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Developmental Biology

फल मक्खी में Immunostaining साथ Steroidogenic अंगों और उनके इंटरएक्टिव अंगों दृश्यमान करने के लिए प्रोटोकॉल Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55519
Automatic Translation
*1, *1, *2, 3
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

हम विच्छेदन, निर्धारण, और ड्रोसोफिला लार्वा और वयस्क महिलाओं में steroidogenic अंगों स्टेरॉयड हार्मोन जैव संश्लेषण और उसके नियामक तंत्र का अध्ययन करने के immunostaining के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। steroidogenic अंगों के अलावा, हम इस तरह के germline स्टेम कोशिकाओं के रूप में steroidogenic अंगों की इन्नेर्वतिओन के साथ-साथ steroidogenic लक्ष्य कोशिकाओं कल्पना।

Abstract

बहुकोशिकीय जीव में, कोशिकाओं के एक छोटे समूह उनके biogenic गतिविधि में एक विशेष समारोह के साथ संपन्न है, विकास और प्रजनन के लिए एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया उत्प्रेरण। कीड़ों में, लार्वा prothoracic ग्रंथि (पीजी) और प्रिंसिपल स्टेरॉयड हार्मोन ecdysteroids बुलाया biosynthesizing में वयस्क मादा अंडाशय खेलने आवश्यक भूमिका। ये ecdysteroidogenic अंगों तंत्रिका तंत्र, जिसके माध्यम से जैव संश्लेषण के समय पर्यावरण संकेतों से प्रभावित होता है से आच्छादित कर रहे हैं। यहाँ हम ecdysteroidogenic अंगों और लार्वा में अपने इंटरैक्टिव अंगों और फल के वयस्कों visualizing मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, जो स्टेरॉयड हार्मोन जैव संश्लेषण और उसके नियामक तंत्र के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली प्रदान करता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। निपुण विच्छेदन हमें मस्तिष्क, उदर तंत्रिका कॉर्ड, और अन्य ऊतकों सहित ecdysteroidogenic अंगों के पदों और उनके इंटरैक्टिव अंगों को बनाए रखने की अनुमति देता है। एक साथ Immunostainingecdysteroidogenic एंजाइमों के खिलाफ ntibodies, ऊतक विशेष प्रमोटरों द्वारा संचालित ट्रांसजेनिक प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ साथ, ecdysteroidogenic कोशिकाओं लेबल करने के लिए उपलब्ध हैं। इसके अलावा, ecdysteroidogenic अंगों का आच्छादन भी विशिष्ट एंटीबॉडी या GAL4 ड्राइवरों न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार में का एक संग्रह से लेबल किया जा सकता। इसलिए, ecdysteroidogenic अंगों और उनके न्यूरोनल संपर्कों immunostaining और ट्रांसजेनिक तकनीक के द्वारा एक साथ देखे जा सकते हैं। अंत में, हम कैसे germline स्टेम सेल, जिसका प्रसार और रखरखाव ecdysteroids द्वारा नियंत्रित कर रहे कल्पना करने के लिए का वर्णन। इस विधि स्टेरॉयड हार्मोन जैव संश्लेषण और उसके न्यूरोनल नियामक तंत्र की व्यापक समझ के लिए योगदान देता है।

Introduction

बहुकोशिकीय जीव में, कोशिकाओं का एक समूह उनके biogenic गतिविधि में एक विशेष समारोह है कि पूरे शरीर के लिए आवश्यक है के साथ संपन्न है। उनके मिशन को पूरा करने के लिए, प्रत्येक ऊतक या अंग उनके कार्यों से संबंधित जीन की एक श्रृंखला को व्यक्त करता है और विकास के संदर्भ में उनकी गतिविधियों रच के अन्य ऊतकों के साथ संचार। इस तरह के विशेष सेलुलर कार्यों और अंतर-अंग बातचीत को चिह्नित करने के लिए, हम कोशिकाओं के अन्य प्रकार बहुकोशिकीय वास्तुकला में बरकरार रखा जा रहा है के साथ कोशिकाओं का एक समूह निर्दिष्ट करने के लिए की जरूरत है।

इस तरह के विशेष अंगों का एक उदाहरण एक steroidogenic अंग है, जहां कई biosynthetic एंजाइमों सक्रिय स्टेरॉयड हार्मोन 1 से कोलेस्ट्रॉल से रूपांतरण चरण मध्यस्थता है। इन एंजाइम जीन के अधिकांश विशेष रूप से steroidogenic अंगों में व्यक्त कर रहे हैं, और biosynthesis मार्ग कसकर शारीरिक इनपुट और न्यूरोनल आदानों के माध्यम से कई बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा विनियमित है। एक बारसंश्लेषित, स्टेरॉयड हार्मोन hemolymph में स्रावित होते हैं और जीन 2 की एक किस्म की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए कई ऊतकों और अंगों को लक्षित कर रहे हैं। इसलिए, एक स्टेरॉयड हार्मोन की कार्रवाई एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया बनाए रखने के लिए समस्थिति, विकास, और प्रजनन प्रेरित करता है।

स्टेरॉयड हार्मोन जैवसंश्लेषण के कार्य करता है और स्टेरॉयड हार्मोन की pleiotropic कार्यों की जांच करने के लिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली के रूप में उपयोग किया जा सकता। लार्वा चरण के दौरान, कीट स्टेरॉयड हार्मोन, ecdysteroid, एक विशेष अंत: स्रावी अंग में biosynthesized है prothoracic ग्रंथि (पीजी) 3 कहा जाता है। पीजी में, कई ecdysteroidogenic एंजाइमों विशेष रूप से कई रूपान्तरण चरणों कोलेस्ट्रॉल से ecdysone को उत्प्रेरित है, जो उचित विकास के चरणों 4 पर molting और कायापलट नियंत्रित करता है। इसलिए, ecdysteroid अनुमापांक में एक गतिशील परिवर्तन नियंत्रित किया जाता हैपर्यावरण संकेतों के जवाब में कई संकेत दे रास्ते से। दूसरी ओर, वयस्क अवस्था में, ecdysteroid शरीर क्रिया विज्ञान में आवश्यक भूमिका, प्रजनन, नींद, स्मृति, और जीवन काल 5, 6, 7, 8 सहित निभाता है। यह ज्ञात है कि ecdysteroid सक्रिय रूप से अंडाशय में biosynthesized है oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11 की प्रगति को विनियमित। हाल ही में हम सूचित किया है कि germline स्टेम सेल (GSCs) की संख्या संभोग के जवाब में ecdysteroid और सेक्स पेप्टाइड संकेत से प्रभावित होता है 12 उत्तेजना।

डी के शक्तिशाली उपकरण आनुवंशिकी और अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम जानकारी सहित कोशिका जीव विज्ञान, मेलानोगास्टर, द्विआधारी जीनअभिव्यक्ति प्रणाली, और ट्रांसजेनिक आरएनएआई तकनीक, हमें सक्षम किया है, आवश्यक जीनों की पहचान करने के लिए पीजी और अंडाशय 13, 14, 15 में जैव संश्लेषण ecdysteroid करने के लिए। एक बार जब ecdysteroidogenic जीन की पहचान कर रहे हैं, इन जीनों और जीन उत्पादों की गतिशील स्थानीयकरणों की ट्रांस्क्रिप्शनल विनियमन biosynthesis मार्ग 16 में जांच की जा सकती। इस प्रयोजन के लिए मात्रात्मक-रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर, स्वस्थानी संकरण, और immunohistological विश्लेषण में शाही सेना आयोजित की जाती हैं। इन तकनीकों के आवेदन एक चुनौती भरा काम भी शामिल है, पीजी या अंडाशय की विस्तृत विच्छेदन। विशेष रूप से, फल मक्खी के पीजी अन्य कीड़ों की तुलना में अपेक्षाकृत छोटा होता है (उदाहरण के लिए रेशमकीट और झटका मक्खी), इसलिए एक फल के महत्वपूर्ण कौशल नमूने के लिए विच्छेदन के लिए उड़ान भरने का अभ्यास करने की जरूरत है। इसके अलावा, दोनों ecdysteroidogenic अंगों इन्नेर्वतिओन प्राप्तकेंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 17, 18, 19, 20 से रों। इस प्रकार, सही संरचनात्मक विश्लेषण के लिए, ecdysteroidogenic अंगों सीएनएस और अन्य अंगों, उनके न्यूरोनल संपर्कों को बाधित करने के लिए नहीं के साथ बरकरार रखा जाना चाहिए।

यहाँ हम विच्छेदन और डी में steroidogenic अंगों के दृश्य के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। मेलानोगास्टर। विच्छेदन तकनीक सीखना इन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण शुरुआती बिंदु है। इसके अलावा, एक सफलतापूर्वक कई एंटीबॉडी और GAL4 ड्राइवर लाइनों के साथ steroidogenic अंगों के साथ ही उनके इंटरैक्टिव अंगों लेबल कर सकते हैं। इन तकनीकों, सामग्री, और आनुवंशिकी का फायदा उठाते हुए एक स्टेरॉयड हार्मोन जैवसंश्लेषण के व्यापक तंत्र का अध्ययन कर सकते हैं।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल के समग्र योजना चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. लारवल अंगूठी ग्रंथि के विच्छेदन (आरजी)

ध्यान दें: डी में। मेलानोगास्टर, जो cyclorrhaphous Diptera के अंतर्गत आता है, पीजी के भीतर एक समग्र अंत: स्रावी अंग अंगूठी ग्रंथि (आरजी, चित्रा 2 डी) कहा जाता है। चूंकि यह अव्यावहारिक है कि पीजी शल्य चिकित्सा द्वारा कोशिकाओं (बाद में चर्चा की) के अन्य प्रकार से अलग है, एक व्यावहारिक लक्ष्य विच्छेदन द्वारा एक अक्षुण्ण, undamaged आरजी अलग करने के लिए है।

  1. उचित विकास के चरणों में लार्वा की तैयारी
    नोट: डी मेलानोगास्टर लार्वा के विकास के चरणों सिंक्रनाइज़ करने के लिए, यह एक संकीर्ण समय खिड़की के भीतर अंडे एकत्र करने के लिए और उचित समय पर लार्वा को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है।
    1. 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अंगूर का रस अगर प्लेट पर 2 घंटे के लिए अंडे इकट्ठा।
    2. इकट्ठा नव रची 1 नोट: लार्वा वर्ष की आयु का प्रतिनिधित्व करती है, "घंटे अंडा बिछाने (hAEL) के बाद" "घंटे पक्षियों के बच्चे के बाद (हां)", या "एल 3 निर्मोचन (hAL3E) के बाद घंटे"।
    3. उचित समय बिंदु पर, अवांछनीय चोट से बचने के लिए एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश के साथ मंचन लार्वा एकत्रित करते हैं। 3 इनस्टार लार्वा के विकास प्रगति में एक फर्क को कम से कम करने के लिए, 70 hAEL (48 हा) में 2 इनस्टार लार्वा को इकट्ठा करने और उन्हें 2 घंटे के अंतराल में गिरना अनुमति देते हैं। फिर, 2 घंटे L3 निर्मोचन के बाद के भीतर 3 इनस्टार लार्वा इकट्ठा; इस प्रक्रिया के 0-2 hAL3E लार्वा देता है।
    4. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) से भरा एक पकवान के लिए मंचन लार्वा स्थानांतरित करें।
    5. पीबीएस के साथ लार्वा कुल्ला शरीर से अवशिष्ट भोजन हटाने के लिए।
  2. एक के तहत लार्वा के मोटे विच्छेदनचीर-फाड़ माइक्रोस्कोप
    1. संदंश के साथ एक लार्वा के मुंह हुक पकड़ो। सूक्ष्म कैंची का उपयोग कर शरीर की लंबाई के पूर्वकाल एक तिहाई पर लार्वा शरीर तोड़।
    2. संदंश की एक जोड़ी के साथ पूर्वकाल लार्वा शरीर के कटौती अंत पकड़ो। संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करना, धीरे शरीर के अंदर की ओर चलें की नोक धक्का; इस प्रक्रिया के बाहर अंदर लार्वा शरीर बदल जाता है।
      नोट: यह चरण 1 इनस्टार लार्वा के विच्छेदन के लिए छोड़ा जा सकता है।
    3. 5-10 मिनट के लिए चरणों को दोहराएं 1.2.1-1.2.2 अतिरिक्त लार्वा के साथ।
      नोट: लार्वा की संख्या के बराबर या कम से कम 20 विच्छेदन के लिए समय बचाने के लिए किया जाना चाहिए।
  3. लार्वा के पट्टिका विच्छेदन
    ध्यान दें: इस विधि के ऊतकों की स्थिति रखने की अनुमति देता है बरकरार रहने के लिए।
    1. केवल 1 घंटे के लिए पानी में लार्वा छोड़ दें। लार्वा asphyxiation के कारण बंद कर रहे हैं।
    2. एक लार्वा पृष्ठीय पक्ष एक सिलिकॉन लेपित पर पीबीएस की एक बूंद में रखोपकवान, इसकी पृष्ठीय पक्ष के साथ।
      ध्यान दें: पृष्ठीय पक्ष 2 नली अनुलंबीय चल ट्यूबों है।
    3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा संदंश का उपयोग कर के पूर्वकाल टिप में एक कीट पिन डालें। पीछे की ओर करने के लिए लार्वा शरीर को स्ट्रेच करें और लार्वा के पीछे टिप में एक दूसरे पिन डाल दिया।
      नोट: कीट पिन के अलावा, एक सुई एक टंगस्टन तार से बने उपयोगी 21 हो सकता है। एक सुई एक विदारक सुई के रूप में उपयोग के लिए हीटिंग के माध्यम से एक विंदुक टिप में एम्बेड किया जा सकता है।
    4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सूक्ष्म कैंची से पूंछ के पास एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। चीरा से, सिर की ओर पृष्ठीय मध्य रेखा के साथ अनुलंबीय पृष्ठीय छल्ली काटा। छल्ली के तहत ऊतकों को नुकसान के प्रति सावधान रहें।
    5. हर तरफ bodywall छल्ली खिंचाव और विच्छेदित bodywall के प्रत्येक कोने में 4 पिन जगह।
    6. संदंश के साथ पूर्वकाल वसा शरीर के एक हिस्से को निकालें, बेनकाब करने के लिए मस्तिष्क आरजी गसतह पर उजागर किया omplex। लार ग्रंथियों की एक जोड़ी निकालें यदि आवश्यक हो तो।
  4. फिक्सेशन और इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री साथ ऊतक के धुंधला
    1. एक 1.5 एमएल 500 μL ठीक समाधान (पीबीएस में 4% paraformaldehyde) के साथ भर microtube में लार्वा निकायों (कदम 1.2.2) के पूर्वकाल एक तिहाई रखो। एक समय में कम से कम 20 नमूने, अन्यथा पीबीएस तय नमूनों से जुड़ी फिक्स बंधक की एक प्रतिकूल कमजोर पड़ने का कारण हो सकता। पट्टिका विच्छेदन के लिए, पीबीएस की एक बूंद को निकालें और फिर ठीक समाधान की एक बूंद जोड़ें।
      नोट: ठीक समाधान के लिए, या तो 3.7% formaldehyde या 4% paraformaldehyde में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान (आर टी) या 2 घंटे के लिए वैकल्पिक रूप में 30 मिनट के लिए ठीक समाधान में विच्छेदित ऊतकों सेते हैं।
    3. 500 μL पीबीएस के साथ ठीक समाधान बदलें और जल्दी से नमूने 3 बार कुल्ला। आर में एक रॉकर पर 15 मिनट के लिए 500 μL 0.3% PBT (पीबीएस + 0.3% octylphenol ethoxylate) के साथ नमूनों धोटी पट्टिका विच्छेदन के लिए, कीट पिंस हटाने और एक 1.5 एमएल microtube में नमूने हस्तांतरण।
      नोट: ऊतकों में एंटीबॉडी की पारगम्यता को बढ़ाते के लिए, नमूने आरटी पर एक रॉकर पर 1-2 घंटे के लिए 500 μL साथ व्यवहार कर रहे 2.0% PBT।
    4. 500 समाधान (2% PBT में गोजातीय सीरम albumin) अवरुद्ध μL साथ PBT बदलें। आरटी पर एक रॉकर पर 1.5 घंटे के लिए नमूने सेते हैं।
    5. 50 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान, यानी अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें।
    6. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर नमूने सेते हैं।
    7. 500 μL 0.3% PBT के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बदलें और जल्दी से नमूने 5 बार कुल्ला। नमूने आरटी पर एक रॉकर पर 15 मिनट के प्रत्येक के लिए 500 μL 0.3% PBT साथ 3 बार धोएं।
    8. 50 μL माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (डाई-संयुग्मित अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी) के साथ 0.3% PBT बदलें। परमाणु धुंधला, 0.5 μL 4 ', 6-diamidino- के लिए2-phenylindole (DAPI, 0.1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान) 50 μL समाधान के लिए जोड़ा गया है। आरटी पर या वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस रात भर 2 घंटे के लिए एक रॉकर पर नमूने सेते हैं।
      ध्यान दें: अंधेरे में नमूने रखें।
    9. 500 μL 0.3% PBT साथ एंटीबॉडी समाधान बदलें और 5 बार कुल्ला। नमूने आरटी पर 15 मिनट के प्रत्येक के लिए 500 μL 0.3% PBT साथ 3 बार धोएं।
  5. मस्तिष्क आरजी परिसर के ठीक विच्छेदन पीजी युक्त और बढ़ते
    1. 0.3% PBT से भरा एक पकवान के लिए immunostained नमूने हस्तांतरण करने के लिए एक डिस्पोजेबल pipet का प्रयोग करें।
      ध्यान दें: विच्छेदन और बढ़ते दौरान असुविधाजनक बुलबुले से बचने के लिए 0.3% PBT पीबीएस के साथ बदला जा सकता है।
    2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संदंश की एक जोड़ी के साथ छल्ली या मुँह हुक पकड़ो। एक 27 जी सुई एक "चाकू" के रूप में एक 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी का उपयोग करना, शरीर छल्ली से मस्तिष्क आरजी आंख डिस्क जटिल दूर करने के लिए घेघा और आंख डिस्क के पूर्वकाल टिप काटा।
    3. SEPAसंदंश के साथ मस्तिष्क आरजी आंख डिस्क जटिल से घेघा और पेट दर। के बाद से घेघा उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) के ऊपर मस्तिष्क से होकर गुजरता है, पीछे की ओर करने के लिए पेट को बाहर खींच।
      नोट: नमूनों से अतिरिक्त imaginal डिस्क को निकालने के लिए एक सुई चाकू के साथ मस्तिष्क, आँख डिस्क, और पैर डिस्क के बीच कनेक्शन काट दिया।
    4. अन्य नमूनों के लिए चरणों का 1.5.1-1.5.4 दोहराएँ।
      ध्यान दें: नमूने के लिए चिपके से ऊतक मलबे को रोकने के लिए 0.3% PBT या पीबीएस के साथ भरा एक अलग स्वच्छ पकवान करने के लिए प्रत्येक पूरा नमूना हस्तांतरण।
    5. एक micropipette के साथ एक साफ़ कांच की स्लाइड के केंद्र के लिए नमूने स्थानांतरण।
      नोट: 2 या 3 Rd instar लार्वा के लिए, एक micropipette टिप के अंत में एक रेजर ब्लेड के साथ छोटा कर दिया जाना चाहिए।
    6. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संदंश का उपयोग करके अपने पृष्ठीय पक्ष के साथ अलग-अलग नमूने संरेखित करें।
      नोट: आरजी (चित्रा 2A मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है)। इस संरेखण इमेजिंग के दौरान अलग-अलग नमूने के विनिर्देश की सुविधा।
    7. एक गिलास स्लाइड झुकाएं और जितना संभव हो उतना अतिरिक्त PBT को हटा दिया। स्लाइड की एक तरफ बढ़ते अभिकर्मक की एक बूंद रखो। बूंद के दूसरी तरफ से एक कवर पर्ची के किनारे रखें और संदंश के साथ धीरे-धीरे नमूनों पर कवर स्लिप डाल दिया।
      नोट: यह प्रक्रिया कवर स्लिप बाहर जाने से नमूने से बचाता है।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहित करें। अंधेरे में नमूने रखें।

2 में अंडाशय के विच्छेदन वयस्क मादा

  1. वयस्क मादा की तैयारी
    1. 3-4 दिनों के अंडाशय ऊपर मोटा करने के लिए के लिए फ़ीड महिला मानक खमीर / cornmeal मक्खी भोजन के साथ उड़ जाता है। 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  2. वयस्क मादा अंडाशय के विच्छेदन
    1. चतनाशून्य महिला के साथ सीओ 2 गैस मक्खियों और उनके सिर काट दिया।
    2. एक 3 सेमी पकवान के लिए उड़ान भरने के शव स्थानांतरणपीबीएस के साथ भरा।
    3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संदंश का उपयोग कर पृष्ठीय पक्ष पर छाती पकड़ो। पेट खंड ए 5 या अन्य संदंश के साथ ए 6 समझ और पीछे की ओर की ओर पेट छल्ली दूर छील। संदंश की नोक से चिपचिपा छल्ली बंद साफ कर लें।
    4. एक डिंबवाहिनी चुटकी और शरीर से अंडाशय बाहर ले।
    5. कंघी और संदंश के साथ अंडाशय के सुझाव दिए गए हैं।
      ध्यान दें: इस आपरेशन immunostaining की दक्षता में सुधार।
  3. वयस्क मादा मस्तिष्क, VNC और प्रजनन अंगों के विच्छेदन।
    ध्यान दें: इस विधि अंडाशय की इन्नेर्वतिओन बरकरार रखा जा सकता है।
    1. चतनाशून्य महिला के साथ सीओ 2 गैस मक्खियों और उन्हें एक सिलिकॉन लेपित पीबीएस के साथ भरा पकवान में स्थानांतरण।
    2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सूंड पकड़ और संदंश के साथ मस्तिष्क को बेनकाब करने के सिर छल्ली दूर छील। श्वासनली मस्तिष्क से जुड़ी निकालें।
      नोट: बीआरएआईn एक सफेद और गोल संरचना है। मस्तिष्क छाती में VNC को जोड़ता है।
    3. पृष्ठीय पक्ष पर छाती पकड़ो और संदंश की एक जोड़ी के साथ पैर और पंख काट दिया। संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करना, पैरों के ठिकानों से छाती उदर छल्ली दूर छील। एक बार VNC सामने आ रहा है, अवशिष्ट पृष्ठीय छल्ली और मांसपेशियों संदंश का उपयोग कर VNC से जुड़ी को हटा दें। मस्तिष्क और VNC के बीच संबंध को नुकसान के प्रति सावधान रहें।
    4. पेट की छल्ली दूर छील और अंडाशय और न्यूरॉन्स, फसल, आंत, डिंबवाहिनी, गर्भाशय और सहायक ग्रंथि सहित उनके इंटरैक्टिव अंगों को बेनकाब करने के संदंश का प्रयोग करें।
    5. श्वासनली और वसा शरीर संदंश का उपयोग कर सहित अवशिष्ट ऊतकों निकालें।
  4. फिक्सेशन और इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री साथ ऊतक के धुंधला
    1. ठीक समाधान एक 1.5 एमएल 250 μL से भर microtube के लिए अंडाशय की लगभग 8-10 जोड़े के स्थानांतरण (4% paraformaपीबीएस में ldehyde) और आरटी पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
    2. 500 μL पीबीएस के साथ ठीक समाधान बदलें और जल्दी से नमूने 3 बार कुल्ला।
    3. नमूने आरटी पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए 500 μL 0.1% PBT साथ 2 बार धो लें।
    4. समाधान अवरुद्ध 50 μL के साथ PBT बदलें। आरटी पर एक रॉकर पर 1 घंटे के लिए नमूने सेते हैं।
    5. 50 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें।
    6. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर नमूने सेते हैं।
    7. 500 μL 0.1% PBT के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान बदलें। नमूने आरटी पर एक रॉकर पर 15 मिनट के प्रत्येक के लिए 500 μL 0.1% PBT साथ 3 बार धोएं।
    8. 50 μL माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ 0.1% PBT बदलें। परमाणु धुंधला के लिए, 50 μL समाधान के लिए 0.5 μL DAPI जोड़ें। आरटी पर एक रॉकर पर 2 घंटे के लिए नमूने सेते हैं।
    9. 500 μL 0.1% PBT के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान बदलें। नमूने 500 μL 0.1% PBT साथ 3 बार धोएं आरटी पर एक रॉकर पर 15 मिनट के प्रत्येक के लिए।
      नोट: धोने की प्रक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में किया जा सकता है। अंधेरे में नमूने रखें।
  5. कांच स्लाइड पर नमूनों बढ़ते
    1. 0.1% PBT एक micropipette का उपयोग के साथ एक गिलास स्लाइड के लिए नमूने स्थानांतरण।
      ध्यान दें: विच्छेदन और बढ़ते दौरान असुविधाजनक बुलबुले से बचने के लिए, 0.1% PBT पीबीएस के साथ बदला जा सकता है।
    2. अंडाशय के लिए, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संदंश के साथ एक दूसरे से ovarioles के तार को अलग। germaria युक्त ovarioles के सुझावों को घायल मत करो। मस्तिष्क VNC-प्रजनन अंग जटिल के लिए, अवशिष्ट छल्ली हटाने और एक गिलास स्लाइड पर स्थिति की व्यवस्था।
    3. जितना संभव हो उतना अतिरिक्त PBT बंद साफ कर लें और नमूने के केंद्र में बढ़ते अभिकर्मक की एक बूंद डाल दिया। एक कवर पर्ची धीरे संदंश का उपयोग कर रखें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहित करें। अंधेरे में नमूने रखें।
"> 3। एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के साथ इमेजिंग

  1. खुर्दबीन के नीचे नमूने का निरीक्षण करें और देखने के क्षेत्र में steroidogenic अंगों लाने के लिए। एक बार दृश्य तय हो गई है, छवि अधिग्रहण मोड के लिए इमेजिंग सिस्टम के लिए स्विच।
    नोट: 10-20x ऑब्जेक्टिव लेंस मस्तिष्क आरजी जटिल या पूरे अंडाशय के चित्र प्राप्त किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, 40-63X ऑब्जेक्टिव लेंस (पानी या तेल विसर्जन) GSCs या पीजी और अंडाशय के न्यूरोनल आच्छादन हो में प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण दृश्यमान करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. संलग्न सॉफ्टवेयर पर छवि अधिग्रहण के मापदंडों सेट करें। प्रतिदीप्ति का संयोजन (जैसे GFP और आरएफपी) का चयन करें। तेजी से स्कैनिंग प्रक्रिया करके, लेजर बिजली, डिटेक्टरों की संवेदनशीलता (लाभ / ऑफसेट), और पिनहोल के आकार को समायोजित।
    ध्यान दें: उच्च गुणवत्ता पर चित्र प्राप्त करने के लिए, स्कैनिंग लेजर शक्ति और डिटेक्टर (लाभ) की संवेदनशीलता प्रत्येक नमूने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। आकार की रूपरेखा तैयार करनेऊतकों की, एक प्रेषित-प्रकाश छवि एक फ्लोरोसेंट छवि के अलावा लिया जा सकता है।
  3. छवियों की जेड के ढेर ले लो। एक सतत तेजी से स्कैन के दौरान, माइक्रोस्कोप का ध्यान केंद्रित ड्राइव के साथ फोकल हवाई जहाज़ के लिए कदम और प्रारंभिक स्थिति और अंत स्थिति निर्धारित किया है। स्लाइस की संख्या और स्लाइस के बीच अंतराल दूरी के हिसाब से समायोजित कर रहे हैं।
  4. स्कैन गति, विधि स्कैन, और द्विदिश स्कैन मोड का चयन करें।
  5. छवि अधिग्रहण के लिए 'असली स्कैन प्रारंभ करें "।
  6. संलग्न सॉफ्टवेयर के प्रारूप के साथ छवि सहेजें।
    नोट: मूल छवि फ़ाइलों छवि अधिग्रहण मापदंडों और तराजू के जानकारी होती है। निर्यात छवियों कंप्यूटर 22 पर एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संसाधित किया जा सकता।

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Representative Results

हम steroidogenic अंगों और डी मेलानोगास्टर लार्वा और वयस्क महिलाओं में उनके इंटरैक्टिव अंगों कल्पना करने के लिए ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग किया। प्रोटोकॉल के समग्र योजना चित्र 1 में दिखाया गया है।

आरजी, पीजी (चित्रा 2 डी), छोटे और मस्तिष्क की तुलना में अधिक पारदर्शी है और मस्तिष्क (चित्रा 2A-सी और 3 ए-ई) के पूर्वकाल-पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है भी शामिल है। पीजी कोशिकाओं लेबल करने के लिए, कई समूहों ecdysteroidogenic एंजाइमों के विरुद्ध रोग के विभिन्न प्रकार उत्पन्न किया है (यानी, नेवरलैंड 23, Spookier 24, श्राउड 20, प्रेत 25, तोड़ा 25, और 26 छाया)। उनमें से, विरोधी श्राउड (एसआरओ) एंटीबॉडी मज़बूती से immunostaining द्वारा पीजी लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 2C, 2 ई, और 3 सी)। वैकल्पिक रूप से, Binary जीन अभिव्यक्ति प्रणाली, Gal4 / UAS प्रणाली 27, पीजी कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। Ecdysteroidogenic जीन प्रेत (PHM) के प्रमोटर विश्लेषण के माध्यम से, पीजी विशिष्ट प्रमोटर पीजी 28 में विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इसलिए, पीजी कोशिकाओं विशेष रूप से की PHM-GAL4 # 22 (चित्रा 3 डी) नियंत्रण में GFP या आरएफपी व्यक्त द्वारा देखे जा सकते हैं।

पीजी और मस्तिष्क के बीच न्यूरोनल कनेक्शन कल्पना करने के लिए, न्यूरॉन्स के एक समूह विभिन्न GAL4 चालकों और एंटीबॉडी (चित्रा 2C, 2 ई, 3 डी, और 3E) के नियंत्रण में mCD8 :: GFP के साथ लेबल किया जा सकता है। GAL4 लाइन संग्रह के FlyLight डेटाबेस लेबलिंग न्यूरॉन्स 29 के लिए अनुकूलित है। इनमें GMR45C06-GAL4 पीजी पेश न्यूरॉन्स (चित्रा 2C और ई) लेबल करता है। imविरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ GFP -expressing लार्वा के munostaining GFP संकेतों को बढ़ाने में कारगर है। इसके अलावा, TRH-GAL4> mCD8 :: GFP लार्वा stomatogastric तंत्रिका तंत्र, जो serotonergic न्यूरॉन्स परियोजना में करने के लिए पीजी न केवल, लेकिन यह भी proventriculus (पीवी, कीट अग्रांत्र) और ग्रसनी मांसपेशियों (प्रधानमंत्री) (चित्रा 3 डी और को दिखाने ई) 20, 30। इसलिए, यह आरजी, मस्तिष्क, और पट्टिका विच्छेदन के दौरान अन्य आसपास के ऊतकों (चित्रा 3) की स्थिति बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

वयस्क महिलाओं में, डिम्बग्रंथि ecdysteroid ऐसे जीएससी प्रसार, पुटी भेदभाव, अंडा कक्ष विकास, और तनाव प्रतिक्रिया 11 के रूप में oogenesis के कई पहलुओं को प्रभावित करता है। पीजी में के रूप में, अंडाशय में ecdysteroidogenic एंजाइमों भी ऊपर 12, 31 में वर्णित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ कल्पना कर रहे हैं।एक नीचे की ओर घटना है जिस पर कार्य ecdysteroids के रूप में, germarium में GSCs की संख्या हमारे ध्यान (चित्रा 4) है। हालांकि germarium कई प्रकार की कोशिकाओं की एक सभा है, GSCs दो जीएससी मार्कर एंटीबॉडी, 1B1 और डी ई cadherin 32 के साथ immunostaining द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं। अंडाशय की इन्नेर्वतिओन कल्पना करने के लिए, अंडाशय मस्तिष्क, VNC, आंत, फसल, गर्भाशय और spermatheca (चित्रा 5) के साथ-साथ विच्छेदित कर रहा है। न्यूरॉन्स nSyb-GAL4, एक अखिल neuronal ड्राइवर (चित्रा 5 ब और डी) के नियंत्रण में mCD8 :: GFP द्वारा कल्पना कर रहे हैं। चारों ओर अंडाशय, गर्भाशय, और पेट की मांसपेशियों को डाई-संयुग्मित phalloidin साथ दाग रहे हैं।

आकृति 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल के समग्र योजना। दो अलग विच्छेदन तरीकों आवेदन के हैंऔर वयस्क मादा लार्वा को, प्रयोगों की उद्देश्य के आधार पर सक्षम। बढ़ते तरीकों में भी नमूना की स्थिति के अनुसार तैयार कर रहे हैं। फिक्सेशन, धुंधला, और इमेजिंग तकनीक मूल रूप से सभी नमूनों के लिए आम हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: पीजी और पीजी पेश न्यूरॉन्स का विजुअलाइजेशन। (ए और बी) जंगली प्रकार 3 इनस्टार लार्वा के मस्तिष्क अंगूठी ग्रंथि (आरजी) जटिल। (बी) में, पीजी बिंदु वाली रेखा द्वारा उल्लिखित है। मस्तिष्क और आरजी के बीच filamentous संरचना श्वासनली है। (सी - ई) पीजी की इन्नेर्वतिओन mCD8 के साथ कल्पना की गई थी ::FlyLight संग्रह में GMR45C06-GAL4 द्वारा संचालित GFP। पीजी और GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स विरोधी Sro एंटीबॉडी (मैजंटा) और विरोधी GFP एंटीबॉडी (हरा), क्रमशः के साथ लेबल रहे थे। फ्लोरोसेंट छवि ऊतकों की रूपरेखा निर्दिष्ट करने के लिए प्रेषित प्रकाश छवि के साथ विलय कर दिया है। में (डी), पीजी, कॉर्पोरा allata (सीए) और कॉर्पोरा cardiaca (सीसी) चित्रित किया गया है। पीजी पेश न्यूरॉन्स 40x उद्देश्य लेंस (ई में तीर) 10X ऑब्जेक्टिव लेंस (सी) के साथ कम बिजली छवि से साथ उच्च शक्ति छवि में अधिक प्रमुख हैं। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: पीजी, PV, को Stomatogastric तंत्रिका तंत्र परियोजनाओं एक nd अपराह्न। (ए और बी) एक जंगली प्रकार 3 इनस्टार लार्वा के पट्टिका विच्छेदन। पीजी, मस्तिष्क (बीआर) के पदों, उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC), नेत्र डिस्क (ईडी), विंग डिस्क (WD), ग्रसनी मांसपेशी (प्रधानमंत्री), और proventriculus (PV) बरकरार रहेगा। (सी) पीजी विशेष रूप से विरोधी Sro एंटीबॉडी (मैजंटा) के साथ चिह्नित किया गया। (डी) पीजी द्वारा PHM-GAL4 # 22 संचालित turboRFP के साथ लेबल किया गया था। Serotonergic न्यूरॉन्स विरोधी 5HT एंटीबॉडी (हरा) के साथ लेबल रहे थे। (ई) stomatogastric तंत्रिका तंत्र mCD8 :: GFP TRH-GAL4 द्वारा संचालित के साथ कल्पना की गई थी। Serotonergic न्यूरॉन्स पीजी, प्रधानमंत्री, और पीवी (तीर) के प्रोजेक्ट। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्र 4: एक, दो, या तीन GSCs युक्त जंगली प्रकार मक्खियाँ की Germaria। (ए) महिला प्रजनन अंग का अवलोकन। एक अंडाशय 16-20 ovarioles कि अंडा कक्षों के तार कर रहे हैं से बना है। germarium, जहां GSCs स्थित हैं, प्रत्येक ovariole की नोक पर है। (बी - डी) एक, दो, या तीन GSCs जंगली प्रकार महिलाओं में से प्रत्येक germarium (सफेद बिंदुओं घेरे) में स्थित हैं। GSCs 1B1 एंटीबॉडी (हरा), जो spectrosome (तीर) नामक एक गोलाकार संरचना और एक झिल्लीदार cytoskeletal संरचना fusome के रूप में जाना लेबल के साथ दाग रहे हैं। सेल सीमाओं रोधी डी ई cadherin एंटीबॉडी (मैजंटा) के साथ कल्पना कर रहे हैं। स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"के लिए: रखने together.within-पन्ने की =" 1 "> चित्रा 5
चित्रा 5: महिला प्रजनन अंग और उनके इंटरएक्टिव अंगों। (ए) अंडाशय (OV), पेट (आंत), फसल (सीआर), मस्तिष्क (बीआर), उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC), और spermatheca (सपा) खुर्दबीन के नीचे विच्छेदित कर रहे थे। (बी - डी) अंडाशय की इन्नेर्वतिओन mCD8 :: GFP nSyb-GAL4 द्वारा संचालित के साथ कल्पना की गई थी। GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स, VNC (तीर) से विस्तार अंडाशय (तीर) की सतह के लिए पेश। अंडाशय बिंदु वाली रेखा द्वारा दिए गए हैं। नमूने विरोधी GFP एंटीबॉडी (हरा) के साथ दाग और डाई-संयुग्मित phalloidin (मैजंटा) कर रहे थे। अंडाशय के आसपास की मांसपेशियों के filamentous actin (OV) और गर्भाशय (यूटी) से संबद्ध करती Phalloidin। चित्रण सी में स्केल बार = 200 सुक्ष्ममापी दिखाया गया है।rge.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम ecdysteroid जैवसंश्लेषण और डी मेलानोगास्टर में अपनी नियामक तंत्र का अध्ययन किया और विच्छेदन और immunostaining के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार की। Ecdysteroid जैव संश्लेषण के समय न्यूरोनल आदानों 33 के माध्यम से पर्यावरण संकेतों से प्रभावित होता है, तो यह मस्तिष्क, VNC, और विच्छेदन के दौरान अन्य ऊतकों के साथ ecdysteroidogenic अंगों की इन्नेर्वतिओन बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

जैसा कि ऊपर वर्णित, डी मेलानोगास्टर पीजी कॉर्पोरा allata (सीए) और कॉर्पोरा cardiaca (सीसी) (चित्रा 2 डी) के साथ एक जटिल अंत: स्रावी अंग आरजी रूपों। जबकि पीजी ecdysteroids पैदा करता है, सीए और सीसी किशोर हार्मोन और adipokinetic हार्मोन क्रमश: उत्पादन। यह संरचनात्मक संपत्ति डी में ecdysteroidogenesis का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए एक बाधा किया गया है। मेलानोगास्टर, अन्य कीड़ों की तुलना में। हालांकि, पिछले दशकों में, आनुवंशिकी हा उड़हमें कई ecdysteroidogenic जीन है कि विशेष रूप से पीजी 4 में व्यक्त कर रहे पहचान करने के लिए अनुमति दी। ये जीन भी नर्स कोशिकाओं या अंडाशय 34, 35 के कूप कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं। अब एक ecdysteroidogenic अंगों में जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की एक अद्वितीय सेट का उपयोग कर सकते है, यह संभव immunostaining और ट्रांसजेनिक तकनीक द्वारा ecdysteroidogenic कोशिकाओं निर्दिष्ट करने के लिए बना रही है।

विच्छेदन के दौरान, यह तेज किनारों के साथ ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। विच्छेदन करने से पहले, संदंश के किनारों एक अर्कांसस पीस पत्थर बिना किसी रिक्ति के साथ किनारों लाने के लिए साथ तेज किया जा सकता है। विच्छेदन, मलबे या इस तरह के वसा शरीर, पेट, और imaginal डिस्क के रूप में अवशिष्ट ऊतकों, के दौरान, जितना संभव हो उतना हटा दिया जाना चाहिए। विशेष रूप से, वसा शरीर के टुकड़े आसानी से ब्याज की ऊतक को चिपके रहते हैं। इसके अलावा, कांच स्लाइड पर नमूनों लगाने को भी प्रदर्शन किया जाना चाहिएएड ध्यान से। जब एक कवर स्लिप चिपचिपा बढ़ते मध्यम में नमूने पर रखा गया है ऊतकों का एक जटिल disarranged जा सकता है। इसलिए, नमूने की पर्याप्त संख्या विच्छेदित किया जाना चाहिए और उपयुक्त नमूने ऐसे उन लोगों के रूप में जो आरजी या अंडाशय ऊपरवाला तरफ है और न्यूरोनल संपर्कों बरकरार रहेगा, इमेजिंग के लिए चुना जाना चाहिए।

सफल immunostaining प्रदर्शन करने के लिए और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह नमूना और हैंडलिंग प्रक्रियाओं के लिए एक ही स्थिति बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। immunostaining की हद तक अत्यधिक नमूना और निर्धारण के समय में अलग-अलग जानवरों की शर्त पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, पशु, पालन तापमान, पोषक तत्व की स्थिति, और विच्छेदन समय की उम्र को ध्यान से विचार किया जाना चाहिए। कई प्रयोगों में निर्धारण की हैंडलिंग त्रुटियों को कम करने के लिए, हम ध्यान से नमूनों की लगभग बराबर संख्या विच्छेदन समय और स्थिरीकरण प्रतिक्रिया बार समन्वय करने के लिए रहते हैं। निर्धारण रों लिएolution, 4% paraformaldehyde या 3.7% formaldehyde प्रयोग किया जाता है। क्योंकि paraformaldehyde जल्दी से समय के साथ अपमानित किया जाता है, इसके पाउडर आमतौर पर पीबीएस में 10% शेयर समाधान बनाने के लिए भंग हो जाता है, और aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। aliquots ताजा 4% ठीक समाधान हर विच्छेदन से पहले बनाने के लिए unfrozen हैं। इसके अलावा, नमूनों की व्यापक धोने चरणों पृष्ठभूमि गैर विशिष्ट धुंधला कम।

छवि अधिग्रहण के चरण में, हम कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। माइक्रोस्कोपी प्रणाली शोधकर्ताओं या छात्रों, ऐसी है कि उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर के इष्टतम सेट स्वचालित रूप से फ्लोरोफोरे के प्रकार निर्दिष्ट कर रहे हैं का चयन किया जाता के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस प्रदान करता है। जबकि माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करने के लिए आसान है, एक, प्रत्येक नमूने या प्रत्येक फोकल विमान पर छवि अधिग्रहण के मापदंडों का अनुकूलन करने डिटेक्टर लाभ, गति स्कैन, संख्या स्कैन, और पिनहोल आकार बदलकर जरूरत है।

36 के रूप में अन्य ecdysteroidogenic जीन उत्पादों, के खिलाफ कई एंटीबॉडी नहीं लगा पाई। इस मुद्दे को दूर करने, दस्तक-इन तकनीक CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग कर Ouija बोर्ड की जीन लोकस में एक HA-टैग सम्मिलित करने के लिए लागू किया जा सकता है। , Immunostaining के साथ संयोजन में इस तरह के ट्रांसजेनिक तकनीक का उपयोग करके कम से कम 3-4 प्रोटीन एक साथ पीजी या अंडाशय में देखे जा सकते हैं। प्रोटीन स्थानीयकरण के विपरीत, तथापि, एक विधि अंतर्जात ecdysteroids कल्पना करने के लिए द्वारा immunostaining स्थापित नहीं किया गया। एक बार विरोधी ecdysteroid एंटीबॉडी immunostaining के लिए उपलब्ध है, ecdysteroid जैवसंश्लेषण के subcellular स्थानीयकरणों और ecdysteroid के परिवहन भविष्य में जांच की जा सकती है। एक और सीमा यह है कि ecdysteroidogenesis के अस्थायी गतिशीलता तय ऊतकों में जांच नहीं की जा सकती है। यह देखते हुए कि ecdysteroid अनुमापांक विकास के चरणों के साथ डोलती है, ecdysteroidogenic अंगों और पेश न्यूरॉन्स की गतिविधियों अस्थायी विभिन्न पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में विनियमित किया जाना चाहिए। एक ताजा अध्ययन में सीए को लाइव इमेजिंग तकनीक का उपयोग करते हुए 37 पीजी कोशिकाओं के 2 + गतिशीलता पर नजर रखी। भविष्य अनुप्रयोगों के लिए, हम वर्तमान में पीजी या उनके पेश न्यूरॉन्स के साथ सुसंस्कृत अंडाशय की लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित कर रहे हैं। मौजूदा तरीकों के संबंध में, इस नए प्रोटोकॉल एक साथ न्यूरॉन्स और अपने लक्ष्य अंगों की गतिविधि कल्पना करने के लिए करना है। एक बार जब न्यूरॉन्स की गतिविधियों सीए 2 + सूचक GCaMP या Cameleon 38 के साथ नजर रखी जा सकती है, यह उचित समय पर optogenetic या thermogenetic दृष्टिकोण के साथ हेरफेर किया जा सकता39 है। इन विधियों स्टेरॉयड हार्मोन जैव संश्लेषण की एक व्यापक समझ और उसके न्यूरोनल नियामक तंत्र के लिए योगदान करते हैं।

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Disclosures

ब्याज की कोई विरोध नहीं घोषित कर दिया।

Acknowledgments

हम इस काम के लिए उनके तकनीकी सहायता के लिए रीको किस और Tomotsune Ameku धन्यवाद। हम यह भी केई इतो, ओल्‍गा एलेक्सेयेंको, अकीको Koto, मासायुकी मिउरा, ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र, क्योटो स्टॉक केंद्र (DGRC), और स्टॉक और अभिकर्मकों के लिए विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक के आभारी हैं। इस काम JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 16K20945, नाइतो फाउंडेशन, और Inoue साइंस रिसर्च अवॉर्ड से Ysn को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया; और MEXT KAKENHI अनुदान संख्या 16H04792 से आर एन, को अनुदान द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 122 विकासात्मक जीवविज्ञान तंत्रिका विज्ञान, Ecdysteroid जैव संश्लेषण इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री germline स्टेम सेल अंडाशय prothoracic ग्रंथि
फल मक्खी में Immunostaining साथ Steroidogenic अंगों और उनके इंटरएक्टिव अंगों दृश्यमान करने के लिए प्रोटोकॉल<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Imura, E., Yoshinari, Y.,… More

Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

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