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Biology

CAPRRESI：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ

Published: June 25, 2017 doi: 10.3791/55526
Automatic Translation
1, 2, 3
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Oncomedic Incorporation, Ciudad de México, 3Laboratorio Internacional de Investigación sobre el Genoma Humano, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

ここでは、同義語DNA配列への制限酵素部位の挿入および機能的プラスミド回収に基づくプロトコルであるプラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。このプロトコールは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。

Abstract

ここでは、プラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。 CAPRRESIは、元のプラスミド回収法の多くの利点から利益を得、制限酵素消化を導入してDNAライゲーション反応を容易にする（キメラアセンブリに必要とされる）。このプロトコルでは、ユーザーは野生型遺伝子を同じプラスミド（pUC18またはpUC19）にクローニングします。キメラが組み立てられるべきアミノ酸配列領域のin silico選択の後、ユーザーはそれらをコードするすべての同義語DNA配列を得る。 Ad Hoc Perlスクリプトを使用すると、ユーザーはすべてのシノニムDNA配列を決定できます。このステップの後、別のPerlスクリプトは、すべての同義語DNA配列上の制限酵素部位を検索する。このin silico分析はまた、pUC18 / 19プラスミド上に見出されるアンピシリン耐性遺伝子（ ampR ）を用いて行われる。ユーザは、野生型およびampR遺伝子をPCRによって破壊するために同義語領域内のオリゴヌクレオチドを設計する。 obtの後相補的なDNA断片を精製し、精製し、制限酵素消化を行う。適切な相補的DNA断片を連結することにより、キメラ構築が達成される。 CAPRRESIのために、小さいサイズ（2,686塩基対）、高いコピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的入手可能性などの技術的利点を提供するため、pUC18 / 19ベクターが選択される。キメラ構築のための制限酵素の使用は、平滑末端生成物を産生するDNAポリメラーゼの必要性を排除する。 CAPRRESIは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。

Introduction

キメラ遺伝子アセンブリは、タンパク質機能を解明するため、および/またはバイオテクノロジー目的のために、分子生物学において広く使用されている。重複するPCR産物増幅1 、プラスミド回収2 、相同組換え3 、CRISPR-Cas9システム4 、部位特異的組換え5 、およびギブソンアセンブリ6のような、遺伝子を融合させるための異なる方法が存在する。これらはそれぞれ異なる技術的利点を提供します。例えば、重複PCR設計の柔軟性、プラスミド回収中の構築物のインビボ選択、またはCRISPR-Cas9およびGibsonシステムの高効率などである。一方、これらの方法のいくつかを実行している間にいくつかの困難が生じることがあります。例えば、最初の2つのアプローチは、平滑末端DNAフラグメントに依存しており、これらのタイプの産物のライゲーションは、sticに比べて技術的に困難であり得るky-endedライゲーション。 部位特異的組換えは、Cre- loxPシステム5のように、オリジナルに余分なDNA配列（傷跡）の痕跡を残す可能性があります。 CRISPR-Cas9は、標的部位4に加えて他のゲノム領域を修飾することがある。

ここでは、プラスミド回収法（PRM）と同義DNA配列に制限酵素部位を挿入し、ライゲーション効率を向上させたタンパク質コード遺伝子を融合させるプロトコールであるプラスミド回収と制限酵素サイト挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを紹介する。アミノ酸配列の完全性を保証するために、制限酵素部位を同義語DNA配列のストレッチ上に挿入する。 CAPPRESIの利点の中には、通常の実験用試薬/ツール（ 例えば 、酵素、コンピテントセル、溶液、サーモサイクラー）を使用して行うことができ、迅速な結果を得ることができるという点が挙げられます。制限に依拠する同義語DNA配列から出現する酵素部位は、目的のタンパク質内の正確な融合点の選択を制限し得る。そのような場合、重複するオリゴヌクレオチドを用いて標的遺伝子を融合させ、制限酵素部位をベクターの耐性遺伝子上に挿入しなければならない。

CAPRRESIは、7つの簡単なステップ（ 図1 ）からなる：1）クローニングベクターpUC18またはpUC19 6の選択 ; 2）融合される野生型配列のin silico分析; 3）キメラアセンブリおよびプラスミド破壊のための破壊領域の選択; 4）制限酵素部位を含む同義語DNA配列のin silico生成; 5）選択されたプラスミドへの野生型遺伝子の独立したクローニング; 6）PCRによるプラスミド破壊、続いて制限酵素消化;および7）DNA連結および細菌形質転換を用いたプラスミド回収。この技術によって産生されるキメラ遺伝子は、i番目のシーケンス。

pUC18 / 19ベクターは、小型（ すなわち、 2,686塩基対）、高コピー数、有利な配列決定反応特徴および商業的利用可能性などのクローニングおよびキメラアセンブリーに技術的利点をもたらす。ここでは、 大腸菌（Escherichia coli）宿主を用いて、バクテリアの培養物が安価で増殖が速いため、キメラを組み立てて取り扱う。このことを考慮して、最終標的プラスミドへの融合断片のその後のクローニングが必要となる（ 例えば、細菌におけるpRK415としての発現ベクターまたは哺乳類細胞におけるpCMVとしての発現ベクター）。

CAPRRESIは、2つの主要なシグマ因子遺伝子、 E. colirpoDおよびRhizobium etlisigAを融合させるために試験された。一次シグマ因子は、転写開始に関与するRNAポリメラーゼサブユニットであり、4つのドメイン（ すなわち、 σ1、σ2、σ3、およびσ4） 8からなる 。アミノ酸配列の長さrpoDおよびsigAによってコードされるタンパク質はそれぞれ613および685である。 RpoDとSigAは48％の同一性（98％のカバレッジ）を共有します。これらの一次シグマ因子は、領域σ2とσ3との間で2つの相補的フラグメントに分割された。キメラ01（RpoDσ1-σ2+SigAσ3-σ4）およびキメラ02（SigAσ1-σ2+RpoDσ3-σ4）の2つのキメラ遺伝子をこのデザインに従って組み立てた。 DNA融合産物は、配列決定によって確認した。

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Protocol

1. CAPRRESIプロトコル

注： 図1はCAPRRESI全体のプロトコルを表しています。この技術は、インシリコの設計およびその後の所望のキメラの構築に基づいている。

  1. クローニングプラスミド、pUC18またはpUC19の選択。
    1. 技術的要求に最も合ったpUCベクターを選択してください。
      注：両方のベクターは、複数のクローニングサイトの向きを除いて、同じシーケンスを持っています。これは、オリゴヌクレオチドの設計およびPCRプラスミド破壊のために重要である。
  2. 野生型遺伝子およびpUC18 / 19配列のインシリコ分析。
    1. 野生型遺伝子のDNA配列を入手し、FASTAフォーマットファイル（ 例えば、 genes.fas）に保存する。
      注：pUC18 / 19ベクターの配列はpUC.fasファイルに含まれています（ 図1 、ステップ1）。
    2. どの制限ENZを決定するymesはREsearch.plスクリプトを実行して野生型遺伝子とpUC18 / 19配列を切断しません。あるいは、オンラインツール（ 図1 、ステップ2）を用いて制限酵素部位検索を行う。
      1. 端末に次のように入力します。
        perl REsearch.pl遺伝子
        perl REsearch.pl pUC.fas
        注：これらのコマンドは、次の出力ファイルを作成します：genes_lin.fas、genes_re.fas、pUC_lin.fas、およびpUC_re.fas。
      2. genes_re.fasおよびpUC.fasファイルを比較することにより、野生型遺伝子を選択したpUC18 / 19ベクターのマルチクローニングサイトにクローニングするための適切な制限酵素を選択する。 pUC18 / 19ベクターのアンピシリン耐性遺伝子（ ampR ）に対するインサートの向きを選択してください。
    3. 野生型遺伝子（外部オリゴヌクレオチド）のコード領域を増幅するためのフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを設計する。各5 '末端に適切な制限酵素部位を含めるのオリゴヌクレオチド;これは挿入方向を定義します。
      1. フォワードオリゴヌクレオチドに機能性リボソーム結合部位を含める。
      2. 両方の野生型遺伝子をベクター内の同じ向きで挿入する。
  3. キメラアセンブリおよびプラスミド破壊のための破壊領域の選択。
    1. translate.plスクリプト（ 図1 、ステップ3）を実行して、野生型およびampR遺伝子のアミノ酸配列を取得します。
      1. 端末に次のように入力します。
        perl translate.pl遺伝子
        perl translate.pl ampR.fas
        注：このスクリプトは、次の出力ファイルを作成します：genes_aa.fasおよびampR_aa.fas。
    2. 2つの野生型アミノ酸配列を適切なソフトウェア（ 例えば、 MUSCLE） 9とグローバルに整列させる。
    3. キメラasseのための望ましい区切り領域（3〜6アミノ酸）を選択してください配列アラインメントに基づくmbly。 FASTA形式のファイル（ 例： regions.fas）に保存します。
    4. 両方の野生型遺伝子上の選択されたアミノ酸ストレッチをコードするDNA配列を見つける。
  4. 制限酵素部位を含む同義語DNA配列のin silico生成
    1. 破壊領域として選択された各アミノ酸配列ストレッチをコードするすべての同義語DNA配列を得る（ 図1 、工程4）。これらの配列はregions.fasファイルに格納されていました。
      1. 端末に次のように入力します。
        perl synonym.pl regions.fas
        注：このスクリプトはregions_syn.fas出力ファイルを作成します。
    2. シノニムDNA配列上に見出される制限酵素部位を検索する。
      1. ターミナルに次のように入力します： perl REsynonym.pl regions_syn.fas
        注：このスクリプトはregions_syn-re.fas出力ファイルを作成します。
    3. 両方の野生型遺伝子の同義語配列の間で共有される1つの制限酵素を選択する;このサイトは、制限酵素消化によるキメラの構築に使用されます。選択された制限酵素が野生型遺伝子またはpUC18 / 19ベクター配列のいずれも切断しないことを確認する。
      1. genes_re.fas、pUC_re.fas、およびregions_syn-re.fasファイルにある制限酵素を比較してください。
    4. インシリコでは、両方の野生型遺伝子の対応する遺伝子座で、同義語のDNA配列をオリジナルに置き換えます。シノニムDNA配列を野生型配列ファイル（genes.fas）に付加する。
    5. 遺伝子に含まれる遺伝子のアミノ酸配列を得る。ファイル（ perl translate.pl genes.fas ）。
    6. 野生型および同義語DNA配列から翻訳されたアミノ酸配列を整列させる。両方のシーケンスが同じであることを確認します。
    7. pU上に存在するampR遺伝子を用いて、このセクションのすべてのステップを繰り返すC18 / 19ベクター。
      注：目的は、 ampR遺伝子（ampR.fasファイル）を2つの相補的な部分に分けることです。 ampR遺伝子を破壊するように選択された制限酵素は、キメラ構築に使用される制限酵素とは異なるはずである。
  5. 選択されたpUC18 / 19ベクターへの2つの野生型遺伝子の独立したクローニング（図1、ステップ3）。
    1. 選択したpUC18 / 19プラスミドDNAをプラスミドDNA精製キットを用いて精製する。
      1. 例えば、pUC18プラスミドで大腸菌 DH5αを形質転換し、形質転換体を固体LB-0.3mg / mLアンピシリン（Amp）上で37℃で一晩増殖させる。形質転換コロニーを選択し、新しいLB-0.3 mg / mL Ampプレートに接種し、37℃で一晩増殖させます。
      2. 以前の培養物の一部をとり、37℃で6〜8時間液体LB-0.3 mg / mL Ampで増殖させます。キットを使用してプラスミドDNAを抽出する。
    2. アプロープを用いて、全ゲノムDNAから野生型遺伝子をPCR増幅する外部オリゴヌクレオチドを産生する。可能であれば、忠実度の高いDNAポリメラーゼを使用してください。収量を最大にするDNAポリメラーゼを選択してください。製造業者のガイドラインおよびオリゴヌクレオチドの融解温度に従ってPCRを実施する。
      1. 使用されるDNAポリメラーゼ、アンプリコンサイズ、鋳型、およびオリゴヌクレオチドに依存して、PCRサイクルを実行する。例えば、 rpoD DNAを増幅するには、5μLの10×バッファー、2μLの50mM MgSO 4、1μLの 10mM dNTPミックス、2μLの各10μMオリゴヌクレオチド（表2）、2鋳型DNA（ 大腸菌 DH5α総DNA）μL、超純水35.8μL、高忠実度DNAポリメラーゼ0.2μLを添加した。次のPCRサイクルを実行します：94℃で1分間の変性後、30サイクルの増幅（変性のために94℃で30秒間、オリゴヌクレオチドをアニールするために60℃で30秒間、および68℃で2分間）拡張します）。
      2. 1.2gのアガロースを100mLの二重蒸留水に入れてマイクロ波で加熱する。ゲルトレーと櫛を組み立てて水平ゲルキャスターに入れます。ゲルトレーに融解したアガロース溶液を満たし、凝固させます。櫛を取り外します。
      3. ゲルを電気泳動チャンバーに入れる。 1×Tris-アセテート-EDTA緩衝液でチャンバーを満たす。 50μLのPCR産物をゲルウェルにロードする。試料を電気泳動させる（ 例えば 、110Vで1時間）。
      4. 電気泳動後、100μLの1mg / mLエチジウムブロマイド溶液100μLを含む二重蒸留水100mL中でゲルを10分間ゆっくり振とうしながら染色する。緩やかに振盪しながらゲルを二重蒸留水中でさらに10分間洗浄する。水平シェーカーを使用してください。
        注意：臭化エチジウムは毒性化合物です。保護手袋と綿の実験用コートを着用してください。
      5. キットを用いてゲルの対応するバンドから野生型遺伝子DNAを精製する。染色されたゲルをUVチャンバーに入れてバンドを可視化する（推奨波長：300nm）。ゲルの露出を最小限に抑えてください。 DNA精製キットを使用し、製造元の指示に従ってください。
        注意：紫外線は危険です。保護盾、眼鏡、綿の実験用コートを着用してください。
    3. 精製された野生型遺伝子およびpUC18 / 19プラスミドDNAを制限酵素で製造者の指示に従って消化する。可能であれば、速やかな消化酵素を使用する。例えば、10μLの超純水、2μLの10X緩衝液、1μLのKpn I制限酵素、および1μLのXbaI制限酵素中の6μLのpUC18 DNA（300ng /μL）を消化する。反応液を37℃で30分間放置する。
      1. 製造業者のガイドラインに従って制限酵素を不活性化する。例えば、二重消化反応Kpn I- Xba Iを80℃で5分間不活性化する。
    4. ミックスインサート：容積比でのベクターDNA3：1である。ライゲーション反応については、製造元の指示に従ってください。可能であれば高速ライゲーション酵素を使用する（25℃で10分間反応させたままにする）。
      注：通常、キットを使用した精製後のDNA濃度は、消化およびライゲーション反応に十分適しています。例えば、 6μLのrpoD DNA（ Kpn I- Xba I、150ng /μL）、 3μLのpUC18 DNA（ Kpn I- Xba I、150ng /μL）、2μlの緩衝液10μL、1μLの超高純度水、および1μLのT4 DNAリガーゼを含む。連結反応を25℃で10分間放置する。
    5. 補足資料に記載されているように、2〜4μLのライゲーション反応で大腸菌 DH5αを形質転換する。形質転換細胞を固体LB / Amp / X-gal / IPTGプレートにプレートする。プレートを37℃で一晩放置する。
    6. 白色形質転換大腸菌コロニーを選択し、それらを新しいLB / Ampプレート上にストリークする。プレートを37℃で一晩放置する</ li>
    7. 補足資料に記載されているように、反応を配列決定するための候補を選択するためにコロニーPCRを行う。候補からプラスミドDNAを抽出する。あるいは、インサートをクローニングするために使用したのと同じ制限酵素で候補プラスミドDNAを消化する。
    8. シークエンシングサービスプロバイダ10を有するシークエンス候補構築物。 DNAアセンブラ11 （ 図1 、ステップ5）を使用して、in silicoでシークエンスを組み立てます。
  6. PCRによるプラスミド破壊、続いて制限酵素消化。
    1. 野生型およびampR遺伝子のための破壊領域での、それぞれin silicoフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドの設計。対応する同義語DNA配列（ステップ1.4で得られた）の野生型フラグメントをin silicoで置換する 。
      注：このシノニムDNA配列には制限酵素サイトが含まれています。順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドは、t彼は制限酵素部位である。オリゴヌクレオチドは、21〜27ヌクレオチドの範囲にあり、シトシンまたはグアニンで終わり、制限酵素部位を含むべきである。フォワードオリゴヌクレオチドは、鋳型DNA上のその標的領域と同じ配列を有する。逆方向オリゴヌクレオチドは、鋳型DNA上の標的領域の逆相補配列である。
    2. 2つの野生型遺伝子構築物をPCR反応のDNA鋳型として用いる（ 例えば、 pUC18 rpoDおよびpUC18 sigA ）。 pUC18 rpoDσ1 -σ2、pUC18 rpoDσ3 -σ4、pUC18 sigAσ1 -σ2、およびpUC18 sigAσ3 -σ4の2つの補完部分を得る（ 図1 、工程6）。
    3. DNAサンプルを1〜1.2％[w / v]のアガロースゲルにロードする。 PCR産物を電気泳動（ 例えば、 110Vで1時間）によってDNA鋳型から分離する。あるいは、PCR反応をDpnIで消化してDNA鋳型を破壊する。
      注： DpnI酵素はメチル化DNA配列（5'-GATC-3 '）のみを認識する。
      1. DNA精製キットを使用してサンプルを精製する。製造元のガイドラインに従ってください。
    4. 製造元の指示に従って適切な制限酵素ですべての相補的DNA断片を二重消化する。可能であれば、速ダイジェスト制限酵素を使用する。例えば、製造者のプロトコールを用いて、AflIIおよびSpeIでpUC18rpoDσ1-σ2DNA断片を二重消化する。消化反応を37℃で15分間放置する。
    5. 製造業者のガイドラインに従って制限酵素を不活性化する。例えば、 AflII- Spe Iを80℃で20分間不活性化する。
  7. DNAライゲーションおよび細菌形質転換を用いたプラスミド回収。
    1. 適切なDNA断片を容積1：1の比で混合して、所望のキメラ遺伝子を構築する（ 図1、ステップ7）。
      注：このようにして、 ampR遺伝子の完全性が回復し、機能性タンパク質が産生される。
      1. 例えば、4μLのpUC18 rpoDσ1 - σ2DNA （ AflII - SpeI 、150ng /μLで消化）、4μLのpUC18 sigAσ3 - σ4DNA （ AflII - SpeI 、150ng /μL）を混合する。 2×緩衝液10μL、超純水2μL、T4 DNAリガーゼ1μL;キット精製後のDNA濃度は、消化およびその後のライゲーションに十分適しています。ライゲーション反応を25℃で10分間放置する。
    2. 3〜5μLのキメラアセンブリライゲーション反応（補充物質）を用いて大腸菌 DH5αを形質転換する。形質転換細胞をLB / Amp / X-gal / IPTGプレートで一晩37℃で一晩増殖させる。
    3. 白色形質転換大腸菌コロニーを選択し、それらを新しいLB / Ampプレート上にストリークする。 37時には一晩放置する℃。
    4. 補足資料に記載されているように、コロニーPCRを行い、シークエンシング反応の候補を選択する。電気泳動（2.3.2.1項を参照）を行うことにより、バンドを1-1.2％（w / v）アガロースゲルで可視化します。
    5. 積極的な候補者から文化を成長させる。プラスミドDNA精製キットを使用してそれらからプラスミドDNAを抽出する。

2.配列候補キメラ構築物

  1. プラスミドDNAの品質が、配列サービス提供者のガイドラインに従って、配列決定反応に十分良好であることを確認する。精製キットを使用してDNAを抽出する。例えば、配列サービスプロバイダーのインターネットページでは、サンプルに推奨されるDNA濃度に特に注意してください。 DNA定量装置を用いてサンプルの濃度を得る。
  2. シークエンシングサービスプロバイダ10を有するシークエンス候補キメラ構築物。
  3. 組み立てる in silico DNAアセンブラ11を使用して読み取りを開始します。
  4. 配列アラインメントツール9,12を使用して、組み立てられた対インシリコ設計キメラ配列を整列させる。キメラ遺伝子が正常に融合したことを確認する。

3.準備をする

注：生きている細胞を含むすべてのステップは、ブンゼンバーナーが付いているきれいな層流フードで実行する必要があります。

  1. E.coliDH5α-コンピテント細胞を産生する。
    1. 大腸菌 -コンピテント細胞を作製するためには、公表されたプロトコール13に従うか、 補足資料を参照のこと。あるいは、市販のコンピテントセルを使用してください。
  2. 形質転換大腸菌 DH5αコンピテント細胞。
    1. 大腸菌 （ E. coli）培養物の化学的形質転換については、公表されたプロトコールclass = "xref"> 13または補足資料を参照してください。あるいは、細菌の形質転換にエレクトロポレーションを使用する。市販のコンピテントセルを使用する場合は、製造元のガイドラインに従ってください。
  3. 大腸菌 DH5αからのゲノムDNAおよびプラスミドDNAの精製。
    1. 補足資料に記載されているように、市販のキットを使用するか、公表されたプロトコールに従って核酸抽出を行う。
  4. コロニーPCRを行う。
    1. この技術を使用して、後続の配列決定反応の候補形質転換コロニーを同定する。
      注：このメソッドは、シーケンスの完全性の最終的な検証を表すものではありません。このテクニックの詳細な説明は補足資料にあります。
  5. ソリューションの準備。
    1. 見る
  6. CAPRRESIプロトコルに必要なスクリプトとシーケンスファイルをダウンロードしてください。
    1. 目的の種の完全なゲノム配列を含む遺伝子バンクファイルをダウンロードし、ゲノムブラウザを用いて選択した遺伝子のDNA配列を抽出し、fastaファイルフォーマットで保存する。 CAPRRESIプロトコルに必要なPerlスクリプトをダウンロードしてください。スクリプトとシーケンスファイルを同じディレクトリに格納します。

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Representative Results

図1に CAPRRESIを示します。この方法を用いて、2つの細菌の一次シグマ因子（ すなわち、大腸菌 RpoDおよびR. etli SigA）のドメインを交換することによって、2つのキメラ遺伝子を組み立てた。 rpoDおよびsigA遺伝子のDNA配列は、それぞれGenBankゲノムファイルNC_000913およびNC_007761からArtemis Genome Browser 14を使用して得た。 pUC18ベクターのDNA配列は、NCBIサーバーのヌクレオチドデータベースから得た。 インシリコ（in silico）分析は、REsearch.pl Perlスクリプト（ステップ1.2.2参照）を実行することにより、DNA配列に対して制限酵素部位を分析した。これらの結果をオリゴヌクレオチド設計に使用した（工程1.2.3）。外部オリゴヌクレオチドは、野生型遺伝子をpUC18多重クローニング部位にクローニングするためのXbaIおよびKpnI制限酵素の認識部位を含んでいた。フォワードオリゴヌクレオチドはまた、リボいくつかの結合部位（ 表2 ）。 LB / Nalブロス（37℃、 220〜250rpm ）で増殖させた大腸菌 DH5α細胞およびPY / Nal / CaCl 2ブロス（30℃、 220〜250rpm ）で増殖させたR. etli CFN42細胞からゲノムDNAを抽出した）。これらの試料を、野生型遺伝子増幅のためのDNA鋳型として使用した（工程1.5.2）。

野生型遺伝子を、アガロースゲル（DNA精製キット）から精製し、 KpnI - XbaI制限酵素で二重消化し、pUC18ベクターにクローニングしたTaq高忠実度DNAポリメラーゼを用いて増幅した。化学的にコンピテントな大腸菌 DH5α細胞を、野生型構築物pUC18 rpoDおよびpUC18 sigA （ステップ1.5.5）に対応する5μLのライゲーション反応で形質転換した。形質転換細胞を、37℃で増殖させた固体LB / Amp / X-gal / IPTGプレート上で選択した。野生型の構築はSanger sequencによって検証された10 。サンガー配列の読み取りは、 MIRA 11を用いてインシリコで組み立てられた（ステップ1.5.8）。

野生型遺伝子由来のアミノ酸配列は、translate.plスクリプトを実行することによって得られた（ステップ1.3.1）。野生型遺伝子をClustal12と整列させた後、アミノ酸領域TLVおよびNLRをそれぞれアンピシリン耐性遺伝子（ ampR ）および野生型一次シグマ因子（ステップ1.3.3）で選択した。これらのアミノ酸領域は、synonym.plスクリプトを実行することによってそれらをコードする可能性のあるすべてのDNA同義語配列を計算するために使用された（ステップ1.4.1）。 REsynonym.plスクリプトは、以前に生成された同義語DNA配列上に見出される制限酵素部位を検索した（ステップ1.4.2）。野生型配列と比較して最も少ない数の変化を導入したそれらの同義語領域が選択された。一次シグマ因子遺伝子については、Rpの野生型配列oD（AACTTACGT）およびSigA（AACCTTCGC）をAA CTTAAG Gと交換した。後者はAfl II部位（太字）を含んでいた。 ampR遺伝子については、野生型配列ACGCTGGTGを同義語AC ACTAGT Gと交換した。ampR遺伝子に挿入された同義語DNA配列はSpeI部位（太字）を含んでいた。対応するシノニム配列の野生型のin silico置換を行って、配列完全性およびオリゴヌクレオチド設計を検証した（ステップ1.2-1.4）。

同義語配列の変化は、適切なオリゴヌクレオチド（ 表2 ）および野生型構築物をDNA鋳型として用いてPCRによって導入された（工程1.5.2）。増幅反応は、4つの相補的部分：pUC18 rpoDσ1 -σ2、pUC18 rpoDσ3 -σ4、pUC18 sigAσ1 -σ2、およびpUC18 sigAσ3 -σ4を産生した 。相補的な部品disシグマ因子だけでなく、 ampR遺伝子も破壊した。相補的な部分をDNA精製キットを用いて精製した（工程1.6.3）。

これらの相補的DNA断片をAflIIおよびSpeI制限酵素で二重消化した（工程1.6.4）。 CAPRRESIデザインによれば、pUC18 rpoDσ1 -σ2のDNA断片をpUC18 sigAσ3 -σ4に連結してキメラ01を得、pUC18 sigAσ1 -σ2をpUC18 rpoDσ3 -σ4と連結してキメラ02を構築した（工程1.7.1-1.7 3）。化学的にコンピテントな大腸菌 DH5α細胞を、5μLのpUC18 chim01とpUC18 chim02のライゲーション反応で形質転換した（工程1.7.4）。形質転換細胞を、37℃で増殖させた固体LB / Amp / X-gal / IPTGプレート上で選択した（工程1.7.5）。キメラ構造は、Sanger配列決定10 （ステップ2）によって確認した。サンガーシーケンスrMIRA 11を使用して組み立てられ、その結果のファイルが表3に列挙されている。 図2は、破壊領域における野生型およびキメラ遺伝子の組み立てられた配列の整列（MUSCLEを用いて実施） 9を示す。

図1
図1：CAPRRESIの概要表現：遺伝子（太い矢印）、機能的プラスミド（黒丸）、オリゴヌクレオチド（薄い黒い矢印）。オリゴヌクレオチドに挿入された制限酵素部位は色で現れる。略語：Wt（野生型）、FWD（フォワードオリゴヌクレオチド）、REV（リバースオリゴヌクレオチド）、 ampR （アンピシリン耐性遺伝子）、RES（制限酵素部位）、RE（制限酵素）。 より大きいversiを見るにはここをクリックしてくださいこの図の上に

図2
図2：組み立てられた野生型およびキメラ遺伝子配列の整列。組み立てられたDNA配列は、MUSCLE 9を用いて整列された。 MIRA 11で配列を構築した。シノニムシークエンスは黒で表示されます。 AflII認識部位には下線が引かれているようです。 IUPACヌクレオチドコード：R（AまたはG）およびK（GまたはT）。構築物： rpoD （赤色）、 sigA （青色）、キメラ01配列（ rpoDσ1 -σ2-sigAσ3-σ4）、およびキメラ02配列（ sigAσ1 -σ2- rpoDσ3 -σ4）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

溶液 コンポーネント 指示
量 化合物
Luria-Bertani（LB）ブロス 5g 酵母エキスすべての成分を水に溶解する。オートクレーブ。使用するまで室温で保管してください。固形のLB培地の場合は、15gの細菌寒天をレシピに加えます。
10g カゼインペプトン
10g NaCl
最大1L 二重蒸留水
LB / Amp / X-gal / IPTGプレート 100mL 溶融固体LBブロスすべての成分を温めたLB培地に加える。ペトリ皿を満たし、凝固するまで待ってください。ブンゼンバーナー付きのきれいな層流フードでステップを実行します。
100μL アンピシリン（Amp）[100mg / mL]
100μL X-gal [20mg / ml]
50μL 1M IPTG溶液
ペプトン酵母（PY）ブロス 3g 酵母エキスすべての成分を水に溶解する。オートクレーブ。使用するまで室温で保管してください。固体のPYブロスについては、15gの細菌寒天をレシピに加える。 R. etli培養には、使用前に1M CaCl 2溶液700μLを添加する。
5g カゼインペプトン
最大1L 二重蒸留水
PY / CaCl 2 / Nalプレート 100mL 融解した固体PYブロスすべての成分を温和なPY培地に加える。ペトリ皿を満たして凝固するまで待ちます。ブンゼンバーナー付きのきれいな層流フードでステップを実行します。
700μL 1M CaCl 2溶液
100μL ナリジクス酸（Nal）[20mg / mL]
1M塩化カルシウム（CaCl 2 ）溶液 11.1g CaCl 2 CaCl 2を水に溶解する。オートクレーブ。室温で保管してください。
最大100 mL 二重蒸留水
トリス-EDTA（TE）10：1、pH 8.0 1 mL 1Mトリス溶液すべてのコンポーネントを混ぜてください。オートクレーブ。室温で保管してください。
400μL 0.25M EDTA溶液
最大100 mL 二重蒸留水
TE 50:20 pH 8.0 5 mL 1Mトリス溶液すべてのコンポーネントを混ぜてください。オートクレーブ。室温で保存する。/ td>
8 mL 0.25M EDTA溶液
最大100 mL 二重蒸留水
TE 10：1 10mM NaCl溶液 58.4mg NaCl NaClをTE 10：1に溶解する。オートクレーブ。室温で保管してください。
最大100 mL TE 10：1 pH 8.0溶液
溶解液I 80 mg リゾチームすべての成分を水に溶解して混合する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。室温で保管してください。
2 mL 0.5Mグルコース溶液
400μL 0.5M EDTA溶液
500μL 1Mトリス溶液
最大20 mL 滅菌した二重蒸留水
溶解液II 1.2mL 5M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液すべての成分を水に溶解する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。室温で保管してください。
3 mL 10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液
30 mLまで滅菌した二重蒸留水
溶解液III 29.4g 酢酸カリウム（CH 3 COOK） すべての成分を水に溶解して混合する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。室温で保管してください。
11.5mL 無水酢酸（CH 3 COOH）
最大100 mL 滅菌した二重蒸留水
1M塩化マグネシウム（MgCl 2 ）溶液 9.5g MgCl 2 MgCl 2をwater。オートクレーブ。室温で保管してください。
最大100 mL 二重蒸留水
3M酢酸ナトリウム（CH 3 COONa）溶液 24.6g CH 3 COONA CH 3 COONaを水に溶解する。オートクレーブ。室温で保管する
最大100 mL 二重蒸留水
10％SDS溶液 10g SDS 低速で磁気攪拌棒を用いてSDSを水に溶解する。オートクレーブ。室温で保管してください。
最大100 mL 二重蒸留水
3M CH 3 COOK溶液 29.4g CH 3 COOK CH 3 COOKを水に溶解する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。室温で保管してください。 最大100 mL 滅菌した二重蒸留水
プロテイナーゼK溶液 5 mg プロテイナーゼK プロテイナーゼKをTE 50:20溶液に溶解する。 37℃で1時間加熱する。 -20℃で保管してください。
最大1 mLまで TE 50:20 pH 8.0溶液
RNase溶液 10 mg RNase RNaseを水に溶解する。 95℃で10分間加熱する。 -20℃で保管してください。
最大1 mLまで滅菌超純水
1Mイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）溶液 238.3mg IPTG IPTGを水に溶解する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。 -20℃で保管してください。
最大1 mLまで滅菌超純水
20 mg X-gal X-galを水に溶解する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。 -20℃で保管してください。
最大1 mLまで滅菌超純水
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール24：24：1溶液 24 mL フェノールすべてのコンポーネントを混ぜてください。 4℃の琥珀色の瓶に入れて保管してください。注意！危険物。保護眼鏡、手袋、綿の実験用ガウンを着用してください。抽出フードを使用してください。取り扱い中にブンゼンバーナーや火災の原因となる火災の原因となることがあります。代わりに、市販のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール25：24：1溶液
24 mL クロロホルム
1 mL イソアミルアルコール
0.5Mグルコース溶液 9g gルコースグルコースを水に溶解する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。室温で保管してください。
最大100 mL 滅菌超純水
0.5Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）pH8.0溶液 14.6g EDTA EDTAを水に溶解する。 5M NaOH溶液でpHを調整する。オートクレーブ。室温で保管してください。
最大100 mL 二重蒸留水
0.25M EDTA pH8.0溶液 7.3g EDTA EDTAを水に溶解する。 5M NaOH溶液でpHを調整する。オートクレーブ。室温で保管してください。
最大100 mL 二重蒸留水
1MトリスpH8.0溶液 12.1g トリストリスを水に溶解する。 pHを調整する無水塩酸（HCl）。オートクレーブ。室温で保管してください。
最大100 mL 二重蒸留水
5M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液 19.9g NaOH NaOHを水に溶解する。室温で保管してください。注意！腐食性化合物。
最大100 mL 滅菌した二重蒸留水
0.1M NaOH溶液 399 mg NaOH NaOHを水に溶解する。室温で保管してください。
最大100 mL 滅菌した二重蒸留水
ナリジクス酸（Nal）ストック溶液 60 mg ナリジクス酸ナルを水に溶かす。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。 4℃で保管してください。
最大3 mL 0.1 MNaOH溶液
アンピシリン（Amp）ストック溶液 300 mg アンピシリンアンプルを水に溶解する。フィルターは0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。 4℃で保管してください。
最大3 mL 滅菌した二重蒸留水
10×トリス - アセテート-EDTA緩衝液 48.4g トリスすべての成分を水に溶解する。オートクレーブ。室温で保管してください。
20 ml 0.5M EDTA溶液
11.44 ml 氷酢酸
最大1L 二重蒸留水

表1：溶液調製。溶液調製のための指示書。

いいえ。 コード シーケンス 長さ（nt） 特徴
1 RpoD-FWD GC TCTAGA GA AGGAGA TATCATATGGAGCAAAACCCGCAGTCA 43 XbaIサイト;野生型遺伝子増幅およびベクタークローニング
2 RoD-REV GG GGTACC TTAATCGTCCAGGAAGCTACG 29 KpnIサイト;野生型遺伝子増幅およびベクタークローニング
3 SigA-FWD GC TCTAGA GA AGGAGA TATCATATGGCAACCAAGGTCAAAGAG 43 XbaIサイト;野生型遺伝子増幅およびベクタークローニング
4 SigA-REV GG GGTACC TTAGCTGTCCAGAAAGCTTCT </ td> 29 KpnIサイト;野生型遺伝子増幅およびベクタークローニング
3 AmpR-FWD AC ACTAGT GAAAGTAAAAGAT 21 SpeIサイト挿入、同義語突然変異。 ampR遺伝子の破壊
4 AmpR-REV TC ACTAGT GTTTCTGGGTGAG 21 SpeIサイト挿入、同義語突然変異。 ampR遺伝子の破壊
5 σ2RpoD-FWD AA CTTAAG GCTGGTTATTTCTATCGCT 27 AflIIサイトが挿入された、同義語突然変異。 chim01-02の構築
6 σ2RpoD-REV GC CTTAAG TTCGCTTCAACCATCTCTT 27 AflIIサイトが挿入された、同義語突然変異。 chim01-02の構築
7 σ2SigA-FWD AA CTTAAG GCTCGTCATTTCAATCGCC 27 AflIIサイトが挿入された、同義語突然変異。 chim01-02の構築
8 σ2SigA-REV GC CTTAAG TTCGCTTCGACCATTTCCT 27 AflIIサイトが挿入された、同義語突然変異。 chim01-02の構築

表2：オリゴヌクレオチド配列。制限酵素部位には下線が引かれている。リボソーム結合部位：太字。

建設 シーケンスファイル 品質ファイル
キメラ01 chim01_out.unpadded.fasta chim01_out.unpadded.fasta.qual
chim01_A3 / B3 / E2 / F2 / G2 /H2.pdf
キメラ02 chim02_out.unpadded.fasta chim02_out.unpadded.fasta.qual
chim02_C3 / D3 / E3 / F3 / G3 / H3.pdf
rpoD rpod_out.unpadded.fasta rpod_out.unpadded.fasta.qual
sigA siga_out.unpadded.fasta siga_out.unpadded.fasta.qual

表3：MIRAアセンブラおよびDNAシーケンサで得られた配列ファイル。キメラおよび野生型構築物からのサンガー配列決定読み取りを、マッピングオプションを用いてMIRA 11ソフトウェアで組み立てた。キメラシーケンシングのクロマトグラムはPDFファイルとして表示されます。

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Discussion

CAPRRESIはPRM 2の代替品として設計されました。元のPRMは強力な技術です。それは、選択された遺伝子の任意の部分に沿ったDNA配列の融合を可能にする。 PRMについては、野生型遺伝子を同じプラスミドにクローニングしなければならない。その後、プラスミド上に見出される野生型および抗生物質耐性遺伝子の内部にオリゴヌクレオチドを設計する。プラスミド破壊は、平滑末端の高忠実度DNAポリメラーゼおよび以前に設計されたオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって達成される。相補的PCR産物のライゲーションは、キメラ遺伝子を組み立て、抗生物質耐性カセットを復元し、機能的プラスミド回収をもたらす。 PRMは、同じプラスミドバックグラウンド上のキメラ遺伝子ライブラリーの構築を可能にする。残念ながら、平滑末端DNA配列のライゲーションは技術的に困難かもしれない。重複するPCRフラグメント1によるキメラアセンブリはまた、DNAポリメラーゼが平滑末端化生成物を産生することを必要とし、各反応のDNA精製。この技術によって組み立てられたキメラ遺伝子は線状DNA産物である。各構築物を標的ベクターにクローニングすることにより、さらなる解析が遅れる可能性がある。

CAPRRESIは、PRMの長所の多くから利益を得、同義語DNA配列領域に制限酵素部位を使用することによって相補的DNA断片の連結を単純化する。これらの理由から、CAPRRESIは平滑末端DNAポリメラーゼを必要としない。同義語DNA配列の使用は、キメラ構築のための融合部位を抑制するが、ライゲーション効率を高める。 CAPRRESIに導入されたもう1つの重要な改変は、キメラが組み立てられ、pUC18 / 19ベクターで取り扱われることである。これらのベクターは、前述のようにいくつかの有利な特徴を有する。構築ベクターを大腸菌宿主中で増殖させることにより、キメラDNAを得ることができた。キメラ遺伝子の最終プラスミド（ 例えば 、発現ベクター）へのその後のクローニングは時には必須。

CAPRRESIは、DNAおよびアミノ酸配列のin silico処理にも依存しています。 特別な Perlスクリプトは、野生型遺伝子をクローニングするための適切な制限酵素の選択、破壊領域に対応するすべての同義語DNA配列の計算（キメラアセンブリのための）、およびプラスミド回復を単純化するための制限酵素の同定を可能にする。これらの条件を考慮すると、CAPRRESIはタンパク質コード遺伝子の融合の代替物である。 CAPRRESIプロトコールの重要なステップは、1）破壊領域の選択、および2）PCR産物の精製である。分割領域は、野生型配列には見られない制限酵素部位を生成する同義語配列が計算されるストレッチである。キメラ構築のための制限酵素部位の使用は、平滑末端化生成物を生じるDNAポリメラーゼの必要性を排除し、ライゲーション反応を容易にする。すべての地域が使用可能な制限酵素部位を有するわけではない。 foこの理由から、最良の配列伸長が見出されるまで、一度に1アミノ酸ずつ破壊領域を移動させることが推奨される。 インシリコデザインが破壊領域の移動を許容しない場合、または配列ストレッチが適切な制限酵素部位を有する同義語DNA配列を欠いている場合、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いて標的遺伝子を融合させ、同義語DNA配列をアンピシリン耐性遺伝子に導入することが推奨される（ベクター上に見出される）のみ。このようにして、遺伝子はいずれの部分でも融合することができ、プラスミド回収は、1つのユニークな部位（1つの制限酵素で消化された）のライゲーションに依存する。 CAPPRESIの柔軟性は、他の技術と組み合わせて実行することを可能にします。

鋳型DNAを除去するためにPCR産物の精製を行い、相補的なDNA断片のライゲーション後の親プラスミドの汚染の機会を減少させる。これらの2つの重要なステップを実行することで、CAPRRESIを化学的コンピテント（CaCl 2 ）またはエレクトロコンピテント大腸菌（E.coli）細胞のいずれかで行うことを可能にする。コンピテント細胞の第1のタイプは、大部分の実験室で細菌形質転換に用いられる最も低温の大腸菌培養源を表す。前述のすべての機能のため、CAPRRESIはキメラの組み立てに便利なオプションです。

さらに、CAPRRESIは、重複PCR断片またはプラスミド回収技術と組み合わせて機能することができる。例えば、相補的DNA部分あたり2つの同義語配列を挿入する代わりに、（標的野生型遺伝子上の）所望の破壊領域は、介在配列を融合するためにオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを使用することができる。同義語配列の導入は、pUC18 / 19ベクターのampR遺伝子に限定され、プラスミドを復元するために1つの制限酵素のみを使用することができるd完全性。これらの将来の用途は、ライゲーション効率を損なうことなく、任意のタイプのDNA配列（ すなわち、タンパク質コード遺伝子だけでなく）の融合を可能にすることによってCAPRRESIを強化することができる。

CAPRRESIを試験するために、二つの野生型一次シグマ因子遺伝子： rpoD （ 大腸菌 ）およびsigA （ R.etli ）の領域を交換することにより、2つのキメラシグマ因子を構築した 。すべての既知の一次シグマ因子は、σ1〜σ4の4つの領域を保持する。キメラ01はRpoDσ1-σ2とSigAσ3-σ4からなり、キメラ02はSigAσ1-σ2とRpoDσ3-σ4を有する。キメラ構造の完全性は、サンガー配列決定10によって確認された（ 図2 ）。

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Disclosures

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

Acknowledgments

この作品はConsejo Nacional de Ciencia yTecnología、CONACYT、México（助成金番号154833）およびNacionalAutónomadeMéxicoの支援を受けました。著者はVíctorGonzález、Rosa I.Santamaría、Patricia Bustos、SoledadJuárezに感謝したい。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304011 Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products
High pure plasmid isolation kit Roche 11754785001 Used for all plasmid purification reactions
High pure PCR product purification kit Roche 11732676001 Used for all PCR purification reactions from agarose gels
AflII restriction enzyme New England Biolabs R0520L Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C
KpnI-HF restriction enzyme New England Biolabs R3142L Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C
SpeI-HF restriction enzyme New England Biolabs R3133L Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C
XbaI restriction enzyme New England Biolabs R0145L Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166-5G Antibiotics
Nalidixic acid Sigma Aldrich N8878-5G Antibiotics
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625-1KG Bacterial cell culture
Casein peptone Sigma Aldrich 70171-500G Bacterial cell culture
NaCl Sigma Aldrich S9888-1KG Sodium chloride
Agar Sigma Aldrich 05040-1KG Bacterial cell culture
XbaI restriction enzyme Thermo Fisher FD0684 Fast digest XbaI enzyme
KpnI restriction enzyme Thermo Fisher FD0524 Fast digest KpnI enzyme
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200S Fast DNA ligation kit
AflII restriction enzyme Thermo Fisher FD0834 Fast digest AflII enzyme
SpeI restriction enzyme Thermo Fisher FD1253 Fast digest SpeI enzyme

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References

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Tags

Molecular Biology、、キメラタンパク質コード遺伝子組換え同義語DNA配列挿入、制限酵素部位挿入、プラスミド回収、pUC18 / 19ベクター、抗生物質耐性遺伝子破壊、遺伝子工学、融合タンパク質、一次シグマ因子、RpoD、SigA
CAPRRESI：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ
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Santillán, O.,… More

Santillán, O., Ramírez-Romero, M. A., Dávila, G. CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion. J. Vis. Exp. (124), e55526, doi:10.3791/55526 (2017).

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