Summary
Beskrevet her er en iscenesatt, atferds screening tilnærming som kan brukes til å skjerme for forbindelser som viser in vivo effekt på kognitive og funksjonelle motoriske oppføringer i transgene musemodeller av β-amyloidose og tauopati. Disse metodene er optimalisert for å skjerme forbindelser for aktivitet i korttids- og arbeidsminneoppgaver.
Abstract
Her beskriver vi en iscenesatt, atferdsprøve-tilnærming som kan brukes til å skjerme for forbindelser som viser in vivo- effekt på kognitiv og funksjonell motorisk adferd i transgene musemodeller av β-amyloidose og tauopati. Paradigmet inkluderer tester for spontan veksling i en Y-labyrint, en ny gjenstandsgenkjenning og lemmer. Disse testene ble valgt fordi de: 1) forhør funksjon av kognitive eller motoriske domener og korrelere nevrale kretser som er relevante for den humane sykdomsstaten, 2) har klart definerte endepunkter, 3) har lett implementerbare kvalitetskontrollkontroller, 4) kan kjøre inn Et moderat gjennomføringsformat, og 5) krever liten intervensjon av etterforskeren. Disse metodene er utviklet for etterforskere som ønsker å skjerme forbindelser for aktivitet i kortsiktige og arbeidsminnesoppgaver, eller funksjonell motorisk adferd assosiert med Alzheimers sykdom musemodeller. Metodene beskrevet her bruker oppførselstest som engAlder en rekke forskjellige hjerneområder, inkludert hippocampus og ulike kortikale områder. Undersøkere som ønsker kognitive tester som spesifikt vurderer kognisjon formidlet av en enkelt hjernegruppe, kan bruke disse teknikkene til å supplere andre atferdstest.
Introduction
Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse som resulterer i svekkende kognitiv tilbakegang som rammer rundt 44 millioner mennesker over hele verden. For tiden er det ingen tilgjengelige behandlinger for AD som er sykdomsmodifiserende, understreker det presserende behovet for preklinisk oppdagelse av nye terapeutiske strategier for denne sykdommen. Det er opprettet en rekke forskjellige transgene musemodeller som rekapitulerer ulike aspekter av AD 1 , 2 , inkludert mangler i kognitive domener forstyrret hos pasienter 3 . Disse musemodellene er et nyttig verktøy for å lette effektiv screening in vivo .
Når man vurderer en forbindelse for potensiell in vivo- effekt, må en iscenesatt tilnærming tas som skjermer for effektivitet i passende kognitive domener og overvåker også atferd som kan påvirke de spesifikke endepunktene som brukes til åSsesskognisjon. Mange transgene musemodeller av AD utviser hyperaktivitet og andre atferd som kan forstyrre en bestemt kognitiv test, og forby bruk av stoffet i narkotika-screening 4 . Videre, for en tilnærming som skal implementeres i et narkotika-screeningsmiljø, bør de spesielle testene opprettholde minst en moderat gjennomstrømning, ha klart definerte endepunkter, og en prosedyre som krever minimal intervensjon av etterforskerne. Ved bruk av disse kriteriene kan adferdsesskjermer implementeres som viser reproduksjonsevnen, lav intra- og interanalysevarians og effektstørrelser som trengs for sammensatt screening. Detaljert her er metodene vi har ansatt for å skjerme for forbindelser som er effektive for å dempe de kognitive og motoriske fenotyper som er tilstede i transgene musemodeller av β-amyloidose og tauopati 5 , 6 . Metodene som er beskrevet er tilpasset fra vanlige adferds paradigmer rapportert i lIteratur 7 , med spesifikke optimaliseringer og kvalitetskontroll sjekker slik at de kan brukes i transgene musemodeller som er relevante for AD. Denne protokollen kan brukes med en rekke datainnsamlings- og analysesystemer, og antar at etterforskeren har arbeidskunnskap om den tilknyttede programvaren.
Protocol
Metodene beskrevet i denne publikasjonen ble gjennomgått av institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC) ved Hilltop Laboratory Animals for å sikre forsvarlig pleie, bruk og human behandling av dyr i samsvar med gjeldende føderale, statlige og lokale lover og forskrifter, slik som Som den føderale dyrevelferdsforskriften eller AWRs (CFR 1985) og folkehelsevesenets politikk for human omsorg og bruk av laboratoriedyr, eller PHS-politikk (PHS 1996).
1. Generelle retningslinjer for all atferdsvurdering
- Før dyrehåndtering, dekk eksisterende burkort med et nytt burkort som bare angir den unike, blinde dyreidentifikatoren.
MERK: Undersøkere som håndterer mus under rutinemessig forbindelse / placebo dosering, er ikke tillatt å håndtere mus for atferdsvurdering. - Dimme eller skru av lysene og juster belysningen slik at belysning på gulvet på arenaen eller labyrinten er 30-35 lux.
- FEller studier som spenner over flere uker, registrerer kroppsvekter hver uke som et indirekte mål for total helse.
MERK: Ytterligere kontroller på klesiden for kappekvalitet, holdning, gang og spontan lokomotiv kan inkluderes dersom mer robuste helsekontroller er berettiget.
2. Habituating Mus å håndtere av etterforskere
- To dager før en hvilken som helst adferdstest, habituerer musene til håndtering. Ta av buret fra burstativet og legg det på en jevn overflate.
- Fjern lokket fra buret. Behandle musen nøyaktig som den ville bli håndtert under utførelse av den kommende atferdstesten. Plasser musen i en kuppet hånd over hjemmekassen.
- Mål latensen å hoppe fra etterforskerens hånd tilbake i hjemmet. Hold mus i maksimalt 5 s.
MERK: Mus som viser ventetider på ≥2 s, anses som "habituated". Mus som viser latenser <2 s under første forsøk, gjennomgår 2 ekstra habituatioN økter den dagen. - Har musene gjennomgått 2 påfølgende dager med behandlingsvaner. Legg merke til hvilken som helst mus som ikke er opptatt ved slutten av 2. dag.
3. Vurdere romlig arbeidsminne ved å måle spontan veksling i en Y-labyrint 8
- Før førstegangs bruk, rengjør Y-labyrinten grundig med et ubearbeidet blekemiddel, bakteriedrep, 70% EtOH, etterfulgt av dH 2 O 9 . Angi klart våpenens armer som 'A', 'B' og 'C' eller andre sammenlignbare unike identifikatorer.
- Før starten av en testsesjon, sett inn datainnsamlingssystemet eller videokameraene og sett opp riktig sporing av mus i labyrinten. Kalibrere avstanden i labyrinten ved hjelp av innspilte videobilder av en linjal eller et annet objekt med kjent lengde.
MERK: Atferdsmetodene i denne prosedyren vil fungere med en rekke datainnsamlingssystemer, og forfatterne antar anyoNe som utfører denne prosedyren er dyktig i bruken av deres valgte datainnsamlingssystem. Kraftanalyser indikerer at prøvestørrelser på 10-15 mus per gruppe kreves for en β ≤0,2. - Ta av buret fra stativet og legg det forsiktig på et bord i nærheten av Y-labyrinten. Fjern musen fra sitt hjem bur og legg den forsiktig inn i en arm i Y-labyrinten, mot midten. Ha etterforskersteget langt nok unna labyrinten, slik at musen ikke kan se etterforskeren.
- Aktiver data / videoinnsamlingssystemet umiddelbart etter plassering av musen i labyrinten.
- Trykk på spill og registrer spontan oppførsel for hver mus i en periode på 10 minutter. Når en økt er fullført, legg forsiktig musen tilbake i hjemmet og returner buret til stativet.
- Rengjør labyrinten grundig mellom hver økt med en ubearbeidet blekemiddel, bakteriedrepende tørk, 70% EtOH, etterfulgt av dH 2 O. Gjenta fra trinn 3.4 for å vurdere alle mikrofonere.
- Når alle musene har fullført leting av Y-labyrinten, analyser dataene fra oppkjøpssystemet eller manuelt score videoene av øktene. En arm inngang oppstår når alle 4 pote av musen krysser terskelen til den sentrale sonen og inn i armen og dyrets snute er orientert mot enden av armen.
MERK: Endpoeng som skal analyseres, inkluderer: Total tilbakestilt avstand i labyrinten, total avstand som er reist innen hver arm (inkludert sentral sone), total tid brukt i hver arm (inkludert sentral sone), totalt antall armoppføringer, antall Oppføringer laget i hver arm, og en sekventiell liste over armer inntatt for å vurdere antall alternativer gjort. - En spontan veksling oppstår når en mus går inn i en annen arm av labyrinten i hver av tre påfølgende armposter. Spontan veksling% beregnes deretter med følgende formel.
MERK: For eksempel, jegF rekkefølgen av arminngang var: ABCCBABCABC, undersøkeren ville score totalt 6 spontane alternativer (i rekkefølge: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). Med totalt 11 armoppføringer vil den spontane veksten% være 67%. - Gjør følgende kontroller for kvalitetskontroll for å sikre at dataene representerer en objektiv vurdering av spontan veksling.
- Utfør en Pearson korrelasjon av spontan veksling% til både total avstand og antall armmeldinger gjort.
MERK: Hvis det er en signifikant korrelasjon mellom spontan veksling% til begge parametere, bør dataene undersøkes ytterligere på grunn av potensiell påvirkning av hyperdynamisk lokomotiv på det tilsynelatende kognitive endepunktet 10 . - Analyser antall oppføringer gjort i hver arm med en 1-veis ANOVA-test.
MERK: Hvis denne analysen er signifikant, vil dette indikere tilstedeværelse av signaler i miljøet som tiltrukket mus til et bestemt områdePå labyrinten.
- Utfør en Pearson korrelasjon av spontan veksling% til både total avstand og antall armmeldinger gjort.
4. Vurdering av mellomleddsgjenkjenningsminne ved å måle objektiv gjenkjenning 11 , 12 og 13
- For hver fase av denne testen, rengjør den åpne feltarena grundig med en ubearbeidet blekemiddelkrepsdrikke, 70% EtOH etterfulgt av dH20 før opprinnelig bruk.
- En dag før objektets eksponering, habituate musene til åpen arena.
- Før starten av oppsamlingsøkten, sett opp datainsamlingssystemet eller videokameraene og bekreft riktig sporing av mus i labyrinten. Kalibrere avstanden i arenaen ved hjelp av innspilte videobilder av en linjal eller et annet objekt med kjent lengde. Merk hjørner av arenaen i programvaren for å tillate scoring av posisjonsforstyrrelser.
MERK: Atferdsmetodene i denne prosedyren vil fungere med en rekke datainnsamlingssystemerStammer og forfatterne antar at alle som utfører denne prosedyren, er dyktige i bruken av deres valgte datainnsamlingssystem. Kraftanalyser indikerer at prøvestørrelser på 15-20 mus per gruppe kreves for en β ≤0,2. - Ta av buret fra stativet og legg det forsiktig på et bord i nærheten av arenaen.
- Fjern musen fra hjemmet og legg forsiktig musen i midten av arenaen. Slå på sporingsprogramvaren og / eller videoopptakssystemet umiddelbart etter at musen er satt inn i arenaen.
- Tillat mus å fritt utforske arenaen i 30 minutter.
MERK: I denne perioden vil etterforskerne ikke forstyrre musene. - Etter habitueringsøkten, plasser musene tilbake i hjemmet og rengjør arena grundig med en ubearbeidet blekemiddel, bakteriedrepende tørke, 70% EtOH etterfulgt av dH20.
- Gjenta fra trinn 4.2.2 til alle musene har blitt habituated til arenaen.
- Etter at alle mus har vært vaneLedet til arenaen, analyser videoen.
MERK: Endpoints for å analysere inkluderer total avstand som er reist i arenaen og tid brukt i nærheten av hvert hjørne. Hvis det er relevant for musemodellen, inngår stereotypad oppførsel i disse analysene ( dvs. myoklonisk hjørnespring, sirkling, etc. ). Mus som viser forstyrrelser i tid brukt i bestemte områder av arenaen, er utelatt fra ytterligere eksperimenter, da dette vil påvirke objektutforskning.
MERK: Den første fasen av ny gjenstandsgenkjenning innebærer at musene blir kjent med en gjenstand. Heri vil denne del av den nye gjenstandsgenkjenningsfremgangsmåten bli referert til som prøvefasen. - Før starten på en prøvefasesession, plasser gjenstander inn i arenaen og fest dem til gulvet med en monteringskitt, slik at dyr ikke kan bevege gjenstandene. Juster to identiske gjenstander til en bestemt vegg med nok avstand mellom veggene og gjenstandene, slik at musene fritt kan utforske objekter fra all angstles.
- Sett opp datainnsamlingssystemet eller videokameraene og bekreft riktig sporing av mus og objekter i labyrinten. Kalibrere avstandene i arenaen ved hjelp av innspilte videobilder av en linjal eller et annet objekt med kjent lengde.
- Merk hjørner av arenaen i programvaren for å tillate scoring av posisjonsforstyrrelser. Merk objekter i programvare og spor deres eksplorative oppførsel separat for hver gjenstand ( dvs. "Objekt A" og "Objekt B").
- Fjern buret fra stativet og legg det forsiktig på et bord i nærheten av arenaen.
- Fjern musen fra hjemmet og legg det forsiktig inn i arenaens midtpunkt, mot objektene.
- Tillat musen å fritt utforske objektene i 15 minutter. I løpet av denne perioden forstyrrer ikke musene.
- På slutten av økten, legg musen forsiktig inn i sitt hjem bur. Rengjør arenaen og gjenstandene med 70% EtOH og dH 2 O. Sett disse gjenstandene tilbake i tE arena.
- Gjenta trinn 4.2.11 til alle mus er kjent med en gjenstand.
- Når alle musene har blitt kjent med et objekt, analyser videoene.
MERK: Objektutforskninger teller når følgende kriterier er oppfylt: musen er orientert mot objektet, snuten er innenfor 2 cm av objektet, midtpunktet til dyrets kropp er over 2 cm fra objektet, og de forrige kriteriene Har blitt oppfylt i minst 1 s. I tillegg, hvis et dyr har tilfredsstilt letekriteriene, men utviser immobilitet i> 10 s, anses den undersøkende bout som ferdig. - Beregn en objektspoengsum for hver mus som følger.
MERK: Mus som viser en objekt-biaspoengsum på under 20% eller over 80%, er utelatt fra ytterligere eksperimenter.
- Før starten av oppsamlingsøkten, sett opp datainsamlingssystemet eller videokameraene og bekreft riktig sporing av mus i labyrinten. Kalibrere avstanden i arenaen ved hjelp av innspilte videobilder av en linjal eller et annet objekt med kjent lengde. Merk hjørner av arenaen i programvaren for å tillate scoring av posisjonsforstyrrelser.
- Den endelige fasen av ny gjenstandsgenkjenning innebærer å vurdere utforskende oppførselRettet mot både et nytt og kjent objekt i miljøet, referert til her som testfasen. Denne fasen blir utført 2-3 timer etter ferdigstillelse av prøvefasen.
- Før starten på en testfase økt, legg objekter inn i arenaen og fest dem til gulvet slik at dyrene ikke kan bevege gjenstandene.
- Plasser gjenstandene i samme posisjon i arenaen i forhold til prøvefasen 13 .
- Balanse den relative plasseringen av nye og kjente objekter på tvers av genotyper og behandlingsgrupper.
- Sørg for at det er nok avstand mellom veggene og gjenstandene, slik at musene fritt kan utforske objektene fra alle vinkler.
- Oppsett datainnsamlingssystemet og / eller videokameraene. Bekreft riktig sporing av mus og objekter i labyrinten. Kalibrere avstander i arenaen ved hjelp av innspilte videobilder av en linjal eller et annet objekt med kjent lengde.
- Marker hjørner av arenaen i softwEr å tillate scoring av posisjonsforstyrrelser. Merk objekter i programvare og spor utforskende oppførsel for hvert objekt enkeltvis ( dvs. "Novel" og "Familiar").
- Fjern buret fra stativet og legg det forsiktig på et bord i nærheten av arenaen.
- Legg forsiktig dyr inn i arenaens midtpunkt, mot objektene. Opptak mus frit å utforske objekter i 10 minutter.
- Ved slutten av testøkten fjerner du mus fra arenaen og plasserer mus tilbake i hjemmet. Rengjør arenaen og gjenstandene grundig med en ubearbeidet blekemiddel, bakteriedrep, 70% EtOH og dH 2O etter hver økt.
- Gjenta fra trinn 4.4.3 til alle dyrene er blitt vurdert.
- Når objektutforskning er målt for alle mus, analyseres videoer.
MERK: Objektundersøkelser teller når følgende kriterier er oppfylt: musen er orientert mot objektet, snuten er innenfor 2 cm av objektet, midtpunktet tilDyrets kropp er over 2 cm fra objektet, og de forrige kriteriene er oppfylt i minst 1 s. I tillegg, hvis et dyr har tilfredsstilt letekriteriene, men utviser immobilitet i> 10 s, anses den undersøkende bout som ferdig. - Vurder ny gjenstandsgenkjenning ved å sammenligne tid brukt til å utforske romanen til kjent objekt. Tre metoder blir ofte rapportert i litteraturen.
- Analyser rå tid brukt til å utforske både nye og kjente objekter ved hjelp av en gjentatt målingstest. Denne metoden brukes best når genotype og / eller behandling ikke påvirker total letetid.
- Beregn nyhetspreferanse ved å bruke ligningen:
MERK: Dette gir prosentandelen tid brukt til å utforske det nye objektet i forhold til den totale tiden som utforsker objekter. Verdier spenner fra 0% (ingen utforskning av nytt objekt) til 100% (bare let etter romanobjektetJect), med en verdi på 50% som indikerer like tid brukt til å utforske nye og kjente objekter. - Beregn diskrimineringsindeks 11 , ved å bruke ligningen:
MERK: Dette gir forskjellen i tid brukt til å utforske de nye og kjente objekter i forhold til total tid brukt til å utforske objekter. Verdier spenner fra -1 (leting bare av det kjente objektet) til +1 (lete bare på det nye objektet, med en verdi på 0 som indikerer like tid brukt til å utforske nye og kjente objekter.
- Fjern dyr som ikke deltar i testøkten på grunn av hyperdynamisk bevegelse eller andre stereotypier, fra vurdering 11 .
MERK: Kriterier som brukes til fjerning må være objektive og bestemmes a priori for musemodellen ( dvs. <5 prosent for total letetid og enten> 100 gjennomsnittSving vinkel under test økten eller> 50 prosent prosentvis tid som viser myoklonisk hjørnehopping).
- Før starten på en testfase økt, legg objekter inn i arenaen og fest dem til gulvet slik at dyrene ikke kan bevege gjenstandene.
5. Vurdering av kardikospinalfunksjon hos mus med limklamper 14
- Video dokument hele sesjonen. Ta opp videoen med en bærbar håndholdt enhet ( f.eks . Smarttelefon eller tilsvarende).
MERK: Maktanalyser indikerer at prøvestørrelser på 10-15 mus per gruppe kreves for en β ≤0,2. - Fjern husburet fra stativet og legg det på et bord. Dokumentdyr ID-en i videoen før neste trinn.
- Fjern forsiktig musen fra buret og suspender ved halen i 5-10 s. Videoen må registrere dyrets hind og forepaws mens de er suspendert.
- Etter å ha tatt minst 5 s med video, plasser musen tilbake i sitt hjem bur, og returner buret til hyllen.
- Vask bordet. Gjenta fra trinn 5.2 til alle mus er blitt rekord d.
- Poengsummen knytter seg fra videoer av mus suspendert av halen på en skala fra 0-4 (se tabell 1 for beskrivelse av scoring). Inspiser videoer av suspenderte mus og tilordne deretter en score basert på følgende kriterier.
- Ingen lemmer clasping. Normal rømningsutvidelse. En bakre lemmer utviser ufullstendig splay og tap av mobilitet. Toes utviser normal splay.
- Begge bakre lemmer viser ufullstendig splay og tap av mobilitet. Toes utviser normal splay.
- Begge bakre lemmer utviser clasping med krøllete tær og umobilitet.
- Forelimbs og bakre lemmer utviser clasping og er krysset, krøllete tær og umobilitet.
- Alle mus er rangert av 2 uavhengige etterforskere. En hvilken som helst mus hvor de 2 poengene varierer med mer enn 1 poeng, blir rescored igjen.
- Poengene som er forskjellige, er i gjennomsnitt.
P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
Tabell 1: Beskrivelse av Limb Clasping Scores.
Representative Results
Alderen Tg2576 mus oppviser robuste underskudd i spontane alternativer gjort i en Y-labyrint 15 , 16 , en fenotype som kan repliseres ved å bruke metodene som er beskrevet her ( Figur 1A ). Mens en trend for økte armoppføringer observeres i disse musene ( figur 1B ), påvirket hyperaktiviteten som observeres i denne muselinjen ikke den spontane vekslingshastigheten ( figur 1C ). I motsetning ser det ut til at alderen rTg4510-mus viser en økt spontan veksling når den plasseres i en Y-labyrint ( Figur 1D ). Dette skyldes ekstrem hyperaktivitet ( Figur 1E ) og stereotypi 10 , noe som i betydelig grad forstyrrer måling av spontan veksling ( figur 1F ). Når du først vurderer mus i denne oppgaven, er det viktig å sørge for at armmeldinger og / eller avstand som er tilbakestilt, ikke erBetydelig korrelert med den spontane vekslingsraten.
Før vurderingen av ny gjenstandsgenkjenning, blir musene hentet til arenaen hvor testen skal utføres. Under habituation kan hyperaktivitet ( Figur 2A ) og annen stereotypad oppførsel relevant for musemodellen bli vurdert. Under prøvefasen er det kritisk å måle utforskningen av hvert objekt separat, slik at mus som utviser betydelige forstyrrelser i utforskende atferd, kan utelukkes fra ytterligere vurdering ( figur 2B , åpne sirkler). Ny gjenstandsgenkjenning vurderes ved å sammenligne utforskning av et kjent og nytt objekt, og analyseres generelt på tre forskjellige måter. Hvis total undersøkelsestid er sammenlignbar på tvers av genotyper og / eller behandlingsgrupper, kan rå tid undersøkelse av hvert objekt og en hensiktsmessig gjentatt målingstest brukes til å avgjøre om det var forskjeller i det nye objektet rØkognisjon ( figur 2C ). Hvis en bestemt musestamme utviser forskjeller i total undersøkelsestid, kan ny gjenstandsgenkjenning bli vurdert ved hjelp av enten nyhetspreferanse ( figur 2D ) eller diskrimineringsindeks ( figur 2E ).
Limb clasping er en funksjonell motor test som kvantifiserer underskudd i kortikospinal funksjon. Limb clasping, som ikke er et kognitivt mål, observeres i flere transgene tau-musemodeller 6 , 17 , 18 , 19 og rekapitulerer noen av de funksjonsmotoriske underskuddene som observeres i sen-trinns AD-pasienter. Suspensjon av mus ved halen fremkaller en fluktrespons ( Figur 3A , "0"). Deficits i evnen til å sprette baklidene og strekke tærne blir scoret ut fra deres alvorlighetsgrad på en skala fra 0-4 ( Figur 3A). Ved å anvende prosedyren beskrevet heri, kan man observere signifikant lemmer i rTg4510-mus ( figur 3B ).
Figur 1: Spontan Alternasjon i Y-labyrinten. ( A ) Når de plasseres i en Y-labyrint, adopterer mus en lost-shift-søkestrategi som resulterer i et undersøkelsesmønster hvor hver arm utforskes bare én gang for hver 3 armoppføringer. Alderen Tg2576 mus oppviser et signifikant underskudd i spontan veksling. Ved bruk av prosedyrene beskrevet i denne metoden ble det observert en signifikant gjenoppretting av spontan veksling etter behandling med en proprietær forbindelse. Data ble analysert ved bruk av 1-veis ANOVA og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS ble utført ved bruk av Dunnetts test. ** p <0,01. Feilstenger indikerer SEM. ( B ) Antall armoppføringer var ikke vesentlig forskjellig på tvers av noenAv gruppene som ble overvåket i dette eksperimentet. Data ble analysert ved å bruke 1-veis ANOVA-test. Feilstenger indikerer SEM. ( C ) Det var ingen korrelasjon mellom spontan veksling og antall armmeldinger gjort, noe som indikerte at eventuelle forskjeller i spontan lokomotorisk aktivitet ikke påvirket kvantifisering av spontan veksling. Korrelasjonstest ble utført ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse. ( D ) Når de plasseres i en Y-labyrint, synes rTg4510-mus (6 måneder) å utvise betydelig mer spontan veksling i forhold til littermate WT-mus. Data ble analysert ved 1-veis ANOVA og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS ble utført ved bruk av Dunnetts test. ** p <0,01. Feilstenger indikerer SEM. ( E ) rTg4510-musene gjorde signifikant flere armoppføringer på grunn av deres ekstreme hyperdynamiske bevegelse. Data ble analysert ved 1-veis ANOVA og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS ble utført ved bruk av Dunnetts test. *** p <0,001. Feilstenger angir SEM. ( F ) Spontan vekslingsadferd som er signifikant korrelert med armposter, som indikerer den hyperdynamiske lokomotoriske fenotypen, skjult sann spontan veksling. Korrelasjonstest ble utført ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse (r = 0,7, p <0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ny objektgjenkjenning. ( A ) Arenaoppholdet tillater måling av spontan bevegelse og annen stereotypad atferd som er relevant for en bestemt musemodell. Her viser alderen Tg2576 mus (22 måneder) betydelig mer spontan lokomotion i forhold til littermate WT-mus. Data ble analysert ved 1-veis ANOVA og post-hoc sammenligninger til Tg-Veh ble utført ved bruk av Dunnett 'S test. ** p <0,01. Feilstenger indikerer SEM. ( B ) Under prøvefasen ble sporing av to identiske gjenstander sporet separat. Mus som utviser store forspenninger mot utforskning av en av de to gjenstandene (åpne sirkler) ble utelatt fra testfasen. ( C - E ) Nylig objektgjenkjenning ble vurdert ved å måle utforskningen av et nytt og kjent objekt. Nylig objektgjenkjenning ble vurdert ved hjelp av ( C ) rå letingstid, ( D ) nyhetspreferanse eller ( E ) diskrimineringsindeks. Data i panel C ble analysert ved bruk av en 2-veis ANOVA med gjentatte tiltak og parvise sammenligninger ble gjort ved bruk av Sidaks test. Data i paneler DE ble analysert med 1-veis ANOVA og post-hoc sammenligninger til Tg-Veh ble laget ved hjelp av Dunnetts test. * P <0,05, ** p <0,01. Feilstenger indikerer SEM. Vennligst klikkHer for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Limb Clasping. ( A ) Representative bilder av mus som utviser ulike grader av lemmer som beskrevet i tabell 1. ( B ) rTg4510-mus (6 måneder) utviser signifikant lemklemming i forhold til littermate WT-mus som scoret ved bruk av disse metodene. Data ble analysert ved å bruke en 1-veis ANOVA og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS ble utført ved bruk av Dunnetts test. *** p <0,001, **** p <0,0001. Feilstenger indikerer SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende metoder
Denne prosedyren er utformet for å skjerme for in vivo aktivitet av forbindelser i transgene musemodeller av p-amyloidose og tauopati. Den benyttede tilnærmingen som brukes her sikrer påvisning av effektive forbindelser i kognitive domener som er relevante for AD 3 . Videre bruker tilnærmingen som er beskrevet her, adferdstest som har klart definerte endepunkter, enkle implementerbare kontroller for kvalitetskontroll, kan kjøre i et moderat gjennomføringsformat, og krever lite intervensjon fra etterforskeren. Disse egenskapene resulterer i analyser som viser god reproduserbarhet innen dyr og på tvers av kohorter, noe som resulterer i lav intra- og interanalysevarians og effektstørrelser (2 ≤ f ≤6) som er robuste nok til å understøtte atferdsmessig profilering i et stofffunnsmiljø.
Kritiske trinn i Protocol
Mange musemodeller som brukes til AD-stoffoppdagelse, viser atferd i samsvar med økt angst og aggresjon. Dette gjør håndteringsevnen viktig for å utføre noen av de adferdstestene som er beskrevet her. Ettersom disse testene er avhengige av umotivert atferd, kan en grov håndtering av etterforskeren på grunn av en hyperaktiv og engstelig eller aggressiv mus betydelig påvirke ytelsen. Høyere angst kan resultere i manglende utførelse av oppgaven, og redusere testens samlede styrke. Videre er lysnivåer i arenaen avgjørende for å lette den spontane bevegelsen som trengs for hver test. Lys lys har en tendens til å øke angst og undertrykke lokomotiv hos gnagere, derfor bør det tas hensyn til å justere omgivende lysnivåer til 30-35 lux i arenaen.
Et annet kritisk aspekt ved prosedyren er å minimere sterke miljøveiledninger som ville forstyrre et dyrs evne til å utføre oppgavene. Rengjøring avArena og gjenstander i mellom løp er viktig fordi mus er tiltrukket av nye dufter i miljøet. Manglende grundig rengjøring av arenaen og gjenstander kan føre til spontan spontan aktivitet og maskering av sann kognitiv ytelse. Undersøkere bør også minimere bruken av personlige hygieneprodukter og colognes / parfymer når de utfører disse prosedyrene. Til slutt viser gnagere robuste daglige og sirkadiske endringer i mange åpen oppførsel 20 inkludert læring og minne 21 . Derfor, for å minimere variansen på grunn av daglige rytmer i basal atferd og kognitiv ytelse, bør alle tester gjøres samtidig på tvers av kohorter og studier.
Videre, spesielt med hensyn til ny gjenstandsgenkjenning, er forsinkelsesintervallet mellom prøve og testfase og valg og plassering av objekter i miljøet kritiske parametere. Minne eksisterer i 3 forskjellige former: korttidsmemOry (STM), mellomtidsminne (ITM) og langtidshukommelse (LTM) 22 , 23 . Endring av intervallet mellom prøve og testfaser fra minutter (STM) til timer (ITM) eller dager (LTM) vil endre typen minne som ble testet ved prosedyre 12 . Dessuten, før du kjører den nye objektgenkjenningsprøven, bør mange gjenstander screenes i en testkonsort av mus for potensielle forstyrrelser ved leting. Et objekt som er overdrevent attraktivt eller avstøtende mot testkohorten, kan ikke brukes når man vurderer ny gjenstandsgenkjenning. Ideelt sett vil alle objekter som skal brukes i testen, når de plasseres i en arena, fremkalle like letetider fra en naiv kohort av mus. Utilstrekkelig testing og optimalisering av objekter kan redusere kraften til ny gjenstandsgenkjenning.
Modifikasjoner og feilsøking
Det er flere faktorer som kan økeTilsynelatende variabilitet i de kognitive tester som er beskrevet her. Mange musemodeller av AD viser hyperdynamisk lokomotiv 3 som kan maske eller endre atferd målt som det kognitive endepunktet. Videre er det voksende bevis på at kjønn 24 , 25 , 26 og til og med moral genotype 27 kan påvirke utvikling og progresjon av nevropatologi og kognitive fenotyper i AD musemodeller. Uventet variabilitet eller manglende implementering av en atferdsoppgave kan skyldes noen av disse faktorene. Ved første gjennomføring av en bestemt adferdstest bør resultatene alltid stratifiseres etter kjønn, alder og, hvis aktuelt, mors genotype. Videre bør kvalitetskontrollene som er skissert i denne prosedyren alltid utføres for å sikre at hyperaktivitet eller annen stereotypad adferd ikke forstyrrer kvantifisering av kognitive endpoints.
envIronment kan også påvirke spontane utforskende oppførsel av gnagere. Dufter eller lyder som ikke kan oppdages for forskere, kan tiltrekke seg eller avstøte mus, skevende resultater av kognitive tester som stole på spontan oppførsel. Når det i utgangspunktet etableres Y-labyrint eller ny gjenstandsgenkjenning, er det viktig å utføre kontrolltiltakene for å sikre at det ikke er noen posisjonsforstyrrelser ved leting av objekter og / eller miljøet. Hvis det oppstår posisjonsforstyrrelser, må utredere grundig undersøke miljøet og potensielt justere belysning, arenaplassering, plassering av testrom i forhold til andre rom i anlegget ( dvs. ikke nær et høyt trafikkområde eller tungt utstyr) og arenarensingsprosedyrer.
Hilsen til testmiljøet er nøkkelen til å oppnå optimal ytelse i den nye gjenstandsgenkjenningsprøven. For eksempel kan lave totale letetider skyldes utilstrekkelig bruk. Som et alternativ til proc procUtgaver som er skissert her for håndtering (Seksjon 2) og arena (punkt 4.2), tilpasning til håndtering og testmiljøet kan utføres som 3, 5 min økter per dag i 2 påfølgende dager.
Begrensninger av teknikken
Som med hvilken som helst prosedyre, har disse atferdstestene begrensninger. Disse prosedyrene har blitt brukt fordi de tester funksjon av forskjellige kortikale regioner og hippocampus. Hvis musemodellen ikke viser funksjonsfeil i hjernegrupper probed av disse testene, vil disse teknikkene ikke være nyttige. Videre har vi valgt kognitive tester som sondrer korttidsminne. Hvis virkningsmekanismen for forbindelsen under preklinisk vurdering ikke forventes å påvirke korttidshukommelsen, bør disse prosedyrene modifiseres tilsvarende ( dvs. øke prøve-testfaseintervallet for å teste langtidshukommelse). Til slutt bruker disse testene umotivert atferd. Derfor, hvis en musemodell er excesSively hyperaktiv eller viser andre stereotype atferd som forhindrer leting av miljøet, kan disse prosedyrene ikke være optimal. Som et alternativ kan man bruke fryktkondisjonering for Tg2576 eller andre β-amyloidosis-musemodeller, eller den romlige vannet labyrinten for rTg4510 eller andre musemodeller av tauopati 3 .
Fremtidige applikasjoner
Når disse prosedyrene har blitt vellykket vedtatt i laboratoriet, kan flere modifikasjoner eller utvidelser gjøres for å vurdere ytterligere kognitive og funksjonelle motoriske tiltak. For eksempel, endre den nye objektgenkjenningsoppgaven for å bestemme om en mus kan gjenkjenne en endring i plassering av et objekt 13 . Alternativt, i stedet for å bruke objekter, kan man bruke andre mus og gjennomføre en test av sosial anerkjennelse. Med hensyn til lemmer og motorfunksjon, kan man supplere den testen med ledningshenger og / eller grepfasthetsprøver. TesterDetaljert i denne metoden danner en fast base for å skjerme for forbindelser som har in vivo- effekt i translasjonelle musemodeller for AD og kan tilpasses eller modifiseres på mange måter for best å forhøre en bestemt musemodell eller møte behovene til et unikt legemiddeloppdagelsesprogram .
Disclosures
JM Levenson er ansatt av Proclara Biosciences, Inc. C. Miedel, J. Patton, A. Miedel og E. Miedel er ansatt ved Hilltop Laboratory Animals.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77 (1), 69-81 (2010).
- Onos, K. D., Sukoff Rizzo, S. J., Howell, G. R., Sasner, M. Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 122, 1-11 (2016).
- Webster, S. J., Bachstetter, A. D., Nelson, P. T., Schmitt, F. A., Van Eldik, L. J. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 5, 88 (2014).
- Rodgers, S. P., Born, H. A., Das, P., Jankowsky, J. L. Transgenic APP expression during postnatal development causes persistent locomotor hyperactivity in the adult. Mol Neurodegener. 7, 28 (2012).
- Hsiao, K., et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274 (5284), 99-102 (1996).
- Santacruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd edn. , Wiley-Interscience. (2007).
- Hughes, R. N. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory. Neurosci Biobehav Rev. 28 (5), 497-505 (2004).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Centers for Disease Control. , (2008).
- Wes, P. D., et al. Tau overexpression impacts a neuroinflammation gene expression network perturbed in Alzheimer's disease. PLoS One. 9 (8), 106050 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., Dineley, K. T. Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav Brain Res. 200 (1), 95-99 (2009).
- DeVito, L. M., Eichenbaum, H. Distinct contributions of the hippocampus and medial prefrontal cortex to the "what-where-when" components of episodic-like memory in mice. Behav Brain Res. 215 (2), 318-325 (2010).
- Lalonde, R., Strazielle, C. Brain regions and genes affecting limb-clasping responses. Brain Res Rev. 67 (1-2), 252-259 (2011).
- King, D. L., Arendash, G. W. Behavioral characterization of the Tg2576 transgenic model of Alzheimer's disease through 19 months. Physiol Behav. 75 (5), 627-642 (2002).
- Lalonde, R., Lewis, T. L., Strazielle, C., Kim, H., Fukuchi, K. Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res. 977 (1), 38-45 (2003).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25 (4), 402-405 (2000).
- Spittaels, K., et al. Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein. Am J Pathol. 155 (6), 2153-2165 (1999).
- Terwel, D., et al. Changed conformation of mutant Tau-P301L underlies the moribund tauopathy, absent in progressive, nonlethal axonopathy of Tau-4R/2N transgenic mice. J Biol Chem. 280 (5), 3963-3973 (2005).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Rep. 6 (10), 930-935 (2005).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behav Neurosci. 128 (3), 283-303 (2014).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Stough, S., Shobe, J. L., Carew, T. J. Intermediate-term processes in memory formation. Curr Opin Neurobiol. 16 (6), 672-678 (2006).
- Stevens, L. M., Brown, R. E. Reference and working memory deficits in the 3xTg-AD mouse between 2 and 15-months of age: a cross-sectional study. Behav Brain Res. 278, 496-505 (2015).
- Yue, X., et al. Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19198-19203 (2005).
- McAllister, C., et al. Genetic targeting aromatase in male amyloid precursor protein transgenic mice down-regulates beta-secretase (BACE1) and prevents Alzheimer-like pathology and cognitive impairment. J Neurosci. 30 (21), 7326-7334 (2010).
- Blaney, C. E., Gunn, R. K., Stover, K. R., Brown, R. E. Maternal genotype influences behavioral development of 3xTg-AD mouse pups. Behav Brain Res. , 40-48 (2013).
