Summary
Hier beschreven is een gestage, gedrags screening aanpak die kan worden gebruikt om te screenen voor verbindingen die in vivo werkzaamheid vertonen op cognitief en functioneel motorisch gedrag bij transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie. Deze methoden zijn geoptimaliseerd om verbindingen te screenen voor activiteit in kort- en werkgeheugen taken.
Abstract
Hier beschrijven we een gestage, gedragstestende aanpak die kan worden gebruikt om te screenen voor verbindingen die in vivo werkzaamheid vertonen op cognitief en functioneel motorisch gedrag bij transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie. Het paradigma omvat tests voor spontane afwisseling in een Y-doolhof, nieuwe objectherkenning, en ledematen. Deze tests werden geselecteerd omdat zij: 1) de functie van cognitieve of motorische domeinen en de correlate neurale schakeling die relevant zijn voor de menselijke ziekte staat, 2) duidelijk gedefinieerde eindpunten hebben, 3) gemakkelijk te kunnen uitvoeren kwaliteitscontroles, 4) kunnen worden uitgevoerd in Een gematigd doorvoerformaat, en 5) weinig interventie door de onderzoeker vereisen. Deze methoden zijn ontworpen voor onderzoekers die verbindingen zoeken voor activiteiten op korte termijn en werkgeheugen, of functionele motorische gedragingen in verband met Alzheimer's ziekte-muismodellen. De hier beschreven methoden gebruiken gedragstests die engLeeftijd een aantal verschillende hersenregio's, waaronder hippocampus en diverse corticale gebieden. Onderzoekers die cognitieve tests verlangen die specifiek beoordelen van cognitie gemedieerd door een enkele hersengebied, kunnen deze technieken gebruiken om andere gedragstests aan te vullen.
Introduction
Alzheimer's ziekte (AD) is een progressieve neurodegeneratieve stoornis, wat leidt tot een verzwakking van de cognitieve afname die ongeveer 44 miljoen mensen wereldwijd beïnvloedt. Momenteel zijn er geen beschikbare behandelingen voor AD die ziekteveranderend zijn, met nadruk op de dringende behoefte aan preklinische ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën voor deze ziekte. Er zijn een aantal verschillende transgene muismodellen gecreëerd die verschillende aspecten van AD 1 , 2 samenvatten, inclusief tekorten in cognitieve domeinen die bij patiënten 3 zijn verstoord. Deze muismodellen vormen een handig hulpmiddel voor het vergemakkelijken van efficiënte screening in vivo .
Bij het beoordelen van een verbinding voor mogelijke in vivo werkzaamheid, moet een opstelling worden uitgevoerd die scherpt voor werkzaamheid in geschikte cognitieve domeinen en ook gedrag controleert die de specifieke eindpunten die gebruikt kunnen worden voor eenSsess cognitie. Veel transgene muismodellen van AD tonen hyperactiviteit en andere gedragingen die een bepaalde cognitieve test kunnen bemoeien, en het gebruik ervan verbieden bij drugscreening 4 . Bovendien, voor een aanpak die in een drugscreeningomgeving moet worden uitgevoerd, dienen de gebruikte tests ten minste een matige doorvoer te hebben, duidelijk gedefinieerde eindpunten en een procedure die minimale interventie door de onderzoekers vereist. Met behulp van deze criteria kunnen gedragscreens geïmplementeerd worden die de reproduceerbaarheid, de lage intra- en interassay variantie en effectgroottes tonen die nodig zijn voor samengestelde screening. Gedetailleerd hier zijn de methoden die we hebben toegepast om te screenen voor verbindingen die effectief zijn om de cognitieve en motorfenotypen die aanwezig zijn in transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie 5 , 6 te verminderen. De beschreven methoden zijn aangepast aan veelgebruikte gedragsparadigma's die in de l worden gerapporteerdIteratuur 7 , met specifieke optimalisaties en kwaliteitscontroles, zodat ze gebruikt kunnen worden in transgene muismodellen die relevant zijn voor AD. Dit protocol kan worden gebruikt met een verscheidenheid aan data-acquisitie- en analysesystemen en veronderstelt dat de onderzoeker over de nodige kennis van de bijbehorende software beschikt.
Protocol
De methoden die in deze publicatie worden beschreven, werden door de institutionele dierenzorg- en gebruikscommissie (IACUC) bij Hilltop Laboratory Animals beoordeeld om de juiste zorg, gebruik en humane behandeling van dieren te waarborgen in overeenstemming met de geldende federale, nationale en lokale wetten en voorschriften, zoals Als de federale dierenwelzijnsverordeningen, of AWR's (CFR 1985) en het volksgezondheidsdienstbeleid inzake humane zorg en gebruik van laboratoriumdieren, of PHS-beleid (PHS 1996).
1. Algemene richtlijnen voor alle gedragsbeoordeling
- Voordat u dieren behandelt, bedek bestaande koekaarten met een nieuwe kooikaart die alleen de unieke, verblindde dierenidentificatie aangeeft.
OPMERKING: Onderzoekers die muizen behandelen tijdens routine / placebo dosering, mogen geen muizen hanteren voor gedragsbeoordeling. - Schakel de bovenlichten af of zet de lamp uit en stel de verlichting aan, zodat verlichting op de vloer van de arena of doolhof 30-35 lux is.
- FOf studies die meerdere weken duren, worden wekelijkse lichaamsgewichten als een indirecte maatregel voor de algemene gezondheid vastgesteld.
OPMERKING: Aanvullende cage-kantcontroles voor de kwaliteit van de jas, houding, gang en spontane bewegingen kunnen worden meegerekend als meer robuuste gezondheidscontroles gerechtvaardigd zijn.
2. Habituerende Muizen om te behandelen door onderzoekers
- Twee dagen voorafgaand aan een gedragstest, wekken de muizen naar de behandeling. Verwijder de kooi uit het kooirak en plaats op een vlak oppervlak.
- Verwijder het deksel uit de kooi. Houd de muis precies zoals het zou worden behandeld tijdens het uitvoeren van de aanstaande gedragstest. Zet de muis in een gekopte hand boven de huiskooi.
- Meet de latentie om van de hand van de onderzoeker naar de huiskooi terug te springen. Houd muizen voor maximaal 5 s vast.
OPMERKING: Muizen die latencies hebben van ≥2 s worden beschouwd als "habituated". Muizen die latencies laten zien <2 s tijdens de eerste proefperiode ondergaan 2 extra habituatioN sessies die dag. - Laat de muizen 2 opeenvolgende dagen van de behandelingshabituatie ondergaan. Let op elke muis die niet aan het einde van de 2e dag voldaan is.
3. Het beoordelen van ruimtelijk werkgeheugen door spontane afwisseling in een Y-doolhof 8 te meten
- Voorafgaand aan het eerste gebruik, reinig de Y-doolhof grondig met een onbedekte bleekmiddelkiemdoder, 70% EtOH, gevolgd door dH 2 O 9 . Duidelijke aanduidingen van de armen van het doolhof als 'A', 'B' en 'C' of andere vergelijkbare unieke identificaties.
- Voordat het begin van een test sessie wordt ingesteld, stelt u het gegevensverzamelingssysteem of de videocamera's in en stelt u de juiste tracking van muizen in het doolhof in. Kalibreer de afstand in het doolhof met behulp van vastgelegde videobeelden van een liniaal of ander object van bekende lengte.
OPMERKING: De gedragsmethoden in deze procedure zullen werken met een verscheidenheid aan gegevensverzamelingssystemen en de auteurs aanvaarden anyoNe die deze procedure uitvoert is vaardig in het gebruik van hun gekozen gegevensverzamelingssysteem. Krachtanalyses geven aan dat monsters van 10-15 muizen per groep nodig zijn voor een β ≤0.2. - Verwijder de kooi uit het rek en leg het zachtjes op een tafel in de nabijheid van de Y-doolhof. Verwijder de muis uit zijn huiskooi en leg hem zachtjes in één arm van de Y-doolhof, naar het midden gericht. Laat de onderzoeker stap ver genoeg van de doolhof af, zodat de muis de onderzoeker niet kan zien.
- Activeer het data- / video-acquisitie systeem onmiddellijk na de plaatsing van de muis in het doolhof.
- Druk op en record het spontane gedrag voor elke muis gedurende een periode van 10 minuten. Zodra een sessie is voltooid, plaats de muis voorzichtig terug in zijn huiskooi en keer de kooi naar het rek.
- Reinig het doolhof grondig tussen elke sessie met een ongekende bleekmiddelkiemdoder, 70% EtOH, gevolgd door dH 2 O. Herhaal van stap 3.4 om alle microgroeven te beoordelene.
- Zodra alle muizen de exploratie van de Y-doolhof hebben voltooid, analyseer de gegevens van het acquisitie systeem of manueel de video's van de sessies scoren. Een arminvoer treedt op als alle 4 pootjes van de muis de drempel van de centrale zone en in de arm oversteken en de snoet van het dier is gericht tegen het einde van de arm.
OPMERKING: Eindpunten die worden geanalyseerd, zijn onder andere: de totale afstand afgelegd in het doolhof, de totale afstand afgelegd binnen elke arm (inclusief de centrale zone), de totale tijd in elke arm (inclusief de centrale zone), totaal aantal armmeldingen, aantal Ingangen in elke arm, en een opeenvolgende lijst van wapens ingevoerd om het aantal bewerkte alternaties te beoordelen. - Een spontane afwisseling vindt plaats wanneer een muis een andere arm van het doolhof binnentreedt in elk van de drie opeenvolgende armen. Spontane alternatie% wordt dan berekend met de volgende formule.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, ikF de volgorde van de arminvoer was: ABCCBABCABC, onderzoeker zou in totaal 6 spontane alternaties scoren (in volgorde: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). Met een totaal van 11 armmeldingen zou de spontane afwisseling% 67% bedragen. - Voer de volgende kwaliteitscontroles uit om ervoor te zorgen dat de gegevens een onbevooroordeelde beoordeling van spontane afwisseling vertegenwoordigen.
- Voer een Pearson's correlatie van spontane afwisseling% uit naar zowel de totale afstandsafstand als het aantal ingevoerde arminvoer.
OPMERKING: Als er sprake is van een significante correlatie van spontane alternatie% naar beide parameters, dan moeten de gegevens verder worden gecontroleerd door de mogelijke invloed van hyperdynamische bewegingen op het schijnbare cognitieve eindpunt 10 . - Analyseer het aantal ingangen dat in elke arm is gemaakt met een 1-way ANOVA-test.
OPMERKING: Als deze analyse significant is, dan zou dit aangeven dat er sprake is van aanwijzingen in de omgeving die muizen hebben aangetrokken aan een bepaalde regiOp de doolhof.
- Voer een Pearson's correlatie van spontane afwisseling% uit naar zowel de totale afstandsafstand als het aantal ingevoerde arminvoer.
4. Beoordeling van Intermediate-Term Recognition Memory door middel van nieuwe objectidentificatie 11 , 12 , 13
- Voor elke fase van deze test, reinig de open veld arena grondig met een ongedrukte kiemdodend wipes, 70% EtOH gevolgd door dH20 voor het eerste gebruik.
- Een dag voor de blootstelling van de objecten, zet de muizen in de open veld arena.
- Voorafgaand aan het begin van de habituation sessie, stel de data-opname systeem of videocamera's op en bevestig de juiste tracking van muizen in het doolhof. Kalibreer de afstand in de arena met behulp van vastgelegde videobeelden van een liniaal of ander object van bekende lengte. Markeer de hoeken van de arena in de software om het plaatsen van positional biases mogelijk te maken.
OPMERKING: De gedragsmethoden in deze procedure werken samen met een verscheidenheid aan data acquisitieStengels en de auteurs ervan uitgaan dat iemand die deze procedure uitvoert, vaardig is in het gebruik van hun gekozen gegevensverzamelingssysteem. Krachtanalyses geven aan dat monstergrootten van 15-20 muizen per groep nodig zijn voor een β ≤0.2. - Verwijder de kooi uit het rek en liggend op een tafel in de buurt van de arena.
- Verwijder de muis uit de thuiskooi en plaats de muis voorzichtig in het midden van de arena. Zet de tracking-software en / of het video-opnamesysteem onmiddellijk aan nadat de muis in de arena is geplaatst.
- Laat muizen vrij om de arena 30 minuten te verkennen.
OPMERKING: Tijdens deze periode zullen de onderzoekers de muizen niet storen. - Plaats de muizen terug in hun huiskooi na de aanvangssessie en maak de arena grondig schoon met een onkruidende kiemdodende wasser, 70% EtOH gevolgd door dH 2 O.
- Herhaal van stap 4.2.2 totdat alle muizen zijn geworden op de arena.
- Na alle muizen zijn gewoonte geweestGeorganiseerd naar de arena, analyseer de video.
OPMERKING: Eindpunten om te analyseren omvatten de totale afstand die in de arena is gereisd en de tijd die in de buurt van elke hoek wordt besteed. Als relevant voor het muismodel, worden stereotype gedrag in deze analyses opgenomen ( dwz myoclonische hoekspringen, cirkelen, enz. ). Muizen die voorspellingen vertoont in de tijd die in bepaalde gebieden van de arena worden besteed, zijn uitgesloten van verder experimenten, omdat dit objectverkenning zal beïnvloeden.
OPMERKING: De eerste fase van nieuwe objectherkenning houdt in dat u muizen vertrouwt op een object. Hierin wordt dit gedeelte van de nieuwe object herkenningsprocedure aangeduid als de voorbeeldfase. - Voorafgaand aan het begin van een monsterfasesessie, plaats objecten in de arena en bevestig ze op de vloer met een montagekit, zodat dieren de voorwerpen niet kunnen verplaatsen. Richt twee identieke objecten op een bepaalde muur met voldoende afstand tussen de muren en de voorwerpen zodat de muizen de voorwerpen vrij van alle angsten kunnen verkennenles.
- Stel het gegevensverzamelingssysteem of videocamera's op en bevestig de juiste tracking van muizen en objecten in het doolhof. Kalibreer de afstanden in de arena met behulp van vastgelegde videobeelden van een liniaal of ander object van bekende lengte.
- Markeer de hoeken van de arena in de software om het plaatsen van positional biases mogelijk te maken. Merk objecten in software en volg hun verkennende gedrag afzonderlijk voor elk object ( dwz "Object A" en "Object B").
- Verwijder de kooi uit het rek en leg het zachtjes op een tafel in de nabijheid van de arena.
- Verwijder de muis uit de huiskooi en plaats het voorzichtig in het midden van de arena, tegenover de objecten.
- Laat de muis de voorwerpen gedurende 15 minuten vrij verken. Gedurende deze periode verstoren de muizen niet.
- Aan het eind van de sessie zet u de muis voorzichtig terug in zijn huiskooi. Reinig de arena en voorwerpen met 70% EtOH en dH 2 O. Plaats deze objecten weer in de steekE arena.
- Herhaal stap 4.2.11 totdat alle muizen vertrouwd zijn met een object.
- Zodra alle muizen vertrouwd zijn met een object, analyseer de video's.
OPMERKING: Objectverkenningen worden geteld zodra aan de volgende criteria is voldaan: de muis is gericht op het object, de snuit is binnen 2 cm van het object, het middelpunt van het lichaam van het dier ligt ruim 2 cm van het object en de vorige criteria Zijn tenminste 1 s vervuld. Bovendien, als een dier voldoet aan de exploratiecriteria maar onbeweeglijk is voor> 10 s, wordt de verkennende bout geacht klaar te zijn. - Bereken een object voorspeling score voor elke muis als volgt.
OPMERKING: Muizen die een object-voorspanningscore hebben onder 20% of meer dan 80%, zijn uitgesloten van verdere experimenten.
- Voorafgaand aan het begin van de habituation sessie, stel de data-opname systeem of videocamera's op en bevestig de juiste tracking van muizen in het doolhof. Kalibreer de afstand in de arena met behulp van vastgelegde videobeelden van een liniaal of ander object van bekende lengte. Markeer de hoeken van de arena in de software om het plaatsen van positional biases mogelijk te maken.
- De laatste fase van nieuwe objectherkenning houdt in het onderzoeken van verkennend gedragGericht op zowel een nieuw en bekend object in het milieu, hierna aangeduid als de testfase. Deze fase wordt 2-3 uur uitgevoerd na afloop van de monsterfase.
- Voorafgaand aan het begin van een testfase sessie, plaats objecten in de arena en fixeer ze op de vloer zodat de dieren de voorwerpen niet kunnen verplaatsen.
- Plaats de voorwerpen in dezelfde positie in de arena ten opzichte van de monsterfase 13 .
- Balanseer de relatieve positie van nieuwe en bekende voorwerpen over genotypes en behandelingsgroepen.
- Zorg ervoor dat er voldoende afstand is tussen de muren en de voorwerpen, zodat de muizen de voorwerpen vanuit alle hoeken vrij kunnen onderzoeken.
- Stel het gegevensverzamelingssysteem en / of videocamera's op. Bevestig de juiste tracking van muizen en voorwerpen in het doolhof. Kalibreer afstanden in de arena met behulp van vastgelegde videobeelden van een liniaal of ander object van bekende lengte.
- Merk de hoeken van de arena in de softwZijn het toelaten van positional biases. Markeer objecten in software en volg verkennend gedrag voor elk object afzonderlijk ( dwz "Novel" en "Familiar").
- Verwijder de kooi uit het rek en leg het zachtjes op een tafel in de nabijheid van de arena.
- Zet voorzichtig dieren in het midden van de arena, tegenover de voorwerpen. Record muizen die objecten vrij kunnen verkennen gedurende 10 minuten.
- Aan het einde van de test sessie, verwijder muizen uit de arena en plaats muizen terug in hun huis kooi. Maak de arena en de voorwerpen grondig schoon met een onbedekte bleekmiddelkiemdodend, 70% EtOH en dH 2O na elke sessie.
- Herhaal uit stap 4.4.3 totdat alle dieren zijn beoordeeld.
- Nadat object exploratie is gemeten voor alle muizen, worden video's geanalyseerd.
OPMERKING: Object verkenningen worden geteld zodra aan de volgende criteria is voldaan: de muis is gericht op het object, de snuit is binnen 2 cm van het object, het middelpunt vanHet lichaam van het dier ligt ruim 2 cm van het voorwerp en de vorige criteria zijn tenminste 1 s vervuld. Bovendien, als een dier voldoet aan de exploratiecriteria maar onbeweeglijk is voor> 10 s, wordt de verkennende bout geacht klaar te zijn. - Beoordeel nieuwe objectherkenning door de tijd te vergelijken die de roman vergeleken met bekende objecten. In de literatuur worden drie methoden vaak vermeld.
- Analyseer de ruwe tijd die wordt besteed aan het onderzoeken van zowel nieuwe als bekende objecten met behulp van een herhaalde meet test. Deze methode wordt het beste gebruikt wanneer genotype en / of behandeling geen invloed hebben op de totale exploratietijd.
- Bereken nieuwigheidsvoorkeur, gebruik de vergelijking:
OPMERKING: dit geeft het percentage tijd dat u het nieuwe object vergelijkt met de totale tijd die objecten verkent. Waarden variëren van 0% (geen exploratie van nieuw object) tot 100% (exploratie alleen van de roman obJect), met een waarde van 50%, die duidelijke tijd voor het verkennen van nieuwe en bekende objecten aanduidt. - Bereken discriminatie index 11 , met behulp van de vergelijking:
OPMERKING: Dit geeft het verschil in de tijd om de nieuwe en bekende objecten te verkennen in relatie tot de totale tijd die de objecten verken. Waarden variëren van -1 (exploratie alleen van het bekende object) tot +1 (alleen exploratie van het nieuwe object, met een waarde van 0 die gelijk is aan de tijd om nieuwe en bekende objecten te onderzoeken.
- Verwijder dieren die niet deelnemen aan de proefsessie door hyperdynamische bewegingen of andere stereotypen, uit overweging 11 .
OPMERKING: Criteria die worden gebruikt voor verwijdering moeten objectief zijn en vooraf bepaald voor het muismodel ( dat wil zeggen <5 procentiel voor totale exploratietijd en ofwel> 100 gemiddeldeDraai hoek tijdens de test sessie of> 50e percentiel tijd die myoclonische hoekspringen vertoont).
- Voorafgaand aan het begin van een testfase sessie, plaats objecten in de arena en fixeer ze op de vloer zodat de dieren de voorwerpen niet kunnen verplaatsen.
5. Beoordeling van de corticospinale functie bij muizen met limb clasping 14
- Video document de gehele sessie. Neem de video op met een draagbaar handapparaat ( dat wil zeggen , smartphone of equivalent).
OPMERKING: Machtanalyses geven aan dat monsters van 10-15 muizen per groep nodig zijn voor een β ≤0.2. - Verwijder de huiskooi uit het rek en plaats het op een tafel. Documenteer het dier ID in de video voor de volgende stap.
- Verwijder de muis voorzichtig uit de kooi en schuif deze 5-10 s door de staart. De video moet de achter- en voorpoten van het dier opnemen, terwijl deze opgeschort is.
- Nadat u minimaal 5 seconden video hebt vastgelegd, plaatst u de muis terug in zijn huiskooi en brengt u de kooi naar het rek.
- Maak de tafel schoon. Herhaal van stap 5.2 tot alle muizen zijn hersteld d.
- Score limb clasping van video's van muizen gesuspendeerd door hun staart op een schaal van 0-4 (zie tabel 1 voor de beschrijving van de score). Controleer video's van gesuspendeerde muizen en geef vervolgens een score op basis van de volgende criteria.
- Geen ledematen vastklampen. Normale vluchtuitbreiding. Eén achterste ledemaat vertoont onvolledige splitsing en verlies van mobiliteit. Toes vertoont normale spleten.
- Beide achterste ledematen tonen onvolledige spleet en verlies van mobiliteit. Toes vertoont normale spleten.
- Beide achterste ledematen tonen clasping met gekrulde tenen en immobiliteit.
- Voorbenen en achterste ledematen tonen clasping en zijn gekruiste, gekrulde tenen en onbeweeglijkheid.
- Alle muizen worden gescoord door 2 onafhankelijke onderzoekers. Elke muis waar de 2 scores verschillen met meer dan 1 punt wordt opnieuw gereduceerd.
- De scores die verschillen zijn gemiddeld.
P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
Tabel 1: Beschrijving van Limb Clasping Scores.
Representative Results
Oudere Tg2576 muizen vertoonden robuuste tekorten in spontane alternaties die in een Y-doolhof 15 , 16 , een fenotype worden gemaakt die kunnen worden gerepliceerd onder toepassing van de hierin beschreven methoden ( Figuur 1A ). Terwijl een trend voor verhoogde arminvoeringen in deze muizen wordt waargenomen ( Figuur 1B ), heeft de hyperactiviteit waargenomen in deze lijn van muizen, de spontane wisselkoers niet beïnvloed ( Figuur 1C ). In tegenstelling, leeftijd rTg4510 muizen lijken te zien verhoogde spontane afwisseling wanneer geplaatst in een Y-doolhof ( Figuur 1D ). Dit komt door extreme hyperactiviteit ( figuur 1E ) en stereotypie 10 , die de spontane afwisseling meten significant beïnvloeden ( figuur 1F ). Bij de eerste beoordeling van muizen in deze taak is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat arminvoer en / of afgelegde reis niet isSignificant gecorreleerd met de spontane wisselkoers.
Voor de beoordeling van nieuwe objectherkenning worden muizen gewoond aan de arena waar de test zal worden uitgevoerd. Tijdens de werving kan hyperactiviteit ( figuur 2A ) en andere stereotype gedragingen die relevant zijn voor het muismodel worden beoordeeld. Tijdens de steekproeffase is het van cruciaal belang om afzonderlijk exploratie van elk voorwerp afzonderlijk te meten, zodat muizen die significante vooroordeel hebben in verkennend gedrag, uitgesloten kunnen worden van verdere evaluatie ( Figuur 2B , open cirkels). Nieuwe objectherkenning wordt beoordeeld door een verkenning van een bekend en nieuw object te vergelijken en wordt op drie verschillende manieren algemeen geanalyseerd. Als de totale verkennende tijd vergelijkbaar is tussen genotypen en / of behandelingsgroepen, dan kan rauwe tijd die elk object vergelijkt en een passende herhaalde meet test gebruikt worden om te bepalen of er verschillen waren in nieuw object rEcognitie ( figuur 2C ). Als een bepaalde muisstamper verschillen vertoont in de totale verkennende tijd, kan nieuwe objectherkenning worden beoordeeld met behulp van nieuwigheidsvoorkeur ( figuur 2D ) of discriminatie index ( figuur 2E ).
Limb clasping is een functionele motor test die de tekorten in corticospinale functie kwantificeert. Limb clasping, die geen cognitieve maatregel is, wordt waargenomen in verscheidene transgene tau muismodellen 6 , 17 , 18 , 19 en herhaalt enkele functionele motorische tekorten waargenomen in late-stadium AD patiënten. Suspensie van muizen door de staart ontstaat een ontsnappingsrespons ( Figuur 3A , "0"). Tekorten in het vermogen om de achterste ledematen te splitsen en de tenen uit te breiden worden op basis van hun ernst op een schaal van 0-4 gescoord ( figuur 3A). Met behulp van de hierin beschreven procedure kan men significante ledematen beklemmen in rTg4510-muizen ( Figuur 3B ).
Figuur 1: Spontane afwisseling in de Y-doolhof. ( A ) Wanneer ze in een Y-doolhof worden geplaatst, nemen muizen een losse-shift-zoekstrategie aan die resulteert in een exploratiepatroon waarbij elke arm slechts één keer wordt verkend voor elke 3 arminvoer. Oudere Tg2576 muizen vertoonden een significant tekort in spontane afwisseling. Met behulp van de procedures die in deze methode zijn beschreven, werd een significante restauratie van spontane afwisseling waargenomen na behandeling met een proprietary compound. Gegevens werden geanalyseerd met 1-weg ANOVA en post-hoc vergelijkingen met Tg-PBS werden uitgevoerd met behulp van Dunnett's test. ** p <0,01. Foutstaven geven SEM aan. ( B ) Het aantal arminvoeringen was niet significant verschillend over alleVan de groepen die in dit experiment werden gecontroleerd. Gegevens werden geanalyseerd met 1-weg ANOVA test. Foutstaven geven SEM aan. ( C ) Er was geen correlatie tussen spontane afwisseling en het aantal ingevoerde arminvoeringen, wat aangeeft dat eventuele verschillen in spontane lokomotorische activiteit geen kwantificering van spontane afwisseling hebben beïnvloed. Correlatie test werd uitgevoerd met behulp van Pearson's correlatie analyse. ( D ) Als er in een Y-doolhof wordt geplaatst, lijken rTg4510-muizen (6 maanden) aanzienlijk meer spontane afwisseling ten opzichte van WT-muizen met littermate te tonen. Gegevens werden geanalyseerd door 1-weg ANOVA en post-hoc vergelijkingen met Tg-PBS werden uitgevoerd met behulp van Dunnett's test. ** p <0,01. Foutstaven geven SEM aan. ( E ) rTg4510 muizen maakten aanzienlijk meer arminvoeringen door hun extreem hyperdynamische bewegingen. Gegevens werden geanalyseerd door 1-weg ANOVA en post-hoc vergelijkingen met Tg-PBS werden uitgevoerd met behulp van Dunnett's test. *** p <0.001. Foutstaven betekenen SEM. ( F ) Spontane afwisselingsgedrag significant gecorreleerd met arminvoeringen, wat het hyperdynamische locomotorische fenotype verduidelijkt verduisterde ware spontane afwisseling. Correlatietest werd uitgevoerd met behulp van Pearson's correlatieanalyse (r = 0,7, p <0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Novel Object Recognition. ( A ) Arena wabituation staat toe voor het meten van spontane bewegingen en andere stereotype gedragingen die relevant zijn voor een bepaald muismodel. Hier vertoont Tg2576-muizen (22 maanden) in de leeftijd aanzienlijk meer spontane locomotie ten opzichte van WT-muizen met littermate. Gegevens werden geanalyseerd door 1-weg ANOVA en post-hoc vergelijkingen met Tg-Veh werden uitgevoerd met behulp van Dunnett 'S test. ** p <0,01. Foutstaven geven SEM aan. ( B ) Tijdens de monsterfase werd exploratie van twee identieke objecten afzonderlijk gevolgd. Muizen die grote vooroordelen vertonen naar verkenning van één van de twee voorwerpen (open cirkels) werden uitgesloten van de testfase. ( C - E ) Nieuwe object herkenning werd beoordeeld door de verkenning van een nieuw en bekend object te meten. Nieuwe object herkenning werd beoordeeld met behulp van ( C ) rauwe exploratie tijd, ( D ) nieuwigheid voorkeur of ( E ) discriminatie index. Gegevens in paneel C werden geanalyseerd met behulp van een 2-way ANOVA met herhaalde maatregelen en pairwise vergelijkingen werden gemaakt met behulp van Sidak's test. Gegevens in panelen DE werden geanalyseerd met een 1-weg ANOVA en post-hoc vergelijkingen met Tg-Veh werden gemaakt met behulp van Dunnett's test. * P <0,05, ** p <0,01. Foutstaven geven SEM aan. Klik opHier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Limb Clasping. ( A ) Representatieve afbeeldingen van muizen die verschillende graden van ledematen bekleden, zoals beschreven in Tabel 1. ( B ) rTg4510 muizen (6 maanden), tonen significante ledematen in relatie tot littermate WT muizen, zoals getekend met behulp van deze methoden. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van een 1-weg ANOVA en post-hoc vergelijkingen met Tg-PBS werden uitgevoerd met behulp van Dunnett's test. *** p <0,001, **** p <0,0001. Foutstaven geven SEM aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande methoden
Deze procedure is ontworpen om te screenen voor in vivo activiteit van verbindingen in transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie. De hier in gebruik getreden benadering zorgt voor detectie van effectieve verbindingen in cognitieve domeinen die relevant zijn voor AD 3 . Bovendien gebruikt de hier beschreven aanpak gedragstesten die duidelijk gedefinieerde eindpunten hebben, gemakkelijk te implementeren kwaliteitscontroles, kunnen worden uitgevoerd in een gematigd doorvoervorm, en vereisen weinig interventie van de onderzoeker. Deze eigenschappen resulteren in analyses die goede reproduceerbaarheid vertonen binnen dieren en over cohorten, wat resulteert in lage intra- en interassay variantie en effectgroottes (2 ≤ f ≤ 6 ) die robuust genoeg zijn om gedragsprofielen te ondersteunen in een drug ontdekkingsomgeving.
Critische stappen binnen de Protocol
Veel muismodellen in gebruik voor AD drug ontdekking tonen gedrag in overeenstemming met verhoogde angst en agressie. Dit maakt het hanteren van wabituatie essentieel voor het uitvoeren van een van de hier beschreven gedragstests. Aangezien deze tests afhankelijk zijn van ongemotiveerd gedrag, kan ruwe behandeling door de onderzoeker door een hyperactieve en angstige of agressieve muis de prestatie aanzienlijk beïnvloeden. Verhoogde angst kan resulteren in het niet uitvoeren van de taak, waardoor de totale kracht van de test wordt verminderd. Bovendien zijn lichte niveaus in de arena essentieel voor het vergemakkelijken van de spontane beweging die nodig is voor elke test. Helder licht heeft de neiging om angst te verhogen en de voortbeweging bij knaagdieren te onderdrukken. Daarom moet er rekening worden gehouden met omgevingslichtniveaus tot 30-35 lux in de arena.
Een ander kritisch aspect van de procedure is het minimaliseren van sterke milieueisen die het vermogen van een dier om de taken te verrichten zouden kunnen bemoeien. Reiniging van deArena en voorwerpen tussen ritten is essentieel, omdat muizen aangetrokken zijn tot nieuwe geuren in het milieu. Als de arena niet grondig wordt gereinigd en objecten kunnen leiden tot spontane werking van de muis en de ware cognitieve prestaties maskeren. Onderzoekers moeten ook bij het uitvoeren van deze procedures gebruik maken van persoonlijke hygiëneproducten en colognes / parfums. Ten slotte vertoont knaagdieren robuuste dag- en circadiaanse veranderingen in veel open gedrag 20 waaronder leer en geheugen 21 . Daarom, om de variatie te beperken als gevolg van dagritmes in basaal gedrag en cognitieve prestaties, moeten alle tests op hetzelfde moment van de dag plaatsvinden over cohorten en studies.
Verder, met betrekking tot nieuwe objectherkenning, zijn de vertragingsinterval tussen sample en testfase en de selectie en plaatsing van objecten in de omgeving kritieke parameters. Geheugen bestaat in 3 verschillende vormen: korte termijn memOry (STM), intermediair term geheugen (ITM) en langdurig geheugen (LTM) 22 , 23 . Als u het interval tussen sample en testfases van minuten (STM) naar uren (ITM) of dagen (LTM) wijzigt, verandert het type geheugen dat wordt getest volgens de procedure 12 . Bovendien, voor het uitvoeren van de nieuwe object herkenningstest, moeten veel objecten worden gescreend in een testcohort van muizen voor potentiële vooroordeel bij exploratie. Een object dat overmatig aantrekkelijk of afstotend is voor de testcohort kan niet worden gebruikt bij het beoordelen van nieuwe objectherkenning. Ideaal gezien zullen alle objecten die in de test worden gebruikt, in een arena worden geplaatst, gelijke verkenningstijden opleveren uit een naïeve cohort muizen. Onvoldoende testen en optimaliseren van objecten kunnen de kracht van nieuwe objectherkenning aanzienlijk verminderen.
Wijzigingen en probleemoplossing
Er zijn verschillende factoren die het kunnen verhogenSchijnbare variabiliteit in de hier beschreven cognitieve tests. Veel muismodellen van AD tonen hyperdynamische locomotie 3 die gedrag kan gemeten of wijzigen, gemeten als het cognitieve eindpunt. Bovendien is er steeds meer bewijs dat seks 24 , 25 , 26 en zelfs genotype 27 van de moeder de ontwikkeling en progressie van neuropathologie en cognitieve fenotypen in AD-muismodellen kan beïnvloeden. Ongewenste variabiliteit of het niet uitvoeren van een gedragstaken kan het gevolg zijn van een van deze factoren. Bij de eerste implementatie van een bepaalde gedragstest dienen de resultaten altijd gestratificeerd te worden door geslacht, leeftijd en, indien van toepassing, moedergenotype. Bovendien moeten de kwaliteitscontroles die in deze procedure worden beschreven, altijd worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat hyperactiviteit of ander stereotype gedrag niet inbreuk maakt op kwantificering van cognitieve eindpunten.
envIrrigatie kan ook het spontane verkennende gedrag van knaagdieren beïnvloeden. Geuren of geluiden die niet door onderzoekers kunnen worden gedetecteerd, zouden muizen kunnen aantrekken of afstoten, scheve resultaten van cognitieve tests die op spontane gedragingen vertrouwen. Bij het oprichten van Y-doolhof of nieuwe objectherkenning is het noodzakelijk om de controlemaatregelen te verrichten om ervoor te zorgen dat er geen positiebeperkingen zijn bij het verkenning van objecten en / of milieu. Als er positiebeperkingen worden waargenomen, moeten de onderzoekers het milieu grondig onderzoeken en mogelijk verlichting, arena-plaatsing, locatie van de testkamer in vergelijking met andere ruimten in de faciliteit aanpassen ( dwz niet in de buurt van een hoge traject of zware apparatuur) en arena-reinigingsprocedures.
Houding van de testomgeving is essentieel voor het bereiken van optimale prestaties in de nieuwe objectherkenningstest. Bijvoorbeeld, lage totale exploratietijden kunnen het gevolg zijn van een onvoldoende werving. Als alternatief voor de procUitwerkingen die hier beschreven zijn voor de behandeling (sectie 2) en arena (sectie 4.2), wabituation to handling en de testomgeving kunnen gedurende 2 opeenvolgende dagen als 3, 5 minuten sessies per dag worden uitgevoerd.
Beperkingen van de techniek
Zoals bij elke procedure hebben deze gedragstests beperkingen. Deze procedures zijn toegepast omdat ze de functie van verschillende corticale gebieden en hippocampus testen. Als het muismodel geen functionele tekorten vertoont in hersengebieden die door deze tests worden getest, dan zijn deze technieken niet bruikbaar. Daarnaast hebben we cognitieve tests gekozen die korttermijn herinneren. Als het werkingsmechanisme van de verbinding onder de preklinische beoordeling niet wordt verwacht dat het kortetermijngeheugen wordt beïnvloed, dienen deze procedures dienovereenkomstig te worden gewijzigd ( dwz het verhogen van het monster-testfaseinterval om het langetermijngeheugen te testen). Ten slotte gebruiken deze tests ongemotiveerd gedrag. Daarom, als een muismodel exces isHyperactief of andere stereotype gedragingen vertoont die de verkenning van het milieu voorkomen, dan zijn deze procedures mogelijk niet optimaal. Als alternatief kan men angstconditionering gebruiken voor Tg2576 of andere β-amyloïdose-muismodellen, of het ruimtelijke waterdoolhof voor rTg4510 of andere muismodellen van tauopathie 3 .
Toekomstige Toepassingen
Zodra deze procedures succesvol zijn aangenomen in het laboratorium, kunnen verschillende wijzigingen of uitbreidingen worden aangebracht om aanvullende cognitieve en functionele motorische maatregelen te beoordelen. Bijvoorbeeld, het wijzigen van de nieuwe object herkennings taak om te bepalen of een muis een verandering in de plaatsing van een object kan herkennen 13 . Alternatief, in plaats van objecten te gebruiken, kan men andere muizen gebruiken en een test van sociale erkenning uitvoeren. Met betrekking tot de ledematen en motorfunctie kan men die test aanvullen met de draadhangen en / of gripstesttests. De testenGedetailleerd in deze methode vormen een solide basis om te screenen voor verbindingen die in vivo werkzaamheid hebben in translational muismodellen voor AD en kunnen op vele manieren aangepast of aangepast worden om een bepaald muismodel het beste te onderzoeken of aan de behoeften van een unieke drug ontdekkingsprogramma te voldoen .
Disclosures
JM Levenson is werkzaam bij Proclara Biosciences, Inc. C. Miedel, J. Patton, A. Miedel en E. Miedel zijn werkzaam bij Hilltop Laboratory Animals.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77 (1), 69-81 (2010).
- Onos, K. D., Sukoff Rizzo, S. J., Howell, G. R., Sasner, M. Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 122, 1-11 (2016).
- Webster, S. J., Bachstetter, A. D., Nelson, P. T., Schmitt, F. A., Van Eldik, L. J. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 5, 88 (2014).
- Rodgers, S. P., Born, H. A., Das, P., Jankowsky, J. L. Transgenic APP expression during postnatal development causes persistent locomotor hyperactivity in the adult. Mol Neurodegener. 7, 28 (2012).
- Hsiao, K., et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274 (5284), 99-102 (1996).
- Santacruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd edn. , Wiley-Interscience. (2007).
- Hughes, R. N. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory. Neurosci Biobehav Rev. 28 (5), 497-505 (2004).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Centers for Disease Control. , (2008).
- Wes, P. D., et al. Tau overexpression impacts a neuroinflammation gene expression network perturbed in Alzheimer's disease. PLoS One. 9 (8), 106050 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., Dineley, K. T. Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav Brain Res. 200 (1), 95-99 (2009).
- DeVito, L. M., Eichenbaum, H. Distinct contributions of the hippocampus and medial prefrontal cortex to the "what-where-when" components of episodic-like memory in mice. Behav Brain Res. 215 (2), 318-325 (2010).
- Lalonde, R., Strazielle, C. Brain regions and genes affecting limb-clasping responses. Brain Res Rev. 67 (1-2), 252-259 (2011).
- King, D. L., Arendash, G. W. Behavioral characterization of the Tg2576 transgenic model of Alzheimer's disease through 19 months. Physiol Behav. 75 (5), 627-642 (2002).
- Lalonde, R., Lewis, T. L., Strazielle, C., Kim, H., Fukuchi, K. Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res. 977 (1), 38-45 (2003).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25 (4), 402-405 (2000).
- Spittaels, K., et al. Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein. Am J Pathol. 155 (6), 2153-2165 (1999).
- Terwel, D., et al. Changed conformation of mutant Tau-P301L underlies the moribund tauopathy, absent in progressive, nonlethal axonopathy of Tau-4R/2N transgenic mice. J Biol Chem. 280 (5), 3963-3973 (2005).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Rep. 6 (10), 930-935 (2005).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behav Neurosci. 128 (3), 283-303 (2014).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Stough, S., Shobe, J. L., Carew, T. J. Intermediate-term processes in memory formation. Curr Opin Neurobiol. 16 (6), 672-678 (2006).
- Stevens, L. M., Brown, R. E. Reference and working memory deficits in the 3xTg-AD mouse between 2 and 15-months of age: a cross-sectional study. Behav Brain Res. 278, 496-505 (2015).
- Yue, X., et al. Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19198-19203 (2005).
- McAllister, C., et al. Genetic targeting aromatase in male amyloid precursor protein transgenic mice down-regulates beta-secretase (BACE1) and prevents Alzheimer-like pathology and cognitive impairment. J Neurosci. 30 (21), 7326-7334 (2010).
- Blaney, C. E., Gunn, R. K., Stover, K. R., Brown, R. E. Maternal genotype influences behavioral development of 3xTg-AD mouse pups. Behav Brain Res. , 40-48 (2013).
