Summary
私たちは、解剖、固定、およびステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するために、ショウジョウバエの幼虫と大人の女性のステロイド産生器官の免疫染色のためのプロトコルを記述します。ステロイド産生臓器に加えて、我々は、ステロイド産生器官の神経支配並びにそのような生殖細胞系列幹細胞のようなステロイド産生標的細胞を可視化します。
Abstract
多細胞生物では、細胞の小グループは、成長と再生への全身応答を誘導する、その生物起源の活動の専門機能に恵まれています。昆虫で、幼虫の前胸腺（PG）と、成人女性の卵巣プレイエクジステロイドと呼ばれる主要なステロイドホルモンの生合成における重要な役割。これらのecdysteroidogenic器官は生合成のタイミングは、環境手がかりに影響され、それを通して神経系から神経支配されています。ここでは、ステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するための適切なモデルシステムを提供キイロショウジョウバエを 、飛ぶecdysteroidogenic臓器や幼虫でのインタラクティブな臓器や果物の大人を可視化するためのプロトコルを記述します。巧みな解剖は、私たちは脳、腹側神経索、および他の組織を含むecdysteroidogenic臓器とそのインタラクティブな臓器の位置を維持することができます。を用いた免疫染色ecdysteroidogenic酵素に対するntibodiesは、組織特異的プロモーターにより駆動されるトランスジェニック蛍光タンパク質と共に、ecdysteroidogenic細胞を標識するために利用可能です。また、ecdysteroidogenic器官の神経支配はまた、特異的抗体又はニューロンの様々なタイプのGAL4ドライバーの集合によって標識することができます。したがって、ecdysteroidogenic器官およびそれらの神経接続は、免疫染色およびトランスジェニック技術によって同時に可視化することができます。最後に、我々は、その増殖とメンテナンスエクジステロイドによって制御されている生殖細胞系列幹細胞を、視覚化する方法について説明します。この方法は、ステロイドホルモンの生合成とその神経調節機構の総合的な理解に貢献しています。
Introduction
多細胞生物では、細胞の集団は、体全体のために不可欠である彼らの生体活動の専門機能に恵まれています。その任務を果たすために、各組織または器官は、それらの機能に関連する遺伝子のシリーズを発現し、開発のコンテキスト内でそれらの活性を編成するために他の組織と通信します。このような特殊な細胞機能およびインター器官相互作用を特徴づけるために、我々は、細胞の他のタイプの多アーキテクチャにそのまま保持されると共にセルのグループを指定する必要があります。
そのような特殊な器官の一例は、多くの生合成酵素が活性ステロイドホルモン1にコレステロールから変換ステップを仲介ステロイド産生器官です。これらの酵素の遺伝子のほとんどは、特にステロイドの器官で発現され、生合成経路がしっかり体液入力とニューロンの入力を介して多くの外部刺激により調節されます。一度合成、ステロイドホルモンは、体液中に分泌され、遺伝子2の種々の発現を調節するため、多くの組織および器官を標的とします。したがって、ステロイドホルモンの作用は、恒常性、成長、および再生を維持するためのシステム応答を誘導します。
ステロイドホルモン生合成の機能及びステロイドホルモンの多面的な行動を調査するために、 キイロショウジョウバエは、適切なモデル系として利用することができます。幼虫の段階では、昆虫ステロイドホルモン、エクジステロイドは、専門的な内分泌器官で生合成される前胸腺（PG）3と呼ばれます。 PGでは、いくつかのecdysteroidogenic酵素は、具体的には、適切な発達段階4に脱皮および変態制御する、エクジソンにコレステロールから複数の変換ステップを触媒します。したがって、エクジステロイド力価の動的変化が規制されています環境合図に応答して、多くのシグナル伝達経路によって。一方、成人の段階では、エクジステロイドは、再生、睡眠、メモリ、および寿命5、6、7、8を含む生理学における重要な役割を果たしています。エクジステロイドが積極卵形成6、7、8、9、10、11の進行を調節する、卵巣で生合成されることが知られています。最近では、生殖細胞系列幹細胞（GSCs）の数が12を刺激交配に応じて、エクジステロイドとのセックスペプチドのシグナル伝達に影響されることを報告しています。
よく注釈付きゲノム情報を含むキイロショウジョウバエ遺伝学および細胞生物学の強力なツール、バイナリ遺伝子発現系、およびトランスジェニックのRNAi技術は、PGおよび卵巣13、14、15で生合成をエクジステロイドために不可欠な遺伝子を同定するために私たちを有効にしています。 ecdysteroidogenic遺伝子が同定されたら、これらの遺伝子の転写調節および遺伝子産物の動的局在は、生合成経路16で検査することができます。この目的のために、定量的逆転写PCR、in situハイブリダイゼーション RNA、及び免疫組織学的分析が行われます。これらの技術の適用は、困難なタスクを含みます。 PGまたは卵巣の精巧な解剖。 1は、果物のサンプリングのために解剖を飛ぶの重要なスキルを練習する必要があるので、特に、ショウジョウバエのPGは、他の昆虫（ 例えばカイコとクロバエ）に比べて相対的に小さいです。さらに、両方のecdysteroidogenic器官は神経支配を受けます中枢神経系（CNS）17、18、19、20秒から。したがって、正確な解剖学的な分析のために、ecdysteroidogenic器官は彼らの神経接続を破壊しない、CNSおよび他の器官と一緒にそのまま保持されなければなりません。
ここでは、Dにおけるステロイド産生器官の解剖と可視化のためのプロトコルを提供します。 ショウジョウバエ。解剖の技術を学ぶことはこれらの実験のための重要な出発点です。また、1が正常にいくつかの抗体とGAL4ドライバーラインとステロイド産生臓器並びにそれらのインタラクティブな器官にラベルを付けることができます。これらの技術、材料、および遺伝学を利用して、一つはステロイドホルモンの生合成の総合的なメカニズムを研究することができます。
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Protocol
注：プロトコルの全体的なスキームを図1に示されています。
1.幼虫リング腺の解剖（RG）
NOTE：Dで。 cyclorrhaphous双翅目に属するメラノは 、PGは、複合内分泌器官内リング腺（RG、 図2D）と呼ばれます。それはPGを外科的（後述する）他のタイプの細胞から分離されることが不可能であるため、実用的な目標は、解剖によって無傷の、無傷RGを単離することです。
- 適切な発達段階での幼虫の準備
注： キイロショウジョウバエの幼虫の発達段階を同期させるために、狭い時間ウィンドウ内の卵を収集するために、適切なタイミングで幼虫を収集する必要があります。- 25℃でのグレープジュース寒天プレート上で2時間、卵を集めます。
- 新たに孵化し収集1
- 適切な時点で、望ましくない負傷を避けるために、使い捨てのプラスチック製のループで上演幼虫を集めます。 第3齢幼虫の発達の進行の差を最小にするために、70 HAEL（48 HAH）における第2齢幼虫を収集し、それらを2時間間隔で脱皮することを可能にします。次いで、L3の脱皮後2時間以内に第3齢幼虫を集めます。この手順は、0-2 hAL3Eの幼虫を与えます。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされたシャーレにステージング幼虫を転送します。
- 身体から残留食べ物を取り除くためにPBSで幼虫をすすぎます。
- 下の幼虫の粗解剖解剖顕微鏡
- ピンセットで幼虫の口のフックを保持します。マイクロはさみを使用して、本体の長さの前方三分の一で幼虫体を切断します。
- 鉗子の1ペアで前幼虫体の切断端を持ちます。鉗子の他のペアを使用して、優しく体の内側に向かってヘッドの先端を押します。この手順は、裏返し幼虫の体を回します。
注：このステップでは、1 回目の齢幼虫の解剖のためにスキップすることができます。 - 手順を繰り返して、1.2.1-1.2.2、追加の幼虫を5〜10分間。
注：幼虫の数は解剖のための時間を節約することが20以下でなければなりません。
- 幼虫のフィレ解剖
注：このメソッドはそのまま残るために組織の位置を維持することができます。- わずか1時間水に幼虫を残します。幼虫は、窒息のために固定化されています。
- シリコンコーティングにPBSのドロップ幼虫の背側を上にして置きますその背側を上にして皿。
注：背側は、長手方向に延びる2本の気管チューブを持っています。 - 解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて幼虫の前方先端部に虫ピンを挿入します。後方側に幼虫体を伸ばすと幼虫の後方先端部に第二のピンを置きます。
注：昆虫ピンに加えて、タングステンワイヤから製造された針21に有用であり得ます。針は、解剖針として使用するための加熱によってピペットチップに埋め込むことができます。 - 解剖顕微鏡下で、マイクロハサミで尾の近くに小さな切開を行います。切開部から、頭部に向けて背側正中線に沿って縦方向に背側クチクラを切りました。キューティクルの下に組織を傷つけないように注意してください。
- 各側の側板のキューティクルを伸ばし、解剖側板の各コーナーに4本のピンを配置します。
- 脳-RG Cを露出させ、鉗子で前脂肪体の部分を削除します表面に露出することomplex。必要に応じて、唾液腺のペアを削除します。
- 免疫組織化学と組織の固定および染色
- 500μL定着液（PBS中の4％パラホルムアルデヒド）を充填した1.5 mLのマイクロチューブに幼虫体（ステップ1.2.2）の前方三分の一を置きます。そうでなければ固定したサンプルに付着PBSで固定液の好ましくない希釈を引き起こす可能性があり、一度に20個の未満のサンプルを固定します。フィレット解剖のために、PBSの滴を除去した後、定着液の液滴を加えます。
注：固定溶液は、3.7％ホルムアルデヒドを4％パラホルムアルデヒドのいずれかを使用することができます。 - 室温（RT）で30分間定着液中に切開組織をインキュベートまたは代わりに4℃で2時間撹拌しました。
- 500μLPBSで定着液を交換し、すぐにサンプルを3回すすいでください。 Rにおけるロッカーに15分間、500μLの0.3％PBT（PBS + 0.3％オクチルフェノールエトキシレート）を有するサンプルを洗いますフィレット解剖についてT.、昆虫ピンを除去し、1.5 mLのマイクロチューブにサンプルを移します。
注：組織への抗体の浸透性を増大させるため、試料を室温でロッカー上で1〜2時間、500μL2.0％のPBTを用いて処理されます。 - 溶液（PBT中の2％ウシ血清アルブミン）をブロック500μLとPBTを置き換えます。 RTでロッカー上で1.5時間試料をインキュベートします。
- 50μL一次抗体溶液、ブロッキング溶液で希釈したすなわち抗体によるブロッキング溶液を交換してください。
- 一晩4℃でロッカー上のサンプルをインキュベートします。
- 500μLの0.3％PBT一次抗体溶液を交換し、迅速にサンプルを5回すすぎます。 RTでロッカー上で15分間、500μLの0.3％PBTで試料を3回洗浄します。
- 50μLの二次抗体溶液（ブロッキング溶液中に希釈した色素標識抗体）を用いて0.3％のPBTを置き換えます。核染色、0.5μL4' のために、6-diamidino-2-フェニルインドール（DAPI、0.1mg / mlのストック溶液）、50μLの溶液に添加します。 RTでまたは代わりに一晩4℃で2時間ロッカー上でサンプルをインキュベートします。
注：暗闇の中でサンプルを保管してください。 - 500μL、0.3％のPBTと抗体溶液を交換し、5回すすいでください。 RTで15分間、500μLの0.3％PBTで試料を3回洗浄します。
- 500μL定着液（PBS中の4％パラホルムアルデヒド）を充填した1.5 mLのマイクロチューブに幼虫体（ステップ1.2.2）の前方三分の一を置きます。そうでなければ固定したサンプルに付着PBSで固定液の好ましくない希釈を引き起こす可能性があり、一度に20個の未満のサンプルを固定します。フィレット解剖のために、PBSの滴を除去した後、定着液の液滴を加えます。
- PGを含むと取付脳-RG複合体の微細解剖
- 0.3％PBTを充填した皿に免疫染色サンプルを転送するために、使い捨てピペットを使用します。
注：解剖および実装時に不便な泡を避けるために、0.3％のPBTは、PBSと交換することができます。 - 解剖顕微鏡下では、鉗子の1ペアでキューティクルや口のフックを保持します。 「ナイフ」と1mlシリンジに取り付けた27 G針を使用して、身体のキューティクルから脳-RG眼ディスク複合体を除去するために、食道と眼ディスクの前方先端を切りました。
- SEPAピンセットで脳-RG-目のディスク複合体から食道と腸を評価。食道は、腹側神経索（VNC）上記脳を通過するので、後側に腸を引き出します。
注：ニードルナイフで脳、目のディスク、および脚のディスク間の接続を切り、サンプルから余分な成虫を削除するには。 - 他のサンプルのための手順を1.5.1-1.5.4繰り返します。
注：0.3％PBT又はPBSで満たされた異なる清浄な皿に各完成サンプルを転送する、サンプルに付着する組織破片を防ぐために。 - マイクロピペットで清潔なガラススライドの中央にサンプルを転送します。
注：第2または第3齢幼虫の場合、マイクロピペットチップの端部は、かみそりの刃で切り捨てられるべきです。 - 解剖顕微鏡下で、ピンセットを使用して、背側を上にして個々のサンプルを整列させます。
注：RGは、脳の背側に配置されている（ 図2A）。このアライメントは、撮像中の個々のサンプルの仕様を容易にします。 - ガラススライドを傾け、できるだけ多くの余分なPBTを拭き取ってください。スライドの側面に取り付けた試薬の液滴を入れてください。ドロップの反対側からカバースリップのエッジを置き、ピンセットでゆっくりとサンプルにカバースリップを置きます。
注：この手順では、カバーガラスの外に移動するからサンプルを防ぐことができます。 - 4°Cでサンプルを保管してください。暗闇の中でサンプルを保管してください。
- 0.3％PBTを充填した皿に免疫染色サンプルを転送するために、使い捨てピペットを使用します。
2.卵巣の解剖で 大人の女性
- 成人女性の調製
- フィードの女性は卵巣を太らせるために3〜4日間食べ物を飛ぶ標準酵母/コーンミールで飛びます。 25°Cで維持します。
- 大人の女性の卵巣の解剖
- 女性は、CO 2ガスで飛んで麻酔し、頭を切り落としました。
- 3センチメートル皿にフライ体を転送PBSでいっぱい。
- 解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて背側胸部を保持します。他の鉗子で腹部のセグメントA5またはA6をつかみ、後側に向かって腹部キューティクルの剥がれ。鉗子の先端から粘着性のキューティクルを拭き取ってください。
- 卵管をピンチし、体内から卵巣を取り出します。
- 櫛や鉗子で卵巣のヒントを広げます。
注：この操作は、免疫染色の効率を向上させることができます。
- 大人の女性の脳、VNCや生殖器官の解剖。
注：この方法は、卵巣の神経支配はそのまま保持されることを可能にします。- 女性は、CO 2ガスで麻酔ハエおよびPBSを充填したシリコンコーティング皿に移します。
- 解剖顕微鏡下で、口吻を保持し、鉗子で脳が露出するようにヘッドキューティクルをはがします。脳に添付気管を削除します。
注：brainが白と丸みを帯びた構造です。脳は胸部にVNCに接続します。 - 背側胸部を持ち、鉗子の1ペアで脚と翼を切り落としました。鉗子の他のペアを使用して、足の塩基から胸部腹キューティクルを剥がします。 VNCが露出されると、VNC使用鉗子に取り付けられた残留背側クチクラ及び筋肉を取り除きます。脳とVNCとの間の接続を傷つけないように注意してください。
- 腹部キューティクルの剥がれや卵巣およびニューロンを含む彼らのインタラクティブな臓器、作物、消化管、卵管、子宮、およびアクセサリー腺を露出するために鉗子を使用してください。
- 気管や鉗子を使用して体脂肪を含む残留組織を削除します。
- 免疫組織化学と組織の固定および染色
- 250μLの固定液（4％paraformaを充填した1.5 mLのマイクロチューブに卵巣の約8~10対を転送PBSでldehyde）とRTで30分間、サンプルをインキュベートします。
- 500μLPBSで定着液を交換し、すぐにサンプルを3回すすいでください。
- RTで5分毎にサンプルを500μLの0.1％PBTで2回洗浄します。
- ブロッキング溶液50μLとPBTを交換してください。 RTでロッカー上で1時間試料をインキュベートします。
- 50μL一次抗体溶液でブロッキング溶液を交換してください。
- 一晩4℃でロッカー上のサンプルをインキュベートします。
- 500μLの0.1％PBT一次抗体溶液を置き換えます。 RTでロッカー上で15分間、500μLの0.1％PBTで試料を3回洗浄します。
- 50μLの二次抗体溶液と0.1％のPBTを置き換えます。核染色のために、50μLの溶液に0.5μLDAPIを追加します。 RTでロッカー上で2時間サンプルをインキュベートします。
- 500μLの0.1％PBTとの二次抗体溶液を置き換えます。 500μLの0.1％PBTで試料を3回洗浄 RTでロッカー上で15分間、。
注：洗浄操作は4℃で一晩行うことができます。暗闇の中でサンプルを保管してください。
- スライドガラス上にサンプルをマウントします
- マイクロピペットを用いて、0.1％のPBTを用いてガラススライドにサンプルを移します。
注：解剖し、実装時の不便な気泡を回避するために、0.1％のPBTをPBSで置換することができます。 - 卵巣のために、解剖顕微鏡下でピンセットで互いにovariolesの文字列を区切ります。 germariaを含むovariolesのヒントを傷つけないでください。脳-VNC-生殖器官の複雑なために、残留キューティクルを削除し、ガラススライド上の位置を配置します。
- できるだけ過剰PBTを拭き取り、サンプルの中心に取り付け試薬の滴を置きます。ゆっくりとピンセットを用いてカバースリップを置きます。
- 4°Cでサンプルを保管してください。暗闇の中でサンプルを保管してください。
- マイクロピペットを用いて、0.1％のPBTを用いてガラススライドにサンプルを移します。
- 顕微鏡でサンプルを観察し、視野内のステロイド産臓器をもたらします。ビューが固定されたら、画像取得モードに撮像システムを切り替えます。
注：10-20X対物レンズが脳-RG複合体や卵巣全体の画像を取得するために使用されています。あるいは、40-63X対物レンズ（水又は油浸）はGSCsまたはPGおよび卵巣のニューロンの神経支配中のタンパク質の細胞内局在を可視化するために使用されます。 - 付属のソフトウェアでの画像取得のパラメータを設定します。蛍光（ 例えば GFPおよびRFP）の組み合わせを選択します。高速走査手順によって、レーザパワー、検出器の感度（ゲイン/オフセット）、及びピンホールの大きさを調整します。
注記：高品質の画像を取得するために、走査レーザパワーと検出器（ゲイン）の感度は、各サンプルのために最適化されなければなりません。形状の概要を説明するために、組織を、透過光画像は蛍光画像に加えて取ることができます。 - 画像のZスタックを取ります。連続高速走査中に、顕微鏡のフォーカス駆動と焦点面を移動させ、開始位置と終了位置を設定します。スライスの数とスライス間の間隔距離は、それに応じて調整されます。
- スキャン速度、スキャン方法、および双方向スキャンモードを選択します。
- 画像取得のための「本当のスキャンを開始します」。
- 付属ソフトの形式で画像を保存します。
注：元の画像ファイルは、画像取得パラメータおよびスケールの情報が含まれています。エクスポートされた画像は、コンピュータ22上で画像処理ソフトウェアを用いて処理することができます。
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Representative Results
私たちは、ステロイド産生器官やキイロショウジョウバエの幼虫と大人の女性で彼らのインタラクティブな臓器を可視化するために上記のプロトコルを使用していました。プロトコルの全体的なスキームを図1に示されています。
PG（ 図2D）を含むRGは、脳よりも小さく、より透明であり、脳（ 図2A-C及び図3-E）の前方、背側に位置しています。 PG細胞を標識するために、いくつかのグループがecdysteroidogenic酵素（ すなわち 、ネバーランド23、24 Spookier、シュラウド20、ファントム25、肉体25、及びシャドウ26）に対する抗体の様々なタイプを生成しました。これらの中でも、抗シュラウド（SRO）抗体が確実に免疫染色によりPGを標識するために使用される（ 図2C、2E、および図3C）。また、binarY遺伝子発現システム、GAL4 / UASシステム27、PG細胞中の蛍光タンパク質遺伝子を発現するために使用することができます。 ecdysteroidogenic遺伝子ファントム（PHM）のプロモーター解析により、PG特異的プロモーターは、PG 28に排他的に遺伝子発現を誘導することができます。したがって、PG細胞を特異的にPHM-GAL4番号22（ 図3D）の制御下でGFPまたはRFPを発現することによって可視化することができます。
PGと脳の間の神経接続を視覚化するために、神経細胞の群は、種々のGAL4ドライバーおよび抗体（ 図2C、2E、3D、及び3E）の制御下mCD8 :: GFPで標識することができます。 GAL4ラインのコレクションのFlyLightデータベースは、ニューロン29を標識するために最適化されています。中でも、GMR45C06-GAL4は、PG-突出ニューロン（ 図2C及びE）のラベル。イム抗GFP抗体を用いたGFP発現性幼虫のmunostainingはGFPシグナルを増強するのに有効です。さらに、TRH-GAL4> mCD8 :: GFP幼虫は、内セロトニン作動性ニューロンのプロジェクトに限らずPGでなく、前胃に（PV、昆虫前腸）と咽頭の筋肉（PM）（ 図3D stomatogastric神経系を、示し、 E）20、30。したがって、RG、脳、およびフィレットの解剖中に他の周囲組織（ 図3）の位置を維持することが重要です。
大人の女性では、卵巣のエクジステロイドは、GSCの増殖、嚢胞分化、卵室の成長、およびストレス応答11として、卵形成の多くの側面に影響します。 PGのように、卵巣ecdysteroidogenic酵素はまた、31、12、上述の特異的抗体を用いて可視化されます。下流のイベントがどの作用がエクジステロイドとして、germariumにGSCsの数は、我々の焦点（ 図4）です。 germariumは、複数の細胞型のアセンブリであるが、GSCsは、二つGSCマーカー抗体、1B1及びD Eカドヘリン32で免疫染色することにより特定されます。卵巣の神経支配を視覚化するために、卵巣、脳、VNC、腸、作物、子宮、および受精嚢（ 図5）と一緒に解剖されます。ニューロンはnSyb-GAL4、パン神経ドライバ（ 図5B及びD）の制御下にmCD8 :: GFPにより可視化されます。卵巣、子宮、および腸の周りの筋肉は、色素結合ファロイジンで染色されています。
図1： プロトコルの全体的なスキーム。二つの異なる解剖方法はAPPLICです実験の目的に応じて、幼虫と大人の女性にできます。取付方法はまた、サンプルの条件に応じて考案されています。固定、染色、及び撮像技術は、基本的にすべてのサンプルに共通です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：PG 及びPG-突出ニューロンの可視化。 （AおよびB）野生型第3齢幼虫の脳リング腺（RG）錯体。 （B）において、PGは、点線で概説されています。脳とRGの間に糸状の構造が気管あります。 （C - E）PGの神経支配はmCD8で可視化した::FlyLightコレクションにGMR45C06-GAL4によって駆動されるGFP。 PG及びGFP陽性ニューロンは、それぞれ抗SRO抗体（マゼンタ）および抗GFP抗体（緑色）で標識しました。蛍光画像は、組織の輪郭を指定する透過光画像とマージされます。 （D）において、PG、コーパスallata（CA）とコーパスのcardiaca（CC）が示されています。 PG-突出ニューロンは、10X対物レンズ（C）の低電力画像よりも40倍対物レンズ（E中の矢印）と高出力画像においてより顕著です。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：PG、PV、 へStomatogastric神経系プロジェクト ND PM。 （AおよびB）野生型第3齢幼虫のフィレット解剖。 PG、脳（BR）、腹側神経索（VNC）の位置、目のディスク（ED）、翼ディスク（WD）、咽頭筋（PM）、及び前胃（PV）がそのまま残ります。 （C）PGは、もっぱら抗SRO抗体（マゼンタ）で標識しました。 （D）PGはPHM-GAL4番号22によって駆動turboRFPで標識しました。セロトニン作動性神経細胞は抗5HT抗体（緑）で標識しました。 （E）stomatogastric神経系は、TRH-GAL4によって駆動mCD8 :: GFPで可視化しました。セロトニン作動性ニューロンはPG、PM、およびPV（矢印）に突出しています。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ファイル/ ftp_upload / 55519 / 55519fig4.jpg」/>
図4： 一、二、または三GSCsを含む野生型のハエのGermaria。 （A）女性の生殖器官の概要。卵巣は卵室の列である16-20 ovariolesで構成されています。 GSCsが配置されているgermariumは、各ovarioleの先端にあります。 （B - D）一、二、または三GSCsは、野生型の雌の各germarium（白色点線の円）に配置されています。 GSCsはspectrosome（矢印）と呼ばれる球状構造とfusomeとして知られている膜状細胞骨格構造を標識1B1抗体（緑）で染色します。セル境界は、抗D Eカドヘリン抗体（マゼンタ）を用いて可視化されます。 =10μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 女性生殖器とそのインタラクティブな器官。 （A）、卵巣（OV）、消化管（腸）、作物（CR）、脳（BR）、腹側神経索（VNC）、そして受精嚢（SP）は、顕微鏡下で解剖しました。 （B - D）卵巣の神経支配はnSyb-GAL4によって駆動mCD8 :: GFPで可視化しました。 GFP陽性ニューロンは、卵巣（矢印）の表面に突出する、VNC（矢印）から延びています。卵巣を点線で概説されています。試料を抗GFP抗体（緑）、色素共役ファロイジン（マゼンタ）で染色しました。糸状卵巣の周りの筋肉のアクチン（OV）と子宮（UT）に会合をファロイジン。図はC.中のスケールバー=200μmで示されています。rge.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、エクジステロイド生合成およびキイロショウジョウバエにおけるその調節機構を研究し、そして解剖および免疫染色のためのプロトコルを考案しました。エクジステロイド生合成のタイミングは、ニューロンの入力33を介して、環境手がかりに影響されるので、解剖時の脳、VNC、および他の組織と一緒にecdysteroidogenic器官の神経支配を維持するために不可欠です。
上述したように、 キイロショウジョウバエ PGはコーパスallata（CA）と複合内分泌器官RGとコーパスcardiaca（CC）（ 図2D）を形成します。 PGは、エクジステロイドを生成しながら、CAおよびCCは、それぞれ、幼若ホルモン及びadipokineticホルモンを産生します。この解剖学的特性はDでecdysteroidogenesisを研究、研究者への障害となってきました。 ショウジョウバエ 、他の昆虫に比べて。しかし、過去数十年では、遺伝学のhaのフライSは、私たちは、具体的にPG 4で表されている多くのecdysteroidogenic遺伝子を同定することができました。これらの遺伝子はまた、ナース細胞または卵巣34,35の包細胞中で発現されます。今1は、免疫染色およびトランスジェニック技術によってecdysteroidogenicセルを指定することが可能となる、ecdysteroidogenic臓器における遺伝子発現プロファイルの固有のセットを使用することができます。
解剖時には、シャープなエッジと細かい鉗子を使用することが不可欠です。解剖前に、鉗子のエッジが隙間なく一緒にエッジを持って砥石アーカンソー州でシャープにすることができます。解剖、デブリ又は脂肪体として残存組織、腸、及び成虫の間、可能な限り除去されるべきです。具体的には、体脂肪の部分は簡単に目的の組織に固執します。加えて、ガラススライド上にサンプルの実装はまた、実行されるべきです慎重編。カバースリップは、粘着性のマウンティング培地内のサンプル上に置かれたときに組織の複合体が乱れてもよいです。したがって、十分な数のサンプルを解剖しなければならず、適切なサンプルは、RGまたは卵巣の最上側にあり、神経接続が無傷のままであるのものと、イメージングのために選択されなければなりません。
成功した免疫染色を行うためには、再現可能な結果を得るためには、サンプリングおよび取り扱い手順のために同じ条件を維持するために重要です。免疫染色の程度は非常にサンプリングし、定着時の個々の動物の状態に依存します。例えば、動物の年齢は、飼育温度、栄養状態、および解剖時間は、慎重に検討する必要があります。複数の実験での固定のハンドリングエラーを最小限に抑えるために、我々は慎重に解剖時間と固定反応時間を調整するために、サンプルのほぼ同じ数を保ちます。固定のためのolution、4％パラホルムアルデヒド又は3.7％のホルムアルデヒドが使用されます。パラホルムアルデヒドを迅速に時間をかけて分解されるので、その粉末は、通常、PBS中の10％ストック溶液を作るために溶解し、アリコートを-20℃で保存します。アリコートを前に、すべての解剖に新鮮な4％の定着液を作ることが凍結解除されています。また、サンプルの大規模な洗浄工程は、バックグラウンドの非特異的染色を減少させます。
画像取得のステップでは、我々は、共焦点顕微鏡のための製造者のプロトコルに従ってください。顕微鏡システムは、蛍光体の種類が指定されているとき、励起/発光フィルタの最適なセットが自動的に選択されるように、研究者や学生のためのユーザーフレンドリーなインターフェイスを提供します。顕微鏡システムは使いやすいが、一方は検出器利得、走査速度、走査数、及びピンホールの大きさを変化させることにより、各試料又は各焦点面上の画像取得パラメータを最適化する必要があります。
36などの他のecdysteroidogenicの遺伝子産物に対するいくつかの抗体の生成に失敗しました。この問題を克服するために、ノックイン技術は、CRISPR / Cas9システムを用いウイジャボードの遺伝子座におけるHAタグを挿入するために適用することができます。免疫染色と組み合わせたこのようなトランスジェニック技術を用いて、少なくとも3-4のタンパク質を同時にPGまたは卵巣で可視化することができます。タンパク質の局在化とは対照的に、しかし、免疫染色により内因性エクジステロイドを可視化する方法が確立されていません。抗エクジステロイド抗体は免疫染色のために利用可能になると、エクジステロイド生合成の細胞内ローカライゼーションとエクジステロイドの輸送は、将来的に調べることができます。 別の制限はecdysteroidogenesisの時間的ダイナミクスが固定組織で検査することができないことです。エクジステロイド力価を発達段階に沿って変動することを考慮すると、ecdysteroidogenic器官および突出ニューロンの活動は、時間的に、様々な環境刺激に応答して調節されるべきです。最近の研究では、ライブイメージング技術37を使用して、PG細胞のカルシウム2+動態を監視しました。将来のアプリケーションのために、私たちは現在、PGまたはその突出した神経細胞と一緒に培養した卵巣のライブイメージングのためのプロトコルを開発しています。既存の方法に関しては、この新しいプロトコルは、同時に神経細胞とその標的器官の活動を可視化することを目指しています。ニューロンの活動は、Ca 2+指示薬GCaMPまたはカメレオン38で監視することができると、それは適切な時間に光遺伝学的又はthermogenetic手法で操作することができます39です。これらのメソッドは、ステロイドホルモンの生合成とその神経調節機構の総合的な理解に貢献しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていません。
Acknowledgments
私たちは、この作品のために彼らの技術支援のため玲子喜瀬とTomotsune Amekuに感謝します。我々はまた圭伊藤、オルガ・アレックシーエンコ、明子琴、正幸三浦、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター、京都ストックセンター（DGRC）、および株式および試薬のための発達研究ハイブリドーマバンクに感謝しています。この作品は、日本学術振興会科研費助成金番号16K20945、内藤財団、井上科学研究賞からYSNへの助成金によってサポートされていました。文部科学省科研費助成金番号16H04792からRNへの助成金によって。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
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