. Sepabedømme spiserøret og tarmen fra hjernen-RG-eye disc kompleks med pincet. Da spiserøret passerer gennem hjernen over den ventrale nerve ledning (VNC) trækkes ud tarmen til den bageste side.
      BEMÆRK: For at fjerne ekstra imaginalskiver fra prøverne, skæres forbindelserne mellem hjernen, øjet diske, og ben diske med en nål kniv.
    4. Gentag trinene 1.5.1-1.5.4 for andre prøver.
      BEMÆRK: For at undgå vævsrester klistrer til prøverne, overføre hver afsluttet prøve til en anden ren skål fyldt med 0,3% PBT eller PBS.
    5. Overfør prøverne til midten af ​​et rent objektglas med en mikropipette.
      BEMÆRK: 2. eller 3. stadiums larver, bør enden af en mikropipettespids blive afkortet med et barberblad.
    6. Under et dissektionsmikroskop, tilslutter individuelle prøver med deres dorsale side op ved hjælp af pincet.
      BEMÆRK: RG er placeret på den dorsale side af hjernen (figur 2A). Denne tilpasning letter specifikation af individuelle prøver under afbildning.
    7. Vippe et objektglas og tør så meget overskud PBT som muligt. Sæt en dråbe montering reagens på en side af slæden. Placer kanten af ​​et dækglas fra den anden side af dråben og sætte dækglasset på prøverne langsomt med en pincet.
      BEMÆRK: Denne procedure forhindrer prøverne i at bevæge sig uden for dækglasset.
    8. Opbevare prøverne ved 4 ° C. Hold prøverne i mørke.

2. Dissektion af Ovary i voksne hunner

  1. Fremstilling af voksne hundyr
    1. Feed kvindelige flyver med standard gær / majsmel flyve mad i 3-4 dage for at opfede op æggestokkene. Opretholde ved 25 ° C.
  2. Dissektion af den voksne kvindelige æggestok
    1. Anesthetize kvindelige flyver med CO2 gas og afbrød deres hoveder.
    2. Overfør flyve organer til en 3 cm skålfyldt med PBS.
    3. Under et dissektionsmikroskop, holde thorax på den dorsale side ved hjælp af pincet. Forstå den abdominale segment A5 eller A6 med de andre pincet og bortskrælle abdominale kutikula mod den bageste side. Tør den klistrede neglebånd fra spidsen af ​​tangen.
    4. Klem en æggeleder og tag æggestok fra kroppen.
    5. Kam og sprede spidsen af ​​æggestokkene med pincet.
      BEMÆRK: Denne funktion forbedrer effektiviteten af ​​immunfarvning.
  3. Dissektion af voksne kvindelige hjerne, VNC og reproduktive organer.
    BEMÆRK: Denne fremgangsmåde tillader innervation af æggestok skal holdes intakt.
    1. Anesthetize kvindelige flyver med CO2 gas og overføre dem til en silicium-belagt skål fyldt med PBS.
    2. Under et dissektionsmikroskop, holde snabel og bortskrælle hovedet neglebånd at eksponere hjernen med pincet. Fjern luftrøret knyttet til hjernen.
      BEMÆRK: brain er en hvid og afrundet struktur. Hjernen forbinder til VNC i brystkassen.
    3. Hold brystkassen på den dorsale side og afskære benene og vinger med en pincet. Bruge den anden tang, bortskrælle thorax ventrale kutikula fra baserne af benene. Når VNC er eksponeret, fjernes det resterende dorsale kutikula og muskler forbundet med VNC ved anvendelse af pincetter. Pas på ikke at beskadige forbindelsen mellem hjernen og VNC.
    4. Pincet for bortskrælle abdominale kutikula og blotlægge ovarie- og deres interaktive organer, herunder neuroner, afgrøden, tarmen, æggelederen, livmoderen, og accessary kirtel.
    5. Fjern de resterende væv, herunder luftrør og fedt kroppen ved hjælp af pincet.
  4. Fiksering og farvning af væv med immunohistokemi
    1. Overfør ca. 8-10 par af æggestokkene til et 1,5 ml mikrorør fyldt med 250 pi rettelsen opløsning (4% paraformaldehyde i PBS) og inkuber prøverne i 30 minutter ved stuetemperatur.
    2. Erstatte fix opløsning med 500 pi PBS og hurtigt skylles prøverne 3 gange.
    3. Vask prøverne 2 gange med 500 pi 0,1% PBT i 5 minutter hver ved stuetemperatur.
    4. Erstat PBT med 50 pi blokerende opløsning. Inkuber prøverne i 1 time på en rocker ved stuetemperatur.
    5. Erstatte blokeringsopløsningen med 50 pi det primære antistof opløsning.
    6. Inkuber prøverne natten over på en rocker ved 4 ° C.
    7. Udskifte den primære antistofopløsning med 500 pi 0,1% PBT. Vask prøverne 3 gange med 500 pi 0,1% PBT i 15 minutter hver på en rocker ved stuetemperatur.
    8. Erstatte 0,1% PBT med 50 pi sekundært antistof opløsning. For nuklear farvning, tilsættes 0,5 uL DAPI til 50 uL løsningen. Inkuber prøverne i 2 timer på en rocker ved stuetemperatur.
    9. Udskifte det sekundære antistof opløsning med 500 pi 0,1% PBT. Vask prøverne 3 gange med 500 pi 0,1% PBT i 15 minutter hver på en rocker ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Vaskeproceduren kan gøres ved 4 ° C natten over. Hold prøverne i mørke.
  5. Montering af prøverne på objektglas
    1. Overfør prøverne til et objektglas med 0,1% PBT under anvendelse af en mikropipette.
      BEMÆRK: For at undgå generende bobler under dissektion og montage, kan 0,1% PBT erstattes med PBS.
    2. For ovarie, adskille strengene af ovarioles fra hinanden med pincet under et dissektionsmikroskop. Må ikke skade spidsen af ​​ovarioles der indeholder germaria. For hjernen-VNC-reproduktionsorganer kompleks, fjernes resterende kutikula og arrangere positionen på et objektglas.
    3. Tør så meget overskud PBT som muligt og sætte en dråbe montering reagens i centrum af prøverne. Placer et dækglas langsomt med en pincet.
    4. Opbevare prøverne ved 4 ° C. Hold prøverne i mørke.
"> 3. Imaging med en Konfokal Laser Scanning Microscope

  1. Overhold prøverne under mikroskop og bringe steroidogene organer i synsfeltet. Når visningen er fast, skifte imaging system til købet billedtilstand.
    BEMÆRK: 10-20x objektive linser bruges til at opnå billeder af hjernen-RG kompleks eller hele æggestok. Alternativt er de 40-63X objektivlinser (vand eller nedsænkning olie), der anvendes til visualisering af subcellulære lokalisering af proteiner i GSCS eller de neuronale innervationer af PG og ovariet.
  2. Opsæt parametrene for erhvervelse billede på vedlagte software. Vælg kombinationen af fluorescens (f.eks GFP og RFP). Ved hurtig scanning procedure, justere lasereffekten, følsomheden af ​​detektorer (Gain / Offset), og størrelsen af ​​pinhole.
    BEMÆRK: For at hente billeder med høj kvalitet, bør scanning lasereffekt og følsomheden af ​​detektoren (Gain) optimeres for hver prøve. At skitsere formenaf væv, kan et transmitteret lys billede tages ud over en fluorescerende billede.
  3. Tag Z stakke af billederne. Under en kontinuerlig hurtig scanning, skal du flytte fokusplanet med fokus drevet af mikroskopet og indstille startpositionen og slutpositionen. Antallet af skiver og intervallet afstanden mellem skiverne justeres i overensstemmelse hermed.
  4. Vælg scanningshastighed, scanningen metode, og den tovejs scanning.
  5. "Start de virkelige scanner" for billedoptagelse.
  6. Gem billedet med det format af vedlagte software.
    BEMÆRK: De originale billedfiler indeholde de oplysninger om erhvervelse billede parametre og vægt. Eksporterede billeder kan blive behandlet i et billedbehandlings-software på computeren 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brugte de ovennævnte protokoller til at visualisere steroidogene organer og deres interaktive organer i D. melanogaster larver og voksne kvinder. Den samlede ordning af protokoller er vist i figur 1.

RG, herunder PG (figur 2D), er mindre og mere gennemsigtige end hjernen og er placeret ved den forreste-dorsale side af hjernen (figur 2A-C og 3A-E). At mærke PG-celler har adskillige grupper genereret forskellige typer af antistoffer mod ecdysteroidogenic enzymer (dvs. Neverland 23, spookier 24, Shroud 20, Phantom 25, disembodied 25 og Shadow 26). Blandt disse anti-Shroud (Sro) antistof pålideligt anvendes til mærkning af PG ved immunofarvning (figur 2C, 2E og 3C). Alternativt binary Genekspressionssystem, GAL4 / UAS systemet 27, kan anvendes til at udtrykke fluorescerende protein-gener i PG-celler. Gennem promotoren analyse af ecdysteroidogenic gen fantom (phm), kan PG-promotor inducerer genekspression udelukkende i PG 28. Derfor kan PG-celler specifikt visualiseret ved at udtrykke GFP eller RFP under kontrol af phm-GAL4 # 22 (figur 3D).

At visualisere den neuronale forbindelse mellem PG og hjernen, kan en gruppe af neuroner mærkes med mCD8 :: GFP under kontrol af forskellige GAL4 drivere og antistoffer (figur 2C, 2E, 3D, og 3E). Den FlyLight database over GAL4 line kollektioner er optimeret til mærkning af neuroner 29. Blandt dem, GMR45C06-GAL4 etiketter PG-ragende neuroner (figur 2C og E). den immunostaining af GFP-udtrykkende larver med anti-GFP-antistof er effektive til forstærkning GFP signaler. Desuden TRH-GAL4> mCD8 :: GFP larver vise stomatogastric nervesystem, hvor serotonerge neuroner projekt til ikke kun PG, men også til proventriculus (PV, insekt fortarm) og svælg muskler (PM) (Figur 3D og E) 20, 30. Derfor er det kritisk at opretholde positionen af RG, hjernen, og de andre omgivende væv under fillet dissektioner (figur 3).

I voksne hunner, ovarie ecdysteroid påvirker mange aspekter af oogenese, såsom GSC proliferation, cyste differentiering, æg vækstkammeret, og stressrespons 11. Som i PG, er ecdysteroidogenic enzymer i ovariet også visualiseret med de specifikke antistoffer, der er beskrevet ovenfor 12, 31.Som en nedstrøms begivenhed, hvorpå ecdysteroid handling, antallet af GSCS i germarium er vores fokus (figur 4). Selvom germarium er en samling af flere celletyper, er GSCS specificeret ved immunofarvning med to GSR markør antistoffer, 1B1 og D E-cadherin 32. At visualisere innervation i æggestokkene, er ovariet dissekeret sammen med hjernen, VNC, tarm, afgrøde, uterus, og spermatheca (figur 5). Neuroner er visualiseret ved mCD8 :: GFP under kontrol af nSyb-GAL4, en pan-neuronal driver (figur 5B og D). Musklerne omkring ovarie, uterus, og tarmen farves med farvestof-konjugeret phalloidin.

figur 1
Figur 1: Den samlede opbygning af protokoller. To distinkte dissektionsmetode er APPLICi stand til at larver og voksne kvinder, afhængigt af formålet med forsøgene. Monteringsmidlerne fremgangsmåder er også udtænkt ifølge prøvebetingelser. Fiksering, farvning, og billeddiagnostiske teknikker er dybest set fælles for alle prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Visualisering af PG og PG-udragende neuroner. (A og B) Hjernen-ring kirtel (RG) kompleks af vildtype 3. stadiums larve. I (B), er PG skitseret med stiplede linier. Den filamentøse struktur mellem hjernen og RG er luftrøret. (C - E) Den innervation af PG blev visualiseret med mCD8 ::GFP drevet af GMR45C06-GAL4 i FlyLight samling. PG og GFP-positive neuroner blev mærket med anti-Sro antistof (magenta) og anti-GFP-antistof (grøn), hhv. Den fluorescerende billede er lagt sammen med den transmitterede lys billede for at specificere omridset af væv. I (D), PG, corpora allata (CA) og corpora cardiaca (CC) er illustreret. PG-udragende neuroner er mere fremtrædende i høj effekt billede med 40X objektiv (pile i e) end den energibesparende billede med 10X objektiv linse (C). Målestok = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: The Stomatogastric Nervous System Projects til PG, PV, en nd PM. (A og B) den filet dissektion af en vildtype 3. stadiums larve. Positionerne af PG, hjerne (Br), ventrale nerve ledning (VNC), øje diske (ED), fløj diske (WD), svælg muskel (PM), og proventriculus (PV) forbliver intakte. (C) PG blev udelukkende mærket med anti-Sro antistof (magenta). (D) PG blev mærket med turboRFP drevet af phm-GAL4 # 22. Serotonerge neuroner blev mærket med anti-5HT-antistof (grøn). (E) Det stomatogastric nervesystem blev visualiseret med mCD8 :: GFP drevet af TRH-GAL4. Serotonerge neuroner projicerer til PG, PM, og PV (pile). Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

filer / ftp_upload / 55.519 / 55519fig4.jpg"/>
Figur 4: Germaria af vildtype Fluer indeholdende ét, to eller tre GSCS. (A) En oversigt over den kvindelige reproduktive organ. En æggestok er sammensat af 16-20 ovarioles der er strenge af æg kamre. Den germarium, hvor GSCS er placeret, er på spidsen af ​​hver ovariole. (B - D) En, to eller tre GSCS er placeret i hvert germarium (hvide stiplede cirkler) af hunnerne vildtype. GSCS farves med 1B1-antistof (grøn), hvilke etiketter en sfærisk struktur kaldet spectrosome (pile) og en membranøs cytoskeletale struktur kaldet fusome. De cellegrænser visualiseres med anti D Ecadherin antistof (magenta). Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

"Fo: keep-together.within-side =" 1" > figur 5
Figur 5: De kvindelige kønsorganer og deres Interaktive organer. (A) ovarie (Ov), tarm (Gut), udbytte (Cr), hjerne (Br), ventrale nerve ledning (VNC), og spermatheca (Sp) blev dissekeret under mikroskopet. (B - D) Den innervation af ovarie blev visualiseret med mCD8 :: GFP drevet af nSyb-GAL4. GFP-positive neuroner strækker sig fra VNC (pil), som rager til overfladen af ​​æggestokkene (pilespidser). Ovarierne er skitseret med stiplede linier. Prøverne blev farvet med anti-GFP-antistof (grøn) og farvestof-konjugeret phalloidin (magenta). Phalloidin associerede virksomheder med den trådformede actin af musklerne omkring æggestokkene (Ov) og livmoderen (Ut). Illustrationen er vist i C. Skalasøjle = 200 um.rge.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi studerede ecdysteroid biosyntese og dens reguleringsmekanisme i D. melanogaster, og udtænkt en protokol for dissektion og immunfarvning. Timingen af ecdysteroid biosyntese påvirkes af miljømæssige påvirkninger gennem neuronale input 33, så det er vigtigt at opretholde den innervation af de ecdysteroidogenic organer sammen med hjernen, VNC, og andre væv under dissektion.

Som beskrevet ovenfor, D. melanogaster PG danner et kompleks endokrint organ RG med corpora allata (CA) og corpora cardiaca (CC) (figur 2D). Mens PG producerer ecdysteroid, CA og CC producere juvenile hormoner og adipokinetisk hormon hhv. Denne anatomisk ejendom har været en hindring for forskere studerer ecdysteroidogenesis i D. melanogaster, i forhold til andre insekter. Men i de seneste årtier, flyve genetik has tilladt os at identificere mange ecdysteroidogenic gener, som specifikt udtrykkes i PG 4. Disse gener udtrykkes ligeledes i follikelceller eller follikelceller i æggestokkene 34, 35. Nu kan man anvende et unikt sæt af genudtrykkelsesprofiler i ecdysteroidogenic organer, hvilket gør det muligt at angive ecdysteroidogenic celler ved immunfarvning og transgene teknikker.

Under dissektion, er det vigtigt at bruge fine pincet med skarpe kanter. Forud for dissektion, kan kanterne af tang skal slibes med en Arkansas slibesten at bringe kanterne sammen uden mellemrum. Under dissektion, snavs eller de resterende væv, såsom fedt kroppen, tarmen, og imaginalskiver bør fjernes så meget som muligt. Især stykker af fedt kroppen nemt holde sig til vævet af interesse. Desuden bør monteringen af ​​prøverne på objektglas også udføreed omhyggeligt. En sammensat af væv kan disarranged når et dækglas anbringes på prøverne i sticky monteringsmedium. Derfor skal et tilstrækkeligt antal prøver dissekeres, og passende prøver skal vælges til billeddannelse, såsom dem, hvori RG eller ovariet er på den øverste side og de neuronale forbindelser forbliver intakte.

For at udføre en succes immunfarvning og for at opnå de reproducerbare resultater, er det afgørende at fastholde de samme betingelser for prøveudtagningsprocedurerne og håndtering. Omfanget af immunfarvning stærkt afhænger af tilstanden af ​​de enkelte dyr på tidspunktet for prøvetagning og fiksering. For eksempel bør en alder af dyrene, opdræt temperaturer, næringsstof tilstand og dissektion tid overvejes nøje. For at minimere håndteringsfejl af fiksering i flere eksperimenter, vi holder omhyggeligt næsten lige antal prøver at koordinere dissektion tid og fiksering reaktionstider. Til fiksering solution, er 4% paraformaldehyd eller 3,7% formaldehyd anvendes. Fordi paraformaldehyd hurtigt nedbrydes med tiden, er dens pulver sædvanligvis opløses til 10% stamopløsning i PBS, og portioner opbevares ved -20 ° C. Portionerne er ufrosne at gøre den friske 4% fix opløsning før hver dissektion. Desuden de omfattende vasketrin prøver reducere baggrunden uspecifik farvning.

I det trin erhvervelse billede, følger vi producentens protokol for konfokal mikroskopi. Det mikroskopi system giver en brugervenlig grænseflade for forskere eller studerende, således at de optimale sæt af excitation / emission filtre automatisk er valgt, når de typer af fluorophor er specificeret. Mens mikroskopi-systemet er nemt at bruge, er man nødt til at optimere parametrene for erhvervelse billede på hver prøve eller hvert brændplanet, ved at ændre detektoren gevinst, scanningshastighed, scan numre, og det lille hul størrelse.

36. For at overvinde dette problem, kan det knock-in teknik anvendes til at indsætte en HA-tag i gen locus af Ouija bord under anvendelse CRISPR / Cas9 systemet. Ved at bruge sådanne transgene teknikker i kombination med immunfarvning mindst 3-4 proteiner kan samtidigt visualiseres i PG eller ovariet. I modsætning til proteinlokalisering imidlertid en metode til at visualisere endogene ecdysteroid ved immunfarvning ikke er fastslået. Når anti-ecdysteroid antistof er tilgængelig for immunfarvning, kan de subcellulære lokaliseringer af ecdysteroid biosyntese og transport af ecdysteroid undersøges i fremtiden. En anden begrænsning er, at den tidsmæssige dynamik ecdysteroidogenesis ikke kan undersøges i faste væv. I betragtning af at ecdysteroid titer svinget langs de udviklingsstadier, bør aktiviteten af ​​ecdysteroidogenic organer og de udragende neuroner være tidsmæssigt reguleret som respons på forskellige miljømæssige stimuli. En nylig undersøgelse overvågede Ca2 + dynamik PG celler under anvendelse af levende billeddannelsesteknikker 37. For fremtidige applikationer, er vi ved at udvikle en protokol for den levende billeddannelse af PG eller kulturperler æggestokke sammen med deres fremspringende neuroner. Med hensyn til de eksisterende metoder, sigter dette nye protokol til at visualisere aktiviteten af ​​neuroner og deres målorganer samtidig. Når aktiviteten af neuroner kan overvåges med Ca2 + indikator GCaMP eller Cameleon 38, kan det manipuleres med optogenetic eller thermogenetic tilgange på det rette tidspunkts 39. Disse fremgangsmåder bidrager til en bred forståelse af steroidhormon biosyntese og dens neuronal reguleringsmekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Reiko Kise og Tomotsune Ameku for deres tekniske støtte til dette arbejde. Vi er også taknemmelige for Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Centre, Kyoto Stock Center (DGRC), og Developmental Studies Hybridoma Bank for aktier og reagenser. Dette arbejde blev støttet af tilskud til YSN fra JSP'er KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation, og Inoue Science Research Award; og af en bevilling til RN fra MEXT KAKENHI Grant Antal 16H04792.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

Tags

Developmental Biology Developmental biologi neurovidenskab, Ecdysteroid biosyntese immunhistokemi kimlinie stamceller ovarie prothoracic kirtel
Protokoller til visualisering steroidogeniske organer og deres interaktive organer med Immunfarvning i bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imura, E., Yoshinari, Y.,… More

Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter