Summary
De mucuspluggen van cystische fibrose (CF) patiënten zijn een ideale omgeving om microbiële pathogenen te bloeien. Het manuscript beschrijft een nieuwe methode om de CF-longmikrobiome te bestuderen in een omgeving die naboots waar ze ziekte veroorzaken en hoe veranderingen van chemische omstandigheden microbiële dynamiek kunnen veroorzaken.
Abstract
Veel chronische luchtwegziekten leiden tot slijmvlies van de luchtwegen. Longen van een individu met cystische fibrose zijn een voorbeeldig geval waarbij hun mucus-aangesloten bronchiolen een gunstige leefomgeving voor microbiële kolonisatie vormen. Verschillende pathogenen gedijen in deze omgeving interageren met elkaar en rijden veel van de symptomen geassocieerd met CF-ziekte. Net als elke microbiële gemeenschap hebben de chemische omstandigheden van hun leefgebied een belangrijke impact op de gemeenschapsstructuur en dynamiek. Bijvoorbeeld, verschillende micro-organismen bloeien in verschillende niveaus van zuurstof of andere opgeloste concentraties. Dit geldt ook in de CF-long, waar zuurstofconcentraties worden geacht gemeenschapsfysiologie en -structuur te runnen. De hier beschreven methoden zijn ontworpen om de longomgeving na te bootsen en pathogenen te laten groeien op een manier die vergelijkbaar is met die waaruit zij ziekte veroorzaken. Manipulatie van de chemische omgeving van deze microben wordt dan gebruikt om te bestuderen hoe de chemieString van longinfecties regelt haar microbiële ecologie. De methode, het WinCF-systeem, is gebaseerd op kunstmatig sputummedium en smalle capillaire buizen die bedoeld zijn om een zuurstofgradiënt te verschaffen die vergelijkbaar is met die welke bestaat in mucus-aangesloten bronchiolen. Manipulatie van chemische condities, zoals de media pH van de sputum of de antibiotica druk, maakt het mogelijk om de microbiologische verschillen in die monsters te visualiseren met behulp van gekleurde indicatoren, kijken naar gas- of biofilmproductie of het extractie en sequentiebepaling van de nucleïnezuurgehaltes van elk monster.
Introduction
De methode beschreven in dit manuscript heet het WinCF-systeem 1 . Het overkoepelende doel van WinCF is een experimentele setup te geven die het milieu kan simuleren van een mucus-gevulde longbronchiole. Dit zorgt voor een tracteerbaar systeem om microbiële pathogenen van longziekten te bestuderen met een fenomeen van mucus hypersecretie, waaronder cystische fibrose (CF), chronische obstructieve longziekte (COPD), astma en anderen. De procedure is speciaal ontworpen voor de studie van CF, die wordt gekenmerkt door mutaties die leiden tot longziekten, die dik en moeilijk worden, waardoor bronchiolen en andere kleine doorgangen met slijm 2 worden gevuld. Dergelijke blokkades in de longinhibitgasuitwisseling omdat inhalatielucht niet meer veel alveoli kan bereiken en ook een habitat voor bacteriële kolonisatie 3 , 4 verschaft. Het onvermogen om microbiële groei te voorkomen in deOverdreven longslijm leidt uiteindelijk tot de ontwikkeling van complexe chronische infecties van de luchtweg. Deze gemeenschappen bevatten een verscheidenheid aan organismen, waaronder virussen, schimmels en bacteriën zoals Pseudomonas aeruginosa , die allemaal met elkaar 5 , 6 , 7 , 8 interageren. De werkzaamheid van de CF-longmicrobiome wordt geacht betrokken te zijn in flappen van symptomen genaamd pulmonale exacerbaties 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF maakt het mogelijk om het gedrag van het microbiële gemeenschap rond deze exacerbaties te onderzoeken en wordt nu uitgebreid om te fungeren als basis experimenteel systeem om longmicrobiële ecologie te bestuderen. Traditioneel zijn exacerbaties bestudeerd door middel van directe analyse van monsters uit de long. Veel confounding factoren maken directe analyse van microbiële bUitwerking op de longen, met het WinCF-systeem, worden veel van deze factoren verwijderd en kan het gedrag van de longmicrobiome directer bestudeerd worden, waardoor een fijne analyse van de bacteriële activiteit in een slijmvliesbronchiole mogelijk is.
Het WinCF-systeem biedt een methode om bacteriën te groeien en te analyseren op een manier die de longomgeving effectief naboots. Traditionele methoden voor het kweken van longbacteriën betroffen vaak cultuurmonsters op traditionele agarplaten. Deze methodes laten de monsters open staan voor atmosferische zuurstof, omdat ze niet in aanmerking komen voor de hypoxische en vaak anoxische aandoeningen die worden gevonden in longbrongchiolen die zijn aangesloten op mucus 12 , 13 . Culturen op agar onder aërobe omstandigheden is niets zoals het milieu van de CF-long en kan artsen en onderzoekers misleiden over het gedrag van de pathogenen die ze proberen te behandelen. Daarnaast zijn de voedingsstoffen beschikbaar voor bacteriën op agarplatenZijn verschillend van die welke beschikbaar zijn in het werkelijke sputum, dat in WinCF wordt verantwoord door gebruik te maken van kunstmatige sputum media (ASM). Zoals blijkt uit de Pseudomonas culturen in Sriramulu et al. 14 bevat ASM een specifieke reeks componenten die de beschikbare middelen voor sputummicroben nabootsen en ook de fysieke consistentie van sputum repliceren. Omdat een zieke long een specifieke microbiome heeft, zou de studie van dergelijke micro-organismen ideaal ook in de specifieke condities van de long moeten plaatsvinden.
Het WinCF systeem zorgt voor snelle analyse en gemakkelijke manipulatie van de experimentele condities om microbiële veranderingen te waarnemen zoals die in een werkelijke longbongchiole voorkomen. Deze techniek zorgt voor de inenting van een groot aantal aanverwante steekproeven, waaronder sputum, speeksel, andere lichaamsafscheidingen en pure of gemengde bacterieculturen. De aard van de experimentele opstelling zorgt voor onmiddellijke visuele interpretatie vande microbiële gemeenschap gedrag en is ontworpen om eenvoudig stroomafwaarts toepassen van meerdere microbiologische en omics procedures mogelijk. Dergelijke studies zijn belangrijk omdat bacteriële gemeenschap samenstelling verandert op basis van de fysisch-chemische omstandigheden van hun omgeving. Met WinCF de chemische omstandigheden van de media kan worden gemanipuleerd om de effecten op de bacteriële activiteit te analyseren. Bijvoorbeeld kan de zuurgraad van het medium worden gewijzigd voorafgaand aan inoculatie met een monster. Na incubatie kan de bacteriële activiteit in elk van deze voorwaarden direct worden vergeleken en kunnen conclusies worden getrokken over bacteriën in sputum monsters die zich in reactie op variërende pH. Hier, schetsen we de procedures voor de toepassing van de WinCF systeem en voorbeelden van de manier waarop de media chemie kan worden gemanipuleerd om de effecten op de longen microbiome bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de voorraden voor de Artificial sputum Media
- Maak een 5% mucine oplossing. Voeg 1,0 g gedehydrateerde varkensmaag mucine tot 20 ml gedeïoniseerd water. Autoclaaf de verkregen oplossing.
OPMERKING: De mucine sterilisatie zal zijn inherente structuur te vernietigen; andere werkwijzen voor het steriliseren mucine in zijn droge vorm omvatten UVsterilisatie en bestraling. Deze methoden zijn niet op grote schaal gebruikt voor de WinCF systeem echter. - Voeg 2,2 g KCl tot 50 ml gedeïoniseerd water en laten oplossen. Voeg 5,0 g NaCl en 50 ml gedeïoniseerd water en laten oplossen. Autoclaaf deze twee oplossingen.
- Voeg 100 mg zalmsperma DNA aan 10 ml steriel gedeïoniseerd water. Verwarm de oplossing tot ongeveer 85 ° C in een waterbad gedurende enkele uren oplossing te verzekeren.
- Voeg 5,0 mg ferritine tot 5,0 ml steriel gedeïoniseerd water.
2. Voorbereiding van de kunstmatige Sputum Medium
- CombinerenDe volgende bestanddelen: 16 ml mucine voorraadoplossing, 2,0 ml KCl voorraadoplossing, 2,0 ml NaCl voorraadoplossing, 200 μL eiergeel emulsie, 5,6 ml DNA voorraadoplossing, 120 μl ferritine voorraadoplossing, 5,78 ml essentieel Aminozuuroplossing, 5,78 ml niet-essentiële aminozuuroplossing en 2,44 ml steriel water.
- Als kleine hoeveelheden sediment verschijnen, schud ze voorzichtig om te mengen.
- Pipet 5,0 ml media in acht steriele 15 ml centrifuge buizen.
OPMERKING: De chemische condities van elke buis kunnen als gewenst worden gemanipuleerd. Bijvoorbeeld, bufferoplossingen en pH-indicatoren kunnen aan elke buis worden toegevoegd voor het vergelijken van microbiële gedrag bij verschillende pH-niveaus. Een demonstratie hiervan wordt getoond in de representatieve resultaten sectie met 8 verschillende pH niveaus, van 5,0 tot 8,5 in 0,5 pH stappen.
- Zodra de chemische condities van de media succesvol zijn gemanipuleerd, bevriezen voor later gebruik. De media blijft stabiel van vorenZen bij -20 ° C gedurende enkele maanden. Vortex bij ontdooien.
3. Bereiding van een controle run van de capillaire buizen
- Vul in een steriel bio-leven acht steriele microcentrifugebuizen met 250 μl media elk.
- Verkrijg 8 meer steriele 15 ml centrifugebuizen, elke buis die overeenkomt met een microcentrifugebuis die in stap 3.1 wordt genoemd.
- Steriliseer een papieren handdoek met 70% ethanoloplossing en laat het drogen. Draai de handdoek eenmaal droog in stukken van ongeveer vier vierkante centimeter, en verkrummel elk stuk in de bodem van een 15 ml centrifugebuis. Voor extra buizen spuit en droog extra papieren handdoeken indien nodig.
- Met één klomp papier aan de onderzijde van elke centrifugebuis dampen elke papierklomp met ongeveer 1,0 ml steriel water om een vochtige omgeving te creëren.
- Verkrijg drie glazen capillaire buizen voor elke microcentrifugebuis die in stap 3.1 is bereid en een blok van capillaire buis stopverf sealant.
- Voor elke microcentrifugebuis, vul drie capillaire buizen met media tot ongeveer 5 mm van de blauwe markering aan de bovenkant van de buis.
- Te vullen door één eind van de buis in de microcentrifugebuis en kantelen naar horizontale richting, waardoor capillaire werking om het medium te geleiden in de buis (zie figuur 1).
- Stop de vulling Hiertoe plaatst een gehandschoende vinger over het open uiteinde van de buis, en dan sluit het andere uiteinde van de buis door het drukken beneden in de kit blok.
Figuur 1: Voorbeeld pH Gradient, Vullen Capillaire leiding met kunstmatige Sputum Medium. Het medium wordt toegevoegd door één uiteinde van de buis in de vloeistof en kantelen capillaire werking te vergemakkelijken. Het medium kleur in dit voorbeeld is te wijten aan pH-indicator toegevoegd aan de demon te helpenStrate mogelijke veranderingen in de zuurgraad na incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Plaats elk drietal capillaire buizen in 15 ml centrifugebuizen gevuld met keukenpapier volledig bevochtigd met steriel water, stopverf afgedicht naar beneden. Sluit het buisje en label. Deze drie capillairen zijn voor replicatie van elke controleconditie.
- Wanneer alle 15 mi centrifugebuizen gevuld met hun aangewezen capillaire buisjes, plaats de buizen in een bedrijf rack. Plaats het rooster zodanig dat de buizen horizontaal worden geïncubeerd (gasbellen vangen) (zie figuur 2). Incubeer de capillaire buisjes in de centrifugebuizen (met het bevochtigde papier klonten) bij 37 ° C gedurende 48 uur.
Figuur 2: Voorbeeld pH Gradient, capillaire buisjes Gelijk Incubation. Zodra drie capillaire buisjes zijn gevuld en afgedicht, worden ze in een centrifugebuis met een vochtige papieren handdoek op de bodem. Deze buis wordt daarna afgesloten en in een rek plaatsen. Het rek moet zijdelings georiënteerd tijdens incubatie, zoals hier afgebeeld, zodat gasproductie kunnen worden waargenomen na incubatie voltooid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
4. Imaging van het Control Capillairbuisjes na incubatie
- Verwijder het rek centrifugebuizen uit de incubator en zorg ervoor dat de buizen horizontaal houdt. Schuif de capillaire buisjes van de centrifugebuizen, waarbij elk drietal gescheiden van andere sets.
- Regelen de capillaire buizen naast elkaar op een lichtbak, allen opgesteld zodat de inhoud van de buizen tenbaar en verlicht. Reactie spleet drie buizen verschillende chemische omstandigheden scheiden.
- Met de buizen uitgelijnd en lichttafel ingeschakeld, foto van direct boven. (Zie figuur 3)
Figuur 3: Voorbeeld pH Gradient, Controle Run, Pre-incubatie, No Sputum toegevoegd. Kunstmatige sputum medium na toevoeging aan capillaire buisjes in sets van drie, het verhogen van de pH van links naar rechts. De combinatie van indicatoren voor het resultaat medium toegevoegd zuurdere buizen verschijnen geler, terwijl minder zuur buizen geworden paars. De buizen horizontaal geplaatst en worden verlicht van onderen, van bovenaf gefotografeerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Gooi decontrolemateriaal in biologisch gevaarlijk afval.
5. Het inenten WinCF de capillaire buisjes met sputummonster
- In een steriele biohood, vul acht steriele microcentrifuge buisjes met 225 ul van medium elke.
- Homogeniseer het sputum monster door onttrekken en uitstoten van het sputum malen met een 3 mL spuit (een plastic spuit zonder naald). Doe dit tot het sputum is van gladde consistentie.
- Voeg 25 ul van gehomogeniseerd sputum aan elke microcentrifugebuis (1/10 verdunning in ASM media) bereid in stap 5.1. vortex dan de buizen gedurende 30 s voldoende te mengen.
- Voeg de media om capillaire buisjes volgens dezelfde procedure als de stappen 3.2 tot en met 3.5.
6. Weergave van monster capillaire buisjes na incubatie
- Na de 48 uur incubatietijd, verwijdert het de capillaire buisjes volgens dezelfde werkwijze als stappen 4.1 tot 4.3.
- Indien deze aanwezig in de buizen, maaktZeker dat de afgebeelde foto's de afbakening tussen de bellen en media in de buizen duidelijk uitbeelden. Als er biofilm aanwezig is, zorg ervoor dat de foto's ook zijn aanwezigheid duidelijk weergeeft.
7. Verwijdering van media voor downstream toepassingen
- Om de stroomafwaartse analyse te vergemakkelijken, verwijder het medium na de afbeelding van de capillaire buizen. Potentiële toepassingen omvatten culturing en DNA / RNA sequencing en metabolomische profilering.
Let op: De glazen capillairbuisjes die met pathogenen zijn gevuld, zijn een belangrijke biohazard. Daarom moeten deze stappen met zorg voorzichtig worden uitgevoerd met specifieke apparatuur. Als kapillair buizen breken, gooi ze in de juiste houder van biohazard sharps. - Gebruik stompe naalden van 25 gauge en 0,5 inch in lengte om de media te verwijderen. Steek de stompe eindige naald in het stopcontact van de buis om de zegel te breken.
- Draai de kapillair buis ondersteboven na het breken van de zegel en laat de media uit het bovenste gedeelte druppelen. ikf de media niet gemakkelijk druppelen Gebruik een pipet met een 200 ul tip en uitzetting van het materiaal uit de buis door te drukken op de pipet plunjer wanneer deze is ingebracht in het uiteinde van de capillaire buis. Verzamel de buis uitgezet medium in een geschikte houder (1,5 ml centrifugebuis).
OPMERKING: transcriptomische of andere RNA-analyse, de media direct worden uitgestoten in RNA stabiliserende buffers.
8. De WinCF FLÜD System
OPMERKING: De WinCF Fluid Loading Utility Device (FLÜD) is een optioneel pakket van aanvullende toestellen die zijn ontworpen om de doorvoer van de WinCF systeem te optimaliseren. De WinCF FLÜD System bestaat voornamelijk uit 3D bedrukbare materialen. 3D geprint productie zorgt voor een snelle en eenvoudige vervanging van materialen om een minimale downtime voor onderzoekers en een minimale productie-eisen te waarborgen. Designs, stl bestanden, 3D printen instructies en de WinCF FLÜD handleiding zijn beschikbaar in de online dieent.
- Voorbereiding media voor capillair geladen
- In een steriele biohood, vul acht steriele 2 mL microcentrifugebuizen met 900 ul van medium elke.
- Homogeniseer elk sputum monsters door terugtrekken en uitstoten van het sputum malen met een 3 mL spuit (een plastic spuit zonder naald). Doe dit tot het sputum is van gladde consistentie.
- Voeg 100 ul van gehomogeniseerd sputum aan elke microcentrifugebuis (1/10 verdunning in medium) bereid in stap 8.1.1. vortex dan de buizen gedurende 30 s voldoende te mengen.
- Slot de gevulde open microcentrifugebuizen in de rotator buishouder georiënteerd dat de buizen verticaal.
- Plaatsing van capillaire buisjes
- Ophalen drie capillaire buisjes voor elke microcentrifugebuis in stap 8.1.
- Slot drie buizen in de rubberen omhulling zodat zij uitgelijnd zijn met de microcentrifugebuizen aan het andere uiteinde van de inrichting.Zorg ervoor dat de gemarkeerde uiteinden van de buizen wegkomen van de microcentrifugebuizen. Monteer de drie gaten op de bodem van de wieg goed over de drie stekkers op de houder.
- Met de geplaatst capillaire buizen die in hun geleidingskanalen op het apparaat rusten, zet de rubberen stempel over hun midsecties op een veilige manier om te voorkomen dat het verschuift. (Zie figuur 4 )
Figuur 4: Het FLUD-systeem, volledig geladen met capillairbuisjes, die door de Rubber Tamp over hun midsecties wordt gewaarborgd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Media in de capillaire buizen plaatsen
- Gebruik voorzichtig één hand om het einde van het apparaat te begrijpen waar de capillaire buizen liggenaded, en met de andere hand de rotor rek waarin de microcentrifugebuizen geladen te houden.
- Subtiel roteren microcentrifuge rek zodat de reactievaatjes bijna horizontaal en gaat langzaam duwen het rek naar de capillaire buisjes. (Zie figuur 5)
- Wanneer de uiteinden van de capillaire buisjes contact met de media in de microcentrifugebuizen te zorgen dat capillaire werking begint direct vullen van de capillairen. Om opvullingspercentage passen en niveau te dichten, voorzichtig zwenken de inrichting als geheel. Terwijl je dit doet, wees niet te media morsen van de microcentrifugebuizen. (Zie figuur 6)
- Wanneer de capillairen worden gevuld gewenste niveaus, plaatst de inrichting niveau op een ondergrond voorzichtig toch snel trekt het rek van microcentrifugebuizen van de uiteinden van de capillaire buisjes te staken vullen. De microcentrifugebuizen kan nu worden teruggetrokken helemaal terug in verticale positie en gesloten.
- Dicht de uitstekende uiteinden van de capillaire buisjes door het indrukken van een afdichtmiddel blok op elke triplo set afdichting één stel per keer totdat alle sets zijn afgedicht. Besmettingsgevaar reduceren, op een ander deel van het afdichtmiddel blok op elke triplo set (zie figuur 7).
Figuur 5: De FLÜD systeem met Medium Tubes ingezet om een horizontale oriëntatie, klaar om in contact met Capillairbuisjes maken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: De FLÜD systeem met Capillairbuisjes Laden met Media via capillaire werking. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Afdichting gevulde capillaire buizen op de FLÜD System One Triplicate tegelijk instellen met behulp van een Sealant Block. Deze kit block had kunststof langs de randen die afgesneden contact met aangrenzende drievoud sets tijdens lassen voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Incubatie
- De rubberen stampen over de buis midsections en til de rubberen omhulling buiten het hoofdapparaat. Dit moet de capillaire buisjes mee te. Stel nu de houder en de buizen vastgehouden op het beeldvormend rack. dit raCk heeft drie stubben die passen in de wieg, evenals kleine geleidingskanalen om de buizen in te stellen.
- Stel het afbeeldingsrek als geheel in de heldere plastic incubatiebox. Week kleine hoeveelheden steriele papierhanddoeken in steriel water en plaats langs de twee kortere zijden van de doos om vochtigheid te geven tijdens incubatie. (Zie figuur 8 )
- Sluit de doos volledig en zet deze in een 37 ° C incubator, zorg ervoor dat de buizen horizontaal blijven. Incubeer gedurende 48 uur.
Figuur 8: Capillaire buizen in Rubber Cradle Overgebracht van FLUD Systeem naar een Imaging Rack, die in een Clear Incubation Box is geplaatst naast Damp Paper Towels om vochtigheid te geven. Klik hier om een grotere versie van th te zienIs figuur.
- Beeldvorming en extractie
- Verwijder de afbeeldingsrak die de buizen vasthoudt van de incubatiebox en zet deze op een lampje, onderaan verlicht. Met de buizen al in het imaging rack, zullen de drievoudige sets op een juiste afstand worden geplaatst en direct op de afbeelding staan.
- Focus de camera op de buizen zodanig dat alles zichtbaar is in het zichtveld en het licht van de lichtbox zorgt voor voldoende contrast en visualisatie van de kleur in de buis kleurstoffen. Foto van direct bovenaan.
- Om de inhoud van de buizen te extraheren, verwijder de capillaire buizen van de rubberhouder één set drievoudige tegelijkertijd. Til de buizen voorzichtig op en uit de houder of schuif ze uit.
- Volg voor elke reeks triplicaten de in stap 7.1 tot en met 7.3 beschreven extractieprocedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microbiologische groei in de verschillende chemische omstandigheden geïnduceerd in de monsters varieerden sterk in sommige gevallen meer subtiel in andere. Veel veranderingen in de activiteit waren visueel van aard zijn, zijn duidelijk zodra de incubatieperiode eindigde. In het voorbeeld van pH manipuleren, de monsters in de pH spectrum sterk gevarieerd zoals weergegeven door meerdere factoren bleek na incubatie. Als er geen sputum monsters werden toegevoegd aan de media, de enige verandering vertoonde in de pH spectrum na 48 uur incubatie werd een lichte afname in gemiddeld volume als gevolg van geringe afdamping (figuur 9). Geïnoculeerd capillaire buisjes vertoonden volumeveranderingen, het verschijnen van gasbellen, veranderde kleur en het uiterlijk van ondoorzichtige afzettingen (Figuur 10).
Figuur 9: Voorbeeld pH Gradient, Controle Run, Post-incubatie, No Sputum toegevoegd. Dezelfde capillaire buisjes figuur 1 na geincubeerd bij 37 ° C gedurende 48 uur. De kleur blijft grotendeels ongewijzigd, aangeeft dat er geen significante verschuivingen in pH. Licht verminderd hoeveelheden van het medium blijven ten gevolge van geringe verdamping uit de open einden van de buizen tijdens incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10: Voorbeeld pH Gradient Resultaten, bericht Incubation, Sputum Added, gasproductie Apparent. Capillaire buisjes met kunstmatige sputum medium na menging met sputum van een CF patiënt. De buizen zijn opgesteld in dezelfde oplopende volgordepH als controleproef. Opvallende verschillen van de controleproef in figuur 2 behoren grote veranderingen in kleur, met aanvankelijk lage of mid-range pH buizen steeds zeer licht gekleurd aangeeft grote druppels in pH. De hoogste pH buizen verandert kleuring minder sterk, hetgeen een kleinere pH verandering. Luchtbellen aanwezig in tubes van lage en mid-range pH, wat aangeeft anaerobe fermentatieve activiteit. Ondoorzichtige gedeelten zijn ook aanwezig in alle buizen met grotere hoeveelheid bij die van lagere pH aangeeft verdere microbiële activiteit van verscheidene soorten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Deze resultaten tonen aan dat bacteriën en andere micro-organismen die in de toegevoegde sputum in staat zijn om te groeien en te veranderen binnen de kunstmatige medium. Verschillen tussen de chemische omstandigheden gesimuleerd warenstark en gemakkelijk worden vergeleken, vertonen biofilm productie, gasproductie en verschillende kleurveranderingen basis toegevoegde indicatoren. Bij de pH experiment de meest significante wijziging was de gasproductie, die veel meer voor bij buizen met een lagere pH, met een pH van 6,0 en 6,5 in het algemeen met de belletjes. Ander ondoorzichtig materiaal werd waargenomen in de meeste buizen, indicatief voor verdere microbiële activiteit optreedt in de media, hoewel hogere pH capillairen neiging minder hebben. De meeste buizen had een gele tint dan voorheen aangenomen, wat aangeeft dat de totale pH van de media laten vallen. Media met hoge pH bleven over het algemeen vergelijkbaar met de oorspronkelijke kleur, zodat deze weinig verandering van de pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De microbiologische make-up van een long met CF bevat een grote verscheidenheid aan organismen, maar de omstandigheden in de long hebben waarschijnlijk een significante invloed op wat voor soort microben kan overleven en 13 , 15 bloeien. Specifieke mechanismen waardoor deze omstandigheden veranderen en de precieze effecten die ze op de longmikrobiomen hebben, zijn over het algemeen onduidelijk. In deze experimentele methode presenteren we een analyse van microbiologische veranderingen op basis van gemanipuleerde chemische omstandigheden in een gesimuleerde longbronchiole.
Er zijn enkele kritische stappen van het protocol. Het houden van het kunstmatige sputummedium steriel voor het toevoegen van sputummonsters is belangrijk bij het overwegen van de microbiome van het geanalyseerde milieu. Buitenlandse microben kunnen de omstandigheden veranderen en de nauwkeurigheid van de bronchiole-simulatie verstoren. De microben zouden ook de doelpatogenen in de s kunnen uitkompeterenputum samples gebruikt, ten koste analyses van veranderingen na de incubatie. Het is cruciaal om de capillaire buisjes horizontaal incuberen. Dit is belangrijk omdat het zorgt voor de observatie van de gasproductie. Werden de buizen verticaal geïncubeerd, het gas kan omhoog en uit het medium stijgen, waardoor de schijn no gasproductie helemaal. Verstopping beide uiteinden groter gasproductie zonder verlies van gas te vergemakkelijken. Toch zou de nodige zuurstof gradiënt worden verstoord.
Het protocol staat open voor verschillende wijzigingen, van de chemische samenstelling van de media om de soorten monsters geïnoculeerd. Specifieke medicijnen kunnen eenvoudig worden toegevoegd aan de voorbereiding stadia, en verschillende incubatie-omstandigheden kunnen verschillende instellingen waar de microben zou wonen simuleren. Dit experiment ook specifiek gebruikt sputum monsters die CF pathogenen, maar monsters van andere longziekten kunnen worden gesubstitueerd om trends te volgen onder deze specifiekeziekteverwekkers.
Een belangrijke beperking van deze techniek is dat de inhoud van de capillairen in hoofdzaak gehomogeniseerd na extractie uit de tubes, vervallen veel gegevens om bacteriële activiteit op verschillende lagen binnen de kolom drager. Bijvoorbeeld, medium dicht bij de lucht potentieel bevatten meer aeroob, met gemiddelde verderop met meer anaërobe organismen 12. Deze twee reeksen microben zouden elkaar worden gemengd wanneer de buisjes werden geleegd in een houder voor sequentie of verwerking. Toekomstige studies met WinCF gericht op het ontwikkelen van methoden sectie en breng de microbiële gemeenschap over de lengte van de buis.
Deze benadering long sputum analyse geeft een nauwkeurigere instelling voor de groei van microben longen dan zou een agarplaat traditionele wijze, waarbij culturen groeien op een vast medium open aan de lucht. Monsters afkomstig van bronchiolesof soortgelijke instellingen zijn geschikter gekweekt in de capillaire buis opstelling vanwege gelijkenissen gedeeld met een effectief long bronchiolus. Deze proefopstelling verklaart de fysieke ruimte, sputum chemie, vochtigheid, gemiddelde consistentie en zuurstofgradiënten die in een feitelijke CF longen 12, 13 zou zijn.
Deze techniek kan worden gebruikt om veel aandoeningen die relevant zijn voor ziekte waarbij de longen microbiome manipuleren. De chemische omstandigheden van de kunstmatige sputum medium kan gemakkelijk worden gemanipuleerd voorafgaande aan het toevoegen van de gewenste microbiële monsters, verschaffen een gemakkelijke werkwijze om de effecten van mogelijke behandelingen of wijzigingen observeren. Bijvoorbeeld, de toevoeging van specifieke soorten antibiotica aan het medium voor het toevoegen van long sputum monsters zou gegevens over hoe een dergelijke medicatie de microbiële gemeenschap van een long bronchiolus invloed zou verschaffen. Het WinCF systeem is een nieuw instrument om de studieLongmicrobiome met directe klinische toepassingen. Traditionele methoden voor het bestuderen van de longmikrobiome omvatten directe sequentiebepaling van mucusmonsters, met WinCF kan de gemeenschap actief worden gegroeid om het collectieve metabolisme beter te visualiseren en te analyseren. Eerdere studies hebben aangetoond dat WinCF de microbiome goed reproduceert in een sputummonster 1 , waardoor het een effectief instrument is voor experimenten met enkele pathogenen, co-culturen en gemeenschappen van organismen die menselijke longen infecteren en beschadigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zouden graag de Vertex Pharmaceuticals en de Cystic Fibrosis Research Innovation Award erkennen voor de financiering van R. Quinn en de NIH / NIAID voor financieringsbijdrage 1 U01 AI124316-01, een systeembiologische benadering voor de behandeling van multi-drug resistente pathogenen. Wij danken ook het ministerie van Werktuigbouwkunde en Ruimtevaarttechniek aan de UCSD-masteropleiding voor de mechanische ingenieurswetenschappen om de samenwerking met de technische aspecten van dit werk te vergemakkelijken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, Suppl 4. S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
