Summary
细胞衰老，细胞周期停滞的不可逆状态，可通过各种细胞应激来诱导。在这里，我们描述的协议来诱导细胞衰老和方法来评估衰老的标志。
Abstract
响应于细胞应激或损害，增殖细胞可诱导特定的程序发起的长期细胞周期停滞的状态，称为细胞衰老。衰老细胞积累的有机体衰老和通过体外培养持续发生。衰老细胞中影响许多生物过程，包括胚胎发育，组织修复和再生，肿瘤抑制和老化。衰老细胞的标志包括，但不限于，增加的衰老相关β半乳糖苷酶的活性（SA-β-GAL）; P16 INK4A和p53和p21的水平;更高水平的DNA损伤，包括γ-H2AX;衰老相关异染色质灶（SAHF）的形成;和获取一个衰老相关分泌表型（SASP），这种现象的特征在于数促炎细胞因子和信号分子的分泌的。在这里，我们描述协议都复制和DNA损伤诱导的衰老中培养的细胞。另外，我们强调技术使用几种衰老相关的标志物，包括SA-β-GAL，γ-H2AX和SAHF染色监测衰老表型，并量化细胞周期调控和SASP因子蛋白和mRNA水平。这些方法可以适用于衰老的各种型号和组织的评估。
Introduction
半个多世纪前，海弗利克和他的同事描述了细胞是如何在未转化增殖的文化，但只是时间1有限的时期。人成纤维细胞的长期培养导致细胞增殖停止;然而，他们是代谢活跃，这被称为细胞衰老。衰老可用于抑制肿瘤发生是有利的，但它也可能是有害的，因为它被认为有助于其与衰老2,3发生的再生能力的损失。衰老细胞已被证明在组织中积累作为人类4年龄和在许多生物过程，包括胚胎发育，伤口愈合，组织修复，和年龄相关的炎症2的有牵连。
在培养细胞的持续传代引起复制性衰老，这已链接以端粒耗损和基因组不稳定性。各种细胞的应力，包括DNA损伤和癌基因，也可引起衰老3。由除端粒耗损等因素衰老经常被称为应力诱导或早衰和通常取决于P16 INK4A / Rb途径5。虽然增殖，未转化的细胞通常出现主轴在形状，衰老细胞可被识别为具有特定的特征，包括一平的，大的形态和提高衰老相关β半乳糖苷酶的活性（SA-β-GAL）（ 图1和2）。衰老细胞也积累的DNA损伤标记物，包括γ-H2AX（ 图3）6，以及潜在的衰老相关异灶（SAHF）（ 图4）7。衰老细胞中具有较高水平的细胞周期调节的，包含p 16（P16 INK4A）和/或p21蛋白和p53（ 图5）8,9。此外，最近的数据已经表明，衰老细胞可通过分泌许多促炎性细胞因子和趋化因子具有非自主效应称为衰老相关分泌表型（SASP）10。虽然这种现象SASP可以从细胞类型而有所不同，以细胞类型，一般地，它是通过增加白细胞介素-6（IL-6），IL-8，粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），生长 - 证明调节的原癌基因α（GRO-α），和GRO-β，等等（ 图6）。诱导衰老的特定应力或损坏还可能影响分泌表型11，12，13。 SASP可以通过测量使用的ELISA或细胞因子/蛋白质阵列分泌的蛋白质的水平来检测S = “外部参照”> 10，14。尽管转录后的机制可以调节SASP蛋白水平11，15，16，17，在mRNA水平的变化也可以在许多情况下检测。这些变化通常更敏感，更容易比蛋白质水平的测量来量化。其它衰老标记物也可以被评估，包括持久性DNA损伤核灶，与染色质的改变称为DNA片段增强衰老（DNA-SCARS）18，以及各种其它的标记3，19，20。
在这里，我们将介绍常见的技术在培养细胞诱导的衰老，也为测量衰老的几个标志物，包括SA-β-Gal的，γ-H2AX，SAHF和衰老的蛋白和mRNANCE相关分子。
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Protocol
1.诱导复制性衰老
- 解冻低传代的人二倍体成纤维细胞（ 例如，WI-38和IMR-90）或其他细胞系。
注意：在此，人二倍体成纤维细胞使用，但这些协议可以用来评估在其它细胞类型，例如内皮细胞，上皮细胞，或间充质干细胞衰老。培养条件可对用于由于不同的生长速率或生长条件的不同的细胞类型进行优化。
注：细胞应是增殖和具有主轴的形态（参见图1的示意图和图2的例子）。理想情况下，细胞应在实验开始时具有<30一个群体倍增水平（PDL），以避免可能的具有复制衰老细胞。- 计算使用下面的等式PDL =日志（N F / N 0）/ LOG2，其中N f是最终细胞数和细胞的PDL <EM> N 0是接种的细胞21的初始数量。
- 培养WI-38细胞在Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清（FBS），1％非必需氨基酸和1％青霉素/链霉素。
- 生长在DMEM IMR-90细胞在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素。
- 生长所有细胞在37℃和5％CO 2生长不断细胞和分裂每2 - 4天当细胞达到〜70 - 80％汇合。使用光学显微镜监测细胞汇合。避免细胞具有较高的汇合时，因为这会影响由于接触抑制细胞生长。
- 监视光显微镜衰老细胞的外观形态下的细胞（参见图1及2），用于当存在从一个传代培养到下在PDL没有变化。
2. DNA损伤诱导的衰老
- 除去使用连接到真空玻璃移液管的生长培养基，并通过添加1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。重复此步骤，总共两次洗涤。两种一个“模拟”处理和用于电离辐射（IR）处理条件添加PBS的薄层（〜750μL用于6cm皿）。
- 使用γ辐照到细胞暴露于IR的10戈瑞（Gy）的单剂量;这对于大多数细胞系的典型曝光。在通风橱中，除去PBS并用生长培养基替换。可替换地，治疗用b细胞leomycin在20微克/毫升2小时。
- 改变对细胞的培养基每48 -7 2小时，并在必要时分裂细胞。
- 监视光显微镜的形态学变化（参见图1的示意图以及图2为代表性的细胞的图像）和测定下的细胞衰老的标记7 -在IR处理后10天。
注：本协议描述了IR诱导的衰老。衰老还可以通过其它应力，包括博来霉素（参见以上的条件）诱导，H 2 O 2 22，23，化疗药物24，香烟烟雾25，转化生长因子（TGF）-β126，27，和其他方法21 ，28，29。
3.染色切尔LS对衰老相关β半乳糖苷酶
- 染色前，将检查在光学显微镜下的细胞以监测形态变化。
注：衰老细胞通常放大并平坦，不像增殖细胞，其具有主轴的形态（参见图1的示意图以及图2为代表性结果）。增殖细胞可以被用作阴性对照，并与IR或其他DNA损伤剂（见部分2）处理的细胞可以用作阳性对照。 - 使用试剂从商业试剂盒（参见材料表 ）量化SA-β-gal的活性。解冻的所有试剂和温热起来至37℃使它们至室温。
- 计算的染色溶液和必要的固定溶液的量。
注意：通常，1mL容量足够用于一个孔在6孔板中。不同板尺寸都可以使用，但一个6孔板尺寸为WEL升适合于以一式三份进行测定对于每种条件。该密度通常提供足够数量的每场的细胞，而无需使用过量的数目的细胞计数。 - 稀染色液1:10用蒸馏水。
- 稀释固定液1:10用蒸馏水。
- 弥补在N，N-二甲基甲酰胺（DMF的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷）的20X储备溶液; 例如，20毫克的X-gal在1mL的DMF）。为了最大限度地使用该试剂盒的，量出的X-gal到所需的每个测定量，然后添加DMF计算量的溶解。可替代地，存储在避光的管中，在-20℃下储备溶液一个月。仅使用聚丙烯（不透明）管用于稀释和存储X-gal的解决方案。
- 制备β-gal染色溶液：930μL1X染色溶液，10微升染色补充A的，染色补充B的10μL，和20毫克的50μL/ mL的X- 半乳糖在DMF。这取决于有多少口井需要进行染色制作高手组合。
- 计算的染色溶液和必要的固定溶液的量。
- 小心地取出从使用移液管或等同物的细胞的培养基。
- 轻轻用1×PBS室温洗细胞一次。
- 加1种的1×固定溶液至各孔中并孵育10 - 在RT下15分钟。
- 删除与移液管固定溶液。
注：固定溶液（1X）含有2％甲醛和0.2％戊二醛和根据实验室安全办公室的建议应作为危险废物处置。 - 轻轻用1×PBS洗涤细胞两次。
- 完全除去PBS，并添加1×β-gal染色溶液的孔中（1毫升/孔的6孔平板）。用铝箔完全覆盖板并孵育24 -在37℃培养箱中48小时（优选地在不存在CO 2的，因为这可以降低缓冲液的pH和影响染色）。
- 检查细胞以染色24小时，如果污渍太淡，孵育24小时。
- 温育时间后，取出的β-gal溶液中并用1×PBS替换它。
注意：此步骤除去一些背景颜色的成像时，也防止了的X-gal溶液的有害溢出。
注：配置了β-gal的解决方案正确的，根据实验室安全办公室的建议。 - 检查上使用10倍或更高的目标附加的相机的光学显微镜的细胞; SA-β-GAL阳性细胞将变成蓝色。获取用于实验的图像的期望数目。如果计数SA-β-gal的阳性细胞的百分比，获得的图像的适当数量（> 5），用于量化每孔。确保图像是从内的每个视图各种领域以及不重叠的。
- 计数SA-β-gal的阳性（蓝色）的数量的细胞与总细胞的数量计算SA-β-GAL阳性细胞的百分比。算每种条件> 100个细胞。
注：代表性图片，也可用于数字。需要注意的是细胞生长汇合如果算上电池的关键，因为太多的细胞，很难区分每个细胞太少可能无法给出足够数量的细胞进行量化和统计。对于出版物的数字照片以最佳分辨率，如果保存为.tiff文件，虽然.JPEG文也是合适的。彩色图像应为300个dpi的。
4.染色的细胞为γ-H2AX
- 板从在玻璃盖玻片第1或2所述的细胞在24孔板中。
- 次日，洗涤细胞用1X PBS。仔细冲洗，如衰老细胞不能很好地粘附于盖玻片，并且很容易洗涤过程中被去除。可替换地，直接固定细胞不经洗涤。
- 除去PBS并修复用在PBS中新鲜制备的3.7％甲醛将细胞在室温10分钟。
- 除去该溶液，透用0.2％Triton X-100将细胞在PBS中持续10分钟。
- 除去在PBS中5％FBS溶液中，块在室温下2个小时。
- 用抗磷酸γ-H2AX（Ser139）和FITC缀合物在5％FBS孵育/ PBS中2小时，在37℃或O / N在4℃下。避光。
- 在37℃下6X用PBS总量的30 - - 洗3 60分钟。
- 染色用DAPI（稀释1：在PBS 15000）在室温下10分钟。
- 洗3次，用PBS。
- 用水迅速冲洗以除去盐，并安装盖玻片上使用3-载玻片 - 抗淬灭剂的5μL。或者，使用含有DAPI的安装的解决方案。
- 让它干燥O / N和可视化上使用63X或更高目标荧光或共焦显微镜将染色的细胞。
- 通过使用下面描述的两种方法定量γ-H2AX焦点。分数使用荧光显微镜通过目测或者协议。理想情况下，我们EA共聚焦显微镜。取Z-段和冷凝成一个单一平面，以可视化所有可检测的灶（代表图像为γ-H2AX染色在增殖细胞和衰老细胞示于图3）。计数通过使用成像软件眼睛的焦点;一般来说，〜100 - 200核足以计数。
- 为了量化具有γ-H2AX阳性病灶细胞的百分比，计算具有至少一个焦点通过DAPI染色的核的总数可见和除法每个小区。
- 为了量化γ-H2AX焦点的数目，计数每个细胞的γ-H2AX焦点。
注：γ-H2AX的水平可取决于诱导的衰老的特定应激或损害而改变。
5.染色的细胞为SAHF标记
注：人类衰老的细胞往往会产生凝聚DNA /染色质的核区。在衰老的细胞，这些异染色质区域被认为抑制的增殖促进基因，如E2F家族成员的表达。 SAHF可以通过DAPI重组可视化;由异相关组蛋白标记，包括组蛋白H3（的H3K9me2和的H3K9me3）Lys9的二和三甲基化的存在;和通过染色质重组蛋白质，包括异HP1蛋白1（HP1），HIRA（组蛋白阻遏A），和ASF1a（抗沉默功能-1a）的染色质30。我们选择使用致癌基因诱导的衰老模型（OIS），如SAHF是OIS模型30更为突出。 IDH4细胞增殖中的地塞米松的存在由于SV40大T抗原的存在而从介质31中除去的地塞米松后变得衰老。 SAHF可以通过DAPI染色，并通过与针对上面列出的特定标记物的抗体染色来检测。在这里，我们描述了DAPI和染色的H3K9me2为visualizat在细胞28的SAHF离子。
- 生长在DMEM IDH4细胞在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素和1微克/ ml地塞米松。为了诱导衰老，取出地塞米松和改变介质，以便它包含木炭处理的FBS;在这种新的媒体〜增长了10天后，IDH4细胞衰老变成31。
- 在一个24孔板上述板IDH4细胞或从第1或2的细胞，在玻璃盖玻片上。
- 次日，洗涤细胞用1X PBS。仔细冲洗，如衰老细胞不能很好地粘附于盖玻片，可以洗涤过程中很容易地删除。可替换地，直接固定细胞不经洗涤。
- 除去PBS并修复用在PBS中新鲜制备的3.7％甲醛将细胞在室温下10分钟。
- 清洗细胞3次，用1×PBS。
- 除去该溶液，透用0.2％Triton X-100将细胞在PBS中5分钟。
- 洗净用1x细胞PBS。除去PBS，并通过加入含有3％BSA阻断缓冲液阻断盖玻片（W / V）的PBS在室温下5分钟。总是过滤溶液包含要使用以除去颗粒物质BSA之前。
- 除去封闭缓冲液，并用针对SAHF标记的初级抗体，如抗H3KMe2抗体孵育的细胞（ 图4;详见材料表 ）。稀释在封闭缓冲液中的抗体并孵育1 - 在室温2小时。
- 除去第一抗体溶液，并用1％（V / V）的Triton X-100的PBS洗盖玻片3次。
- 稀释在封闭缓冲液（ 材料表 ）二次抗体和在室温下孵育1个小时。避光。
- 用1×PBS洗涤细胞两次。在室温10分钟;：用DAPI染色（在PBS 15000参见材料表稀释1）。
- 洗盖玻片用1X PBS 3倍。
- 用水迅速冲洗以除去盐一抗淬灭剂的5μL - ND上使用3个载玻片装入每个盖玻片。或者，使用含有DAPI的安装的解决方案。
- 让干燥O / N和可视化上使用63X或更高目标（参见图4中的代表性结果）荧光或共焦显微镜将染色的细胞。如第4描述量化SAHF。
注：同种型对照第一抗体或无第一抗体（ 即单独次级）应该被用作用于免疫荧光染色的阴性对照。
6.通过免疫印迹分析衰老相关蛋白
注：衰老表型的特征在于由细胞周期调节，包括P16 INK4A，P21和p53的上调。该协议将描述在细胞裂解液中这些蛋白质的水平的量化。这些技术可以使用多种用于评估衰老诱导的方法21，28，29。
- 如在第1和2或使用另一种方法21，28，29中所述诱导细胞衰老。为了分析细胞衰老的标记，板6个cm培养皿的细胞和同时分析两个蛋白质和RNA（见用于RNA分离指令第7节）。
- 取出的细胞培养基。把电池上的冰盘。
- 清洗细胞2次，冷的1×PBS。倾斜盘，以确保所有的PBS吸，以便在用于该过程的量方面那样精确。
- 抽吸PBS的最后一次洗涤后，加冷1×PBS中的200μL（为一个6cm皿）在培养皿。刮使用细胞刮细胞。
- 移液管将细胞/ PBS混合物成用于RNA分离的无RNase的管。大约需要150＆＃181;该混合物中，并移液管到一个新的管中的L.此等份将用于蛋白质分析，所以一定要由每个管吸取相同的量。
- 裂解细胞，加入75 - 改进的2×的Laemmli的样品缓冲液中加入100μL（60mM的Tris-盐酸pH为6.8，12.5％甘油，2％SDS，5％β巯基乙醇（BME），和溴酚蓝;可以由如大批量，等分并储存在-20℃直至使用）或等效的样品缓冲液中。
- 备选地，裂解细胞在75 - 裂解缓冲液和离心机的100μL以15,000×g离心10分钟，在4℃下，以除去细胞碎片。去除上清，吸移管到一个干净的试管中。甲Bradford蛋白测定或等效蛋白质测定可以在裂解物被用于确保蛋白的等量上样。
注：蛋白质测定法不能在样品缓冲液中裂解的样品来进行。 - 取出〜25μL裂解液，并把它添加到2X样品缓冲液的15微升。吸取了做WN在样品缓冲液中裂解细胞。
注：裂解缓冲液或者样品缓冲液的体积可根据细胞汇合进行调整。如果样品是“糊糊”由于核裂解，添加更多的样品缓冲或PBS稀释。样品可以贮存于-20℃直至使用。
- 备选地，裂解细胞在75 - 裂解缓冲液和离心机的100μL以15,000×g离心10分钟，在4℃下，以除去细胞碎片。去除上清，吸移管到一个干净的试管中。甲Bradford蛋白测定或等效蛋白质测定可以在裂解物被用于确保蛋白的等量上样。
- 煮沸样品在95℃的加热块上5分钟（或等效设备），并负载在样品缓冲液溶解的样品的〜40μL在一个18％Tris-甘氨酸凝胶。
注：梯度凝胶（4-15％）或14％Tris-甘氨酸凝胶也足以检测的低分子量蛋白质。不同类型的丙烯酰胺凝胶，也可使用，但确保了凝胶和系统是足够的，用于检测低分子量蛋白质。- 运行使用1×电泳缓冲液在恒定的100伏20分钟（通过浓缩胶）和〜180 V. 60分钟监测凝胶所以染料前端刚刚跑出或是在凝胶的底部，以使低分子量量的蛋白质做不属于R未关闭凝胶。
- 转移丙烯酰胺凝胶至PVDF膜（预先浸泡用100％甲醇来激活）。如果做一个湿转移，仅需要1小时为传送（相对于正常〜1.75小时）。相应地调整为适当的传输系统;使用预染色的分子量标记物可以在评估转印效率帮助。
- 在水中洗膜。使用丽春红染色以监测样品的平等装载。用清水洗净丽春红了。
- 在RT或O / N在4℃下搅拌阻止TBST 1个小时，在5％无脂干乳的膜（50毫摩尔Tris-盐酸pH为7.5，150mM的NaCl和0.1％吐温20）。
- 洗涤用TBST印迹一次，并用在5％牛奶的TBST（参见稀释和抗体建议的材料表 ），用于在室温下1个小时稀释的初级抗体孵育。
- 用TBST执行两个快速洗涤，然后在摇动器上清洗两次，总共约30分钟（〜15分钟为每H）。
- 与在室温40分钟的第二抗体孵育。重复步骤6.10。
- 用新鲜的印迹基板培育和发展电影或阅读上的化学发光阅读器。
- 探针与免疫印迹P16 INK4A抗体第一（ 图5）。通过15分钟，用水，15分钟用0.2N NaOH和水15分钟温育剥离该膜。使用抗p21抗体步骤6.9继续。
- 与每50mL剥离液300微升新鲜加入BME的剥离用62.5毫摩尔Tris-HCL pH 6.8的2％SDS将膜。
- 孵育在50℃下进行30分钟，并用TBS然后TBST洗广泛。与蛋白-样对照抗肌动蛋白或抗GAPDH抗体探针（ 图5示出的代表性结果）。
注：p53水平也可以在相同的膜进行评估。然而，由于p53是较高分子量，最好是解决上的较低百分比凝胶（ 例如，
7.分析衰老标记的表达水平
注：当分离RNA，确保工作表面用RNA酶去除溶液或等效的清洗和材料都是无RNA酶。
- 来自步骤4.2使用细胞/ PBS混合物，加入的RNA提取溶液并涡旋30秒1毫升（应该没有可见的团块或细胞碎片）。
- 加入200μl氯仿，剧烈摇晃15秒。
- 离心机以最大速度（> 15000×g下）在4℃下15分钟。
- 拆下顶部RNA水层的〜400μL，并用移液管到一个新的微量离心管中。
- 添加400μL的异丙醇（1：1与水层的在上一步移液的总体积）和PR 4μLecipitant到RNA层。
- 离心机以最大速度（> 15000×g）离心15-30分钟，4℃以沉淀RNA。
- 除去上清液，并添加1毫升的75％冰冷的乙醇。
- 离心机以最大速度（> 15000×g下）和4℃1分钟。
- 去除上清，离心机以最大速度（> 15000×g下）和4℃1分钟。
- 移液器尽可能多的液体尽可能和空气干燥2分钟。
- 在10微升10X DNA酶缓冲液中，H 2 O 85μL重悬，和DNA酶1的5μL。
- 孵育在37℃下30分钟。
- 添加200μLNT2缓冲液（50mM的Tris-HCl pH 7.4的，150mM NaCl的，1毫摩尔MgCl 2，和0.05％的Nonidet P-40），并加入酸的苯酚-三氯甲烷2的下层的300μL。
- 涡流以最大速度在室温下1分钟，并离心5分钟（> 15000×g）离心。
- 收集上层RNA层（2×125μL）的250μL，添加253M乙酸钠pH为5.2的100％冰冷的乙醇625微升，并沉淀剂的5μL微升。混合均匀，并且在-20℃下沉淀O / N。
- 第二天，混合，并在最大速度（> 15000×g下）和4℃，30分钟旋涂，并弃去上清液。
- 重复步骤6.8-6.11。
- 在-80℃下直至使用重悬在无核酸酶的水和存储12μL沉淀。
注意：其他RNA分离方法和试剂盒可以使用。 - 用随机六聚体进行反转录和SSII根据制造商的方案逆转录酶。
注意：给定来自衰老细胞分离的RNA的量低时，最好使用所有的RNA（12μL）的用于逆转录合成。可选地，RNA可使用分光光度计进行定量，且可用于逆转录等量的RNA。 - 分析采用实时定量PCR定量（RT-qPCR的）amplific mRNA水平通货膨胀和SYBR绿色PCR主混合物用基因特异性引物。
- 如在典型的RT-qPCR反应中，淡化的cDNA 1:30（在RNA酶/ DNA酶的水），并加入3微升至实时96孔板为更好吸移精度。制备基因特异性正向的反应预混液和反向引物（2.5μM浓度，加入5μL/反应），SYBR绿色PCR混合物（6.25μL/反应;使用小于制造商的建议），和5.75μLRNA酶/无DNA酶的水的20μL（引物/ SYBR绿色/水17μL和cDNA的3微升）的最终反应体积。
- 使用实时PCR机进行RT-qPCR的扩增;按照制造商的协议。
注：前验证人的名单和反向实时引物可以在表1中找到。这些基因包括SASP蛋白质和其他衰老相关的标志物和/或基因。从IR诱导的衰老代表性的结果示于
8.量化SASP蛋白水平
- 使用第1或2或使用另一种方法诱导衰老。板上6个或10厘米板中的细胞，上述（〜250,000个细胞/6厘米板或〜650000 / 10cm平板）所描述的。
- 或者与细胞10天后IR处理或复制衰老细胞（和适当的对照细胞），洗细胞三次，用1×PBS和用抗生素在小体积中添加的无血清培养基（2.5毫升6厘米，即5毫升为10厘米）。
- 在组织培养培养箱中在37℃下孵育过夜，5％CO 2。第二天，收集媒体，并把它在一个锥形管冰。
- 清洗细胞2次，用PBS，然后添加1mL的胰蛋白酶的（为一个6cm皿）。计数使用血球根据细胞数稍后调整浓度的细胞。
- 离心机在300×g下5分钟的平台。
- FILTER培养基用0.45微米的注射器式过滤器。
- 等分在-80℃下的介质并冷冻直至使用或测定直接使用ELISA或等价测定。
- 通过取总细胞数/介质的收集体积计算细胞/ mL浓度的数量。
- 执行根据制造商的说明适当的酶联免疫吸附测定（ELISA）。参见推荐的ELISA试剂盒的材料表用于测定对IL-6，IL-8，GROα，和其它细胞因子/趋化因子（ 图6B）。
- 为了确保所测量的因素是ELISA试剂盒的线性范围内，使比增殖细胞培养基中的衰老细胞介质的稀释液。占这些稀释并计算IL-6的量时的体积。每稀释的细胞浓度每毫升获取IL-6为每天每细胞分泌的量，计算从试剂盒（以pg）中得到的IL-6值（FROM步骤7.8）。
注意：其他方法，如细胞因子的阵列，可用于检测SASP蛋白水平和可适合用于筛选大量的SASP因素。的SASP因子的蛋白水平可以基于衰老诱导，细胞类型，或衰老诱导的类型后的时间。
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Representative Results
图2 -图6示出从SA-β-gal染色的代表性结果;染色γ-H2AX和SAHF; P16 INK4A，P21和p53的蛋白水平的评估;和mRNA和衰老相关分子的蛋白水平。增加SA-β-gal染色以复制和DNA损伤诱导的衰老发生。此外，观察与衰老发生形态变化。相比增殖的成纤维细胞的主轴外观细胞成为扩大且平坦。对于此实验范例，细胞染色和RNA /蛋白质被暴露于IR辐射之后，分离7天。更健壮的结果可以由IR暴露（ 即 10天）后等待再发生。条件需要为每个条件和试验设置确定。这些结果代表，并且当衰老使用其他方法诱导也可以被检测这些标记物。
图6中 ，基因名称列出并对应于CXCL1（GROα），CXCL2（GROβ），和CSF2（GM-CSF）。 IR诱导的衰老后观察到在WI-38细胞的一些mRNA水平的SASP因子的上调，但不是全部。其他衰老相关的mRNA，包括CDKN1A（编码p21蛋白）和CDKN2A（p16基因编码INK4A），被上调。其它mRNA（EDN1和ANKRD1）也被包括在内，先前已被证明在衰老细胞15要高。引物列于表1中 。
图1：增殖和衰老成纤维细胞。增殖（左）和衰老（右）的成纤维细胞的示意图。衰老诱导剂的实例示于叶llow框。衰老与上级指示标记的关联。 SA-β-GAL，衰老相关β半乳糖苷酶的活性; SASP，衰老相关分泌表型; SAHF，衰老相关异灶; DDR，DNA损伤应答。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.形态特征和衰老细胞的增加的SA-β-gal的活性的影响。 WI-38细胞，无论是增殖 “年轻”（PDL 27），复制衰老（PDL 40），或那些暴露于电离辐射（IR），进行染色SA-β-gal的活性。 IMR-90细胞中，无论是增殖 “年轻”（PDL 30），复制衰老（PDL 52），或那些暴露于电离辐射（IR），分别为STA独立非执行董事为SA-β-GAL活性。部分1 - 2描述诱导复制和DNA损伤诱导的衰老，和第3节说明了SA-β-gal染色。将细胞IR染色后7天。 CON，控制。比例尺=50μm以下。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.增加γ-H2AX焦点衰老细胞中。 WI-38细胞，无论是增殖 “年轻”（PDL 30）或复制衰老（PDL 53），固定，并用抗γ-H2AX的抗体和DAPI染色。注意γ-H2AX焦点的衰老细胞数量的增加。在共聚焦显微镜获得图像。 Z-切片截取，并使用该最大强度投影以获得一个单一的平面图像来可视化所有DETEC表灶。比例尺=20μm以下。 请点击此处查看该图的放大版本。
图衰老细胞SAHF 4.荧光染色。 （A）增殖WI-38细胞（PDL 27）不接受治疗，或暴露于电离辐射（IR）。 10天后，将细胞用DAPI染色以显现SAHF（注意在IR处理的细胞密/点状DAPI染色）（B）IDH4是在地塞米松存在下生长（增殖）或木炭处理的FBS诱导衰老（衰老）。 10天后，将细胞用针对的H3K9me2和DAPI的抗体染色。在共聚焦显微镜获得图像。 Z-切片截取，并使用最大强度投影以获得一个单一的平面图片。在（A）和（B）的增殖细胞具有漫DAPI染色，而衰老细胞具有点状DAPI染色。在（B）中，控制单元具有用于漫的H3K9me2，很轻染色，而染色的H3K9me2更坚固，并与在衰老细胞DAPI染色共定位病灶。比例尺=20μm以下。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.定量衰老相关蛋白。 （ - ）或暴露于电离辐射的10格雷（IR）IMR-90细胞中的蛋白质是从任一增殖“年轻”（PDL 30）IMR-90细胞中分离。将培养基换成每48小时，将细胞IR裂解后7天。样品通过SDS-PAGE分析，具有抗P16 INK4A antibo免疫印迹模具，并与抗p21再p53抗体再探测。 GAPDH用作蛋白质样对照。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.定量衰老相关的mRNA和蛋白质SASP的。 （ - ），其暴露于电离辐射（IR）的10戈瑞或WI-38细胞（A）RNA是从任一增殖“年轻”（PDL 27或34）WI-38细胞中分离。培养基每48个小时改变和IR后进行RNA分离7天。 RT-qPCR的用于定量使用表1中列出的基因特异性引物所指示的衰老相关的mRNA的水平。 18S水平用于标准化。直方图代表平均标准化ŧ从5个独立实验ö未处理±SEM。 （B）WI-38细胞（PDL 26）暴露于IR的10戈瑞; 10d中后，将培养基换成无血清培养基（参见第7节）。 24个小时后，收集条件培养基，并使用ELISA测定IL-6，IL-8，GROα和水平进行定量。直方图表示3个实验的平均值±SEM。 * P <0.05和*** P <0.001通过学生t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 人类引物 | 前锋 | 相反 |
| 18S | CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTCG | CCAATGGATCCTCGTTAAAGGATTT |
| ANKRD1 | AGT AGA GGA ACT GGT CACTGG | TGG GCT AGA AGT GTCTTC AGAŧ |
| CDKN1A（P21） | GAC ACCACT GGA GGG TGA CT | CAGGTC CAC ATG GTC TTC CT |
| CDKN2A（P16） | CCAACGCACCGAATAGTTACG | GCGCTGCCCATCATCATG |
| CSF2（GM-CSF） | GGCCCCTTGACCATGATG | TCTGGGTTGCACAGGAAGTTT |
| CXCL1 | GAAAGCTTGCCTCAATCCTG | CACCAGTGAGCTTCCTCCTC |
| CXCL2 | AACTGCGCTGCCAGTGCT | CCCATTCTTGAGTGTGGCTA |
| EDN1 | CAG CAGTCT TAG GCG CTG AG | ACTCTT TAT CCA TCA GGG ACG AG |
| IL6 | CCGGGAACGAAAGAGAAGCT | GCGCTTGTGGAGAAGGAGTT |
| IL7 | CTCCAGTTGCGGTCATCATG | GAGGAAGTCCAAAGATATACCTAAAAGAA |
| IL8 | CTTTCCACCCCAAATTTATCAAAG | CAGACAGAGCTCTCTTCCATCAGA |
表1：RT-qPCR 的引物对衰老相关的mRNA。正向和反向引物使用RT-qPCR的SYBR绿色技术表示。
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Discussion
在这里，我们已经描述了使用人二倍体成纤维细胞用于复制和DNA损伤诱导的衰老的方法。此外，用于定量蛋白质和多种衰老相关蛋白的mRNA水平的技术包括，以及染色SA-β-gal和对DNA损伤标记物γ-H2AX。这些协议可广泛用于评估在体外和体内表型衰老，虽然用于体内 20表征衰老存在许多警告。其他细胞可表达衰老标记，即使它们不衰老细胞。例如，细胞如破骨细胞和巨噬细胞有较高水平的β-gal活性的32，33的。此外，许多癌细胞已经上调p16基因INK4A 34。细胞也可以积累的DNA损伤（ 例如，γ-H2AX焦点）和不衰老。 SASP因素也可以通过上调各种正常生理或可以或可以不涉及衰老细胞的病理状况。因此，多个衰老标记物应当利用在体内评估衰老时尤其如此。
虽然被发现衰老细胞在正常老化组织20余年前4增加，这是唯一的，现在我们充分理解角色的过多是衰老细胞在正常组织稳态和病理条件下发挥。最近的小鼠模型的就业，消除P16 INK4A阳性衰老细胞已经允许研究人员更清楚，更准确地领会衰老细胞的组织和器官35，36，37的作用。这些模型已经揭露了衰老细胞有助于与年龄有关的疾病，肿瘤发生的众多和鼠标寿命35 </ SUP>，36，37。鉴于这些最新发现和衰老细胞的生理的重要性验证，时机已经成熟，在这些特定的细胞更多的研究。例如，研究用人策略，以治疗去除衰老细胞或延缓衰老可能是双方长期保健和寿命的研究是有益的。
最近，我们的实验室发现，二甲双胍，常用来治疗2型糖尿病的药物，减少细胞衰老38。如二甲双胍，目前正在提议作为一种抗衰老疗法，具有抗癌特性39，40，这将是未来的有趣的探索通过调控细胞衰老这种药物，或其他老化干预，是否会影响健康结果。
我们在这里讨论的协议是常见的，广泛的一ccepted技术来评估衰老表型。对于体外生长的细胞，关键是要监视由纺锤状至平坦的形貌细胞变化，以确保细胞是衰老（参见图1和2）。如果细胞不是阳性的SA-β-gal的或此处描述的其它标志物，在更高的细胞的PDL（对于复制衰老），或者在DNA损伤诱导的衰老之后增加的时间评估衰老。此外，这些协议可能需要为不同的细胞类型进行优化。用于评估SASP蛋白水平，至关重要的是，从细胞培养基中去除血清，因为这将导致在ELISA或蛋白质阵列高背景水平。因此，在设计实验时，记住这一点，因为它可能不是理想的同时评估多个标志。
染色SA-β-gal的，如在此所描述的，通过它需要细胞的固定的事实的限制。此外，细胞融合已经显示出影响SA-β-GAL活性。协议已经被开发使用的β-gal活性的荧光底物，其允许该标志物在使用流式细胞仪41，42，43活细胞的定量，以评估SA-β-Gal的活性。 SA-β-gal的活性也可以在使用化学发光方法44细胞裂解液中测定的。另外，γ-H2AX，也可以使用各种其他方法，包括流式细胞术或细胞裂解物45的免疫印迹测定。
应当指出的是，SAHF形成是细胞系相关的，并且主要是与相关联的癌基因诱导的衰老20,30，46。因此，SAHF可能不会出现在所有的衰老模型。的效用SAHF如在小鼠模型中衰老标记物也可通过其SAHF一般不小鼠衰老细胞30，46，47中观察到的事实的限制。在这里，针对的H3K9me2抗体被用于，但SAHF的其它分子标记可用于，包括的macroH2A，高迁移率族A（HMGA）蛋白，和三甲基化的赖氨酸9组蛋白H3（的H3K9me3）和结合的HP1蛋白。此外，染色质免疫沉淀测定法可以用于评估组蛋白标记或染色质结合蛋白与E2F靶基因的关联。
每个人都应该知道，有对衰老特征，包括异质性标志物，事实上，这些标记不衰老细胞中特异表达的各种限制。多个（在一般情况下，2 - 3）标记物应当用来评估衰老，包括这里未描述的标记。例如，DNA-疤痕，端粒损坏，和/或DNA损伤信号也可以定量。此外，如衰老和，特别地，所述SASP表型，最近已表明通过诱导衰老11，12，13中的特定应力源或损坏的影响，所以，以评估在每个实验范例多个标记是重要的。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生研究院老龄研究所院内研究计划的支持。作者要感谢迈娅姆·戈罗斯佩和寇柏Abdelmohsen约衰老和寇柏Abdelmohsen的批判也读手稿许多有益的讨论。我们也感谢我们的实验室成员，特别是道格拉斯·德卢岑批判地阅读手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/mL in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000 - 5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2,000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 |
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