Summary
Burada, β-amiloidoz ve tauopatinin transgenik fare modellerinde bilişsel ve fonksiyonel motor davranışlarda in vivo etkinlik gösteren bileşiklerin taranması için kullanılabilen aşamalı, davranışsal tarama yaklaşımı anlatılmaktadır. Bu yöntemler, bileşikleri kısa süreli ve hafızadaki işlerde etkinlik açısından taramak için optimize edilmiştir.
Abstract
Burada β-amiloidoz ve tauopatinin transgenik fare modellerinde bilişsel ve fonksiyonel motor davranışlarda in vivo etkinlik gösteren bileşiklerin taranması için kullanılabilecek aşamalı, davranışsal test yaklaşımı anlatılmaktadır. Paradigma, bir Y-labirentindeki spontan değişim, yeni nesne tanıma ve kol uzantısı için testler içerir. Bu testler seçildi: 1) bilişsel veya motor alanların işlevini ve insan hastalık durumu ile ilgili korelasyon sinirsel devresini sorgularlar, 2) belirgin son noktaları vardır, 3) kolayca uygulanabilir kalite kontrol kontrollerine sahiptirler, 4) Ilımlı bir çıktı biçimi ve 5) araştırmacı tarafından küçük müdahale gerektirir. Bu yöntemler, bileşikleri kısa süreli ve çalışma belleği görevlerinde etkinlik açısından taramak isteyen araştırmacılar veya Alzheimer hastalığı fare modelleriyle ilişkili işlevsel motor davranışları için tasarlanmıştır. Burada açıklanan yöntemler, engHipokampus ve çeşitli korteks alanları içeren bir dizi farklı beyin bölgesi yaşı. Tek bir beyin bölgesi tarafından aracılık edilen biliş özel olarak değerlendiren kognitif testleri arayan araştırmacılar, diğer davranış testlerini tamamlamak için bu teknikleri kullanabilir.
Introduction
Alzheimer hastalığı (AD), dünya çapında yaklaşık 44 milyon kişiyi etkileyen zayıflatıcı bilişsel gerileme ile sonuçlanan progressif nörodejeneratif bir hastalıktır. Şu anda hastalık düzeltici olan bu hastalık için yeni terapötik stratejilerin klinik öncesi keşfi için acil ihtiyaç olduğunu vurgulayan AD için mevcut herhangi bir tedavi mevcut değildir. Bilişsel alanlarda hastalarda bozulma açıkları da dahil olmak üzere, AD 1 , 2'nin çeşitli yönlerini tekrarlayan bir dizi farklı transgenik fare modeli oluşturulmuştur. Bu fare modelleri , in vivo etkin taramayı kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.
Bir bileşiğin potansiyel in vivo etkinlik açısından değerlendirilmesi sırasında, uygun bilişsel alanlarda etkinliklerin tarandığı ve ayrıca, uygun bilişsel alanlarda etkinliklerin gösterildiği aşamalardan oluşan bir yaklaşım uygulanmalıdır;Ssess biliş. Birçok transjenik fare AD modeli hiperaktivite ve belirli bir bilişsel testi etkileyebilecek ve uyuşturucu taramasında kullanımını yasaklayan diğer davranışları sergilemektedir4. Üstelik, bir uyuşturucu tarama ortamında uygulanacak bir yaklaşım için, kullanılan belirli testler, en azından ılımlı bir verim sağlamalı, açıkça tanımlanmış son noktaları olmalıdır ve araştırmacılar tarafından en az müdahale gerektiren bir prosedür olmalıdır. Bu kriterleri kullanarak, tekrarlanabilirlik, düşük intra-ve inter-assay varyansı ve bileşik tarama için gerekli efekt boyutlarını gösteren davranışsal ekranlar uygulanabilir. Ayrıntılı burada, β-amiloidoz ve tauopati 5,6'nın transjenik fare modellerinde mevcut kognitif ve motor fenotipleri azaltmada etkili bileşiklerin taranması için kullandığımız yöntemlerdir. Tanımlanan yöntemler, l'de bildirilen yaygın olarak kullanılan davranışsal paradigmadan uyarlanmaktadır.Iterasyon 7 , AD için alakalı transgenik fare modellerinde kullanılabilmesi için belirli optimizasyonlar ve kalite kontrol kontrolleri ile. Bu protokol, çeşitli veri toplama ve analiz sistemleri ile kullanılabilir ve araştırmacının ilgili yazılımla ilgili bir çalışma bilgisine sahip olduğunu varsayar.
Protocol
Bu yayında ayrıntılandırılan yöntemler, Hilltop Laboratuar Hayvanları'ndaki kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) tarafından hayvanların uygun federal, eyalet ve yerel yasalara ve yönetmeliklere uygun olarak uygun bakım, kullanım ve insancıl muamele edilmesini sağlamak için gözden geçirilmiştir Federal Hayvan Refah Yönetmeliği ya da AWR'ler (CFR 1985) ve Hayvan Bakımı ve Laboratuar Hayvanlarının Kullanımı ile İlgili Halk Sağlığı Hizmet Politikası ya da PHS Politikası (PHS 1996) olarak.
1. Davranışsal Değerlendirme için Genel Kurallar
- Hayvanları elleçlemeden önce, mevcut kafes kartlarını sadece benzersiz, körleştirilmiş hayvan tanımlayıcıyı gösteren yeni bir kafes kartuyla örtün.
NOT: Rutin bileşik / plasebo dozları sırasında fareleri tutan araştırmacıların davranış değerlendirme için fareleri kullanmasına izin verilmez. - Tepegöz ışıklarını kapatın veya aydınlatın ve arena veya labirentin zeminindeki aydınlatma 30-35 lux olacak şekilde ışığı ayarlayın.
- FVeya birkaç hafta boyunca devam eden çalışmalar, haftalık genel sağlık kayıtlarının dolaylı bir ölçümü olarak vücut ağırlıklarını kaydeder.
NOT: Daha sağlam sağlık kontrolleri gerekliyse, ceket kalitesi, duruş, yürüme ve kendiliğinden hareket için ilave kafes kontrolleri dahil edilebilir.
2. Araştırmacıların Fareyi Alışkan Haklarında Kullanmaya Hazırlanması
- Herhangi bir davranış testinden iki gün önce, fareleri elle tutulur hale getirin. Kabini, kafes rafından çıkarın ve düz bir zemin üzerine koyun.
- Kapağı kafesden çıkarın. Fare, yaklaşmakta olan davranış testinin performansı boyunca tam olarak ele alınacak şekilde kullanın. Fareyi, kafesin üstündeki kupalı bir elin içine yerleştirin.
- Araştırmacının elinden tekrar ev kafesine atlamak için gecikmeyi ölçün. Fareleri en çok 5 saniye tutun.
NOT: ≥2 s gecikme süresi olan fareler "alışkanlık" olarak kabul edilir. İlk deneme süresince gecikme süresi <2 s olan fareler, 2 ilave alışkanlık edinirlerO gün seans yok. - Farelerin 2 gün üst üste konut alışkanlığından geçmesini sağlayın. 2. günün sonuna kadar alışkanlık duymayan herhangi bir fare unutmayın.
3. Y-labirentinde Spontan Değişimi Ölçerek Mekansal Çalışma Belleğinin Değerlendirilmesi 8
- İlk kullanımdan önce, Y-labirentini kokusuz bir ağartıcı mikrop öldürücü silme sıvısı,% 70 EtOH, ardından dH209 ile iyice temizleyin. Labirentin kollarını 'A', 'B' ve 'C' veya benzeri diğer benzersiz tanımlayıcılar olarak açıkça belirtin.
- Bir test oturumuna başlamadan önce veri toplama sistemi veya video kameraları ayarlayın ve labirentteki farelerin uygun şekilde izlenmesini ayarlayın. Bir cetvelin veya bilinen uzunluğun diğer bir nesnesinin çekilen video görüntülerini kullanarak labirentteki mesafeyi kalibre edin.
NOT: Bu prosedürdeki davranış metotları, çeşitli veri toplama sistemleri ile çalışacaktır ve yazarlar, herhangi birBu prosedürün uygulanması, seçtikleri veri toplama sisteminin kullanılmasında oldukça ustadır. Güç analizleri, bir grup için 10-15 farenin bir numunenin bir β ≤0.2 için gerekli olduğunu göstermektedir. - Kabini raftan çıkarın ve yavaşça Y-labirentine yakın bir masanın üzerine yerleştirin. Fareyi evdeki kafesinden çıkarın ve merkeze bakacak şekilde Y-labirentinin bir koluna hafifçe yerleştirin. Araştırmacı labirentten yeterince uzaklaşın böylece farenin araştırmacıyı göremezsiniz.
- Fareyi labirente yerleştirdikten hemen sonra veri / video edinme sistemini etkinleştirin.
- Oynat tuşuna basın ve her fare için 10 dakikalık bir süre için spontan davranışı kaydedin. Bir oturum tamamlandıktan sonra, fareyi yavaşça ev kafesine yerleştirin ve kafesi rafa geri koyun.
- Labirenti, her seansta kokusuz bir ağartıcı mikrop öldürücü silme,% 70 EtOH, ardından dH2O ile iyice temizleyin. Tüm mikrofonu değerlendirmek için adım 3.4'den itibaren tekrarlayıne.
- Tüm fareler Y-labirentin araştırmasını tamamladıktan sonra, satın alma sistemindeki verileri analiz edin veya oturumların videolarını manuel olarak puanlayın. Farenin 4 basamağının tümünün orta bölgenin eşiğini geçip kola girmesi ve hayvanın burnunun kolun ucuna doğru yönlendirilmesi kol girişi gerçekleşir.
NOT: Analiz edilecek son noktalar şunlardır: labaratuvarda toplam mesafe, her kol (merkez bölge dahil) içinde dolaşan toplam mesafe, her kolda (merkezi bölge dahil olmak üzere) harcanan toplam süre, toplam kol girişi sayısı, sayı Her bir kola yapılan girdiler ve sıralı bir silah listesi girilerek yapılan değişikliklerin sayısını değerlendirdik. - Bir fare labirentin farklı bir koluna 3 ardışık kol girişinin her birine girdiğinde spontan bir değişim meydana gelir. Daha sonra, aşağıdaki formül ile spontan değişim% hesaplanır.
NOT: Örneğin, iKol girişi sırası: ABCCBABCABC, araştırmacı toplam 6 spontan değişim (sırayla: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC) puan alacaktı. Toplam 11 kol girişi ile spontan değişim% 67 olacaktır. - Verilerin spontan değişimin tarafsız bir değerlendirmesini temsil ettiğinden emin olmak için aşağıdaki kalite kontrolü kontrollerini yapın.
- Pearson'un kendiliğinden değişime ilişkin% 'si, hem toplam seyahat mesafesi hem de yapılan kol girişi sayısı için korelasyon yapın.
NOT: Her iki parametreden% spontan değişimin anlamlı bir korelasyona sahip olması halinde, hiperdinamik hareketin görünür kognitif son nokta üzerindeki olası etkisinden dolayı, veriler daha ayrıntılı bir şekilde incelenmelidir 10 . - Her bir kola yapılan girişlerin sayısını bir 1-yönlü ANOVA testiyle analiz edin.
NOT: Eğer bu analiz önemli ise, bu durum, farelerde belirli bir bölgeye çekiş ip uçları bulunduğunu gösterecektirLabirentin üzerine.
- Pearson'un kendiliğinden değişime ilişkin% 'si, hem toplam seyahat mesafesi hem de yapılan kol girişi sayısı için korelasyon yapın.
4. Orta Boyda Tanınma Belleğinin Roman Objesinin Tanımını Ölçerek Değerlendirilmesi 11 , 12 , 13
- Bu testin her fazı için, ilk kullanımdan önce açık alan arenasını kokusuz bir ağartıcı mikrop öldürücü silme bezi,% 70 EtOH ve ardından dH20 ile iyice temizleyin.
- Nesneye maruz kalmadan bir gün önce, fareleri açık saha tarlasına yatıştırın.
- Alışkanlık oturumunun başlangıcından önce, veri toplama sistemi veya video kameraları kurun ve farelerin labirentte doğru şekilde izlenip onaylanmadığını teyit edin. Bir cetvelin veya bilinen uzunluğun diğer bir nesnesinin çekilmiş video görüntülerini kullanarak arenadaki mesafeyi kalibre edin. Konumsal önyargıların puanlanmasına izin vermek için yazılımın arenasının köşelerini işaretleyin.
NOT: Bu prosedürdeki davranış metodları çeşitli veri toplama sistemleri ile çalışacaktır.Yazarlar, bu prosedürü uygulayan herhangi birinin seçtiği veri toplama sisteminin kullanılmasında yeterli olduğunu düşünüyor. Güç analizleri, grup başına 15-20 farenin bir numune boyutunun bir β ≤0.2 için gerekli olduğunu göstermektedir. - Kabini raftan çıkarın ve arenaya yakın bir masanın üzerine yavaşça yerleştirin.
- Fareyi ev kafesinden çıkarın ve hafifçe arena ortasına fareyi yerleştirin. Fareyi arenaya koyduktan hemen sonra izleme yazılımı ve / veya video kayıt sistemini açın.
- Farelerin 30 dakika boyunca arena keşfedilmesine izin verin.
NOT: Bu süre zarfında araştırmacılar fareleri rahatsız etmeyecektir. - Alışkanlık oturumundan sonra, fareleri ev kafeslerine yerleştirin ve arena'yı kokusuz bir ağartıcı mikrop öldürücü silme bezi,% 70 EtOH ve bunu takiben dH20 ile iyice temizleyin.
- Adım 4.2.2'den itibaren tüm fareler arenaya yatıncaya kadar tekrarlayın.
- Bütün fareler alışkanlık haline geldikten sonraArena yapıldı, videoyu analiz edin.
NOT: Analiz için bitiş noktaları arenada toplam mesafeyi ve her köşenin yanında harcanan zamanı içerir. Fare modeli ile alakalı olması durumunda, stereotipik davranışlar bu analizlere dahil edilir ( yani , miyoklonik köşe atlama, daire çizme, vb. ). Arenanın belirli bölgelerinde harcanan zamana karşı önyargılar sergileyen fareler, nesne araştırmalarını etkileyeceğinden ileri denemelerden çıkarılır.
NOT: Yeni nesne tanımanın ilk aşaması, fareleri bir nesneye tanıtır. Burada, yeni nesne tanıma prosedürünün bu kısmı Örnekleme safhası olarak geçecektir. - Örnek bir faz oturumunun başlangıcından önce, nesneleri arenaya yerleştirin ve hayvanlar nesneleri hareket ettiremeyecek şekilde onları bir montaj macunu ile zemine sabitleyin. Duvarlar ve nesneler arasında yeterli mesafeyle belirli bir duvara iki aynı nesneyi hizalayın, böylece fareler tüm açılardan nesneleri özgürce keşfedebilirles.
- Veri toplama sistemi veya video kameraları kurun ve labirentteki farelerin ve nesnelerin doğru şekilde izlenmesini onaylayın. Bir cetvelin veya bilinen uzunluğun diğer bir nesnesinin çekilmiş video görüntülerini kullanarak arenadaki mesafeleri kalibre edin.
- Konumsal önyargıların puanlanmasına izin vermek için yazılımın arenasının köşelerini işaretleyin. Nesneleri yazılımda işaretleyin ve keşif davranışlarını her nesne için ayrı ayrı izleyin ( ör . "Nesne A" ve "Nesne B").
- Kabini raftan çıkarın ve hafifçe arenaya yakın bir masanın üzerine koyun.
- Fareyi evdeki kafesden çıkarın ve nesnelerin bulunduğu alanın ortasına hafifçe yerleştirin.
- Farenin 15 dakika boyunca nesneleri özgürce keşfetmesine izin verin. Bu süre zarfında fareleri rahatsız etmeyin.
- Oturumun sonunda, fareyi yavaşça ev kafesine yerleştirin. Arenayı ve nesneleri% 70 EtOH ve dH 2 O ile temizleyin. Bu nesneleri tekrarArenada.
- Tüm fareler bir nesneye aşina oluncaya kadar adım 4.2.11'i tekrarlayın.
- Tüm fareler bir nesneye aşina olduktan sonra, videoları analiz edin.
NOT: Nesne araştırmaları aşağıdaki kriterler yerine getirildiğinde sayılır: fare nesneyle yönlendirilir, burun kısmı nesnenin 2 cm'inde, hayvanın gövdesinin orta noktası nesneden 2 cm'nin üstündedir ve önceki ölçütler En az 1 s süreyle yerine getirildi. Buna ek olarak, bir hayvan keşif kriterlerinden memnun ise ancak> 10 saniye süreyle hareketsizlik sergilerse, keşif sonu tamamlanmış sayılacaktır. - Her fare için nesne yanlılık skorunu aşağıdaki gibi hesaplayın.
NOT: Nesne önyargı puanı% 20'nin altında veya% 80'in üstünde olan fareler, daha ileri denemelerden çıkarılır.
- Alışkanlık oturumunun başlangıcından önce, veri toplama sistemi veya video kameraları kurun ve farelerin labirentte doğru şekilde izlenip onaylanmadığını teyit edin. Bir cetvelin veya bilinen uzunluğun diğer bir nesnesinin çekilmiş video görüntülerini kullanarak arenadaki mesafeyi kalibre edin. Konumsal önyargıların puanlanmasına izin vermek için yazılımın arenasının köşelerini işaretleyin.
- Yeni nesne tanımanın son aşaması, keşif davranışının değerlendirilmesini içerirOrtamda hem yeni hem de tanıdık bir nesneye yöneltilmiş ve burada Test aşamasında değinilmiştir. Bu evre, örnek evrenin tamamlanmasından 2-3 saat sonra yapılır.
- Bir test evresi seansının başlangıcından önce, nesneleri arenaya yerleştirin ve hayvanların nesneleri hareket ettirememesi için zemine sabitleyin.
- Nesneleri, örnek safhaya 13 göre arenada aynı konuma yerleştirin.
- Genotipler ve tedavi grupları arasındaki yeni ve tanıdık nesnelerin göreli konumunu dengeleyin.
- Duvarlar ve nesneler arasında farelerin nesneleri her açıdan rahatça keşfedebilmesi için yeterli mesafe olduğundan emin olun.
- Veri toplama sistemi ve / veya video kameraları kurun. Labirentte farelerin ve nesnelerin doğru şekilde izlenmesini onaylayın. Bir cetvelin veya bilinen uzunluğun diğer bir nesnesinin çekilmiş video görüntülerini kullanarak arenadaki mesafeleri kalibre edin.
- Arenanın köşelerini yazılımda işaretleyinKonumsal önyargıların puanlanmasına izin vermektir. Nesneleri yazılımda işaretleyin ve her nesneye yönelik keşif davranışını tek tek izleyin ( yani , "Roman" ve "Tanıdık").
- Kabini raftan çıkarın ve hafifçe arenaya yakın bir masanın üzerine koyun.
- Nazikçe nesneleri hayvanat bahçelerine bakacak şekilde arenanın merkezine yerleştirin. Fareleri 10 dakika boyunca nesneleri özgürce keşfetmek için kaydedin.
- Test oturumunun sonunda, arenadaki fareleri çıkarın ve fareleri evdeki kafese geri yerleştirin. Arenayı ve nesneleri, her oturumdan sonra kokusuz bir ağartıcı mikrop öldürücü silme,% 70 EtOH ve dH20 ile iyice temizleyin.
- Adım 4.4.3'te tüm hayvanlar değerlendirilene kadar tekrarlayın.
- Nesne araştırması tüm fareler için ölçülünce videolar analiz edilir.
NOT: Nesne araştırmaları aşağıdaki kriterler yerine getirildiğinde sayılır: fare nesneye doğru yönlendirilir, burun nesnenin 2 cm'inde, orta noktadaHayvanın cismi cisimden 2 cm'nin üstünde ve önceki kriterler en az 1 sn boyunca yerine getirildi. Buna ek olarak, bir hayvan keşif kriterlerinden memnun ise ancak> 10 saniye süreyle hareketsizlik sergilerse, keşif sonu tamamlanmış sayılacaktır. - Yeni nesnel tanımayı, romanı tanıdık nesnelere keşfetmek için harcanan zamanı kıyaslayarak değerlendirin. Literatürde yaygın olarak üç yöntem bildirilmiştir.
- Tekrarlanan bir ölçüm testi kullanarak yeni ve tanıdık nesneleri keşfetmek için harcanan zamanı analiz edin. Bu yöntem, genotip ve / veya tedavi, toplam arama süresini etkilemediğinde en iyi şekilde kullanılır.
- Yenilik tercihini aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın:
NOT: Bu, nesneleri keşfetmek için toplam zamana göre yeni nesne keşfetmek için harcanan zamanın yüzdesini sağlar. Değerler% 0'dan (yeni nesne keşfi yok)% 100'e değişir (yalnızca roman obJect),% 50 değeri, yeni ve tanıdık nesneleri keşfetmek için harcanan süreyi gösterir. - Aşağıdaki denklemi kullanarak ayırma endeksini 11 hesaplayın:
NOT: Bu, nesneleri keşfetmek için harcanan toplam süreye kıyasla yeni ve tanıdık nesneleri keşfetmek için harcanan zaman farkını ortaya çıkarmaktadır. Değerler -1 (yalnızca tanıdık nesnenin araştırılması) ile +1 arasında değişir (yalnızca yeni nesnenin araştırılması, 0 değeri, yeni ve tanıdık nesneleri keşfetmek için harcanan zamana eşit olduğunu gösterir.
- Hiperdinamik hareket ya da diğer stereotipler nedeniyle test oturumuna katılmayan hayvanlardan dikkatle çıkın 11 .
NOT: Çıkarma için kullanılan kriterler objektif olmalı ve fare modeli için önceden belirlenmelidir ( yani , toplam arama süresi için <5 . yüzdelik ve> 100 ortalamaTest döngüsü sırasında dönüş açısı veya miyoklonik köşe atlaması sergileyen> 50. yüzdelik süre).
- Bir test evresi seansının başlangıcından önce, nesneleri arenaya yerleştirin ve hayvanların nesneleri hareket ettirememesi için zemine sabitleyin.
5. Limb Clapping'li Farelerde Kortikospinal Fonksiyonun Değerlendirilmesi 14
- Video, tüm oturumu belgeliyor. Videoyu taşınabilir bir el tipi cihazla ( ör . Akıllı telefon veya eşdeğeri) kaydedin.
NOT: Güç analizleri, grup başına 10-15 farenin bir numunenin bir β ≤0.2 için gerekli olduğunu göstermektedir. - Ev kafesini raftan çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin. Bir sonraki adımdan önce videoda hayvanın kimliğini belgeleyin.
- Fareyi kafesinden hafifçe çıkarın ve 5-10 saniye kuyrukta bekletin. Video askıya alınırken hayvanın arka ve önlerini kaydetmelidir.
- En az 5 saniyelik videoyu çektikten sonra fareyi evdeki kafese geri yerleştirin ve kafesi rafa geri getirin.
- Masayı temizle. Adım 5.2'den tüm fareler recorde oluncaya kadar tekrarlayın d.
- 0-4 arası bir skala ile kuyrukları ile askıya alınmış farelerin videolarından tutunarak puanlama ekseni (skor tarifi için Tablo 1'e bakınız). Askıya alınan farelerin videolarını inceleyin ve ardından aşağıdaki ölçütlere dayalı olarak bir puan atayın.
- Bağlamayan bacak yok. Normal kaçış uzantısı. Bir arka ekstremite eksik gösterim ve mobilite kaybı sergiler. Parmak uçları normal sergilemektedir.
- Her iki arka ekstremitede eksik görüntü ve mobilite kaybı vardır. Parmak uçları normal sergilemektedir.
- Her iki arka bacaklar kıvrımlı ayak parmakları ve hareketsizlikle örtüşür.
- Ayak başları ve arka ekstremiteler birbirine tutunur ve çaprazlanmış, kıvrımlı ayak parmakları ve hareketsizlik gösterir.
- Bütün fareler 2 bağımsız araştırmacı tarafından skorlanmıştır. 2 puanın 1 puandan fazla fark ettiği herhangi bir fare yeniden canlandırılır.
- Farklı olan puanlar ortalamalı.
P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
Tablo 1: Koltukaltı Kelepçe Puanlarının Tanımı.
Representative Results
Yaşlı Tg2576 fareler, burada ayrıntılı olarak anlatılan yöntemler kullanılarak çoğaltılabilen bir Y-labirenti 15 , 16'da yapılan spontan değişimlerde sağlam açıklar sergilemektedir ( Şekil 1A ). Bu farelerde artmış kol girişi eğilimi gözlenirken ( Şekil 1B ), bu farede gözlemlenen hiperaktivite spontan değişim oranını etkilemedi ( Şekil 1C ). Buna karşılık, yaşlı rTg4510 fareleri, bir Y-labirente yerleştirildiğinde artmış spontan değişim sergilemektedir ( Şekil 1D ). Bu aşırı aşırı hareketlilik ( Şekil 1E ) ve stereotipi 10'dur , bu da spontan değişimin ölçülmesine büyük ölçüde müdahale eder ( Şekil 1F ). Başlangıçta bu görevdeki fareleri değerlendirirken, kol girişlerinin ve / veya seyahat edilen mesafeninSpontan değişme oranı ile anlamlı korelasyon göstermektedir.
Yeni nesne tanımanın değerlendirilmesinden önce fareler, testin yapılacağı arenaya alışır. Alışkanlık sırasında, hiperaktivite ( Şekil 2A ) ve fare modeliyle alakalı diğer kalıplaşmış davranışlar değerlendirilebilir. Örneklem aşamasında, keşif davranışlarında önemli yanlılıklar gösteren farelerin daha sonraki değerlendirmeden çıkarılabilmesi için her bir nesnenin araştırılmasının ayrı ayrı ölçülmesi önemlidir ( Şekil 2B , açık daireler). Roman nesne tanıma, tanıdık ve yeni bir nesnenin araştırılmasıyla değerlendirilir ve genellikle üç farklı şekilde analiz edilir. Toplam keşif süresi genotipler ve / veya tedavi grupları arasında kıyaslanabilirse, o zaman, her cismi araştıran ham zaman ve uygun tekrarlanan ölçüm testleri yeni nesne r'de farklılıklar olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir( Şekil 2C ). Belirli bir fare suşu toplam keşif süresinde farklılıklar gösteriyorsa, yeni nesne tanıma yenilik tercihi ( Şekil 2D ) veya ayrımcılık indeksi ( Şekil 2E ) kullanılarak değerlendirilebilir.
Koltuk altı kelepçesi, kortikospinal fonksiyondaki eksiklikleri ölçen, fonksiyonel bir motor testidir. Bilişsel bir önlem değildir, Limb kavraması, birkaç transjenik tau fare modelinde 6 , 17 , 18 , 19 gözlenir ve geç AD AD hastalarında gözlemlenen işlevsel motor eksikliklerin bir kısmını tekrarlar. Farelerin kuyruk süspansiyonu bir kaçış tepkisi ortaya çıkarır ( Şekil 3A , "0"). Arka ekstremiteleri oynatma ve ayak parmaklarını uzatma yeteneklerindeki açıklar, şiddetine göre 0-4 arası bir skorla puanlanır ( Şekil 3A). Burada özetlenen prosedürü kullanarak, rTg4510 farelerinde önemli ekstremite klapajı gözlemleyebilir ( Şekil 3B ).
Şekil 1: Y-labirentindeki Spontan Değişim. ( A ) Bir Y-labirente yerleştirildiğinde, fareler her kolun her 3 kol girişi için yalnızca bir kez araştırıldığı bir keşif deseniyle sonuçlanan bir kayma vardiya arama stratejisi benimserler. Yaşlı Tg2576 fareler spontan değişimde önemli bir eksiklik sergilerler. Bu metoda özetlenen prosedürleri kullanarak tescilli bir bileşik ile muamele ettikten sonra spontan değişimin önemli bir restorasyonu gözlemlendi. Veriler 1-yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve Dunnett testi kullanılarak Tg-PBS'ye post-hoc karşılaştırmaları yapıldı. ** p <0.01. Hata çubukları SEM'i işaret eder. ( B ) Kol girişlerinin sayısı herhangi birinde önemli ölçüde farklı değildiBu deneyde izlenen grupların% Veriler 1-yönlü ANOVA testi kullanılarak analiz edilmiştir. Hata çubukları SEM'i işaret eder. ( C ) Spontan değişim ile yapılan kol girişi sayısı arasında herhangi bir korelasyon bulunmamakta olup, spontan lokomotor aktivitedeki farklılıkların spontan değişimin kantifikasyonunu etkilemediğini göstermektedir. Korelasyon testi, Pearson korelasyon analizi kullanılarak yapıldı. ( D ) Y-labirente yerleştirildiğinde, rTg4510 farelerinin (6 ay), littermat WT farelerine göre belirgin şekilde daha fazla spontan alternasyon sergilediği görülür. Veriler 1-yönlü ANOVA ile analiz edildi ve Dunnett testi kullanılarak Tg-PBS'ye post-hoc karşılaştırmaları yapıldı. ** p <0.01. Hata çubukları SEM'i işaret eder. ( E ) rTg4510 fareleri, aşırı hiperdinamik hareketlerinden dolayı önemli derecede daha fazla kol girişi yapmıştır. Veriler 1-yönlü ANOVA ile analiz edildi ve Dunnett testi kullanılarak Tg-PBS'ye post-hoc karşılaştırmaları yapıldı. *** p <0.001. Hata çubukları SE'yi gösterirM. ( F ) Spontan değişim davranışı, kol girişi ile anlamlı korelasyon gösterdi; bu, hiperdinamik lokomotor fenotipi gerçek spontan değişimi gizlediğini gösterdi. Korelasyon testi, Pearson korelasyon analizi (r = 0.7, p <0.0001) kullanılarak yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Yeni Nesne Tanıma. ( A ) Arena alışkanlığı, belirli bir fare modeli ile ilgili spontan hareket ve diğer kalıplaşmış davranışların ölçülmesine izin verir. Burada, yaşlı Tg2576 fareler (22 ay), littermate WT farelerine göre çok daha spontan hareket gösterirler. Veriler 1-yönlü ANOVA ile analiz edildi ve Tg-Veh'a post-hoc karşılaştırmaları Dunnett 'S testi. ** p <0.01. Hata çubukları SEM'i işaret eder. ( B ) Örnek aşamasında, iki özdeş nesnenin araştırılması ayrı olarak izlenmiştir. İki nesneden birinin (açık daireler) araştırılması yönünde büyük önyargılar sergileyen fareler test aşamasından çıkarılmıştır. ( C - E ) Roman nesne tanıma, yeni ve tanıdık bir nesnenin araştırılmasının ölçülmesiyle değerlendirildi. Roman nesne tanıma, ( C ) ham keşif zamanı, ( D ) yenilik tercihi veya ( E ) ayrımcılık indeksi kullanılarak değerlendirildi. Panel C'deki veriler iki yönlü bir ANOVA kullanılarak tekrarlanan ölçümlerle analiz edildi ve Sidak testi kullanılarak çift karşılaştırmaları yapıldı. Paneller DE'deki veriler bir 1-yönlü ANOVA ile analiz edildi ve Dunnett testi kullanılarak Tg-Veh'a post-hoc karşılaştırmaları yapıldı. * P <0.05, ** p <0.01. Hata çubukları SEM'i işaret eder. lütfen tıklayınBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Koltuk altı kelepçeleri. ( A ) Tablo 1'de anlatıldığı gibi çeşitli derecelerde uzuv kırpma gösteren farelerin temsili görüntüleri. ( B ) rTg4510 fareleri (6 ay), littermat WT farelerine kıyasla, bu yöntemleri kullanarak skorlamada önemli kol uzantısı sergilemektedir. Veriler bir 1-yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve Dunnett testi kullanılarak Tg-PBS'ye post-hoc karşılaştırmaları yapıldı. *** p <0.001, **** p <0.0001. Hata çubukları SEM'i işaret eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Tekniğin Mevcut Metotlar Üzerindeki Önemi
Bu prosedür, β-amiloidoz ve tauopatinin transgenik fare modellerinde bileşiklerin in vivo aktivitesi için tarama yapmak üzere tasarlanmıştır. Burada kullanılan kademeli yaklaşım, AD 3'le alakalı bilişsel alanlardaki etkili bileşiklerin saptanmasını sağlar. Ayrıca, burada ayrıntılı olarak açıklanan yaklaşım, açıkça tanımlanmış bitiş noktalarına, kolayca uygulanabilir kalite kontrol kontrollerine, daha ılımlı bir çıktı formatında yürütülebilecek ve araştırmacının az müdahalesine ihtiyaç duyan davranış testlerini kullanmaktadır. Bu özellikler, bir ilaç keşfi ortamında davranışsal profillemeyi destekleyecek kadar sağlam olan (2 ≤ f ≤6) düşük intra-ve inter-assay varyansı ve etki boyutları ile sonuçlanan, hayvanlarda ve kohortlar arasında iyi tekrarlanabilirlik sergileyen testlerle sonuçlanır.
Pr içinde Kritik Adımlarotocol
AD ilaç keşfi için kullanılan birçok fare modeli, artmış kaygı ve saldırganlıkla tutarlı davranış sergilemektedir. Bu, burada açıklanan davranış testlerinden herhangi birini yerine getirmek için taşıma alışkanlığını zorunlu kılar. Bu testler, hareketsiz davranışlara dayandığından, hiperaktivite ve endişe verici veya saldırgan bir fareden dolayı araştırmacı tarafından kaba bir şekilde kullanılması, performansı önemli ölçüde etkileyebilir. Yüksek endişe, görevin başarısız olmasına ve testin genel gücünün düşmesine neden olabilir. Dahası, arenadaki ışık seviyeleri, her test için gereken spontan hareketliliğin kolaylaştırılması için gereklidir. Parlak ışık kemirgenlerdeki endişeyi artırmaya ve lokomotif hareketleri bastırmaya eğilimli olduğundan, ortam ışığı seviyelerini arena'da 30-35 lux'e ayarlamaya özen gösterilmelidir.
Prosedürün bir diğer kritik yönü de, bir hayvanın görevleri yerine getirebilme yeteneğini etkileyecek güçlü çevresel ipuçlarını en aza indirgemektir. TemizlenmesiArena ve nesneler arasındaki nesneler, fareler çevreye özgü yeni kokulara çekildiğinden dolayı önemlidir. Arenayı ve nesneleri iyice temizlemekteki başarısızlık, farenin kendiliğinden hareket etmesini ve gerçek kognitif performansı maskeleyerek sonuçlanmasına neden olabilir. Araştırmacılar, bu prosedürleri gerçekleştirirken kişisel hijyen ürünlerini ve kolonyaları / parfümleri en aza indirgemelidir. Son olarak, kemiriciler, öğrenme ve hafıza da dahil olmak üzere birçok belirgin davranışlarda, günışığı ve sirkadiyen değişiklikler sergilemektedir21. Bu nedenle, bazal davranışlarda ve bilişsel performansta günlük ritimleri nedeniyle varyansı en aza indirgemek için tüm testler kohortlar ve çalışmalar boyunca günün aynı saatinde yapılmalıdır.
Ayrıca, özellikle yeni nesne tanıma ile ilgili olarak, numune ile test aşaması arasındaki gecikme aralığı ve nesnelerin çevreye yerleştirilmesi ve yerleştirilmesi kritik parametrelerdir. Bellek 3 farklı biçimde bulunur: kısa süreli memOry (STM), ara terim belleği (ITM) ve uzun süreli bellek (LTM) 22 , 23 . Örnek ve test aşamaları arasındaki süreyi dakikalar (STM) ila saat (ITM) veya günler (LTM) arasında değiştirmek, prosedür 12 tarafından test edilen bellek türünü değiştirecektir. Ayrıca, yeni nesne tanıma testini çalıştırmadan önce, birçok nesne, keşifte potansiyel önyargılar için farelerin bir test kohortunda taranmalıdır. Test kohortuna aşırı çekici veya itici olan bir nesne, yeni nesne tanımayı değerlendirirken kullanılamaz. İdeal olarak, testte kullanılacak tüm nesneler, bir arenaya yerleştirildiğinde, naif bir fareden çıkarılma zamanlarını ortaya çıkaracaktır. Nesnelerin yetersiz testi ve optimizasyonu yeni nesne tanıma gücünü önemli ölçüde azaltabilir.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
Artırabilir çeşitli faktörler vardır.Burada açıklanan bilişsel testlerde görünür değişkenlik. Birçok fare AD modelinde, hiperdinamik lokomotif 3 , bilişsel son nokta olarak ölçülen davranışları maskeleyebilir veya değiştirebilir. Dahası, cinsiyet 24 , 25 , 26 ve hatta maternal genotip 27'nin AD fare modellerinde nöropatoloji ve bilişsel fenotiplerin gelişimini ve ilerlemesini etkileyebileceğine dair artan kanıtlar vardır. Beklenmedik değişkenlik veya davranışsal bir görevi yerine getirmede başarısızlık, bu etkenlerden herhangi birine bağlı olabilir. Belirli bir davranış testini ilk uygularken, sonuçlar daima cinsiyet, yaş ve varsa annenin genotipine göre tabakalandırılmalıdır. Ayrıca, hiperaktivitenin veya diğer kalıplaşmış davranışların bilişsel son noktaların nicelenmesine müdahale etmemesini sağlamak için bu prosedürde belirtilen kalite kontrolleri daima yapılmalıdır.
envDemirbaş ayrıca kemirgenlerin kendiliğinden keşfedici davranışını da etkileyebilir. Araştırmacılar tarafından saptanamayan kokular veya sesler, spontan davranışlara dayanan kognitif testlerin sonuçlarını çarpıtarak fareleri çekebilir veya itebilir. Başlangıçta Y-labirentini veya yeni nesne tanımayı kurarken, nesne ve / veya çevreyi araştırmada herhangi bir konumsal önyargı bulunmadığından emin olmak için kontrol tedbirlerinin uygulanması şarttır. Konumsal önyargılar gözlemlenirse, araştırmacılar çevreyi iyice incelemek ve aydınlatma, arenada yerleştirme, test odasının tesis içindeki diğer odalara ( yani , yüksek trafik alanı veya ağır teçhizata yakın değil) göre arena temizleme prosedürlerini ayarlamaları potansiyel olarak ayarlamalıdır.
Test ortamına alışmak, yeni nesne tanıma testinde en iyi performansa ulaşmanın anahtarıdır. Örneğin, toplam arama sürelerinin düşük olması yetersiz alışkanlığa bağlı olabilir. Proc için bir alternatif olarakTaşıma (Bölüm 2) ve arena (Bölüm 4.2) alışkanlığı, kullanıma alışkanlık ve test ortamı için burada ana hatlarıyla belirtilen etütler, ard arda iki gün boyunca günde 3, 5 dakikalık seanslar halinde yapılabilir.
Teknik Sınırlamalar
Herhangi bir prosedürde olduğu gibi, bu davranış testlerinin de sınırlamaları vardır. Bu işlemler, çeşitli korteks bölgelerinin ve hipokampüsün fonksiyonlarını test ettikleri için uygulanmıştır. Fare modeli bu testlerle araştırılan beyin bölgelerinde işlevsel açıklar göstermezse, bu teknikler kullanışlı olmayacaktır. Dahası, kısa süreli belleği araştıran bilişsel testleri seçtik. Klinik öncesi değerlendirme altındaki bileşiğin etki mekanizmasının kısa süreli hafızayı etkilemesi beklenmiyorsa, bu prosedürler buna göre modifiye edilmelidir ( yani , uzun süreli hafızayı test etmek için numune test aşaması aralığını arttırmak). Son olarak, bu testler motivasyonsuz davranışlar kullanır. Bu nedenle, eğer bir fare modeli atılmışsaAşırı hiperaktif veya çevrenin araştırılmasını engelleyen kalıplaşmış davranışlar sergiliyorsa, bu işlemler en uygun olmayabilir. Alternatif olarak, Tg2576 veya diğer β-amiloidoz fare modelleri için korku koşullandırma, veya rTg4510 için uzaysal su labirenti veya tauopati 3'ün diğer fare modelleri için kullanılabilir.
Gelecekteki Uygulamalar
Bu prosedürler laboratuarda başarıyla benimsedikten sonra, ilave bilişsel ve fonksiyonel motor önlemleri değerlendirmek için çeşitli değişiklikler veya uzatmalar yapılabilir. Örneğin, bir fare nesnenin yerleştirilmesinde bir değişikliği tanıyıp tanımayacağını belirlemek için yeni nesne tanıma görevini değiştirme 13 . Alternatif olarak, nesneler kullanmak yerine, başka fareler kullanabilir ve sosyal tanıma testi uygulayabilir. Ekstremite kavrama ve motor fonksiyonu ile ilgili olarak, bu testi tel asması ve / veya kavrama gücü testleriyle tamamlayabilir. TestlerBu yöntemde ayrıntılı olarak AD için translasyonel fare modellerinde in vivo etkinliğe sahip olan bileşiklerin taranması için sağlam bir baz oluşturur ve belirli bir fare modelini en iyi araştırmak veya benzersiz bir ilaç keşfi programının ihtiyaçlarını karşılamak için pek çok yönde uyarlanabilir veya modifiye edilebilir .
Disclosures
JM Levenson, Proclara Biosciences, Inc. tarafından istihdam edilmektedir. C. Miedel, J. Patton, A. Miedel ve E. Miedel, Hilltop Laboratuar Hayvanları tarafından istihdam edilmektedir.
Acknowledgments
Yazarların onayları yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77 (1), 69-81 (2010).
- Onos, K. D., Sukoff Rizzo, S. J., Howell, G. R., Sasner, M. Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 122, 1-11 (2016).
- Webster, S. J., Bachstetter, A. D., Nelson, P. T., Schmitt, F. A., Van Eldik, L. J. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 5, 88 (2014).
- Rodgers, S. P., Born, H. A., Das, P., Jankowsky, J. L. Transgenic APP expression during postnatal development causes persistent locomotor hyperactivity in the adult. Mol Neurodegener. 7, 28 (2012).
- Hsiao, K., et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274 (5284), 99-102 (1996).
- Santacruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd edn. , Wiley-Interscience. (2007).
- Hughes, R. N. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory. Neurosci Biobehav Rev. 28 (5), 497-505 (2004).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Centers for Disease Control. , (2008).
- Wes, P. D., et al. Tau overexpression impacts a neuroinflammation gene expression network perturbed in Alzheimer's disease. PLoS One. 9 (8), 106050 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., Dineley, K. T. Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav Brain Res. 200 (1), 95-99 (2009).
- DeVito, L. M., Eichenbaum, H. Distinct contributions of the hippocampus and medial prefrontal cortex to the "what-where-when" components of episodic-like memory in mice. Behav Brain Res. 215 (2), 318-325 (2010).
- Lalonde, R., Strazielle, C. Brain regions and genes affecting limb-clasping responses. Brain Res Rev. 67 (1-2), 252-259 (2011).
- King, D. L., Arendash, G. W. Behavioral characterization of the Tg2576 transgenic model of Alzheimer's disease through 19 months. Physiol Behav. 75 (5), 627-642 (2002).
- Lalonde, R., Lewis, T. L., Strazielle, C., Kim, H., Fukuchi, K. Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res. 977 (1), 38-45 (2003).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25 (4), 402-405 (2000).
- Spittaels, K., et al. Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein. Am J Pathol. 155 (6), 2153-2165 (1999).
- Terwel, D., et al. Changed conformation of mutant Tau-P301L underlies the moribund tauopathy, absent in progressive, nonlethal axonopathy of Tau-4R/2N transgenic mice. J Biol Chem. 280 (5), 3963-3973 (2005).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Rep. 6 (10), 930-935 (2005).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behav Neurosci. 128 (3), 283-303 (2014).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Stough, S., Shobe, J. L., Carew, T. J. Intermediate-term processes in memory formation. Curr Opin Neurobiol. 16 (6), 672-678 (2006).
- Stevens, L. M., Brown, R. E. Reference and working memory deficits in the 3xTg-AD mouse between 2 and 15-months of age: a cross-sectional study. Behav Brain Res. 278, 496-505 (2015).
- Yue, X., et al. Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19198-19203 (2005).
- McAllister, C., et al. Genetic targeting aromatase in male amyloid precursor protein transgenic mice down-regulates beta-secretase (BACE1) and prevents Alzheimer-like pathology and cognitive impairment. J Neurosci. 30 (21), 7326-7334 (2010).
- Blaney, C. E., Gunn, R. K., Stover, K. R., Brown, R. E. Maternal genotype influences behavioral development of 3xTg-AD mouse pups. Behav Brain Res. , 40-48 (2013).
