Summary
Beskriven här är ett stegvis beteende-screening-tillvägagångssätt som kan användas för att screena för föreningar som uppvisar in vivo- effektivitet på kognitiva och funktionella motoriska beteenden i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati. Dessa metoder optimeras för att skärma föreningar för aktivitet i kort- och arbetsminnesuppgifter.
Abstract
Här beskriver vi ett iscensatt beteendestest som kan användas för att skärpa för föreningar som uppvisar in vivo- effekt på kognitiva och funktionella motoriska beteenden i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati. Paradigmet innefattar test för spontan växling i en Y-labyrint, ett nytt objektigenkänning, och extremitetskontroll. Dessa tester valdes eftersom de: 1) fråger funktionen av kognitiva eller motoriska domäner och den korrelerade neurala kretsen som är relevant för det mänskliga sjukdomsstaten, 2) har klart definierade ändpunkter, 3) har lätt implementerbara kontroller för kvalitetskontroll, 4) kan köras i Ett måttligt genomströmningsformat, och 5) kräver liten intervention av utredaren. Dessa metoder är utformade för utredare som söker skärmföreningar för aktivitet i kortvariga och arbetsminnesuppgifter eller funktionella motorbeteenden i samband med Alzheimers sjukdomsmusmodeller. De metoder som beskrivs här använder beteendestest som engÅldras ett antal olika hjärnregioner, inklusive hippocampus och olika kortikala områden. Undersökare som önskar kognitiva test som specifikt bedömer kognition som medieras av en enda hjärnregion kan använda dessa tekniker för att komplettera andra beteendestest.
Introduction
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som leder till försvagande kognitiv minskning som påverkar cirka 44 miljoner människor världen över. För närvarande finns det inga tillgängliga behandlingar för AD som är sjukdomsmodifierande och betonar det akuta behovet av preklinisk upptäckt av nya terapeutiska strategier för denna sjukdom. Ett antal olika transgena musmodeller har skapats som rekapitulerar olika aspekter av AD 1 , 2 , inklusive underskott i kognitiva domäner störda hos patienter 3 . Dessa musmodeller representerar ett användbart verktyg för att underlätta effektiv screening in vivo .
Vid bedömning av en förening för potentiell in vivo- effektivitet måste ett stegvis tillvägagångssätt vidtas som skärmar för effektivitet i lämpliga kognitiva domäner och övervakar också beteenden som kan påverka de specifika slutpunkter som används för attSsess kognition. Många transgena musmodeller av AD uppvisar hyperaktivitet och andra beteenden som kan störa ett visst kognitivt test och förbjuda dess användning vid läkemedelsscreening 4 . För att ett tillvägagångssätt ska kunna genomföras i en läkemedelsscreeningsmiljö, bör de specifika test som används ha åtminstone en måttlig genomströmning, tydligt definierade ändpunkter och ett förfarande som kräver en minimal inblandning av utredarna. Genom att använda dessa kriterier kan beteendesskärmar implementeras som uppvisar reproducerbarhet, låg intra- och interanalysvariant och effektstorlekar som behövs för sammansatt screening. Detaljerad här är de metoder som vi har använt för att skärma för föreningar som är effektiva för att mildra de kognitiva och motoriska fenotyperna som finns närvarande i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati 5 , 6 . De beskrivna metoderna är anpassade från allmänt använda beteendeparadigma rapporterade i lIteratur 7 , med specifika optimeringar och kontroller av kvalitetskontroll så att de kan användas i transgena musmodeller som är relevanta för AD. Detta protokoll kan användas med en mängd olika datainsamlings- och analyssystem och förutsätter att utredaren har en fungerande kunskap om den tillhörande mjukvaran.
Protocol
Metoderna i denna publikation granskades av den institutionella djurvårds- och användningsutskottet (IACUC) hos Hilltop Laboratory Animals för att säkerställa korrekt vård, användning och human behandling av djur i enlighet med gällande federala, statliga och lokala lagar och förordningar, såsom Som de federala djurskyddsbestämmelserna, eller AWRs (CFR 1985), och folkhälsopolitiken för humanvård och användning av laboratoriedjur, eller PHS-policyen (PHS 1996).
1. Allmänna riktlinjer för all beteendebedömning
- Innan djurhantering täcker befintliga burkort med ett nytt burkort som endast visar den unika, blinda djuridentifieraren.
OBS: Undersökare som hanterar möss under rutinmässig förening / placebo-dosering är inte tillåtna att hantera möss för beteendebedömning. - Dimma eller stäng av lamporna och justera belysningen så att belysningen på arenan eller labyrinten är 30-35 lux.
- FEller studier som sträcker sig över flera veckor, registrerar kroppsvikt veckovis som en indirekt mätning av den totala hälsan.
OBSERVERA: Ytterligare kontroller på kappsidan för kappkvalitet, hållning, gång och spontan rörelse kan inkluderas om mer robusta hälsokontroller är motiverade.
2. Habituating möss att hantera av utredare
- Två dagar före ett beteendestest, habituerar mössen att hantera. Ta bort buret från burhållaren och placera den på en jämn yta.
- Ta bort locket från buret. Hantera musen exakt som den skulle hanteras under utförandet av det kommande beteendeprovet. Placera musen i en kuppad hand ovanför hemburet.
- Mät latensen att hoppa från utredarens hand tillbaka till hemburet. Håll mus i högst 5 s.
OBS: Möss som uppvisar latenser på ≥2 s anses vara "upptagna". Möss som uppvisar latenser <2 s under första försöket genomgår 2 extra habituatioN sessioner den dagen. - Har mössen genomgått 2 på varandra följande dagar av hanteringstillfället. Observera vilken mus som helst som inte habituated vid slutet av 2: a dagen.
3. Bedömning av rumsligt arbetsminne genom att mäta spontan växling i en Y-labyrint 8
- Före första användningen rengör Y-labyrinten noggrant med en osmält blekmedelsmedel, 70% EtOH, följt av dH 2 O 9 . Tydligt beteckna labyrintens armar som "A", "B" & "C" eller andra jämförbara unika identifierare.
- Innan testperioden startar, ställ in datainsamlingssystemet eller videokamerorna och sätt in korrekt spårning av möss i labyrinten. Kalibrera avståndet i labyrinten med hjälp av fångade videobilder av en linjal eller annat objekt med känd längd.
OBS: Beteendemetoderna i detta förfarande kommer att fungera med en mängd olika datainsamlingssystem och författarna antar anyoNe som utför denna procedur är skicklig i användningen av sitt valda datainsamlingssystem. Effektanalyser indikerar att provstorlekar på 10-15 möss per grupp krävs för en β ≤0,2. - Ta bort buret från stället och lägg det försiktigt på ett bord i närheten av Y-labyrinten. Ta bort musen från sin hembur och placera den försiktigt i en arm i Y-labyrinten, vänd mot mitten. Ha utredaren steg tillräckligt långt bort från labyrinten så att musen inte kan se utredaren.
- Aktivera data- / videoinsamlingssystemet omedelbart efter att musen placerats i labyrinten.
- Tryck spela och spela in det spontana beteendet för varje mus under en period av 10 minuter. När en session är avslutad, lägg försiktigt musen tillbaka i sitt hembur och sätt tillbaka buret till hyllan.
- Rengör labyrinten noggrant mellan varje session med en unscented blekmedelsmedel, 70% EtOH, följt av dH2O. Upprepa från steg 3.4 för att bedöma alla mikrofonere.
- När alla möss har slutfört utforskningen av Y-labyrinten, analysera data från förvärvssystemet eller manuellt värdera videon i sessionerna. En armingång inträffar när alla 4 paws på musen passerar tröskeln till den centrala zonen och in i armen och djurets snut är orienterad mot armens ände.
ANMÄRKNING: Slutpunkter som ska analyseras inkluderar: Total körsträcka i labyrinten, total räckvidd som reste inom varje arm (inklusive den centrala zonen), total tid i varje arm (inklusive den centrala zonen), totalt antal armposter, antal Poster gjorda i varje arm och en sekventiell lista över armar inmatade för att bedöma antalet gjorda alternationer. - En spontan växling sker när en mus går in i en annan arm i labyrinten i var och en av tre på varandra följande armposter. Spontanväxel% beräknas sedan med följande formel.
OBS! Till exempel, jagF armorderns ordning var: ABCCBABCABC, utredaren skulle göra totalt 6 spontana alternationer (i ordning: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). Med totalt 11 armposter skulle spontanväxeln% vara 67%. - Gör följande kontroller för kvalitetskontroll för att säkerställa att uppgifterna representerar en objektiv bedömning av spontan växling.
- Utför en Pearsons korrelation av spontan växel% till både total räckvidd och antal utförda armposter.
ANMÄRKNING: Om det finns en signifikant korrelation mellan spontanväxel% till endera parametern, ska data granskas ytterligare på grund av det potentiella inflytandet av hyperdynamisk rörelse på det uppenbara kognitiva ändpunktet 10 . - Analysera antalet poster som gjorts i varje arm med ett 1-vägs ANOVA-test.
ANMÄRKNING: Om denna analys är signifikant skulle detta indikera närvaron av signaler i miljön som lockade möss till ett visst regiPå labyrinten.
- Utför en Pearsons korrelation av spontan växel% till både total räckvidd och antal utförda armposter.
4. Bedömning av mellantidsmottagningsminne genom att mäta ny objektgodkännande 11 , 12 , 13
- För varje fas av detta test, rengör grundfältarenan noggrant med en ostadig blekmedel, bakteriedödande torka, 70% EtOH följt av dH2O före första användningen.
- En dag före objektets exponering, habituera mössen till öppen fält arenan.
- Innan starten av samlingssessionen, sätta upp datainsamlingssystemet eller videokamerorna och bekräfta korrekt spårning av möss i labyrinten. Kalibrera avståndet i arenan med hjälp av fångade videobilder av en linjal eller annat objekt med känd längd. Markera hörn av arenan i programvaran för att möjliggöra scoring av positionella förspänningar.
OBS: Beteendemetoderna i detta förfarande kommer att fungera med en mängd olika datasamlingssystemStammar och författarna antar att någon som utför denna procedur är skicklig i användningen av sitt valda datainsamlingssystem. Effektanalyser indikerar att provstorlekar på 15-20 möss per grupp krävs för en β ≤0,2. - Ta bort buret från hyllan och lägg försiktigt på ett bord i närheten av arenan.
- Ta bort musen från hemburet och lägg försiktigt musen i mitten av arenan. Slå på spårningsprogrammet och / eller videoinspelningssystemet omedelbart efter att du har placerat musen i arenan.
- Låt mössen fritt utforska arenan i 30 minuter.
OBS: Under den här perioden kommer utredare inte att störa mössen. - Efter mötningssessionen placerar mössen tillbaka i sin hembur och rengör arenan grundligt med en osmält blekmedelsmedel, 70% EtOH följt av dH2O.
- Upprepa från steg 4.2.2 tills alla möss har habituated till arenan.
- Efter alla möss har vanaLeda till arenan, analysera videon.
OBS: Slutpunkter för att analysera inkluderar total räckvidd som reste i arenan och tiden som spenderas nära varje hörn. Om det är relevant för musmodellen ingår stereotypa beteenden i dessa analyser ( dvs myoklonisk hörnhoppning, cirkling, etc. ). Möss som uppvisar förspänning i tid som spenderas i särskilda områden i arenan utesluts från ytterligare experiment, eftersom detta kommer att påverka objektutforskning.
ANMÄRKNING: Den första fasen av det nya objektigenkännetecknandet involverar att bekanta sig med möss till ett objekt. Häri kommer denna del av det nya objektigenkänningsförfarandet att refereras till som provfasen. - Före början av en provfasession, placera föremål in i arenan och fixa dem till golvet med en monteringskit så att djur inte kan flytta föremålen. Rikta in två identiska föremål till en viss vägg med tillräckligt avstånd mellan väggarna och föremålen så att mössen fritt kan utforska föremålen från all angrepples.
- Ställ in datainsamlingssystemet eller videokamerorna och bekräfta korrekt spårning av möss och objekt i labyrinten. Kalibrera avstånden i arenan med hjälp av fångade videobilder av en linjal eller annat objekt av känd längd.
- Markera hörn av arenan i programvaran för att möjliggöra scoring av positionella förspänningar. Markera objekt i programvara och spåra deras undersökande beteende separat för varje objekt ( dvs "Objekt A" och "Objekt B").
- Ta bort buret från stället och lägg det försiktigt på ett bord i närheten av arenan.
- Ta bort musen från hemburet och lägg det försiktigt in i arenans mitt, mot objekten.
- Låt musen fritt utforska objekten i 15 minuter. Under denna period stör inte mössen.
- I slutet av sessionen lägger du försiktigt musen tillbaka i sitt hembur. Rengör arenan och föremålen med 70% EtOH och dH 2 O. Placera dessa föremål tillbaka i thE-arenan.
- Upprepa steg 4.2.11 tills alla möss är bekanta med ett objekt.
- När alla möss har bekantats med ett objekt analyserar du videoklippen.
OBS: Objektutforskningar räknas när följande kriterier har uppfyllts: musen är orienterad mot objektet, snuten ligger inom 2 cm av objektet, mittpunkten på djurets kropp är bortom 2 cm från föremålet och de tidigare kriterierna Har uppfyllts i minst 1 s. Dessutom, om ett djur har uppfyllt prospekteringskriterierna men uppvisar orörlighet för> 10 s, anses det undersökande bandet vara avslutat. - Beräkna ett objektförspänningsresultat för varje mus enligt följande.
ANMÄRKNING: Möss som uppvisar ett objektförspänningsresultat under 20% eller över 80% är uteslutna från ytterligare experiment.
- Innan starten av samlingssessionen, sätta upp datainsamlingssystemet eller videokamerorna och bekräfta korrekt spårning av möss i labyrinten. Kalibrera avståndet i arenan med hjälp av fångade videobilder av en linjal eller annat objekt med känd längd. Markera hörn av arenan i programvaran för att möjliggöra scoring av positionella förspänningar.
- Den sista fasen av nya objektigenkänning innebär att man undersöker förberedande beteendeRiktade mot både ett nytt och välbekant objekt i miljön, här refererad till som testfasen. Denna fas utförs 2-3 h efter avslutad provfas.
- Innan en testfasperiod börjar, lägg objekt i arenan och fixa dem till golvet så att djuren inte kan flytta föremålen.
- Placera föremålen i samma position i arenan i förhållande till provfasen 13 .
- Balansera den relativa positionen hos nya och välbekanta objekt över genotyper och behandlingsgrupper.
- Se till att det finns tillräckligt med avstånd mellan väggarna och objekten så att mössen fritt kan utforska föremålen från alla vinklar.
- Ställ in datainsamlingssystemet och / eller videokamerorna. Bekräfta korrekt spårning av möss och objekt i labyrinten. Kalibrera avstånd i arenan med hjälp av fångade videobilder av en linjal eller annat objekt med känd längd.
- Markera hörn av arenan i softwÄr att möjliggöra scoring av positionsförskjutningar. Markera objekt i programvara och spåra exploratory behavior för varje objekt individuellt ( dvs "Novel" och "Familiar").
- Ta bort buret från stället och lägg det försiktigt på ett bord i närheten av arenan.
- Lägg försiktigt djur in i arenan, mot objekten. Spela in möss fritt utforska objekt i 10 min.
- Vid slutet av testperioden tar du bort mus från arenan och lägger mössen tillbaka i sin hembur. Rengör arenan och föremålen noggrant med osmält blekmedel, 70% EtOH och dH 2O efter varje session.
- Upprepa från steg 4.4.3 tills alla djur har bedömts.
- När objektutforskning är uppmätt för alla möss analyseras videor.
OBS: Objektutforskningar räknas när följande kriterier har uppfyllts: musen är orienterad mot objektet, snuten ligger inom 2 cm av objektet, mittpunkten avDjurets kropp är bortom 2 cm från objektet, och de tidigare kriterierna har uppfyllts i minst 1 s. Dessutom, om ett djur har uppfyllt prospekteringskriterierna men uppvisar orörlighet för> 10 s, anses det undersökande bandet vara avslutat. - Bedöm det nya objektigenkännetecknet genom att jämföra tiden att utforska romanen till välbekant objekt. Tre metoder beskrivs vanligen i litteraturen.
- Analysera rå tid att utforska både nya och välbekanta objekt med hjälp av ett upprepat mätprov. Denna metod används bäst när genotyp och / eller behandling inte påverkar den totala prospekteringstiden.
- Beräkna nyhetspreferens med hjälp av ekvationen:
OBS: Detta ger den procentuella tiden som spenderas för att utforska det nya objektet i förhållande till det totala tidsutforskande objektet. Värden sträcker sig från 0% (ingen utforskning av nytt objekt) till 100% (endast utforskning av romanobjektetJect), med ett värde på 50% vilket indikerar lika lång tid att utforska nya och välbekanta objekt. - Beräkna diskrimineringsindex 11 med hjälp av ekvationen:
OBS: Detta ger skillnaden i tid att utforska de nya och välbekanta objekten i förhållande till den totala tiden att utforska objekt. Värden sträcker sig från -1 (utforskning av det kända objektet) till +1 (utforskning av det nya objektet, med ett värde av 0 som indikerar lika lång tid att utforska nya och välbekanta objekt.
- Ta bort djur som inte deltar i testperioden på grund av hyperdynamisk rörelse eller andra stereotyper, från överväganden 11 .
OBS: Kriterier som används för avlägsnande måste vara objektiva och bestämda a priori för musmodellen ( dvs. <5 : e percentilen för total prospekteringstid och antingen> 100 genomsnittVinkla vinkel under testsessionen eller> 50 : e percentiltid som uppvisar myoklonisk hörnhoppning).
- Innan en testfasperiod börjar, lägg objekt i arenan och fixa dem till golvet så att djuren inte kan flytta föremålen.
5. Bedömning av corticospinalfunktionen hos möss med limklemning 14
- Videodokument hela sessionen. Spela in videon med en bärbar handhållen enhet ( dvs. smarttelefon eller motsvarande).
OBS: Maktanalyser visar att provstorlekar på 10-15 möss per grupp krävs för en β ≤0.2. - Ta bort höljen från racket och lägg den på ett bord. Dokumentera djurets ID i videon före nästa steg.
- Ta försiktigt bort musen ur buret och upphäng av svansen i 5-10 s. Videon måste registrera djurets bak och fötter när de stängs av.
- Efter att ha tagit minst 5 s av video, placera musen tillbaka i sitt hembur och sätt tillbaka buret till racket.
- Duka av. Upprepa från steg 5.2 tills alla möss har rekordats d.
- Betygsskiktet klämmer fast från videoklipp av möss som är upphängda av svansen på en skala från 0-4 (se tabell 1 för beskrivning av poäng). Inspektera videor av suspenderade möss och tilldela sedan ett poäng baserat på följande kriterier.
- Inga extremiteter klämmer fast. Normal flyktillägg. En bakre extremitet uppvisar ofullständig splittring och förlust av rörlighet. Toes uppvisar normal splay.
- Båda bakbenen uppvisar ofullständig splittring och förlust av rörlighet. Toes uppvisar normal splay.
- Båda bakbenen uppvisar klämning med krullade tår och immobilitet.
- Forelimbs och bakre extremiteter uppvisar klämning och är korsade, krullade tår och immobilitet.
- Alla möss räknas av 2 oberoende utredare. Varje mus där de två poängen skiljer sig med mer än 1 poäng återställs igen.
- Resultat som skiljer sig är genomsnittliga.
P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
Tabell 1: Beskrivning av Limb Clasping Scores.
Representative Results
Åldrade Tg2576 möss uppvisar robusta underskott i spontana växlingar gjorda inom en Y-labyrint 15 , 16 , en fenotyp som kan replikeras med användning av de metoder som beskrivs här ( Figur 1A ). Medan en trend för ökade armposter observeras i dessa möss ( Figur 1B ), påverkade hyperaktiviteten som observerades i denna linje av möss inte den spontana växlingshastigheten ( Figur 1C ). Däremot tycks åldrade rTg4510-möss uppvisa ökad spontan växling när de placeras i en Y-labyrint ( Figur 1D ). Detta beror på extrem hyperaktivitet ( Figur 1E ) och stereotypi 10 , vilket väsentligt påverkar mätningen av spontan växling ( Figur 1F ). När man initialt bedömer möss i den här uppgiften är det viktigt att se till att armposter och / eller avstånd som reste inte ärSignifikant korrelerad med den spontana växelkursen.
Före bedömning av nytt objektigenkänning, möts möss till arenan där testet kommer att utföras. Under habituationen kan hyperaktivitet ( Figur 2A ) och andra stereotypa beteenden som är relevanta för musmodellen utvärderas. Under provfasen är det kritiskt att mäta prospektering av varje objekt separat så att möss som uppvisar signifikanta förspänningar i utforskande beteende kan uteslutas från ytterligare bedömning ( Figur 2B , öppna cirklar). Nya objektigenkänning utvärderas genom att jämföra prospektering av ett välbekant och nytt objekt och analyseras vanligtvis på tre olika sätt. Om den totala undersöknings tiden är jämförbar mellan genotyper och / eller behandlingsgrupper, kan rå tid att utforska varje objekt och en lämplig upprepad mätningstest användas för att bestämma om det fanns skillnader i det nya objektet rEkognition ( figur 2C ). Om en särskild musstam uppvisar skillnader i total exploratory tid kan nytt objektigenkänning utvärderas med användning av antingen nyhetspreferens ( Figur 2D ) eller diskrimineringsindex ( Figur 2E ).
Limb clasping är ett funktionellt motor test som kvantifierar underskott i kortikospinalfunktionen. Limbindning, som inte är en kognitiv åtgärd, observeras i flera transgena tau-musmodeller 6 , 17 , 18 , 19 och återfinns några av de funktionella motoriska underskotten som observerades i senstegrade AD-patienter. Uppskjutning av möss i svansen framkallar ett flygrespons ( Figur 3A , "0"). Deficits i förmågan att splittra bakbenen och förlänga tårna är poängade baserat på deras svårighetsgrad på en skala från 0-4 ( Figur 3A). Med användning av proceduren som beskrivs häri kan man observera signifikant lemklemning i rTg4510-möss ( Figur 3B ).
Figur 1: Spontan Alternering i Y-labyrinten. ( A ) När de placeras i en Y-labyrint antar möss en strategi för förlustförskjutning, som resulterar i ett prospekteringsmönster där varje arm utforskas en gång för varje 3 armposter. Åldrade Tg2576 möss uppvisar ett signifikant underskott i spontan växling. Genom att använda de förfaranden som beskrivs i denna metod observerades en signifikant återställande av spontan växling efter behandling med en proprietär förening. Data analyserades med användning av 1-vägs ANOVA och posthoc-jämförelser med Tg-PBS utfördes med användning av Dunnett's test. ** p <0,01. Felfält indikerar SEM. ( B ) Antal armposter var inte signifikant olika över allaAv de grupper som övervakades i detta experiment. Data analyserades med 1-vägs ANOVA-test. Felfält indikerar SEM. ( C ) Det fanns ingen korrelation mellan spontanväxling och antalet armposter som gjordes, vilket indikerar att eventuella skillnader i spontan lokomotorisk aktivitet inte påverkade kvantifiering av spontan växelverkan. Korrelationstest utfördes med användning av Pearsons korrelationsanalys. ( D ) När de placeras i en Y-labyrint, tycks rTg4510-möss (6 månader) uppvisa signifikant mer spontan växling i förhållande till WT-möss med kullmatt. Data analyserades genom 1-vägs ANOVA och post-hoc jämförelser med Tg-PBS utfördes med användning av Dunnett's test. ** p <0,01. Felfält indikerar SEM. ( E ) rTg4510-möss gjorde signifikant fler armposter på grund av deras extrema hyperdynamiska rörelse. Data analyserades genom 1-vägs ANOVA och post-hoc jämförelser med Tg-PBS utfördes med användning av Dunnett's test. *** p <0,001. Felfält indikerar SEM. ( F ) Spontanväxelbeteende som är signifikant korrelerad med armposter, vilket indikerar den hyperdynamiska lokomotoriska fenotypen obducerad sann spontan växelverkan. Korrelationstest utfördes med användning av Pearsons korrelationsanalys (r = 0,7, p <0,0001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ny objektgenkänning. ( A ) Arenahabituation tillåter mätning av spontan rörelse och andra stereotypa beteenden som är relevanta för en viss musmodell. Här uppvisar åldrade Tg2576 möss (22 månader) signifikant mer spontan lokomotion i förhållande till WT-möss med skräp. Data analyserades med 1-vägs ANOVA och post-hoc jämförelser med Tg-Veh utfördes med användning av Dunnett 'S test. ** p <0,01. Felfält indikerar SEM. ( B ) Under provfasen spårades undersökning av två identiska föremål separat. Möss som uppvisar stora förspänningar mot utforskning av ett av de två föremålen (öppna cirklar) uteslutes från testfasen. ( C - E ) Nya objektigenkänning bedömdes genom att mäta utforskningen av ett nytt och välbekant objekt. Nya objektigenkänning utvärderades med användning av ( C ) rå prospekteringstid, ( D ) nyhetspreferens eller ( E ) diskrimineringsindex. Data i panel C analyserades med användning av en 2-vägs ANOVA med upprepade mätningar och parvisa jämförelser gjordes med Sidaks test. Data i paneler DE analyserades med en 1-vägs ANOVA och efter-hoc jämförelser med Tg-Veh gjordes med användning av Dunnett's test. * P <0,05, ** p <0,01. Felfält indikerar SEM. var god klickaHär för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Limb Clasping. ( A ) Representativa bilder av möss som uppvisar olika grader av extremitetsklämmor såsom beskrivits i Tabell 1. ( B ) rTg4510-möss (6 månader) uppvisar signifikant lemklingning i förhållande till kullmats-WT-möss som uppskattats med användning av dessa metoder. Data analyserades med användning av en 1-vägs ANOVA och posthoc-jämförelser med Tg-PBS utfördes med användning av Dunnett's test. *** p <0,001, **** p <0,0001. Felfält indikerar SEM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Teknikens betydelse med hänsyn till befintliga metoder
Denna procedur har utformats för att screena för in vivo- aktivitet av föreningar i transgena musmodeller av p-amyloidos och tauopati. Det iscensatta sättet som används här säkerställer detektering av effektiva föreningar i kognitiva domäner som är relevanta för AD 3 . Vidare använder tillvägagångssättet som beskrivs här beteendetest som har tydliga definierade slutpunkter, lätt genomförbara kvalitetskontrollskontroller, kan köras i ett måttligt genomströmningsformat och kräver lite intervention från utredaren. Dessa egenskaper resulterar i analyser som uppvisar god reproducerbarhet hos djur och över kohorter, vilket resulterar i låga inter- och interanalysvarianter och effektstorlekar (2 < f <6) som är robusta nog för att stödja beteendemässig profilering i en läkemedelsforskningsmiljö.
Kritiska steg inom Protocol
Många musmodeller som används för AD-läkemedelsupptäckt uppvisar beteenden som överensstämmer med ökad ångest och aggression. Detta gör hanteringsvanan nödvändig för att utföra någon av de beteendestest som beskrivs här. Eftersom dessa test är beroende av omotiverade beteenden kan grovhantering av utredaren på grund av en hyperaktiv och ängslig eller aggressiv mus väsentligt påverka prestanda. Ökad ångest kan resultera i misslyckande att utföra uppgiften, vilket reducerar testets totala effekt. Dessutom är ljusnivåer i arenan nödvändiga för att underlätta den spontana rörelsen som behövs för varje test. Ljust ljus tenderar att öka ångest och undertrycka lokomotion hos gnagare, därför bör man ta hand om att justera omgivande ljusnivåer till 30-35 lux i arenan.
En annan viktig aspekt av förfarandet är att minimera starka miljöanpassningar som skulle störa ett djurs förmåga att utföra uppgifterna. Rengöring avArenor och föremål i mellan körningar är avgörande eftersom möss lockas till nya dofter i miljön. Underlåtenhet att noggrant rengöra arenan och föremål kan resultera i muskels spontana aktivitet och maskerande sant kognitiv prestanda. Undersökare bör också minimera användningen av personliga hygienprodukter och colognes / parfymer vid utförandet av dessa förfaranden. Slutligen uppvisar gnagare robusta dagliga och cirkadiska förändringar i många öppna uppträdanden 20 inklusive lärande och minne 21 . För att minimera variationen på grund av dagliga rytmer i basalt beteende och kognitiv prestanda, bör alla tester göras samtidigt vid hela kohorter och studier.
Vidare, specifikt med avseende på nya objektigenkänning, är fördröjningsintervallet mellan prov och testfas och val och placering av objekt i miljön kritiska parametrar. Minne finns i tre olika former: kort sikt memOry (STM), mellantidsminne (ITM) och långsiktigt minne (LTM) 22 , 23 . Ändring av intervallet mellan prov och testfaser från minuter (STM) till timmar (ITM) eller dagar (LTM) kommer att ändra den typ av minne som testas med proceduren 12 . Vidare, före körning av det nya objektigenkänningstestet, måste många föremål screenas i en testkohort av möss för potentiella biaser vid prospektering. Ett objekt som är överdrivet attraktivt eller repulsivt mot testkohorten kan inte användas vid bedömning av nytt objektigenkänning. Ideellt kommer alla objekt som kommer att användas i testet, när de placeras i en arena, framkalla lika undersökningstider från en naiv kohort av möss. Otillräcklig testning och optimering av objekt kan avsevärt minska kraften hos det nya objektigenkännet.
Ändringar och felsökning
Det finns flera faktorer som kan ökaUppenbar variation i de kognitiva testen som beskrivs här. Många musmodeller av AD uppvisar hyperdynamisk rörelse 3 som kan maskera eller ändra beteenden mätt som den kognitiva ändpunkten. Dessutom finns det växande bevis på att kön 24 , 25 , 26 och till och med moderns genotyp 27 kan påverka utvecklingen och utvecklingen av neuropatologi och kognitiva fenotyper i AD-musmodeller. Oväntad variabilitet eller underlåtenhet att genomföra en beteendomsuppgift kan bero på någon av dessa faktorer. Vid första genomförandet av ett visst beteendestest ska resultaten alltid stratifieras efter kön, ålder och i förekommande fall moderns genotyp. Vidare bör de kvalitetskontroller som beskrivs i denna procedur alltid utföras för att säkerställa att hyperaktivitet eller andra stereotypa beteenden inte stör kvantifiering av kognitiva ändpunkter.
envIronment kan också påverka gnagarnas spontana utforskande beteende. Dofter eller ljud som är odetekterbara för forskare kan locka eller avvisa möss, skevresultat från kognitiva tester som är beroende av spontan beteende. När man i början fastställer Y-labyrint eller ett nytt objektigenkänning är det viktigt att kontrollåtgärderna genomförs för att säkerställa att det inte finns några positionära förskjutningar vid utforskning av föremål och / eller miljö. Om positionella förspänningar observeras måste utredarna noggrant granska miljön och eventuellt justera belysning, arenaplacering, plats för provrummet i förhållande till andra rum i anläggningen ( dvs. inte nära ett högtrafikområde eller tung utrustning) och arena-rengöringsprocedurer.
Habituation till testmiljön är nyckeln till att uppnå optimal prestanda i det nya objektigenkänningstestet. Till exempel kan låga totala prospekteringstider bero på otillräcklig uppställning. Som ett alternativ till procUtgåvor som beskrivs här för hantering (avsnitt 2) och arenan (avsnitt 4.2), förflyttning till hantering och testmiljön kan utföras som 3, 5 min sessioner per dag i 2 på varandra följande dagar.
Begränsningar av tekniken
Precis som vid något förfarande har dessa beteendestest begränsningar. Dessa förfaranden har använts eftersom de testar funktionen hos olika kortikala regioner och hippocampus. Om musmodellen inte uppvisar funktionella underskott i hjärnregioner probed av dessa test, kommer dessa tekniker inte att vara användbara. Dessutom har vi valt kognitiva tester som sondar på kortsiktigt minne. Om föreningens verkningsmekanism under preklinisk bedömning inte förväntas påverka korttidsminnet, bör dessa procedurer modifieras i enlighet därmed ( dvs. ökning av provtestfasintervallet för att testa långsiktigt minne). Slutligen använder dessa test omotiverade beteenden. Därför, om en musmodell är excesSively hyperaktiv eller visar andra stereotypa beteenden som förhindrar prospektering av miljön, då dessa förfaranden kanske inte är optimala. Som ett alternativ kan man använda räddningskonditionering för Tg2576 eller andra p-amyloidosemusmodeller, eller den rumsliga vattendyran för rTg4510 eller andra musmodeller av tauopati 3 .
Framtida applikationer
När dessa förfaranden väl har antagits i laboratoriet kan flera ändringar eller förlängningar göras för att bedöma ytterligare kognitiva och funktionella motoråtgärder. Till exempel ändrar den nya objektigenkänningsuppgiften att bestämma om en mus kan känna igen en förändring i placeringen av ett objekt 13 . Alternativt kan man istället för att använda objekt använda andra möss och genomföra ett test av socialt erkännande. Med avseende på extremitetskontroll och motorfunktion kan man komplettera det testet med trådhänget och / eller gripstyrktesterna. TesternaDetaljerad i denna metod bildar en fast bas för att screena för föreningar som har in vivo- effektivitet i translationella musmodeller för AD och kan anpassas eller modifieras på många sätt för att bäst ifråga en viss musmodell eller tillgodose behoven hos ett unikt läkemedelsupptäcktsprogram .
Disclosures
JM Levenson är anställd av Proclara Biosciences, Inc. C. Miedel, J. Patton, A. Miedel och E. Miedel är anställda av Hilltop Laboratory Animals.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77 (1), 69-81 (2010).
- Onos, K. D., Sukoff Rizzo, S. J., Howell, G. R., Sasner, M. Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 122, 1-11 (2016).
- Webster, S. J., Bachstetter, A. D., Nelson, P. T., Schmitt, F. A., Van Eldik, L. J. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 5, 88 (2014).
- Rodgers, S. P., Born, H. A., Das, P., Jankowsky, J. L. Transgenic APP expression during postnatal development causes persistent locomotor hyperactivity in the adult. Mol Neurodegener. 7, 28 (2012).
- Hsiao, K., et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274 (5284), 99-102 (1996).
- Santacruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd edn. , Wiley-Interscience. (2007).
- Hughes, R. N. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory. Neurosci Biobehav Rev. 28 (5), 497-505 (2004).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Centers for Disease Control. , (2008).
- Wes, P. D., et al. Tau overexpression impacts a neuroinflammation gene expression network perturbed in Alzheimer's disease. PLoS One. 9 (8), 106050 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., Dineley, K. T. Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav Brain Res. 200 (1), 95-99 (2009).
- DeVito, L. M., Eichenbaum, H. Distinct contributions of the hippocampus and medial prefrontal cortex to the "what-where-when" components of episodic-like memory in mice. Behav Brain Res. 215 (2), 318-325 (2010).
- Lalonde, R., Strazielle, C. Brain regions and genes affecting limb-clasping responses. Brain Res Rev. 67 (1-2), 252-259 (2011).
- King, D. L., Arendash, G. W. Behavioral characterization of the Tg2576 transgenic model of Alzheimer's disease through 19 months. Physiol Behav. 75 (5), 627-642 (2002).
- Lalonde, R., Lewis, T. L., Strazielle, C., Kim, H., Fukuchi, K. Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res. 977 (1), 38-45 (2003).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25 (4), 402-405 (2000).
- Spittaels, K., et al. Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein. Am J Pathol. 155 (6), 2153-2165 (1999).
- Terwel, D., et al. Changed conformation of mutant Tau-P301L underlies the moribund tauopathy, absent in progressive, nonlethal axonopathy of Tau-4R/2N transgenic mice. J Biol Chem. 280 (5), 3963-3973 (2005).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Rep. 6 (10), 930-935 (2005).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behav Neurosci. 128 (3), 283-303 (2014).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Stough, S., Shobe, J. L., Carew, T. J. Intermediate-term processes in memory formation. Curr Opin Neurobiol. 16 (6), 672-678 (2006).
- Stevens, L. M., Brown, R. E. Reference and working memory deficits in the 3xTg-AD mouse between 2 and 15-months of age: a cross-sectional study. Behav Brain Res. 278, 496-505 (2015).
- Yue, X., et al. Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19198-19203 (2005).
- McAllister, C., et al. Genetic targeting aromatase in male amyloid precursor protein transgenic mice down-regulates beta-secretase (BACE1) and prevents Alzheimer-like pathology and cognitive impairment. J Neurosci. 30 (21), 7326-7334 (2010).
- Blaney, C. E., Gunn, R. K., Stover, K. R., Brown, R. E. Maternal genotype influences behavioral development of 3xTg-AD mouse pups. Behav Brain Res. , 40-48 (2013).
