Summary
Der Schleim verstopft die Atemwege von zystischer Fibrose (CF) Patienten sind eine ideale Umgebung für die mikrobielle Krankheitserreger zu gedeihen. Das Manuskript beschreibt ein neuartiges Verfahren der CF-Lunge microbiome in einer Umgebung für die Untersuchung, dass imitiert, wo sie Krankheit und wie Veränderungen der chemischen Bedingungen verursachen mikrobielle Dynamik antreiben kann.
Abstract
Viele chronische Atemwegserkrankungen führen zu Schleimverschluss der Atemwege. Lungen eines Individuums mit zystischer Fibrose sind ein exemplarischer Fall, bei dem ihre Schleimhautbronchiolen einen günstigen Lebensraum für die mikrobielle Kolonisation schaffen. Verschiedene Pathogene gedeihen in dieser Umgebung, die miteinander interagieren und viele der mit CF-Krankheit assoziierten Symptome antreiben. Wie jede mikrobielle Gemeinschaft haben die chemischen Bedingungen ihres Lebensraumes einen erheblichen Einfluss auf die Gemeinschaftsstruktur und die Dynamik. Beispielsweise gedeihen unterschiedliche Mikroorganismen in unterschiedlichen Konzentrationen von Sauerstoff oder anderen gelösten Konzentrationen. Dies gilt auch in der CF-Lunge, wo Sauerstoffkonzentrationen geglaubt werden, um die Physiologie und Struktur der Gemeinschaft zu treiben. Die hier beschriebenen Methoden sind so ausgelegt, dass sie die Lungenumgebung nachahmen und die Erreger in einer Weise erhöhen, die derjenigen ähnlich ist, aus der sie eine Krankheit hervorrufen. Manipulation der chemischen Umgebung dieser Mikroben wird dann verwendet, um zu untersuchen, wie die chemistry von Lungeninfektionen regelt seine mikrobielle Ökologie. Das Verfahren, das WinCF System bezeichnet wird, basiert auf künstlichen Sputum Medium und schmalen Kapillarröhrchen bedeutete einen Sauerstoffgradienten bereitzustellen, die ähnlich zu der in Schleim verstopft Bronchiolen existiert. Manipulieren chemische Bedingungen, wie beispielsweise die Medien pH-Wert des Sputums oder Antibiotika Drucks, ermöglicht die Visualisierung der mikrobiologische Unterschiede in den Proben, farbige Indikatoren, die gerade für Gas oder Biofilm-Produktion, oder Extrahieren und die Sequenzierung des Nukleinsäure Inhalts jeder Probe.
Introduction
Die in diesem Manuskript beschriebene Methode heißt das WinCF-System 1 . Das übergeordnete Ziel von WinCF ist es, eine experimentelle Einrichtung zur Verfügung zu stellen, die in der Lage ist, die Umgebung eines mit Schleim gefüllten Lungenbronchiole zu simulieren. Dies ermöglicht ein traktierbares System, um mikrobielle Pathogene von Lungenerkrankungen mit einem Schleim-Hypersekretionsphänotyp einschließlich zystischer Fibrose (CF), chronisch obstruktiver Lungenkrankheit (COPD), Asthma und anderen zu untersuchen. Das Verfahren wurde speziell für die Untersuchung von CF entwickelt, die durch Mutationen gekennzeichnet ist, die dazu führen, dass Lungensekrete dick und schwer zu klären sind, schließlich füllende Bronchiolen und andere kleine Durchgänge mit Schleim 2 . Solche Blockaden in der Lungen hemmen Gasaustausch, weil inhalierte Luft nicht mehr in der Lage ist, viele Alveolen zu erreichen und auch einen Lebensraum für die Bakterienkolonisation 3 , 4 zu schaffen . Die Unfähigkeit, das mikrobielle Wachstum zu verhindernübermäßige Lunge Schleim führt schließlich zu der Entwicklung von komplexen chronischen Infektionen der Atemwege. Diese Gemeinschaften enthalten eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Viren, Pilze und Bakterien , wie Pseudomonas aeruginosa, die alle in Wechselwirkung miteinander , 5, 6, 7, 8. Die Aktivität der CF Lungen microbiome wird angenommen , in Leuchtsignale von Symptomen pulmonale Exazerbationen 1, 9, 10, 11 genannt beteiligt sein. WinCF ermöglicht Studie der mikrobiellen Gemeinschaft Verhalten rund um diese Exazerbationen und jetzt erweitert wird als Basis experimentelles System zu handeln Lunge mikrobielle Ökologie zu studieren. Traditionell wurden Exazerbationen durch direkte Analyse von Proben aus der Lunge entnommen suchen. Viele Störfaktoren machen direkte Analyse der mikrobiellen bVerhalten in der Lunge herausfordernd, mit dem WinCF-System werden viele dieser Faktoren entfernt und das Verhalten des Lungenmikrobioms kann direkt untersucht werden, was eine feinere Analyse der Bakterienaktivität in einem Schleimhautbronchiole ermöglicht.
Das WinCF-System bietet eine Methode zum Bilden und Analysieren von Bakterien in einer Weise, die die Lungenumgebung effektiv nachahmt. Traditionelle Methoden zum Aufwachsen von Lungenbakterien beteiligten sich oft an der Kultivierung von Proben auf traditionellen Agarplatten. Diese Methoden lassen die Proben dem atmosphärischen Sauerstoff offen und vernachlässigen die hypoxischen und oft anoxischen Zustände bei Lungenbronchiolen, die mit dem Schleim 12 , 13 verbunden sind . Die Kultivierung auf Agar unter aeroben Bedingungen ist nichts wie die Umgebung der CF-Lunge und kann Kliniker und Forscher über das Verhalten der Krankheitserreger, die sie behandeln wollen, irreführen. Zusätzlich sind die Nährstoffe für Bakterien auf Agarplatten erhältlichSind unähnlich zu denen, die in der tatsächlichen Sputum, die in WinCF durch die Verwendung von künstlichen Sputum Medien (ASM) berücksichtigt wird. Wie die Pseudomonas- Kulturen in Sriramulu et al. 14 , ASM enthält einen bestimmten Satz von Komponenten, die die verfügbaren Ressourcen für Sputum-Mikroben nachbildet und auch die physikalische Konsistenz von Sputum repliziert. Weil eine kranke Lunge ein spezifisches Mikrobiom hat, sollte das Studium solcher Mikroorganismen idealerweise auch in den spezifischen Bedingungen der Lunge stattfinden.
Das WinCF-System ermöglicht eine schnelle Analyse und eine einfache Manipulation der experimentellen Bedingungen, um mikrobielle Veränderungen zu beobachten, ähnlich wie sie bei einer tatsächlichen Lungenbronchiole auftreten würden. Diese Technik ermöglicht die Inokulation einer Vielzahl von verwandten Probenarten einschließlich Sputum, Speichel, andere Körpersekrete und reine oder gemischte Bakterienkulturen. Die Natur des experimentellen Aufbaus ermöglicht eine sofortige visuelle Interpretation vondas mikrobielle Gemeinschaft Verhalten und ist so konzipiert, leicht nachgeschaltete Anwendung einer Vielzahl von mikrobiologischen und omics Verfahren zu ermöglichen. Solche Studien sind wichtig, weil bakterielle Veränderungen Gemeinschaft Zusammensetzung basierend auf den physikalisch-chemischen Bedingungen ihrer Umwelt. Mit WinCF die chemischen Bedingungen der Medien manipuliert werden, um die Auswirkungen auf die bakterielle Aktivität zu analysieren. Zum Beispiel kann der Säuregehalt der Medien geändert werden, bevor mit einer Probe der Inokulation. Nach der Inkubation kann die bakterielle Aktivität in jedem dieser Bedingungen direkt miteinander verglichen werden und Rückschlüsse darüber, wie Bakterien in diesen Sputum-Proben verhalten sich als Reaktion auf verschiedene pH gezogen werden. Hier erläutern wir die Verfahren zur Anwendung des WinCF System und Beispiele dafür, wie die Medien Chemie manipuliert werden kann, die Auswirkungen auf die Lunge microbiome zu studieren.
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Protocol
1. Herstellung von Aktien für die Artificial Sputum Medien
- Erstellen Sie eine 5% Mucin Lösung. Hinzufügen 1,0 g entwässertes Schweinemagen zu 20 ml entionisiertem Wasser Mucin. Autoclave die resultierende Lösung.
HINWEIS: Die Mucin-Sterilisation wird seine inhärente Struktur zerstören; andere Verfahren, die die Muzin in ihrer trockenen Form umfassen UV-Bestrahlung und Sterilisation zu sterilisieren. Diese Verfahren sind nicht für das WinCF System jedoch ausgiebig genutzt. - In 2,2 g KCl auf 50 ml entsalztem Wasser und lassen für die Auflösung. Hinzufügen von 5,0 g NaCl zu 50 ml entionisiertem Wasser und ermöglichen für die Auflösung. Autoclave diese beiden Lösungen.
- Je 100 mg Lachssperma-DNA zu 10 ml sterilem deionisiertem Wasser. Erhitzen Sie diese Lösung auf etwa 85 ° C in einem Wasserbad für einige Stunden Auflösung zu gewährleisten.
- Hinzufügen 5,0 mg Ferritin bis 5,0 ml sterilem deionisiertem Wasser.
2. Herstellung des künstlichen Sputum Medium
- KombinierenDie folgenden Komponenten: 16 ml Mucin-Stammlösung, 2,0 ml KCl-Stammlösung, 2,0 ml NaCl-Stammlösung, 200 μl Eigelb-Emulsion, 5,6 ml DNA-Stammlösung, 120 μl Ferritin-Stammlösung, 5,78 ml essentiell Aminosäurelösung, 5,78 ml nicht essentielle Aminosäurelösung und 2,44 ml steriles Wasser.
- Wenn kleine Mengen von Sediment erscheinen, schütteln Sie sanft zu mischen.
- Pipettieren Sie 5,0 ml Medium in acht sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Die chemischen Bedingungen jedes Röhrchens können wie gewünscht manipuliert werden. Zum Beispiel können Pufferlösungen und pH-Indikatoren zu jedem Röhrchen hinzugefügt werden, um das mikrobielle Verhalten bei verschiedenen pH-Werten zu vergleichen. Eine Demonstration hiervon zeigt sich im repräsentativen Ergebnisbereich mit 8 verschiedenen pH-Werten von 5,0 bis 8,5 in 0,5 pH-Schritten.
- Sobald die chemischen Bedingungen der Medien erfolgreich manipuliert sind, frieren Sie für spätere Verwendung. Die Medien bleiben stabilZen bei -20 ° C für mehrere Monate. Vortex beim Auftauen.
3. Vorbereitung eines Kontrolllaufs der Kapillarrohre
- In einem sterilen Biohood füllen Sie acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 250 μl Medium.
- Erwerben Sie acht weitere sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei jedes Röhrchen einem in Schritt 3.1 genannten Mikrozentrifugenröhrchen entspricht.
- Sterilisieren Sie ein Papiertuch mit 70% iger Ethanol-Lösung und trocknen lassen. Sobald es getrocknet ist, reißen Sie das Handtuch in Stücke von etwa vier Quadrat-Zoll und zerbröckeln jedes Stück in der Unterseite eines 15-ml-Zentrifugenröhrchens. Für zusätzliche Röhrchen, Spray und trockene zusätzliche Papiertücher nach Bedarf.
- Mit einem Klumpen Papier an der Unterseite jedes Zentrifugenröhrchens, dämpfen Sie jeden Papierklumpen mit ca. 1,0 ml sterilem Wasser, um eine feuchte Umgebung zu erzeugen.
- Erhalten Sie drei Glas-Kapillarröhrchen für jedes in Schritt 3.1 hergestellte Mikrozentrifugenröhrchen und einen Block aus Kapillarrohr-Kitt SealaNt
- Für jedes Mikrozentrifugenröhrchen füllen Sie drei Kapillarrohre mit Medien bis etwa 5 mm von der blauen Markierung in der Nähe der Oberseite des Röhrchens ab.
- Füllen Sie, indem Sie ein Ende des Rohres im Mikrozentrifugenröhrchen halten und in Richtung der horizontalen Ausrichtung kippen, so dass Kapillarwirkung das Medium in das Röhrchen führen kann (siehe Abbildung 1 ).
- Stoppen Sie die Füllung, indem Sie sanft einen Handschuh über das offene Ende des Rohres legen und dann das andere Ende des Rohres abdichten, indem Sie es in den Dichtungsblock drücken.
Abbildung 1: Beispiel pH-Gradient, Füllen Kapillarrohr mit künstlichem Sputum Medium. Das Medium wird durch Einsetzen eines Endes des Röhrchens in die Flüssigkeit und Kippen hinzugefügt, um die Kapillarwirkung zu erleichtern. Die mittlere Färbung in diesem Beispiel ist aufgrund der pH-Indikator hinzugefügt, um Dämon zu helfenNach der Inkubation potenzielle Säureänderungen durchführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Legen Sie jeden Satz von drei Kapillarröhrchen in 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit Papiertüchern gefüllt sind, die vollständig mit sterilem Wasser angefeuchtet wurden, Kitt-versiegelte Seite nach unten. Kappe die Tube und Etikett. Diese drei Kapillarröhren dienen zur Replikation jeder Kontrollbedingung.
- Wenn alle 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit den dafür vorgesehenen Kapillarrohren gefüllt sind, legen Sie die Röhrchen in einen Halterahmen. Stellen Sie das Gestell so auf, dass die Röhrchen horizontal inkubiert werden (um Gasblasen zu fangen) (siehe Abbildung 2 ). Inkubieren Sie die Kapillarröhrchen innerhalb der Zentrifugenröhrchen (mit den befeuchteten Papierklumpen) bei 37 ° C für 48 h.
Abbildung 2: Beispiel pH - Gradient, Kapillarröhrchen Bereit Inkubation. Sobald drei Kapillarröhrchen gefüllt wurden und versiegelt, werden sie in einem Zentrifugenröhrchen mit einem feuchten Papiertuch an der Unterseite angebracht. Dieses Rohr wird dann verschlossen und in ein Gestell gelegt. Das Rack muss während der Inkubation orientiert seitwärts, wie hier dargestellt, so dass die Gasproduktion beobachtet werden kann, sobald die Inkubation abgeschlossen ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Imaging der Kontroll Kapillarröhrchen nach Inkubation
- Entfernen Sie die Ständer von Zentrifugenröhrchen aus dem Inkubator, um sicherzustellen, die Rohre horizontal zu halten. gleiten sorgfältig die Kapillarröhren aus den Zentrifugenröhrchen, wobei jeder Satz aus drei getrennt von anderen Sätzen zu halten.
- Ordne die Kapillarröhren nebeneinander auf einem Leuchtkasten, alle aufgereiht, so dass der Inhalt der Röhren sind visUnd beleuchtet Lassen Sie eine Lücke alle drei Röhren, um verschiedene chemische Bedingungen zu trennen.
- Mit den Rohren ausgerichtet und lightbox eingeschaltet, foto von oben oben. (Siehe Abbildung 3 )
Abbildung 3: Beispiel pH-Gradient, Kontrolllauf, Vorinkubation, kein Sputum hinzugefügt. Künstliches Sputum-Medium nach der Zugabe zu Kapillarröhrchen in Sätzen von drei, Erhöhung des pH-Werts von links nach rechts. Die Kombination der Indikatoren, die dem Medium hinzugefügt wurden, führt zu mehr sauren Röhrchen, die mehr gelb erscheinen, während weniger saure Röhrchen lila werden. Die Rohre sind horizontal angeordnet und werden von unten beleuchtet, von oben fotografiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- EntsorgenKontrollmaterialien in biologischen Abfällen.
5. Inokulation des WinCF Kapillarröhrchen mit einem Sputumprobe
- In einem sterilen biohood füllt acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit 225 & mgr; l Medium pro Person.
- Homogenisieren der Sputumprobe durch Herausziehen und Auswerfen des Sputums wiederholt mit einer 3 ml-Spritze (eine Plastikspritze ohne Nadel). Tun Sie dies, bis der Auswurf der glatten Konsistenz ist.
- Zugabe von 25 & mgr; l Sputum homogenisierte zu jedem Reaktionsgefäß (1/10 Verdünnung in ASM media), hergestellt in Schritt 5.1. Dann vortexen die Röhrchen für 30 s ausreichend zu mischen.
- Fügen Sie die Medien Kapillaren nach dem gleichen Verfahren wie 3.2 bis 3.5 Schritte.
6. Imaging von Probe Kapillarröhrchen nach Inkubation
- Nach der Inkubationszeit von 48 h, entfernen und Bild der Kapillarröhrchen nach dem gleichen Verfahren wie die Schritte 4.1 bis 4.3.
- Wenn Luftblasen in den Rohren vorhanden sind, machensicher, dass die zeigen aufgenommenen Fotografien deutlich die Abgrenzung zwischen den Blasen und Medien in den Rohren. Wenn Biofilm vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass die Fotos eindeutig seine Präsenz als auch darstellen kann.
7. Entfernen von Medien für Downstream-Anwendungen
- Zur Erleichterung des Downstream-Analyse, entfernt die Medien aus den Kapillarröhrchen nach der Bebilderung. Mögliche Anwendungen umfassen die Kultivierung und DNA / RNA-Sequenzierung und metabolomic Profilierung.
Achtung: Die Glaskapillarröhren gefüllt mit Krankheitserregern sind ein bedeutender Biohazard, so müssen diese Schritte sehr sorgfältig mit der speziellen Ausrüstung durchgeführt werden. Wenn Kapillaren brechen, entsorgen Behälter richtigen Biohazard sharps. - Verwenden blunt ended Nadeln von 25 Gauge und 0,5 Zoll in der Länge, die Medien zu entfernen. Legen Sie die blunt ended Nadel in das verstopfte Ende der Röhre um die Dichtung zu brechen.
- Nachdem die Dichtung zu brechen, drehen das Kapillarrohr den Kopf und die Medien aus dem oberen Teil heraustropfen. ichWenn die Medien nicht leicht abtropfen, verwenden Sie eine Pipette mit einer 200 μl Spitze und vertreiben Sie das Medium aus dem Schlauch heraus, indem Sie den Pipettenkolben nach unten drücken, wenn er in das Ende des Kapillarrohres eingeführt wird. Das ausgestoßene Röhrchenmedium in einem geeigneten Behälter (1,5 mL Zentrifugenröhrchen) sammeln.
HINWEIS: Für die transkriptomische oder andere RNA-Analyse können die Medien direkt in RNA-stabilisierende Puffer ausgewiesen werden.
8. Das WinCF FLUD System
HINWEIS: Das WinCF Fluid Loading Utility Device (FLUD) System ist eine optionale Suite von komplementären Geräten zur Optimierung des Durchsatzes des WinCF Systems. Das WinCF FLUD System besteht in erster Linie aus 3D bedruckbaren Materialien. 3D gedruckte Fertigung ermöglicht einen schnellen und einfachen Austausch von Materialien, um minimale Ausfallzeiten für Forscher sowie minimale Fertigungsanforderungen zu gewährleisten. Entwürfe, Stl-Dateien, 3D-Druckanweisungen und das WinCF FLUD-Handbuch finden Sie im Online-SupplemeNt
- Medien für die Kapillarrohrbeladung vorbereiten
- In einem sterilen Biohood füllen Sie acht sterile 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit je 900 μl Medium.
- Homogenisieren Sie alle Sputumproben, indem Sie das Sputum wiederholt mit einer 3-ml-Spritze (einer Plastikspritze ohne Nadel) abziehen und ausstoßen. Tun Sie dies, bis das Sputum ist von glatter Konsistenz.
- 100 μl homogenisiertes Sputum zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen (1/10 Verdünnung in Medium), hergestellt in Schritt 8.1.1, zugeben. Dann die Röhrchen für 30 s vortexen, um ausreichend zu mischen.
- Schlitz die gefüllten und offenen Mikrozentrifugenröhrchen in den Rotatorrohrhalter, der so ausgerichtet ist, dass die Rohre vertikal sind.
- Platzierung von Kapillarrohren
- Drei Kapillarröhrchen für jedes Mikrozentrifugenröhrchen in Schritt 8.1 abholen.
- Schieben Sie drei Röhrchen in die Gummi-Wiege, so dass sie mit den Mikrozentrifugenröhren am anderen Ende des Gerätes ausgerichtet sind.Vergewissern Sie sich, dass die markierten Enden der Rohre von den Mikrozentrifugenröhrchen abgewandt sind. Setzen Sie die drei Löcher auf die Unterseite der Wiege richtig über die drei Bolzen auf dem Wiege stehen.
- Wenn die platzierten Kapillarröhrchen in ihren Führungskanälen auf dem Apparat ruhen, legen Sie den Gummistoß sicher über den Mittelteil, um ein Verschieben zu verhindern. (Siehe Abbildung 4 )
Abbildung 4: Das FLUD-System, das vollständig mit Kapillarrohren beladen ist, die durch den Gummistoß über ihre Mittelsektionen gesichert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Einlegen von Medien in die Kapillarrohre
- Verwenden Sie sorgfältig eine Hand, um das Ende des Gerätes zu erfassen, wo die Kapillarrohre liegenaded, und die andere Hand den Rotator Gestell, in dem die Mikrozentrifugenröhrchen geladen zu halten.
- Delikat drehen, um die Mikrozahnstange, so dass die Mikrozentrifugenröhrchen fast horizontal sind und schreiten langsam die Zahnstange in Richtung der Kapillarröhren zu schieben. (Siehe Abbildung 5)
- Wenn die Enden der Kapillarröhren Kontakt mit den Medien in den Mikrozentrifugenröhrchen machen, stellen Sie sicher, dass sofort Kapillarwirkung beginnt die Kapillaren zu füllen. Um Füllrate einstellen und Füllstand, drehen Sie vorsichtig die Vorrichtung als Ganzes. Während dies zu tun, seien Sie vorsichtig nicht Medien aus den Mikrozentrifugenröhrchen zu verschütten. (Siehe Abbildung 6)
- Wenn die Kapillarröhrchen auf gewünschte Pegel gefüllt sind, stellen die Vorrichtung Ebene auf einer Oberfläche und vorsichtig noch schnell das Gestell von Mikrozentrifugenröhrchen von den Enden der Kapillarröhrchen ziehen einzustellen füllt. Die Reaktionsgefäße können nun den ganzen Weg zurück zur vertikalen Position zurückgezogen und geschlossen werden.
- Abdichten des überstehenden Endes der Kapillarröhrchen durch einen Dichtungsblock auf jeden Satz dreifachen Ausführung Pressen, Dichtungs- einen Satz zu einer Zeit, bis alle Sätze abgedichtet sind. Um das Risiko der Kontamination zu reduzieren, drücken , um einen anderen Teil des Dichtungsmittelblockes auf jede dreifachen Ausführung eingestellt ist (siehe Abbildung 7).
Abbildung 5: Das FLUD - System mit Mitteln Tubes Eingesetzt in eine horizontalen Ausrichtung, fertig Kontakt mit Kapillarröhrchen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Das FLUD - System mit Kapillarröhrchen mit Medien über Kapillarwirkung Laden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Abdichten gefüllte Kapillarrohre auf dem FLUD-System Ein Triplicate Set zu einem Zeitpunkt mit einem Sealant Block. Dieser Dichtungsblock hatte an den Kanten Kunststoff, der abgeschnitten wurde, um den Kontakt mit benachbarten dreifachen Sätzen während des Versiegelns zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Inkubation
- Entfernen Sie den Gummistoß über den Teller-Mittelteil und heben Sie die Gummi-Wiege vom Hauptgerät ab. Das sollten alle Kapillarrohre mitnehmen. Setzen Sie nun die Wiege und die Röhren auf das Imaging-Rack. Dieses raCk hat drei Stubs, die in die Wiege passen, sowie kleine Führungskanäle, um die Rohre einzusetzen.
- Stellen Sie das Imaging-Rack als Ganzes in die klare Kunststoff-Inkubationsbox ein. Kleine Mengen steriler Papiertücher in steriles Wasser einweichen und an den beiden kürzeren Seiten der Schachtel anbringen, um während der Inkubation Feuchtigkeit zu liefern. (Siehe Abbildung 8 )
- Schließen Sie die Schachtel vollständig und stellen Sie sie in einen 37 ° C Inkubator ein und achten Sie darauf, die Rohre waagerecht zu halten. Inkubieren für 48 h.
Abbildung 8: Kapillarrohre in der Gummi-Wiege vom FLUD-System auf ein Imaging-Rack übertragen, das in einer klaren Inkubationsbox neben feuchten Papiertüchern angeordnet wurde, um Feuchtigkeit zu liefern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version von th anzuzeigenIst Figur.
- Bildgebung und Extraktion
- Entfernen Sie das Imaging-Rack, das die Rohre hält, aus der Inkubationsbox und legen Sie es auf einen Leuchtkasten, der von unten beleuchtet ist. Bei den Röhren, die sich bereits im Imaging-Rack befinden, werden die Triplicate-Sets richtig beabstandet und sofort fertig.
- Fokussieren Sie die Kamera auf die Röhren, so dass alle sichtbar sind im Sichtfeld und Licht aus dem Lichtkasten bietet ausreichend Kontrast und Visualisierung der Farbe in den Röhrenfarbstoffen. Foto von direkt oben.
- Um den Inhalt der Rohre zu extrahieren, entfernen Sie die Kapillarrohre aus der Gummi-Wiege einen Satz von Triplikaten zu einer Zeit. Heben Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Wiege heraus und schieben Sie sie heraus.
- Für jeden Satz von Triplikaten folgen Sie den in den Schritten 7.1 bis 7.3 beschriebenen Extraktionsverfahren.
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Representative Results
Das mikrobiologische Wachstum über die verschiedenen chemischen Zustände, die in den Proben induziert wurden, variierte drastisch in einigen Fällen und subtiler in anderen. Viele Veränderungen in der Aktivität waren in der Natur visuell, sobald die Inkubationszeit endete. Im Beispiel der pH-Manipulation variierten die Proben über dem pH-Spektrum stark, wie durch mehrere Faktoren gezeigt wurde, die nach der Inkubation sichtbar wurden. Wenn dem Medium keine Sputumproben zugesetzt wurden, zeigte sich nach 48 h der Inkubation nur eine weitere Abnahme des mittleren Volumens, die sich aus einer geringfügigen Verdampfung ergab (Abbildung 9 ). Inokulierte Kapillarröhrchen zeigten Volumenveränderungen, das Auftreten von Gasblasen, veränderte Färbung und das Auftreten von opaken Ablagerungen (Abbildung 10 ).
Abbildung 9: Beispiel pH-Gradient, Kontrolllauf, Nachinkubation, kein Sputum hinzugefügt. Die gleichen Kapillarröhrchen, die in Fig. 1 gezeigt sind, nachdem sie bei 37ºC für 48 h inkubiert worden waren. Die Färbung bleibt weitgehend unverändert, was auf keine signifikanten Verschiebungen im pH-Wert hindeutet. Leicht reduzierte Mengen des Mediums bleiben aufgrund der geringfügigen Verdampfung aus den offenen Enden der Röhrchen während der Inkubation zurück. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 10: Beispiel pH-Gradienten-Ergebnisse, Nach-Inkubation, Sputum hinzugefügt, Gas-Produktion scheinbar. Kapillarröhrchen mit künstlichem Sputum-Medium nach der Vermischung mit Sputum von einem CF-Patienten. Die Rohre sind in der aufsteigenden Reihenfolge angeordnetDes pH-Wertes als Kontrolllauf. Auffällige Unterschiede zum Kontrolllauf, die in Fig. 2 gezeigt sind, umfassen große Verschiebungen in der Färbung, wobei anfänglich niedrige oder mittlere pH-Röhrchen sehr leicht gefärbt werden, was auf große Tropfen im pH-Wert hindeutet. Die höchsten pH-Röhrchen änderten die Färbung weniger drastisch, was auf eine geringere pH-Änderung hinweist. Blasen sind in Röhrchen mit niedrigem und mittlerem pH-Wert vorhanden, was auf eine fermentative Anaerobe-Aktivität hinweist. Opake Abschnitte sind auch in allen Röhrchen vorhanden, mit einer höheren Menge in denen mit niedrigerem pH-Wert, was auf eine weitere mikrobielle Aktivität verschiedener Sorten hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Bakterien und andere Mikroben, die in dem zugegebenen Sputum enthalten sind, in der Lage sind, sich innerhalb des künstlichen Mediums zu wachsen und zu verändern. Unterschiede zwischen den simulierten chemischen Bedingungen warenStark und leicht verglichen, Biofilm-Produktion, die Gasproduktion und verschiedene Farbänderungen auf der Grundlage zugesetzter Indikatoren aufweisen. Im Fall des pH-Experiments war die wichtigste Änderung die Gaserzeugung, die mit einem pH-Wert viel häufiger in Rohren niedrigeren pH betrug 6,0 und 6,5 im Allgemeinen die meisten Blasen aufweisen. Anderes opakes Material wurde in den meisten Rohren, indikativ für weitere mikrobielle Aktivität auftritt in den Medien beobachtet, obwohl höhere pH Kapillarröhrchen weniger aufweisen neigten. Die meisten Rohre hatten einen gelben Ton als bisher angenommen, was darauf hinweist, dass die Gesamt pH-Wert der Medien fallen gelassen. Medien mit hoher pH-Wert blieb im Allgemeinen ähnlich wie ihre Anfangsfärbung, was auf eine geringe Änderung des pH-Wertes.
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Discussion
Die mikrobiologische Make-up einer Lunge mit CF enthält eine Vielzahl von Organismen, aber die Bedingungen innerhalb der Lunge haben wahrscheinlich einen signifikanten Einfluss auf welche Arten von Mikroben überleben und gedeihen können 13 , 15 . Spezifische Mechanismen, durch die sich diese Bedingungen ändern und die genauen Wirkungen auf das Lungenmikrobiom sind im Allgemeinen unklar. In dieser experimentellen Methode stellen wir eine Analyse der mikrobiologischen Veränderungen auf der Grundlage der manipulierten chemischen Bedingungen in einem simulierten Lungenbronchiole vor.
Es gibt einige kritische Schritte des Protokolls. Halten Sie das künstliche Sputum mittel steril, bevor die Zugabe von Sputumproben wichtig ist, wenn man das Mikrobiom der zu analysierenden Umgebung betrachtet. Ausländische Mikroben könnten möglicherweise die Bedingungen verändern und die Genauigkeit der Bronchiole-Simulation stören. Die Mikroben könnten auch die Zielpathogene in den s übertreffenputum Proben verwendet, jede Analyse von Veränderungen Nachinkubation beeinträchtigen. Es ist wichtig, die Kapillarröhrchen horizontal inkubieren. Dies ist wichtig, weil sie für die Beobachtung der Gasproduktion ermöglicht. Wurden die Röhrchen vertikal, um das Gas nach oben und aus inkubiert kann aus dem Medium erzeugt steigen, die ein Aussehen ohne Gasproduktion gibt überhaupt. beide Enden Anstecken kann eine größere Gasproduktion ohne den Verlust von Gas erleichtern. Allerdings würden die notwendigen Sauerstoff-Gradienten aufgebrochen.
Das Protokoll ist offen für verschiedene Modifikationen, die von der chemischen Zusammensetzung der Medien auf die Arten von Proben beimpft. Spezielle Medikamente können leicht in der Vorbereitungsphase hinzugefügt werden, und verschiedene Inkubationsbedingungen verschiedene Einstellungen simulieren könnte, in denen die Mikroben befinden würden. Dieses Experiment verwendet auch speziell Sputum-Proben CF Erreger enthält, aber Proben von anderen Lungenerkrankungen könnten Trends ersetzt werden unter diesen besonderen verfolgenPathogene
Eine wichtige Einschränkung dieser Technik besteht darin, daß der Inhalt der Kapillarröhrchen bei der Extraktion aus den Röhrchen im wesentlichen homogenisiert wird und viele Daten bezüglich der mikrobiellen Aktivität in verschiedenen Schichten innerhalb der Spalte des Mediums verfällt. Zum Beispiel würde das Medium in der Nähe der Luft potentiell mehr aerobe Organismen enthalten, wobei das Medium weiter unten mehr anaerobe Organismen enthält. Diese beiden getrennten Sätze von Mikroben würden miteinander vermischt, wenn die Röhrchen in eine Aufnahme zur Sequenzierung oder Verarbeitung entleert würden. Zukünftige Studien mit WinCF zielen darauf ab, Methoden zu entwickeln, um die mikrobielle Gemeinschaft durch die Länge der Röhre zu visualisieren und zu visualisieren.
Dieser Ansatz zur Lungen-Sputum-Analyse liefert eine genauere Einstellung für das Wachstum von Lungenmikroben als ein herkömmliches Agarplattenverfahren, bei dem die Kulturen auf einem festen, auf die Luft offenen Medium wachsen. Proben aus BronchiolenOder ähnliche Einstellungen werden in der Kapillarrohranordnung aufgrund von Ähnlichkeiten, die mit einer tatsächlichen Lungenbronchiole geteilt werden, geeigneter kultiviert. Diese experimentelle Anordnung berücksichtigt den physikalischen Raum, die Sputumchemie, die Feuchtigkeit, die mittlere Konsistenz und die Sauerstoffgradienten, die in einer aktuellen CF-Lunge 12 , 13 vorhanden wären.
Diese Technik kann verwendet werden, um viele Bedingungen zu behandeln, die für eine Krankheit mit dem Lungenmikrobiom relevant sind. Die chemischen Bedingungen des künstlichen Sputummediums können vor der Zugabe der gewünschten mikrobiellen Proben leicht manipuliert werden, was eine bequeme Methode zur Beobachtung der Wirkungen möglicher Behandlungen oder Veränderungen bietet. Zum Beispiel würde die Zugabe von spezifischen Arten von Antibiotika auf das Medium vor der Zugabe von Lungen-Sputum-Proben Daten liefern, wie diese Medikamente die mikrobielle Gemeinschaft einer Lungenbronchiole beeinflussen würden. Das WinCF-System ist ein neues Werkzeug, um das zu studierenLungenmikrobiom mit direkten klinischen Anwendungen. Traditionelle Methoden des Lernens des Lungenmikrobioms beinhalten die Sequenzierung von Schleimproben direkt, mit WinCF kann die Gemeinschaft aktiv angebaut werden, um ihren kollektiven Stoffwechsel besser zu visualisieren und zu analysieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass WinCF das Mikrobiom in einer Sputumprobe 1 gut reproduziert und somit ein wirksames Instrument für Experimente mit einzelnen Pathogenen, Co-Kulturen und Organismen von Organismen darstellt, die menschliche Lungen infizieren und schädigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Vertex Pharmaceuticals und den Cystic Fibrosis Research Innovation Award für die Finanzierung von R. Quinn und der NIH / NIAID zur Finanzierung von 1 U01 AI124316-01, einem systembiologischen Ansatz zur Behandlung von Multi-Arzneimittelresistente Pathogenen, anerkennen. Wir danken auch der Abteilung für Mechanische und Luft- und Raumfahrttechnik bei UCSD's Undergraduate Maschinenbau Senior Design Design für die Erleichterung der Zusammenarbeit mit den technischen Aspekten dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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