Summary
mukus kistik fibrozis solunum yolları (CF) hastalarının mikrobiyal patojenler gelişmek için ideal bir ortam vardır takılı. el yazması onlar kimyasal koşulların hastalığı ve nasıl değişikliklere neden taklit mikrobiyal dinamikleri harekete geçirebilir bir ortamda CF akciğer mikrobiyomu eğitimi için yeni bir yöntem tarif eder.
Abstract
Birçok kronik hava yolu hastalığı, mukusun solunum yollarının tıkanmasına neden olur. Kistik fibrozlu bir bireyin akciğerleri mukus takılan bronşiollerin mikrobiyal kolonizasyon için uygun bir yaşam alanı oluşturduğu örnek bir durumdur. Çeşitli patojenler bu ortamda birbirleriyle etkileşime girerek ve KF hastalığına bağlı belirtilerin çoğunu çekerler. Herhangi bir mikrobik toplumda olduğu gibi, yaşam alanlarının kimyasal koşulları toplum yapısı ve dinamikleri üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Örneğin, farklı mikroorganizmalar farklı oksijen seviyeleri veya diğer çözünen konsantrasyonlarda gelişirler. Bu durum, oksijen konsantrasyonlarının topluluk fizyolojisi ve yapısını yönlendirdiği düşünülen CF akciğerinde de geçerlidir. Burada açıklanan yöntemler, akciğer çevresini taklit etmek ve patojenlere hastalığa neden olduklarına benzer şekilde büyürler. Bu mikropların kimyasal çevrelerinin manipülasyonu daha sonra kimyasalın nasıl çalıştığını incelemek için kullanılırAkciğer enfeksiyonları stry onun mikrobiyal ekoloji yönetir. yöntem WinCF sistemi olarak, suni balgam orta ve mukus takılı bronşiyollerde var olan benzer bir oksijen gradyanı sağlamak amaçlı dar kılcal tüpler dayanır. , balgam veya antibiyotik basınç ortam pH gibi kimyasal koşullar, Manipulating, bu örneklerde mikrobiyolojik farklılıklar, renkli göstergeler kullanılarak gaz veya biyofilm üretimi için takip içerir, veya çıkarılan ve her bir numunenin nükleik asit içeriği dizilenmesi olarak gösterebilir.
Introduction
Bu yazıda tarif edilen yöntem WinCF sistemi 1 olarak adlandırılır. WinCF genel amacı, mukus doldurulmuş akciğer bronşiyollerde ortamı simüle edebilen bir deney düzeneği sağlamaktır. Bir uysal sistemi kistik fibroz (CF), kronik obstrüktif akciğer hastalığı (COPD), astım ve diğerleri dahil olmak üzere, bir mukus aşırı salgılanması fenotip ile akciğer hastalıklarının mikrobiyal patojenleri çalışma Bu sağlayacaktır. Prosedür akciğer salgıları sonunda mukus 2 bronşiyolleri ve diğer küçük geçiş yolu doldurma temizlemek için kalın ve sert hale gelmesine neden mutasyon ile karakterize edilir CF çalışma için özel olarak tasarlanmıştır. Solunan hava artık birçok Alveollere ulaşmak ve de bakteri kolonizasyonu 3, 4 bir yaşam alanı sağlamak mümkün olduğu için akciğerde Bu tür blokajlar gaz değişimi önler. yetersizlik mikrobiyal büyümeyi önlemek içinAşırı akciğer mukusu sonunda hava yolu kompleksinde kronik enfeksiyonlara neden olur. Bu topluluklar virüsleri, mantarları ve Pseudomonas aeruginosa gibi bakterileri de içeren çeşitli organizmaları içerir; bunların hepsi birbirleriyle etkileşime girer 5 , 6 , 7 , 8 . CF akciğer mikrobiyomunun etkinliğinin pulmoner alevlenmeler 1 , 9 , 10 , 11 denilen belirtilerin alevlenmesine karıştığı düşünülmektedir. WinCF, bu alevlenmelerin etrafındaki mikrobik toplum davranışının incelenmesini sağlar ve şimdi akciğer mikrobik ekolojisini incelemek için bir temel deney sistemi olarak işlev görmek üzere genişletilmektedir. Geleneksel olarak, alevlenmeler akciğerden alınan örneklerin doğrudan analizi ile incelenmiştir. Birçok karıştırıcı faktör mikrobik b'nin doğrudan analizini yaparWinCF sistemi ile akciğerlerde davranış, bu faktörlerin birçoğu kaldırılır ve akciğer mikrobiyesinin davranışı, mukus takılı bronşiolde bakteri aktivitesinin daha ince analizine izin verilerek daha doğrudan incelenebilir.
WinCF sistemi, bakterileri akciğer ortamını etkili şekilde taklit edecek şekilde büyütmek ve analiz etmek için bir yöntem sağlar. Akciğer bakterilerini büyütmek için geleneksel yöntemler genellikle geleneksel agar plakalarına kültür örnekleri vermeyi gerektirir. Bu yöntemler, örnekleri atmosferik oksijene açık bırakarak, mukus ile tıkanan akciğer bronşiollerinde bulunan hipoksik ve çoğunlukla anoksik koşulları hesaba katmayı ihmal eder 12,13. Agar üzerinde aerobik koşullar altında kültür yapılması, CF akciğerinin ortamı gibi bir şey değildir ve klinisyenleri ve araştırmacıları, tedavi etmeye çalıştıkları patojenlerle ilgili yanıltabilir. Ek olarak, bakteri plağı üzerindeki bakterilerin besin maddeleriYapay balgam ortamı (ASM) kullanılarak WinCF'de hesaplanan gerçek balgamda bulunanlardan farklıdır. Sriramulu ve diğerlerinde Pseudomonas kültürleri tarafından gösterildiği gibi ; 14 , ASM, balgam mikropları için mevcut olan kaynakları taklit eden ve balgamın fiziksel tutarlılığını çoğaltan spesifik bir bileşen seti içerir. Hastalıklı bir akciğerin spesifik bir mikrobiyomu olduğu için, bu tür mikroorganizmaların çalışılması ideal olarak akciğerin spesifik koşullarında gerçekleşmelidir.
WinCF sistemi, gerçek bir akciğer bronşiolünde görüleceği gibi mikrobiyal değişiklikleri izlemek için hızlı analiz ve deney koşullarının kolay manipüle edilmesini sağlar. Bu teknik, balgam, tükrük, diğer vücut salgıları ve saf veya karışık bakteri kültürleri gibi sayısız ilgili örnek türlerinin aşılanmasına izin verir. Deney düzeneğinin doğası, derhal görsel olarak yorumlanmasına izin verir.mikrobiyal topluluk davranışı ve mikrobiyolojik ve omik prosedürlerin çok sayıda kolay mansap uygulamasını sağlamak için tasarlanmıştır. Böyle çalışmalar çevreleriyle fizikokimyasal şartlara bağlı olarak bakteriyel topluluk bileşim değişikliği nedeniyle önemlidir. ortamın kimyasal koşullar bakteriyel aktivite üzerinde etkilerini analiz etmek için manipüle edilebilir WinCF ile. Örneğin, ortamın asitliği bir numune ile aşılama öncesinde değiştirilebilir. İnkübasyondan sonra, bu durumların her bakteriyel aktivitesi direkt karşılaştırılabilir ve sonuçlar bu balgam numunelerinde bakteri değişen pH karşılık olarak hareket hakkında çizilebilir. Burada, WinCF sistemi ve medya kimyası akciğer mikrobiyomu üzerindeki etkilerini incelemek için manipüle edilebilir nasıl örneklerini uygulamak için prosedürleri özetlemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yapay Balgam Ortamında Stok Hazırlama
- % 5 müsin solüsyonu oluşturun. 1.0 g dehidrate domuz mide musini, 20 mL deiyonize suya ilave edin. Elde edilen çözeltiyi otoklavlayın.
NOT: Müsin sterilizasyonu doğal yapısını bozacaktır; Müsini kuru halde sterilize etmek için diğer yöntemler arasında UV sterilizasyonu ve ışınlama bulunur. Bununla birlikte, bu yöntemler WinCF sistemi için yaygın olarak kullanılmamıştır. - 2.2 g KCI'yi 50 mL deiyonize suya ilave edin ve çözünmesine izin verin. 50 mL deiyonize suya 5.0 g NaCl ilave edin ve çözünmesine izin verin. Bu iki çözümü otoklavla yapın.
- 10 mL steril deiyonize suya 100 mg somon sperm DNA'sı ekleyin. Çözünmeyi sağlamak için bu çözeltiyi bir su banyosunda birkaç saat boyunca yaklaşık 85 ° C'ye ısıtın.
- 5.0 mL steril deiyonize suya 5.0 mg ferritin ekleyin.
2. Yapay Balgam Ortamının Hazırlanması
- birleştirmekAşağıdaki bileşenler: 2.0 ml NaCI stok çözeltisi, 2.0 ml KCI stok çözeltisi musin stok çözeltisi 16 ml, yumurta sarısı, emülsiyon 200 uL DNA stok çözeltisi 5.6 mL, ferritin stok çözeltisi 120 uL, uçucu 5.78 mL amino asit çözeltisi, esansiyel olmayan amino asit çözeltisi 5.78 ml ve steril su 2.44 ml.
- tortu az miktarda görünüyorsa, karıştırmak için hafifçe sallayın.
- Sekiz steril 15 ml santrifüj tüplerine ortam pipetleyin 5.0 mL.
Not: İstenilen her borunun kimyasal koşullar manipüle edilebilir. Örneğin, tampon çözeltiler ve pH göstergeleri farklı pH seviyelerinde mikrobiyal davranışlarını karşılaştırmak amacıyla her bir tüpe ilave edilebilir. Bu bir gösteri 5.0 ila 8.5, 0.5, pH 'lik artışlarla, 8 farklı pH değerleri ile elde edilen temsilci sonuçlar kesit olarak gösterilmiştir.
- medyanın kimyasal koşullar başarıyla manipüle sonra, daha sonra kullanılmak üzere dondurmak. Medya fro stabil olacaktır-20 ° C'de birkaç ay boyunca zen. Çözündükten sonra girdap.
3. Kılcal Tüplerin Kontrol Dengelemesinin Hazırlanması
- Steril bir biyolojide, sekiz steril mikrosantrifüj tüpünü 250 mcL ortamla doldurun.
- Adım 3.1'de bahsedilen bir mikrosantrifüj tüpüne karşılık gelen sekiz steril 15 mL santrifüj tüpü elde edin.
- Kağıt havluyu% 70 etanol çözeltisi ile sterilize edin ve kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra havluyu her biri yaklaşık dört santimetre parçaya bölün ve her bir parçayı 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün tabanında parçalayın. İlave tüpler için, gerektiğinde ilave kağıt havluları püskürterek ve kurutun.
- Her bir santrifüj borusunun altındaki bir kağıt kümesiyle, nemli bir ortam oluşturmak için yaklaşık 1.0 mL steril su ile her kağıt kümesini hafifçe nemlendirin.
- Adım 3.1'de hazırlanan her mikrosantrifüj tüpü için üç cam kılcal tüp ve bir kılcal boru macunu seal bloğu alınnt.
- Her bir mikrosantrifüj tüpü için, üç kılcal tübü, tüpün üstündeki mavi işaretleyiciden yaklaşık 5 mm uzaktaki bir ortama doldurun.
- Borunun bir ucunu mikro santrifüj tüpünde tutarak ve kılcal hareketin ortamı tüpe yönlendirmesi için yatay yönlendirmeye doğru bastırın (Bkz. Şekil 1 ).
- Tüpün açık ucuna hafifçe eldivenli bir parmak yerleştirerek doldurmayı durdurun ve sonra tüpün diğer ucunu conta bloğuna bastırarak kapatın.
Şekil 1: Örnek pH Gradyanı, Yapay Balgam Ortamıyla Kapiler Tüp Dolum. Ortam, tüpün bir ucunu sıvının içine sokarak ve kılcal eylemi kolaylaştıracak şekilde eğilerek eklenir. Bu örnekte orta renklenme, iblide yardım etmek için eklenen pH göstergesinden kaynaklanmaktadırKuluçka sonrasında asitlikteki potansiyel değişiklikleri belirler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Üç kılcal tüpün her bir setini, steril suyla, macunla mühürlenmiş yüzü tamamen nemlendirilmiş kağıt havlu ile doldurulmuş 15 mL santrifüj tüplerine yerleştirin. Tüpü ve etiketi kapatın. Bu üç kılcal boru, her kontrol durumunun replikasyonu içindir.
- 15 mL'lik tüm santrifüj tüpleri, belirlenmiş kılcal boruları ile doldurulduğunda, tüpleri bir tutma rafa yerleştirin. Rafı yatay olarak inkübe edecek şekilde yerleştirin (gaz kabarcıkları yakalamak için) (Bkz. Şekil 2 ). 48 saat boyunca 37 ° C'de (nemli kağıt kümeleri içeren) santrifüj tüpleri içindeki kılcal tüpleri inkübe edin.
Şekil 2: Örnek pH Gradyan, Kuluçka kılcal borular hazır. üç kılcal tüpler, doldurulmuş ve kapatılmış sonra, bunlar altta nemli bir kağıt havlu ile bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. Bu tüp daha sonra kapatılmış ve bir rafın içine konur. Resimdeki olarak kuluçka tamamlandıktan sonra bu gaz üretimi gözlenebilir böylece raf, inkübasyon sırasında yanlara doğru yönlendirilmiş olması gerekir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Inkübasyon sonrasında kontrol kılcal tüpler 4. Görüntüleme
- Yatay tüpleri tutmak emin olarak inkübatör santrifüj tüpleri raf çıkarın. Dikkatlice diğer setleri ayrı olarak her üç set tutarak, santrifüj tüpleri üzerinden kılcal tüpler kaydırın.
- bir ışık kutusu üzerinde birbirine, her dizilmiş bir sonraki kılcal tüpler düzenlemek böylece, tüplerin muhtevaları olduğu visible ve ışıklı. farklı kimyasal koşullar ayrılması için bir aralık ile, her üç tüpleri bırakın.
- borular hizalanır ve ışık kutusu, doğrudan yukarıdan, fotoğrafı açıkken. (Şekil 3'e bakınız)
Şekil 3: Örnek pH Gradyan, Kontrol Partisi, Ön-enkübasyon, balgam Eklendi. sonra yapay balgam orta soldan sağa doğru pH artan, üçlü setler halinde kılcal tüplere ilave edilir. Sarı belirlenen daha fazla asidik tüpler orta sonucuna ilave göstergeler kombinasyonu, daha az asidik borular mor haline gelmektedir. borular yatay olarak düzenlenmiş ve yukarıda fotoğraflandı alttan aydınlatılır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
- elden çıkarmakBiyolojik tehlikeli atıklarda kontrol malzemeleri.
5. Balgam Örneği ile WinCF Kapiler Tüpleri İnoküle Edilmesi
- Steril bir biyolojide, sekiz adet steril mikrosantrifüj tüpünü 225 μL medya ile doldurun.
- Balgam numunesini, 3 mL'lik şırınga (iğne olmadan plastik bir şırınga) ile tekrar tekrar çekerek çıkartarak homojenize edin. Balgam pürüzsüz bir kıvama gelene kadar bunu yapın.
- Adım 5.1'de hazırlanan her mikrosantrifüj tüpüne (ASM ortamında 1/10 seyreltme) 25 μL homojenize balgam ekleyin. Daha sonra, tüpleri 30 saniye boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın.
- 3. 3.2 ile 3.5 arasındaki adımları izleyerek medyumu kılcal borulara ekleyin.
6. İnkübasyondan Sonra Örnek Kılcal Tüplerin Görüntülenmesi
- 48 saatlik inkübasyon süresinden sonra, 4.1 ila 4.3 arasındaki adımlarla aynı prosedür izlenerek kılcal tüpleri alın ve görüntüleyin.
- Kabarcıklar tüplerde varsa,Çekilen fotoğrafların tüplerdeki kabarcıklar ve ortamlar arasındaki çizimi açıkça gösterdiğinden emin olun. Biyofilm varsa, fotoğrafların varlığını da açıkça gösterebildiğinden emin olun.
7. Aşağı Akış Uygulamalarında Ortamın Kaldırılması
- Akış aşağı analizini kolaylaştırmak için, görüntülemeden sonra ortamı kılcal tüplerden çıkarın. Olası uygulamalar, kültürleme ve DNA / RNA dizilemesi ve metabolomik profillemeyi içerir.
Dikkat: Patojenlerle dolu cam kılcal borular önemli bir biyolojik tehlikeye sahiptir, bu nedenle bu adımlar belirli ekipmanlarla çok dikkatli yapılmalıdır. Kılcal tüpler kırılırsa, uygun biyolojik tehlike aralıkları kabına koyun. - Ortamı çıkarmak için 25 gauge ve 0,5 inç uzunluğunda künt uçlu iğneler kullanın. Contasını kırmak için kör uçlu iğneyi tüpün tıkalı ucuna yerleştirin.
- Contayı kırdıktan sonra, kılcal boruyu ters çevirin ve ortam üst bölümden damlayacaktır. benf media, kolayca damla 200 uL ucu olan bir pipet kullanın ve kılcal borunun ucuna takıldığında pipet piston üzerine bastırarak tüp üzerinden ortam dışarı atmaz. uygun bir kap (1.5 ml santrifüj tüpü) atılır boru ortamı toplayın.
Not: transkriptomik veya başka RNA analizi için, ortam RNA, stabilize edici tampon doğrudan deşarj edilebilir.
8. WinCF Flud Sistemi
Not: WinCF Sıvı yükleme Yardımcı Cihaz (Flud) Sistem WinCF Sisteminin verimini optimize etmek için tasarlanmış tamamlayıcı cihazlar isteğe bağlı bir takımdır. WinCF Flud Sistemi öncelikle 3D yazdırılabilir malzemelerin oluşur. Malzemelerin hızlı ve kolay değiştirme araştırmacılar için asgari kesinti yanı sıra asgari üretim gereksinimlerini sağlamak için 3D baskılı imalat sağlar. Tasarımlar, stl dosyaları, 3D baskı talimatları ve WinCF Flud manuel çevrimiçi suppleme mevcutturnt.
- Kılcal boru yüklemesi için ortam hazırlama
- Steril bir biyolojide, her biri 900 μL orta ile sekiz steril 2 mL mikro santrifüj tüpünü doldurun.
- Herhangi bir balgam numunesini, 3 mL'lik bir şırınga (iğne olmadan plastik bir şırınga) ile tekrar tekrar çekerek ve atarak atın. Balgam pürüzsüz bir kıvama gelene kadar bunu yapın.
- Adım 8.1.1'de hazırlanan her mikrosantrifüj tüpüne (ortamda 1/10 dilüsyon) 100 μL homojenize balgam ekleyin. Daha sonra, tüpleri 30 saniye boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın.
- Doldurulmuş ve açık mikro santrifüj tüplerini, borular dikey olacak şekilde yönlendirilmiş rotator tüp tutucusuna yerleştirin.
- Kılcal boruların yerleştirilmesi
- Adım 8.1'de her mikrosantrifüj tüpü için üç kılcal boruyu alın.
- Aygıtın diğer ucundaki mikrosantrifüj tüpleriyle hizalanacak şekilde üç boruyu lastik beşik içine sokun.Tüplerin işaretli uçlarının mikrosantrifüj borularından uzakta durduğundan emin olun. Beşikten altındaki ç deliği, beşlik yerindeki üç pedi uygun şekilde takın.
- Yerleştirilen kılcal borular, cihaz üzerindeki kılavuz kanallarına oturtulduğunda, kaydırmayı önlemek için lastik tamponlarını orta kısımlarının üzerine sıkıca yerleştirin. (Bakınız Şekil 4 )
Şekil 4: Kauçuk Tampa Tarafından Menteşeler Üzerinde Tutulan Kılcal Tüplerle Tamamen Yüklenen FLUD Sistemi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Kılcal tüplere malzeme yüklenmesi
- Kılcal tüplerin bulunduğu cihazın ucunu bir elle tutmak için dikkatli bir şekilde kullanınaktarıldı ve mikrosantrifüj tüpleri yüklü olan rotator dişli çubuğu diğer elle.
- mikrosantrifüj tüpleri neredeyse yatay ve yavaş yavaş kılcal tüpler karşı rafı itmek devam böylece ince mikrosantrifüj raf döndürün. (Bakınız Şekil 5)
- Kılcal tüplerin uçları, mikrosantrifüj tüpleri içinde ortam ile temas ettiğinde, bu kılcal etki hemen kılcal tüplerin doldurmak başlar emin olun. seviyesi doldurma hızını ayarlamak ve doldurmak için, yumuşak bir bütün olarak cihaz döndürün. Bunu yaparken mikro santrifüj tüpünün dışarı medyayı dökmemeye dikkat edin. (Bakınız Şekil 6)
- kılcal tüpler, istenen seviyelere dolu olduğunda, bir yüzey üzerinde cihazı seviyesi yerleştirin ve dikkatli bir şekilde yine hızlı ve dolgu durdurma kılcal tüpler uçlarındaki mikro santrifüj tüpünün raf çekin. mikrosantrifüj tüpleri artık dikey konumuna geri tüm yol geri ve kapatılabilir.
- Kılcal boruların çıkıntı yapan uçlarını, her üçlü setin üzerine bir conta bloğu basarak kapatın ve tüm setler kapatılıncaya kadar bir sefer bir set sızdırmaz hale getirin. Kirlenme riskini azaltmak için, her üçlü sete de sızdırmazlık engelinin farklı bir bölümüne basın (Bkz. Şekil 7 ).
Şekil 5: Yatay Oryantasyona Dağıtılmış Orta Tüpler ile FLUD Sistemi, Kılcal Tüplerle Temas Yapmaya Hazır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Kılcal İşlemle Ortam Yükleyen Kılcal Tüplerle FLUD Sistemi. bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Bir su geçirmezlik maddesi Block Kullanımı Sırasında Set Flud Sistemi Bir üç nüsha üzerinde Kılcal Tüpleri Dolgulu mühürleme. Bu dolgu bloğu sızdırmazlık sırasında komşu üçlü gruplar ile temasını önlemek için kesildi kenarlar boyunca plastik vardı. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
- Kuluçka
- Tüp orta kesimlerinde üzerinde tamp lastiği çıkarın ve ana aparatı kapalı kauçuk beşiği kaldırın. Bu da beraberinde bütün kılcal tüpler almalıdır. Şimdi beşiği ayarlamak ve tüpler görüntüleme raf üzerine tutuluyor. Bu raCk, beşiği ayarlamak için beşiğin yanı sıra küçük rehber kanallarına uyan üç saplamaya sahiptir.
- Görüntü rafını bir bütün olarak açık plastik kuluçka kutusuna yerleştirin. İnkübasyon esnasında nemi sağlamak için küçük miktarda steril kağıt havluları steril suya batırın ve kutunun iki kısa yanına yerleştirin. (Bakınız Şekil 8 )
- Kutuyu tamamen kapatın ve tüpleri yatay tutmaya özen gösterin, 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. 48 saat inkübe edin.
Şekil 8: Nem Sağlamak İçin Nemli Kağıt Havlularının yanında Şeffaf İnkübasyon Kutusuna Yerleştirilen FLUD Sisteminden Görüntüleme Raketine Aktarılan Kauçuk Beşikten Tüplü Kılcal Borular. Th daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınızŞekildir.
- Görüntüleme ve çıkarma
- Tüpleri kuluçka kutusundan tutarak görüntüleme rafını çıkarın ve alttan aydınlatılmış bir ışık kutusu üzerine yerleştirin. Zaten görüntüleme rafındaki tüplerle, üçlü takımlar düzgün bir şekilde aralıklarla yerleştirilecek ve hemen görüntü hazır hale gelecektir.
- Kamerayı tüplere odaklayın, böylece hepsi görünen alanda görünür ve ışık kutusundaki ışık, tüp boyalarındaki rengin yeterli kontrast ve görselleştirilmesini sağlar. Doğrudan yukarıdan fotoğraf.
- Tüplerin içeriğini çıkarmak için, kılcal tüpleri kauçuk beşikten birer birer üçlüden çıkarın. Tüpleri hafifçe kaldırın ve yuvasından çıkarın veya dışarıya doğru kaydırın.
- Her üçlü grubun her biri için, adım 7.1 ila 7.3'te ayrıntılı olarak açıklanan çıkarma prosedürünü uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
örnekleri içinde indüklenen farklı kimyasal koşullar arasında Mikrobiyolojik büyümenin önemli ölçüde, bazı durumlarda daha da fazla ustaca diğerlerinde değişiyordu. aktivitesinde çok değişiklik kısa Kuluçka süresi sona gibi hali hazırda belirginlik kazanacaktır, doğada görsel edildi. kuluçkadan sonra ortaya çıktı bir çok faktör tarafından gösterildiği gibi, pH değeri manipülasyon örnekte, pH spektrumu boyunca örnekler büyük ölçüde değişmiştir. Balgam örnekleri ortama ilave edildi, inkübasyondan 48 saat sonra pH değeri yelpazesinde ise sadece bir değişiklik küçük buharlaştırma (Şekil 9) elde edilen bir ortam hacminde hafif bir azalma oldu. İnoküle kılcal borular hacmindeki değişiklikler, gaz kabarcıkları, değiştirilmiş renk görünümünü, ve opak yataklarının görünümünü (Şekil 10) göstermiştir.
Şekil 9: Örnek pH Gradienti, Kontrol Çalışması, Kuluçka Sonrası Olmadan, Balgam Yok Eklendi. Aynı kılcal tüpler 37 ° C'de 48 saat inkübe edildikten sonra Şekil l' de gösterilmiştir. Renklenme büyük oranda değişmeden kalır ve pH'da önemli bir kayma olmadığını gösterir. İnkübasyon sırasında tüplerin açık uçlarından az miktarda buharlaşmaya bağlı olarak ortamın hafifçe azaltılmış miktarları kalır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 10: Örnek pH Gradient Sonuçları, Kuluçka Sonrası, Balgam Eklendi, Görünen Gaz Üretimi. CF hastasından balgamla karıştırıldıktan sonra yapay balgam içeren manşet tüpleri. Tüpler aynı artan düzende düzenlenmiştirKontrol çalıştırmak gibi pH. Şekil 2'de gösterilen kontrol çalışmasından hissedilir fark başlangıçta düşük ya da orta aralığı pH borular pH büyük damla gösteren, çok açık renkli hale gelen renklenme büyük değişiklikler içerir. En yüksek pH borular pH daha küçük bir değişikliği gösteren, daha az ölçüde renk değiştirdi. Kabarcıklar fermantasyon anaerob etkinliği gösteren, düşük ve orta sınıf pH tüpler içinde mevcut bulunmaktadır. Opak bölümleri çeşitli türlerdeki başka mikrobik etkinliği gösteren, daha düşük bir pH ve daha yüksekti miktar ile, tüm tüplerin içinde de mevcut bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Bu sonuçlar bakteri ve katma balgam içinde bulunan diğer mikroplar büyümeye ve yapay ortam içinde değiştirmek mümkün olduğunu göstermektedir. simüle kimyasal koşullar arasındaki farklar olduğuapaçık ve kolayca biyofilm üretimi, gaz üretimi, herhangi bir ilave göstergeler dayalı çeşitli renk değişiklikleri gösteren karşılaştırılmıştır. pH deney durumunda, en önemli değişiklik, 6.5 ve 6.0, genel olarak en kabarcıklar olan bir pH'a sahip olan, çok daha yaygın düşük pH'ın tüpler içinde olan gaz üretimi, oldu. daha yüksek pH kılcal borular daha az sahip olma eğiliminde olsa diğer opak malzeme, gösterge ortamında cereyan eden daha başka mikrobiyal aktivitenin en tüpler gözlenmiştir. Çoğu tüpler medyanın genel pH'ı düştüğünü belirten eskisinden daha bir daha sarı tonu üstlenmişti. Yüksek pH ortamı genellikle pH çok az değişiklik gösteren, başlangıç rengi benzer kalmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CF ile akciğerin mikrobiyolojik yapısı, çok çeşitli organizmalar içerir, ancak akciğerdeki koşullar, muhtemelen hangi tür mikropların hayatta kalabileceği ve gelişebileceği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir 13,15. Bu koşulların değiştiği belirli mekanizmalar ve akciğer mikrobiyomu üzerindeki tam etkileri şu andan itibaren genellikle belirsizdir. Bu deneysel yöntemde, simüle edilmiş bir akciğer bronşiolündeki manipüle edilen kimyasal koşullara dayalı mikrobiyolojik değişikliklerin bir analizi sunulmaktadır.
Protokolün bazı kritik adımları vardır. Balgam numunelerinin eklenmesinden önce yapay balgam ortamının steril tutulması, analiz edilen ortamın mikrobiyomu göz önüne alındığında önemlidir. Yabancı mikroplar koşulları muhtemelen değiştirebilir ve bronşiol simülasyonunun doğruluğunu bozabilir. Mikroplar aynı zamanda hedef patojenleri dışavurmakla birlikteKuluçka sonrasındaki değişikliklerin herhangi bir analizini tehlikeye attı. Kılcal tüpleri yatay olarak inkübe etmek önemlidir. Bu önemlidir çünkü gaz üretiminin gözlemlenmesine izin verir. Tüpler dikey olarak inkübe edilmişlerdi, üretilen bu gaz yükselebilir ve ortamdan dışarı çıkabilir, bu da hiç gaz çıkışı göstermez. Her iki ucun da tıklanması gaz kaybı olmaksızın daha fazla gaz üretimini kolaylaştırabilir. Bununla birlikte, gerekli oksijen gradyanı bozulacaktır.
Protokol, medyanın kimyasal bileşiminden aşılanmış örnek türlerine kadar çeşitli değişiklikler için açıktır. Spesifik ilaçlar hazırlık safhalarında kolayca eklenebilir ve farklı kuluçka koşulları, mikropların bulunacağı çeşitli ortamları taklit edebilir. Bu deney ayrıca özellikle CF patojenler içeren balgam numunelerini kullandı, ancak diğer akciğer hastalıklarından alınan örnekler,patojenler.
Bu tekniğin önemli bir kısıtlaması, kılcal tüplerin içeriğinin, tüplerden çıkarıldığında esas itibari ile homojenleştirilmesidir; bu da, ortamın kolonu içindeki farklı tabakalardaki mikrobik aktivite ile ilgili çok fazla veri kaybedebilir. Örneğin, havaya yakın ortam, muhtemelen daha fazla anaerobik organizma içeren ortamı içeren daha fazla aerobik organizma içerebilir 12 . Bu iki ayrı mikrop kombinasyonu, tüpler dizileme veya işleme için bir hazneye boşaltılırsa birlikte karıştırılır. WinCF ile gelecekteki çalışmalar, tüpün uzunluğu boyunca mikrobik topluluğu kesit ve görüntüleme yöntemleri geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Akciğer balgam analizine yönelik bu yaklaşım, kültürlerin havaya açık katı bir ortamda büyüyen geleneksel bir agar plakası yöntemine kıyasla akciğer mikroplarının büyümesi için daha doğru bir ortam sağlar. Bronşiollerden kaynaklanan örneklerya da benzer ayarlar dolayı gerçek bir akciğer bronşiyollerde paylaşılan benzerlik daha uygun kılcal boru düzeneğinin kültürlenir. Bu deneysel düzenek fiziksel alan, balgam kimya, nem, orta ile ve bir fiili CF akciğer 12, 13 içinde mevcut olacaktır, oksijen gradyan oluşturur.
Bu teknik akciğer mikrobiyomu kapsayan hastalığı ile ilgili birçok koşullara işlemek için kullanılabilir. Yapay balgam ortamın kimyasal koşullar almadan önce kolaylıkla mümkün tedaviler veya değişikliklerin etkilerini gözlemlemek için uygun bir metod sağlanmış, arzu edilen mikrobik numunelerinin için manipüle edilebilir. Örneğin, bu gibi ilaç, bir akciğer bronşiyollerde mikrobik topluluk etkileyecek kadar ilgili verileri sağlayacak akciğer balgam örnekleri eklemeden önce ortama antibiyotiklerin belirli tiplerinin ilavesi. WinCF sistemi incelemek için yeni bir araçtırDoğrudan klinik uygulamalı akciğer mikrobiyomu. Akciğer mikrobikini inceleyen geleneksel yöntemler, mukus örneklerini direk olarak sıralamayı içerir; WinCF ile topluluk, toplu metabolizmasını daha iyi görselleştirmek ve analiz etmek için aktif olarak yetiştirilebilir. Önceki çalışmalar, WinCF'nin bir balgam numunesinde 1 mikrobiyomu iyi ürettiğini göstermiştir, bu nedenle tekli patojenler, ortak kültürler ve insan ciğerlerine bulaştıran ve bunlara zarar veren organizmaların topluluklarıyla deney yapmak için etkili bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar fon hibe 1 U01 AI124316-01, çoklu ilaca dirençli patojenlerin tedavisinde bir sistem biyolojisi yaklaşımı için R. Quinn ve NIH / NIAID finansmanı için Vertex Pharmaceuticals ve Kistik Fibrozis Araştırma Yenilik Ödülü kabul etmek istiyorum. Biz de bu işin mühendislik yönleri ile işbirliğinin kolaylaştırılması için UCSD'nin lisans makine mühendisliği üst düzey tasarım sahasında Makine ve Uzay Mühendisliği Bölümü teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, Suppl 4. S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
