Summary
O muco das vias respiratórias ligado de fibrose cística (FC) pacientes são um ambiente ideal para agentes patogénicos microbianos prosperar. O manuscrito descreve um novo método para estudar a microbiome CF pulmão num ambiente que imita onde causam doença e como alterações de condições químicas pode conduzir dinâmica microbianas.
Abstract
Muitas doenças crônicas das vias aéreas resultam em obstrução do muco das vias aéreas. Os pulmões de um indivíduo com fibrose cística são um caso exemplar onde seus bronquíolos obstruídos pelo muco criam um habitat favorável para a colonização microbiana. Vários agentes patogénicos prosperam neste ambiente interagindo uns com os outros e conduzindo muitos dos sintomas associados com doença de FC. Como qualquer comunidade microbiana, as condições químicas de seu habitat têm um impacto significativo na estrutura e dinâmica da comunidade. Por exemplo, diferentes microrganismos prosperam em diferentes níveis de oxigénio ou outras concentrações de soluto. Isto também é verdade no pulmão de FQ, onde se acredita que as concentrações de oxigênio conduzem a fisiologia e estrutura da comunidade. Os métodos descritos aqui são projetados para imitar o ambiente pulmonar e gerar patógenos de uma maneira mais semelhante àquela de que eles causam a doença. Manipulação do ambiente químico desses micróbios é então usado para estudar como o chemistry de infecções pulmonares regula a sua ecologia microbiana. O método, chamado o sistema WinCF, baseia-se em meio de expectoração artificial e tubos capilares estreitos destinam a proporcionar um gradiente de oxigénio similar ao que existe no bronquíolos ligado de muco. Manipulando as condições químicas, tais como o pH do meio da expectoração ou antibióticos pressão, permite a visualização das diferenças microbiológicos nas amostras utilizando indicadores coloridos, para observação de gás ou de biofilme de produção, ou extracção e sequenciando os teores de ácidos nucleicos de cada amostra.
Introduction
O método descrito neste manuscrito é chamado de sistema WinCF 1 . O objetivo geral do WinCF é fornecer uma instalação experimental capaz de simular o ambiente de um bronquíolo pulmonar cheio de muco. Isto permitirá um sistema de tratamento para estudar patógenos microbianos de doenças pulmonares com um fenótipo de hipersecreção de muco incluindo fibrose cística (FC), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), asma e outros. O procedimento foi projetado especificamente para o estudo da FC, que é caracterizada por mutações que causam secreções pulmonares para tornar-se espessa e difícil de limpar, eventualmente enchimento bronquíolos e outras pequenas passagens com muco 2 . Tais bloqueios no pulmão inibem a troca de gases porque o ar inalado não é mais capaz de atingir muitos alvéolos e também proporcionar um habitat para colonização bacteriana 3 , 4 . A incapacidade de prevenir o crescimento microbianoO excesso de muco pulmonar leva eventualmente ao desenvolvimento de infecções crónicas complexas das vias aéreas. Estas comunidades contêm uma variedade de organismos, incluindo vírus, fungos e bactérias como Pseudomonas aeruginosa , todos interagindo uns com os outros 5 , 6 , 7 , 8 . Acredita-se que a atividade do microbioma pulmonar da FC esteja envolvida em crises de sintomas denominadas exacerbações pulmonares 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF permite o estudo do comportamento da comunidade microbiana em torno dessas exacerbações e agora está sendo expandido para atuar como um sistema experimental de base para estudar a ecologia microbiana pulmonar. Tradicionalmente, as exacerbações foram estudadas através da análise direta de amostras retiradas do pulmão. Muitos fatores de confusão fazem análise direta do microbiano bComportamento no pulmão desafiando, com o sistema WinCF, muitos desses fatores são removidos eo comportamento do microbioma pulmonar pode ser estudado mais diretamente, permitindo uma análise mais fina da atividade bacteriana em um muco-plugged bronchiole.
O sistema WinCF fornece um método para crescer e analisar as bactérias de uma forma que efetivamente imita o ambiente pulmonar. Os métodos tradicionais para o cultivo de bactérias pulmonares envolvem frequentemente a cultura de amostras em placas de agar tradicionais. Esses métodos deixam as amostras abertas ao oxigênio atmosférico, negligenciando a explicação das condições hipóxicas e muitas vezes anóxicas encontradas nos bronquíolos pulmonares obstruídos pelo muco 12,13 . A cultura em ágar sob condições aeróbicas não é nada como o ambiente do pulmão de FQ e pode induzir em erro os clínicos e pesquisadores quanto ao comportamento dos patógenos que eles estão tentando tratar. Além disso, os nutrientes disponíveis para bactérias em placas de ágarSão diferentes daquelas disponíveis no escarro real, o que é explicado no WinCF através da utilização de meios de escarro artificial (ASM). Tal como demonstrado pelas culturas de Pseudomonas em Sriramulu et al. 14 , ASM inclui um conjunto específico de componentes que imita os recursos disponíveis para os micróbios de expectoração e também reproduz a consistência física do escarro. Porque um pulmão doente tem um microbiome específico, o estudo de tais microorganisms deve ocorrer idealmente nas circunstâncias específicas do pulmão também.
O sistema WinCF permite uma análise rápida e fácil manipulação das condições experimentais para observar alterações microbianas semelhantes à forma como elas ocorreriam em um bronquíolo pulmonar real. Esta técnica permite a inoculação de uma miríade de tipos de amostras relacionadas incluindo escarro, saliva, outras secreções corporais e culturas bacterianas puras ou misturadas. A natureza da configuração experimental permite uma interpretação visual imediataO comportamento da comunidade microbiana e é projetado para permitir a fácil aplicação a jusante de uma infinidade de procedimentos microbiológicos e ósmicos. Tais estudos são importantes porque a composição da comunidade bacteriana muda com base nas condições físico-químicas de seu ambiente. Com WinCF as condições químicas da mídia podem ser manipuladas para analisar os efeitos sobre a atividade bacteriana. Por exemplo, a acidez do meio pode ser alterada antes da inoculação com uma amostra. Após a incubação, a actividade bacteriana em cada uma destas condições pode ser directamente comparada, e as conclusões podem ser tiradas sobre como as bactérias nessas amostras de escarro se comportam em resposta ao pH variável. Aqui, descrevemos os procedimentos para aplicar o sistema WinCF e exemplos de como a química dos meios pode ser manipulada para estudar os efeitos sobre o microbioma pulmonar.
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Protocol
1. Preparação de Stocks para o Artificial escarro mídia
- Crie uma solução de mucina 5%. Adicionar 1,0 g de estômago de porco desidratado mucina a 20 ml de água desionizada. Autoclavar a soluo resultante.
NOTA: A esterilização mucina irá destruir a sua estrutura inerente; outros métodos para esterilizar a mucina na sua forma seca incluem a esterilização de UV e a irradiação. Estes métodos não têm sido extensivamente usados para o sistema de WinCF no entanto. - Adicionar 2,2 g de KCl a 50 ml de água desionizada e permitir a dissolução. Adicionar 5,0 g de NaCl para 50 ml de água desionizada e permitir a dissolução. Autoclave estas duas soluções.
- Adiciona-se 100 mg de ADN de esperma de salmão a 10 mL de água desionizada estéril. Aquecer esta solução para cerca de 85 ° C num banho de água durante algumas horas para assegurar a dissolução.
- Adicionar 5,0 mg de ferritina de 5,0 ml de água desionizada estéril.
2. Preparação do Artificial escarro Médio
- Combinaros seguintes componentes: 16 ml de solução de estoque de mucina, 2,0 mL de uma solução de estoque de KCl, 2,0 mL de uma solução de estoque de NaCl, 200 mL de emulsão de gema de ovo, 5,6 mL de uma solução de estoque de DNA, 120 mL de solução de estoque de ferritina, 5,78 mL de essencial solução de ácido amino, 5,78 mL de solução de amino ácidos não-essenciais, e 2,44 mL de água estéril.
- Se pequenas quantidades de sedimentos aparecem, agitar suavemente para misturar.
- Pipetar 5,0 ml de meio em oito tubos de centrifugação estéril de 15 mL.
NOTA: As condições químicas de cada tubo podem ser manipuladas como desejado. Por exemplo, soluções tampão e indicadores de pH pode ser adicionado a cada tubo com a finalidade de comparar o comportamento microbiano a níveis de pH diferentes. Uma demonstração disto é mostrado na secção de resultados representativos com 8 níveis de pH diferentes, de 5,0 a 8,5 em incrementos de pH 0,5.
- Uma vez que as condições químicas da mídia são manipulados com sucesso, congelar para uso posterior. Os meios de comunicação permanecerá estável frozen a -20 ° C durante vários meses. Vortex após o descongelamento.
3. Preparação de um controlo da execução do capilar Tubes
- Numa biohood estéril, encher oito tubos de microcentrífuga estéreis com 250 ul de meio cada.
- Adquirir mais oito estéreis tubos de 15 ml de centrífuga, cada um dos tubos que corresponde a um tubo de microcentrífuga mencionado no passo 3.1.
- Esterilizar uma toalha de papel com uma solução de etanol a 70% e deixar secar. Depois de seco, rasgar a toalha em pedaços de cerca de quatro polegadas quadradas cada, e amassar cada pedaço no fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL. Para tubos adicionais, spray e toalhas de papel adicionais secos, conforme necessário.
- Com um grupo de papel na parte inferior de cada tubo de centrífuga, cada amortecer ligeiramente aglomerado papel com cerca de 1,0 mL de água estéril para criar um ambiente húmido.
- Obter três tubos capilares de vidro para cada tubo de microcentrífuga, preparado no passo 3.1 e um bloco de tubo capilar de vidraceiro sealant.
- Para cada tubo de microcentrífuga, preencher três tubos capilares com meios para cerca de 5 mm de distância do marcador azul perto do topo do tubo.
- Encha segurando uma extremidade do tubo no tubo de microcentrífuga e inclinando no sentido de orientação horizontal, permitindo a acção capilar para guiar o meio para dentro do tubo (Ver Figura 1).
- Pare o enchimento, colocando suavemente com um dedo enluvado sobre a extremidade aberta do tubo, e em seguida selar a outra extremidade do tubo, pressionando-a para baixo para dentro do bloco de vedante.
Figura 1: Exemplo pH Gradient, enchimento capilar tubo com Artificial escarro Médio. O meio é adicionada através da inserção de uma extremidade do tubo para dentro do líquido e a inclinação para facilitar a acção capilar. A coloração forma, neste exemplo, é devido ao indicador de pH adicionada para ajudar a demonPotenciais mudanças na acidez após incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque cada conjunto de três tubos capilares em tubos de centrifugação de 15 mL cheios de toalhas de papel completamente umedecidas com água estéril, com vedação de vedação para baixo. Tampe o tubo ea etiqueta. Estes três tubos capilares são para a replicação de cada condição de controlo.
- Quando todos os tubos de centrífuga de 15 mL estiverem cheios com os seus tubos capilares designados, coloque os tubos num suporte. Coloque o rack de modo que os tubos sejam incubados horizontalmente (para capturar as bolhas de gás) (ver Figura 2 ). Incubar os tubos capilares dentro dos tubos de centrífuga (contendo os agregados de papel umedecidos) a 37 ° C durante 48 h.
Figura 2: Exemplo pH Gradient, tubos capilares Pronto para incubação. Uma vez que três tubos capilares foram cheios e selados, que são colocados num tubo de centrífuga com uma toalha de papel húmido no fundo. Este tubo é em seguida tapado e colocado num bastidor. A cremalheira deve ser orientada lateralmente durante a incubação, como mostrado aqui, de modo que a produção de gás pode ser observado, uma vez a incubação estar completa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Imagem do Controle capilar tubos após incubação
- Remover o rack de tubos de centrífuga da incubadora, certificando-se de manter os tubos horizontal. Cuidadosamente deslizar os tubos capilares para fora dos tubos de centrífuga, mantendo-se cada conjunto de três separados de outros conjuntos.
- Dispor os tubos capilares próximos uns dos outros sobre uma caixa de luz, todos alinhados de modo que os conteúdos dos tubos são visIluminado. Deixar um intervalo de três em três tubos para separar diferentes condições químicas.
- Com os tubos alinhados e a caixa de luz ligada, fotografe diretamente acima. (Ver Figura 3 )
Figura 3: Exemplo de Gradiente de pH, Controlo Executado, Pré-incubação, Sem Escarro Adicionado. Meio de escarro artificial depois de ser adicionado aos tubos capilares em grupos de três, aumentando o pH da esquerda para a direita. A combinação de indicadores adicionados ao meio resultam em tubos mais ácidos aparecendo mais amarelos, enquanto que os tubos menos ácidos tornam-se mais roxos. Os tubos são dispostos horizontalmente e são iluminados a partir de baixo, fotografado de cima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Descarte oMateriais de controlo em resíduos biodegradáveis.
5. Inoculação dos tubos capilares WinCF com uma amostra de escarro
- Numa biofundidade estéril, enche oito tubos de microcentrífuga estéril com 225 μL de meio cada.
- Homogeneizar a amostra de escarro retirando e ejectando o escarro repetidamente com uma seringa de 3 mL (uma seringa de plástico sem a agulha). Faça isso até que o escarro tenha consistência suave.
- Adicionar 25 μL de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (diluição 1/10 em meio ASM) preparado no passo 5.1. Em seguida, vortex os tubos por 30 s para misturar suficientemente.
- Adicionar o meio aos tubos capilares seguindo o mesmo procedimento dos passos 3.2 a 3.5.
6. Imagiologia dos Tubos Capilares de Amostra após Incubação
- Após o tempo de incubação de 48 h, remova e faça a imagem dos tubos capilares seguindo o mesmo procedimento descrito nos passos 4.1 a 4.3.
- Se houver bolhas nos tubos, façaAs fotografias tiradas representam claramente a delineação entre as bolhas e os meios nos tubos. Se o biofilme estiver presente, certifique-se de que as fotografias também podem representar claramente a sua presença.
7. Remoção de mídia para aplicativos downstream
- Para facilitar a análise a jusante, remova o meio dos tubos capilares após a imagem. As aplicações potenciais incluem a cultura e a sequenciação de ADN / ARN e perfis metabolómicos.
Cuidado: Os tubos capilares de vidro cheios de agentes patogênicos são um risco biológico significativo, portanto, estes passos devem ser feitos com muito cuidado com equipamentos específicos. Se os tubos capilares quebrarem, descarte-os em recipientes adequados para perfurocortantes com risco biológico. - Use agulhas de ponta romba de calibre 25 e 0,5 polegadas de comprimento para remover a mídia. Insira a agulha de ponta romba na extremidade do tubo quebrada para quebrar o selo.
- Depois de quebrar o selo, vire o tubo capilar de cabeça para baixo ea mídia vai escorrer para fora da parte superior. EuSe o meio não escorrer facilmente, use uma pipeta com uma ponta de 200 μL e expulse o meio para fora do tubo pressionando o êmbolo da pipeta quando inserido na extremidade do tubo capilar. Recolher o meio do tubo expelido num recipiente apropriado (tubo de centrífuga de 1,5 mL).
NOTA: Para análise transcriptómica ou outra análise de ARN, o meio pode ser expelido directamente para tampões de estabilização de ARN.
8. O sistema WinCF FLUD
NOTA: O Sistema de Utilitário de Carregamento de Fluidos WinCF (FLUD) é um conjunto opcional de dispositivos complementares projetados para otimizar o rendimento do Sistema WinCF. O sistema WinCF FLUD é composto principalmente por materiais 3D imprimíveis. A fabricação impressa 3D permite a substituição rápida e fácil de materiais para garantir o tempo de inatividade mínimo para os pesquisadores, bem como exigências mínimas de fabricação. Projetos, arquivos stl, instruções de impressão 3D e o manual WinCF FLUD estão disponíveis no suplemento on-lineNt.
- Preparação de meios para o carregamento de tubos capilares
- Numa biofundidade estéril, enche oito tubos de microcentrífuga estéril de 2 mL com 900 μL de meio cada.
- Homogeneizar as amostras de escarro retirando e expelindo o escarro repetidamente com uma seringa de 3 mL (uma seringa de plástico sem a agulha). Faça isso até que o escarro tenha consistência suave.
- Adicionar 100 μL de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (diluição 1/10 em meio) preparado no passo 8.1.1. Em seguida, vortex os tubos por 30 s para misturar suficientemente.
- Encaixar os tubos de microcentrífuga cheios e abertos no suporte do tubo rotador orientado de modo que os tubos sejam verticais.
- Colocação de tubos capilares
- Recolher três tubos capilares para cada tubo de microcentrífuga no passo 8.1.
- Introduza três tubos no suporte de borracha de forma que estejam alinhados com os tubos de microcentrífuga na outra extremidade do aparelho.Certifique-se de que as extremidades marcadas dos tubos fiquem afastadas dos tubos de microcentrífuga. Coloque os três furos na parte inferior do suporte corretamente sobre os três parafusos na base do berço.
- Com os tubos capilares colocados em repouso nos seus canais guia no aparelho, coloque o tampão de borracha sobre os seus midsections com segurança para evitar deslocamento. (Ver Figura 4 )
Figura 4: O sistema FLUD totalmente carregado com tubos capilares protegidos pela borracha Tamp sobre seus Midsections. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Colocação da mídia nos tubos capilares
- Utilize cuidadosamente uma mão para agarrar a extremidade do aparelho onde os tubos capilares estãoaded, e utilizar a outra mão para segurar a cremalheira rotador em que os tubos de microcentrífuga são carregados.
- Delicadamente rodar a cremalheira de microcentrífuga de modo que os tubos de microcentrífuga são quase horizontal e prosseguir para empurrar lentamente a cremalheira para os tubos capilares. (Ver Figura 5)
- Quando as extremidades dos tubos capilares fazer contacto com os meios em tubos de microcentrífuga, assegurar que a acção capilar começa imediatamente o enchimento dos tubos capilares. Para ajustar a taxa de preenchimento e preencha nível, rode suavemente o aparelho como um todo. Enquanto isso, tenha cuidado para não derramar mídia para fora dos tubos de microcentrífuga. (Ver Figura 6)
- Quando os tubos capilares estão cheios até níveis desejados, colocar o nível aparelho sobre uma superfície e cuidadosamente ainda rapidamente puxar a prateleira de tubos de microcentrífuga de fora das extremidades dos tubos capilares para cessar o enchimento. Os tubos de microcentrífuga pode ser agora retraída todo o caminho de volta para a posição vertical e fechado.
- Selar as extremidades salientes dos tubos capilares, premindo um bloco de vedante em cada conjunto em triplicado, um conjunto de vedação de cada vez até que todos os conjuntos são selados. Para reduzir o risco de contaminação, pressionar uma parte diferente do bloco de vedante em cada conjunto em triplicado (Ver Figura 7).
Figura 5: O Sistema Flud com meio tubos implantados para uma orientação horizontal, pronto para fazer contato com tubos capilares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O sistema Flud com Capilar Tubos Carregando com o Media via ação capilar. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 7: Selando tubos capilares cheios no sistema FLUD Um conjunto de triplicado por vez utilizando um bloco de vedação. Este bloco de vedação tinha plástico ao longo dos bordos que foi cortado para evitar o contacto com conjuntos de triplicado vizinhos durante a vedação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Incubação
- Remova o tampão de borracha sobre o midsections tubo e levantar o berço de borracha fora do aparelho principal. Isso deve levar todos os tubos capilares com ele. Agora coloque o berço e os tubos sendo mantidos no rack de imagem. Esta rack tem três topos que se encaixam dentro do compartimento, bem como canais de guia pequenos para definir os tubos para.
- Defina o rack de imagem como um todo em caixa de plástico de incubação claro. Soak pequenas quantidades de toalhas de papel estéril em água estéril e colocar ao longo dos dois lados mais curtos da caixa para fornecer humidade durante a incubação. (Ver Figura 8)
- Fechar a caixa completamente e ajustado dentro de um 37 ° C incubadora, certificando-se de manter os tubos horizontais. Incubar durante 48 h.
Figura 8: Capilar Tubos em Borracha Cradle Transferido do Flud Sistema em uma cremalheira Imaging, que foi colocado em uma câmara de incubação Limpar Juntamente com papel toalha para fornecer umidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thÉ a figura.
- Imaging e extração
- Remova o suporte de imagem que segura os tubos da caixa de incubação e coloque-o em uma caixa de luz, iluminada por baixo. Com os tubos já existentes no crivo de imagem, os conjuntos triplicados estarão devidamente espaçados e prontos para imagem imediatamente.
- Focalize a câmera nos tubos de modo que todos sejam visíveis no campo de visão ea luz da caixa de luz fornece contraste e visualização suficientes da cor nos corantes de tubo. Fotografia de diretamente acima.
- Para extrair o conteúdo dos tubos, retire os tubos capilares do suporte de borracha um conjunto de triplicados de cada vez. Levante suavemente os tubos para cima e fora do berço ou deslize-os para fora.
- Para cada conjunto de triplicados, siga o procedimento de extração detalhado nos passos 7.1 a 7.3.
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Representative Results
crescimento microbiológico entre as várias condições químicas induzidas no interior das amostras variou dramaticamente em alguns casos, e mais subtilmente nos outros. Muitas mudanças na atividade eram de natureza visual, sendo facilmente perceptível assim que o período de incubação terminou. No exemplo de manipulação de pH, as amostras de todo o espectro de pH variado muito conforme mostrado por vários factores que se tornaram evidentes após incubação. Quando não há amostras de expectoração adicionaram-se aos meios de comunicação, a única mudança exibiu em todo o espectro de pH após 48 h de incubação foi uma ligeira redução no volume médio resultante da evaporação menor (Figura 9). Tubos capilares inoculados exibiram variações de volume, o aparecimento de bolhas de gás, coloração alterada, e o aparecimento de depósitos opacos (Figura 10).
Figura 9: Exemplo gradiente de pH, o Ensaio de Controlo, pós-incubação, n escarro Adicionado. Os mesmos tubos capilares mostrados na Figura 1 depois de ter sido incubada a 37 ° C durante 48 h. A coloração permanece praticamente inalterada, indicando que não há mudanças significativas no pH. quantidades ligeiramente reduzida do meio de permanecer devido a evaporação menor fora das extremidades abertas dos tubos durante a incubação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Resultados Exemplo gradiente de pH, Pós incubação, escarro Adicionado, Produção de gás aparente. Os tubos capilares contendo meio de expectoração artificial depois de ser misturado com expectoração de um paciente com FC. Os tubos são dispostas na mesma ordem crescenteDe pH como controlo. Diferenças visíveis da execução de controlo ilustrada na Figura 2 incluem grandes mudanças na coloração, com os tubos de pH inicialmente baixos ou médios tornando-se muito ligeiramente coloridos, indicando grandes quedas no pH. Os tubos de pH mais elevados alteraram a coloração menos drasticamente, indicando uma alteração menor no pH. As bolhas estão presentes em tubos de pH baixo e médio, indicando atividade anaeróbica fermentativa. Secções opacas também estão presentes em todos os tubos, com maior quantidade naqueles de menor pH, indicando atividade microbiana adicional de vários tipos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Estes resultados mostram que as bactérias e outros micróbios contidos no escarro adicionado são capazes de crescer e mudar dentro do meio artificial. As diferenças entre as condições químicas simuladasStark e facilmente comparadas, exibem produção de biofilme, a produção de gás, e várias mudanças de cor com base em quaisquer indicadores adicionados. No caso do experimento de pH, a alteração mais significativa foi a produção de gás, que foi muito mais prevalente em tubos de pH mais baixo, com um pH de 6.0 e 6.5 geralmente ter a maioria dos bolhas. Outro material opaco foi observado na maioria dos tubos, indicativo de uma maior actividade microbiana que ocorre nos meios de comunicação, apesar de tubos capilares de um pH mais elevado tendem a ter menos. A maioria dos tubos tinha assumido um tom mais amarelo do que antes, o que indica que o pH global dos media caiu. Meios de pH elevado geralmente permaneceu semelhante para a sua coloração inicial, indicando pouca alteração no pH.
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Discussion
A composição microbiológica de um pulmão com CF contém uma grande variedade de organismos, mas as condições dentro do pulmão provavelmente tem uma influência significativa sobre que tipos de micróbios podem sobreviver e prosperar 13, 15. mecanismos específicos através dos quais essas condições mudam e os efeitos exatos que têm sobre o microbioma pulmão são geralmente desconhecido até o momento. Neste método experimental, é apresentada uma análise das alterações microbiológicas com base em condições químicas manipulados em um bronquíolo pulmão simulado.
Existem alguns passos críticos do protocolo. Mantendo a forma expectoração artificial estéril antes da adição das amostras de expectoração é importante quando se considera a microbiome do ambiente a ser analisado. micróbios estrangeiros poderia alterar as condições e perturbar a precisão da simulação bronquíolos. Os micróbios também poderia outcompete os agentes patogénicos alvo no SPutum amostras utilizadas, comprometendo qualquer análise de mudanças pós-incubação. É crítico incubar os tubos capilares horizontalmente. Isto é importante porque permite a observação da produção de gás. Se os tubos foram incubados verticalmente, o gás produzido pode subir e sair do meio, dando uma aparência de nenhuma produção de gás em tudo. A obstrução de ambas as extremidades pode facilitar uma maior produção de gás sem a perda de gás. No entanto, o gradiente de oxigénio necessário seria interrompido.
O protocolo está aberto para várias modificações, variando desde a composição química dos meios aos tipos de amostras inoculadas. Medicamentos específicos podem ser facilmente adicionados nos estádios de preparação, e diferentes condições de incubação poderiam simular várias configurações em que os micróbios iria residir. Este experimento também utilizou especificamente amostras de escarro contendo patógenos CF, mas amostras de outras doenças pulmonares poderiam ser substituídas por tendências dePatógenos.
Uma limitação importante desta técnica é que o conteúdo dos tubos capilares é essencialmente homogeneizado após a extracção dos tubos, perdendo muitos dados relativos à actividade microbiana em diferentes estratos dentro da coluna de meio. Por exemplo, o meio próximo ao ar potencialmente contaria mais organismos aeróbios, com o meio mais abaixo contendo mais organismos anaeróbios 12 . Estes dois conjuntos separados de micróbios seriam misturados em conjunto se os tubos fossem esvaziados para dentro de um receptáculo para sequenciação ou processamento. Futuros estudos com WinCF visam o desenvolvimento de métodos para seccionar e visualizar a comunidade microbiana através do comprimento do tubo.
Esta abordagem para a análise de escarro pulmonar proporciona um ajuste mais preciso para o crescimento de micróbios pulmonares do que um método de placa de ágar tradicional, no qual as culturas crescem sobre um meio sólido aberto ao ar. Amostras provenientes de bronquíolosOu configurações semelhantes são mais apropriadamente cultivadas no arranjo do tubo capilar devido a semelhanças partilhadas com um bronquíolo pulmonar real. Este arranjo experimental explica o espaço físico, a química do escarro, a umidade, a consistência média e os gradientes de oxigênio que estariam presentes em um pulmão CF real 12 , 13 .
Esta técnica pode ser usada para manipular muitas condições pertinentes à doença envolvendo o microbioma pulmonar. As condições químicas do meio de escarro artificial podem ser facilmente manipuladas antes da adição das amostras microbianas desejadas, proporcionando um método conveniente para observar os efeitos de possíveis tratamentos ou alterações. Por exemplo, a adição de tipos específicos de antibióticos ao meio antes da adição de amostras de escarro pulmonar forneceria dados sobre como tal medicação influenciaria a comunidade microbiana de um bronquíolo pulmonar. O sistema WinCF é uma nova ferramenta para estudarmicrobiome pulmão com aplicações clínicas directos. Os métodos tradicionais de estudar o microbioma pulmão envolvem amostras de sequenciamento muco diretamente, com WinCF a comunidade podem ser cultivadas ativamente para melhor visualizar e analisar o seu metabolismo coletiva. Estudos anteriores têm mostrado que reproduz o WinCF bem microbiome em uma amostra de expectoração um, portanto, representa um instrumento eficaz para a experimentação com agentes patogénicos individuais, co-culturas e comunidades de organismos que infectam e danos de pulmões humanos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Vertex Pharmaceuticals e o Prêmio Inovação Tecnológica em Fibrose Cística para financiar R. Quinn e do NIH / NIAID para o financiamento da concessão 1 U01 AI124316-01, uma abordagem de biologia de sistemas para tratamento de patógenos resistentes a múltiplas drogas. Gostaríamos também de agradecer ao Departamento de Engenharia Mecânica e Aeroespacial no curso de design sênior de engenharia mecânica de graduação da UCSD para facilitar a colaboração com os aspectos de engenharia deste trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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