Overview
Un des outils plus utilisés en biologie moderne est moléculaire clonage avec des enzymes de restriction, qui créent des extrémités compatibles entre les fragments d’ADN qui leur permettent d’être réunies. Cependant, cette technique a certaines restrictions qui limitent son applicabilité pour génération de construction ADN importante ou complexe. Une technique plus récente qui aborde certaines de ces lacunes est recombineering, qui modifie l’ADN à l’aide de recombinaison homologue (HR), l’échange entre les différentes molécules d’ADN basé sur les étirements des séquences similaires ou identiques. Ainsi que du gène cible, qui tire parti des RH endogène de modifier le génome d’un organisme à un locus spécifiques, des techniques de clonage axée sur les ressources humaines ont grandement amélioré la rapidité et l’efficacité du génie génétique haut débit.
Dans cette vidéo, nous présentons les principes des RH, ainsi que les éléments de base nécessaires pour réaliser une expérience de recombineering, y compris les organismes compétents recombinaison et génomiques tels que les chromosomes artificiels bactériens (BAC). Nous traversons ensuite un protocole qui utilise recombineering pour générer un vecteur de ciblage de gènes qui peut finalement être transfecté dans des cellules souches embryonnaires pour générer un animal transgénique. Enfin, nous présenterons plusieurs applications qui mettent en évidence l’utilité et la variété des techniques de recombineering.
Procedure
Clonage par recombinaison homologue ou recombineering, a grandement amélioré les capacité de chercheurs pour mener le génie génétique de haut débit. Clonage moléculaire classique nécessite la digestion des vecteurs et insère avec les enzymes de restriction mêmes pour générer des extrémités compatibles pour « recombinaison », mais surtout en essayant d’isoler une région d’une séquence plus longue, comme une portion de l’ADN génomique, il n’y a pas toujours des enzymes de restriction qui coupera unique autour de la région d’intérêt et pas au sein de la région ou ailleurs dans la séquence. En évitant la nécessité pour ces sites de restriction, recombineering fournit un moyen beaucoup plus efficace et rentable de faire des constructions de génie génétique.
Dans cette vidéo, nous introduirons les principes de la recombinaison génétique, fournir un protocole général pour recombineering un vecteur de ciblage de gène et discuter de plusieurs applications de ces technologies.
Tout d’abord, nous allons discuter de ce que la recombinaison est et comment elle peut être appliquée.
Recombinaison génétique implique l’échange d’informations entre les molécules d’ADN. Dans « recombinaison homologue », relativement vastes étendues des séquences d’ADN similaires ou identiques sont échangés. Les cellules utilisent ce procédé pour réparer double brins et eucaryotes sexuellement se reproduisent également mener entre chromosomes homologues au cours de la méiose pour accroître la diversité génétique.
Recombinaison homologue a été exploitée pour un certain nombre de fins expérimentales, y compris la modification des loci endogènes spécifiques dans les cellules — appelé « ciblage génétique. » Elle est également appliquée à l’ingénierie de constructions génétiques, un processus appelé « recombineering », qui est particulièrement utile pour apporter des modifications aux vastes étendues de l’ADN afin de cibler au génome de l’organisme. Pour ce faire, les chercheurs peuvent utiliser « génomiques », ou des ensembles de vecteurs chaque contenant de l’ADN génomique de temps des fragments. Différents types de bibliothèques avec des capacités différentes, multiplies habituellement dans des clones bactériens, ont été créés et peuvent être commandées auprès des référentiels commerciales ou à but non lucratif. Un des types plus couramment utilisés de banque génomique est appelé un chromosome artificiel bactérien ou le BAC, qui peut transporter une taille entre 150-350 kilobases.
Afin de recombineer une construction, besoin de scientifiques un organisme dans lequel la recombinaison se produit. La levure Saccharomyces cerevisiae est naturellement « recombinaison compétent » et peut facilement mener à une recombinaison homologue entre un vecteur et insérer. Un autre système couramment appliqué utilise les protéines « Rouge » du bactériophage lambda, qui est reconstituée dans la bactérie e. coli. Vecteurs peuvent être recombineered en préétablies de souches bactériennes exprimant le rouge, ou un plasmide codant composants système rouge peuvent être transformés avec les substrats recombineering Co dans les bactéries.
Maintenant, nous allons marcher à travers un protocole pour créer un vecteur de ciblage de gène de recombineering.
Le but du présent protocole est de créer une souris génétiquement modifiée avec des modifications ciblées à un gène spécifique. Brièvement, les modifications souhaitées le gène d’intérêt sont effectués dans un BAC ; la séquence modifiée est « récupérée » dans un vecteur de ciblage, et ce vecteur est transfecté dans des cellules souches embryonnaires pour le ciblage de gène. Les cellules souches peuvent alors servir à générer l’animal génétiquement modifié. Pour obtenir des instructions sur cette dernière procédure, veuillez vous référer à l’enseignement des sciences JoVE vidéo « génie génétique d’organismes modèles. »
Pour commencer, un clone de BAC contenant la séquence génomique d’intérêt est identifié et ordonné. Ensuite, le bras d’homologie ou oligonucléotides contenant les régions homologues de 30-50 régions, sont conçus. Ces oligonucléotides sont utilisés comme amorces dans les réactions de PCR pour générer l’ADN « cassettes » permet de modifier le gène d’intérêt. Ces cassettes contiennent généralement, par exemple, les gènes de résistance aux antibiotiques qui peuvent servir de marqueurs de sélection, qui peuvent être facilement amplifiés à partir de plusieurs plasmides accessibles au public. Le clone bactérien de BAC est alors transformé, par exemple par électroporation, avec un plasmide codant les composants du système rouge, suivis par les cassettes contenant des bras de l’homologie. Les bactéries sont ensuite incubées à la température appropriée pour induire la recombinaison.
Pour récupérer la séquence modifiée depuis le BAC, un vecteur de « récupération » est linéarisé et amplifié à l’aide d’amorces contenant des armes d’homologie qui couvrent plusieurs kilobases autour du site de modification. Cette épine dorsale vector est transformé en le clone bactérien de BAC, et recombineering est induite à nouveau. Le vecteur sera « écart-réparé » en « récupérant » la séquence appropriée de la BAC. Cela se traduit par un vecteur de ciblage de gènes contenant la séquence modifiée d’intérêt, ainsi que les régions qui sont homologues à l’ADN génomique entourant la séquence modifiée. Ce vecteur puis peut être purifié, linéarisé et introduit dans des cellules souches embryonnaires, où le mécanisme de recombinaison homologue endogène ciblera la séquence modifiée au locus correspondant, altérant ainsi le génome de l’hôte.
Penchons-nous maintenant sur quelques applications des techniques d’ingénierie axée sur la recombinaison.
Tout d’abord, les chercheurs peuvent utiliser recombineering pour rapidement et facilement l’ingénieur le génome bactérien, par exemple, pour l’étude des complexes protéiques. Ici, une cassette encodage une balise d’affinité de peptide séquentiel comme un marqueur de sélection de résistance kanamycine a été conçue pour être recombineered à l’extrémité de 3¢ du gène d’intérêt. Ce vecteur a été introduit en rouge « recombinaison compétent » e. coli, et recombinants réussies ont été isolés à l’aide de milieux sélectifs. Les complexes de protéine marqués ont été purifiées biochimiquement utilisant les protéines qui se lient fortement aux balises et analysé par spectrométrie de masse pour identifier les partenaires d’interaction de la protéine d’intérêt.
Recombineering et ciblage génétique peuvent aussi servir à modifier le génome d’organismes parasites, tels que le parasite intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii, qui cause la toxoplasmose maladie. Dans cette étude, un vecteur de ciblage est recombineered chez les levures, où les séquences génomiques flanquant le gène d’intérêt ont été placées autour d’un marqueur de sélection. Le vecteur a été ensuite linéarisé et électroporation dans les parasites. Limitant la dilution d’électrodéposition en milieux sélectifs a permis d’isoler des recombinants réussies, dans lequel le mécanisme de recombinaison homologue du parasite remplacé la séquence génomique avec la séquence machinée, supprimant ainsi le gène d’intérêt. PCR de la région ciblée a confirmé les événements de recombinaison positive.
Enfin, une procédure appelée subcloning et d’insertion, ou le SPI, il a été élaboré dans quel écart réparation et cassette insertion se produisent simultanément, rendant le processus de recombineering plus simple et plus souple. Critique pour la réussite de ce processus est la bonne conception de l’homologie de multiples armes, qui, jusqu'à 180 bp, sont plus longtemps qu’en recombineering classique afin d’accroître l’efficacité de la recombinaison. Après avoir incorporé les bras d’homologie dans le plasmide subcloning et cassettes d’insertion par PCR, ils ont été transformés en ensemble en un clone BAC exprimant le rouge, et recombineering a été induite. Avec succès des constructions recombineered ont été ensuite identifiées par PCR ou restriction digest analyse.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur recombineering. Dans cette vidéo, nous avons discuté des principes de recombinaison et comment ils peuvent être utilisés en génie génétique, un protocole pour un projet de recombineering et enfin plusieurs applications de ces techniques. Comme toujours, Merci pour regarder !
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