Introduction
Axon Erreichen Regeneration nach Schädigung des Nervensystems ist eine anspruchsvolle Aufgabe 1. Um den Ausfall von Axonregeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) zu untersuchen, haben die Forscher eine Vielzahl von Nervenverletzungen Modelle verwendet. Als Regionen des ZNS unterscheiden, ist es wichtig, ein anatomisch geeignetes Modell zu studieren Axonregeneration zu verwenden. Durch das entsprechende Modell verwenden, können die Forscher eine spezifische Behandlung formulieren von der Schwere der Verletzung basiert, der neuronalen Zelltyp von Interesse und den gewünschten Rücken-Darm-Trakt Regeneration für die Beurteilung, im Gegensatz zu einer „One-for-all“ Behandlungsstrategie.
In Verletzung des Rückenmarks, zum Beispiel stammen die meisten schwächenden Symptome der Verlust der Empfindung und Fortbewegung. Verlust der Empfindung wird durch Schäden an den aufsteigenden sensorischen Bahnen verursacht, während der Verlust der Fortbewegung durch Schäden an den absteigenden motorischen Bahnen verursacht wird. Aufgrund zellulären und anatomischen Unterschiede zwischen diesen two Wege konzentrieren sich viele gezielte Axonregeneration Studien nur auf den einen oder anderen Weg, mit der Begründung, dass eine erfolgreiche Erholung der entweder von enormem Nutzen für die Patienten sein würde. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll, das eine direkte Spinalganglien (DRG) Injektion mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark einer erwachsenen Ratte als Modell Regeneration zu studieren sensorische Axonen verwendet.
DRG sensorisch Neuronen sind verantwortlich für die sensorischen Informationen, wie taktile Empfindung und Schmerzweiterleitung, von der Peripherie zum ZNS. Die langen axonale Projektionen von sensorischen Neuronen im Rückenmark dienen als ein gutes Modell Fern Axonregeneration zu studieren. Darüber hinaus, wie Nager eine sensorische Bahn Läsion wie ein dorsale Wurzel Quetschverletzungen mit minimalen Wohlergehen Komplikationen überleben können, können die Forscher CNS Axonregeneration studieren, ohne die Notwendigkeit vollständig in das Rückenmark zur Läsion. A Quadruple C5 - C8 (zervikale level 5 bis 8) dorsale Wurzel Quetschverletzungen wurde ein nützliches Modell für forepaw Deafferentation 2 gezeigt werden. Darüber hinaus bietet ein dorsales Wurzel Quetschverletzungen ein „sauberes“ Modell Axonregeneration als eine direkte Verletzung des Rückenmarks zu studieren, weil sie durch andere Faktoren wie Glia Narbenbildung unkompliziert.
Die Verwendung von viralen Gentherapie Neuronen in einem regenerativen Zustand neu zu programmieren zunehmend als vielversprechende Behandlungsstrategie für viele neurologische Erkrankungen 3 angesehen. Studien haben die Anwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV) Vektor trägt das Transgen eines wachstumsförderndes Protein gezeigt , mit Verhaltensbesserung 4, 5, 6 robust Axonregeneration erzielen. Die scheinbare niedrige Pathogenität von AAV in Hervorrufen einer Immunantwort und die Fähigkeit, sich nicht teilende Zellen transduzieren, wie Neuronen, machenes der optimale Vektor für die Gentherapie. Zusätzlich wird die rekombinante AAV Form zur Therapie verwendet. In dieser Form ist er unfähig , seine viralen Genoms in das Wirtsgenom zu integrieren , 7, um das Risiko von Insertionsmutagenese zu reduzieren , im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, wie Lentivirus. Dies macht AAV eine sichere Wahl für gentherapeutische Anwendungen.
Als DRG die Zellkörper von sensorischen Neuronen enthält, ist es das am besten geeignete anatomische Ziel für die Verabreichung des Virus für die Gentherapie zu untersuchen und / oder sensorische Axonregeneration zu fördern. In einer Studie wurde verschiedene AAV - Serotypen und Lentivirus, AAV - Serotyp 5 (AAV5) Vergleichen gezeigt in DRG - Neuronen transduzieren über einen Zeitverlauf von mindestens 12 Wochen die effizienteste, wenn 8 direkt in den DRG injiziert. Zusätzlich kann AAV mehr als 40% Transduktionseffizienz erreichen, alle DRG neuronalen Subtypen Umwandlungs, wie mit dem großen Durchmesser Neurofilament 200 kDa(NF200) -positiven Neuronen und der kleine Durchmesser Calcitonin gene-related peptide (CGRP) - oder isolectin b4 (IB4) -positiven Neuronen 4, 8.
Da das chirurgische Verfahren der DRG-Injektion und Quetschverletzungen dorsalen Wurzel extrem invasiv und empfindlich ist, sind wir der Meinung, dass dieser Artikel neue Benutzer helfen wird, das Verfahren auf eine sehr effiziente Art und Weise zu lernen. In diesem Artikel zeigen wir repräsentative Ergebnisse von erwachsenen Ratten vier Wochen nach der Injektion eines Kontrollvirus AAV5-GFP (green fluorescent protein) in C6 - C7 DRGs mit einem gleichzeitigen C5 - C8 dorsaler Wurzel Zu. Dieses Modell eignet sich besonders für Forscher, die die Verwendung von viralen Gentherapie untersuchen zu sensorischen Axonregeneration zu fördern.
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Protocol
Alle folgenden Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Vereinigten Königreich Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt Falls Sie nicht wissen mit diesen Verfahren, überprüfen Sie bitte mit den lokalen / nationalen Vorschriften und Veterinär Rat einholen, bevor das Protokoll zu starten.
1. Die Wahl eines geeigneten Stammes von Tiere
Hinweis: Eine dorsale Wurzel Quetschverletzungen führt zum Verlust der Empfindung und Pfote Deafferentation. Häufige Nebenwirkungen von forepaw Deafferentation können, gehören Über Grooming, Selbstverstümmelung und Pfote autotomy.
- Erhalten Tiere für das Verfahren.
HINWEIS: Bei Ratten, die aktiveren Stämme wie Lister-Hooded Wistar und haben eine höhere Inzidenz von Paw autotomy nach Deafferentation den fügsamen Stämmen verglichen, wie Lewis und Sprague-Dawley. Wenn möglich, die fügsam Stamm, Lewis, sollte immer an erster Stelle in Betracht gezogen werden. Sollte eine besonders aktive Belastung für das Experiment notwendig sein, durch genetischen mNDERUNG oder spezifische Verhaltensbeurteilung Anforderungen soll Veterinärbehandlung vorhanden sein, schädliche Wirkungen zu begegnen erwartet.
2. Vorbereitung des Virus für die Injektion
ACHTUNG: Behandeln Sie alle Viren in Übereinstimmung mit biologischen und Laborsicherheitsbestimmungen.
- Verdünnen oder das Virus zu einem Titer von 2 x 10 12 Genomkopie (GC) konzentrieren / mL folgende einzelne Virusverpackung Protokollen 9.
HINWEIS: Hier wurde das Virus in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) mit 5% Saccharose verdünnt. Der Titer kann optimiert werden, abhängig von der Art des Virus-Promotor, konstruiert Größe sowie gezielter Zelltyp. - Optional: 1% farbigen Farbstoff (zB Fast Green) an die Virus - Lösung für die einfache Visualisierung der Injektion später. Mischen Sie die Lösung sehr sanft.
- Halten Sie die Lösung auf Eis für den sofortigen Einsatz (innerhalb von 4 h) oder in einem -80 ° C-Gefrierschrank für die LangZeitlagerung.
3. Durchführung der präoperativen Vorbereitung des Tier
HINWEIS: Aufgrund der extremen Invasivität der Operation sollten aseptische Techniken jederzeit verwendet werden.
- Vorbereiten und Sterilisieren alle chirurgischen Instrumente und das Rücken Stereotaxierahmen vor der Operation zu beginnen. Beispielsweise sterilisieren, die Werkzeuge in einem Autoklaven bei 134 ° C. Verwenden Sie einen frischen Satz von sterilisierten Werkzeugen für jedes Tier.
- Betäuben das Tier. Bestätigen Sie die richtige anesthetization durch die Pfote Kneifen für den Rückzug Reflex zu testen oder durch die Hornhaut für die Lidschlussreflex berühren.
- Für erwachsene Ratten Inhalationsanästhesie wie Isofluran arbeiten, verwenden 4% Isofluran in 2,0 l / min Sauerstoff für die Induktion. Für Wartung während der Operation verwenden, 2 - 3% Isofluran in 1,5 l / min Sauerstoff, Variieren die Isofluran-Konzentration nach dem Atemmuster des Tieres Über- oder Unterdosierung zu vermeiden.
- Aufce das Tier zunächst betäubt ist, notieren Sie die präoperative Gewicht des Tieres.
- Für die zervikale DRG Injektion, scheren das Fell auf dem Hals zwischen den Ohren gerade distal des scapulae ab. Desinfizieren Sie die rasierte Fläche mit einem Antiseptikum Produkt.
- Einzuzuspritzen 2 ml Kochsalzlösung subkutan in der Flanke des Tieres, zusammen mit einer geeigneten Dosis des Analgetikums (beispielsweise 5 mg / kg Carprofen) und Antibiotika (beispielsweise 5 mg / kg Enrofloxacin).
- Bewerben Augensalbe sowohl für die Augen Hornhauttrocknung während des Verfahrens zu verhindern.
- Weiter zur Operation an einem Wirbelsäulen Stereotaxierahmen mit einem Heizkissen bei 37 ° C unterhalb des Tieres platziert.
4. Injizieren DRG und Durchführen einer Hinterwurzel Quetschverletzungen
HINWEIS: Dies ist eine äußerst heikle Operation. Es ist ratsam, ein paar tote Tiere üben zunächst mit der Anatomie vertraut zu machen, bevor fortTierChirurgie zu leben.
- Locate die prominenten C2 und T2 Dornfortsätze über die Haut. Führe einen Hautschnitt zwischen den C2 und T2 Dornfortsätzen mit einer No.10 Skalpellklinge (einmal die Haut geöffnet wird, ein weißes, faseriges Gewebe-Mittellinie auf der ersten Schicht des Muskels sichtbar sein soll, wobei die erste Schicht von Muskel hat eine " geleeartige“Textur).
- Machen Sie einen ähnlich großen Einschnitt auf der ersten Schicht des Muskels entlang der weißen Mittellinie ein Skalpell. Gehen Sie nicht über den prominenten T2 spinous Prozess, da es einen großen arteriellen Zweig von der absteigenden Aorta ist dort in der Nähe befindet.
HINWEIS: Starke Blutungen ab überall von diesem Schritt erfolgen können. Halten Sie immer die Blutung und entfernen Sie das Blut durch die Verwendung sterilisierten Wattestäbchen oder chirurgische resorbierbaren Schwämme klare Visualisierung jederzeit zu ermöglichen. Fortschreiten mit dem Verfahren „blind“ zu unerwünschten Schäden führen kann später an das Rückenmark, DRG, oder dorsal root, was zu unerwarteten Nebenwirkungen bei dem Tiere. - einfahren dieerste Schicht von Muskel zwei Retraktoren unter Verwendung einer platziert rostral und eine caudal; die zweite Schicht von Muskeln, mit einem quergestreifter Aussehen, sollte sichtbar sein.
- Lokalisieren der Mittellinie der zweiten Schicht des Muskels (wo zwei Längsmuskeln können durch ein dünnes, membranartigen Gewebe verbunden beobachtet werden). Seziert das membranöse Gewebe ein Paar von Mikroschere mit den beiden Längsmuskeln zu trennen. Vermeiden Sie ein Skalpell, wenn möglich, da dies zu unnötigen Muskelschäden und Blutungen führen kann.
- Stellen Sie die Retraktoren dementsprechend die dritte Schicht aus dünnem Muskel zu, die Wirbelsäule bedecken. Die Dornfortsätze können mit einer Zange über die dritte Schicht des Muskels durch leichtes Berühren fühlbar.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der dritten Schicht von Muskel Mikroscheren mit und sanft abzukratzen den Muskel vom Knochen einer Kürette oder Skalpell in einer Seitwärts Weise mit deutlich die Wirbel aus. Bei Bedarf wegschneiden einige der Muskeln oder Sehnen, um die Lami zu machennectomy einfacher.
- Zu belichten des linksen C5 - C8 DRGs, führt eine linke hemi-Laminektomie auf dem C4 - Wirbel T1 durch vorsichtiges Teil der Lamina entfernt und Pedikel ein Paar von feinen Rongeurs verwenden. Die DRG ist nahe der Quer Foramen des Wirbels angeordnet.
HINWEIS: C3 - C7 Wirbel nicht einen prominenten spinous Prozess. Die DRG C5 zwischen C4 und C5 Wirbeln befindet, ist die C6 DRG zwischen C5 und C6 Wirbel, und so weiter, während die C8 DRG zwischen C7 und T1 Wirbeln ist. Es gibt keinen C8 Wirbel, trotz der Gegenwart eines C8 DRG und eine Rückenmarksegment C8. - Sobald genug von der DRG wird zur Injektion freigelegt worden ist, bereitet die Spritze durch die Virus gefüllte Mikroliterspritze mit einem Maße, 33-Gauge-Nadel stumpf auf den stereotaxische Spritzenhalter angebracht platzieren. Vor der Injektion verwenden, um eine 30-Gauge-Nadel eine abgeschrägte kleinen oberflächlichen Öffnung auf jede der gezielten DRG zu machen mit dem Einstechen der Injektionsnadel zu unterstützen.
- Legen Sie die 33-gAuge entfernt Nadel in der Mitte der DRG daß die Knöpfe gedreht sanft die stereotaxische Koordinaten einzustellen. Nicht über-die Nadel, da diese Flüssigkeit aus der Bauchseite des DRG austreten verursachen kann. Bei Leckage die Position der Nadel sofort auftreten, anzupassen.
HINWEIS: Die numerischen Stereotaxierahmen Koordinaten nicht verwendet werden; jedoch ist es hilfreich, um den Rahmen zu nutzen, um die Nadel für die Injektion zu halten. - Einzuspritzen 1 ul des Virus in jedem DRG bei 0,2 & mgr; l / min, eine Infusionsspritzenpumpe. Warten für weitere drei Minuten, bevor die Nadel zurückzuziehen. Während der Injektion wird die DRG langsam Farbe ändern, wenn die Viruslösung einen Farbstoff enthält.
- Um eine gleichzeitige C5 auszuführen - C8 dorsal root Quetschverletzung, zerquetschen jeder Wurzel dreimal 10 s jeweils unter Verwendung eines Paar von feiner bestückte Zange (Bonn Micro), gegenüberliegenden Enden der Zange vollständig; eine weiße Linie in dem Gewebe an der Quetschstelle erscheinen soll. Gehen Sie nicht tiefer als bei der forc erforderlicheps, da dies kann zu Schäden an der ventralen Wurzel führen.
- Im Anschluss an die Injektion und / oder zu vernichten, stellen Sie sicher, dass es keine Blutungen oder kleine Stücke von Knochenfragmenten an der Einschnittstelle vor dem Schließen bis das Tier nach links ist. Wenn bevorzugt wird, stellt ein kleines Stück chirurgischer resorbierbaren Schwamms auf der Oberseite des freiliegenden Rückenmark und DRG.
- Lassen Sie die dritte Schicht des Muskels natürlich auf die Wirbelsäule, ohne Vernähung zurückzuziehen zurück. Lose Naht die beiden auf der zweiten Schicht Längsmuskeln mit resorbierbaren Nahtmaterial 6-0 (≈ 3 Fäden unterbrochen). Vernähen die erste Schicht des Muskels (≈ 5 unterbrochen Nähte) mit resorbierbaren Nahtmaterial 6-0.
- Vernähen die Haut mit resorbierbaren 5-0 Nahtmaterial (≈ 10 unterbrochen Nähte).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Nähte nicht zu eng sind. Vorwölbung der Haut ist ein Zeichen von Überdrehen und können Beschwerden an das Tier verursachen. - Wenn schwere Blutungen während der Operation aufgetreten ist, injiziert subkutan 1 bis 2ml Kochsalzlösung, den Verlust von Flüssigkeit aus dem Tiere wieder aufzufüllen, wie unter lokalen Regelungen zulässig.
- Vorzusehen eßbaren hydratisierende Gel und ermöglicht es dem Tier zu gewinnen zum regelmäßigen Überwachung der Durchführung mindestens 1 h vollständig von der Anästhesie, bevor das Tier zurück zu dem Haltebereich zurückkehrt.
- Halten Sie das Tier für mindestens 3 Wochen für eine optimale Transgen-Expression auf sensorische Axonregeneration zu bewerten.
5.es Durchführen von Postoperative Pflege des Tieres
- Geben Sie Lebensmittel Maische und weiche Baumwollbettwäsche für das Tier während der ersten Woche nach der Operation. Bei Bedarf verabreicht zusätzliche Dosen von analgetischen und Antibiotikum mit der Erholung im Einklang mit den lokalen / nationalen Vorschriften und Veterinär Beratung zu unterstützen.
- Entfernen Sie die Nähte auf der Haut nach 7 - 10 Tagen.
HINWEIS: Häufige Nebenwirkungen der Operation umfassen die Bildung von seroma oder Hämatom an der Einschnittstelle, Kratzspuren auf der Haut aufgrund der Juckreiz verursacht durchdie inneren resorbierbaren Fäden, subtile sensorische oder Bewegungsdefiziten und Anzeichen von Selbstverstümmelung auf der deafferentierten Pfote nach der Quetschverletzungen dorsalen Wurzel. Für alle Schutzfragen, die wesentlich schwerer sind als erwartet, suchen Sie sofort ein Tierarzt.
6. Durchführen einer Anterograde CTB Injection für Axonal Tracing
HINWEIS: Es wird empfohlen, Choleratoxin B-Untereinheit (CTB) axonalen Tracing in der Woche vor der Gewebesammlung durchzuführen.
- Bereiten Sie 1% CTB Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Optional: 1% gefärbten Farbstoff zu der Lösung für die einfache Visualisierung der Injektion später. Mischen Sie die Lösung sehr sanft.
- Anesthetize das Tier (siehe Schritt 3.2.1) und Stabilisierung der linken Vorderpfote durch das Glied zum Tisch Taping.
- Manuell und 1 ul 1% CTB langsam subkutan in die Mitte des glabrous Fußballen und vier Ziffern unter Verwendung einer Mikroliterspritze versehen wi injizierenth eine maßgefertigte, 33-Gauge-Nadel kurz.
Hinweis: Vor der Injektion, hilft es, zunächst eine 30-Gauge-Nadel verwenden, um eine abgeschrägte kleine oberflächliche Öffnung an der Haut zu machen, die mit dem Einführen der Injektionsnadel unterstützt. - Lassen Sie das Tier vollständig aus der Narkose erholen, bevor das Tier zu dem Haltebereich zurückkehrt.
7. Sammeln Tissue
- Um das Virus injiziert DRG und Rückenmark für die Immunhistochemie zu sammeln, eine Überdosis Anästhetikum administrieren und transkardial perfundiert das Tier mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von kaltem 4% Paraformaldehyd. Vorsichtig führen Sie eine vollständige Laminektomie auf dem Rücken der festen Gewebe unter dem Mikroskop zu sammeln. Weiter mit Gewebepräparation, Sektionierung, und die Verarbeitung , wie für die Analyse erforderliche 4, 5, 6.
HINWEIS: Die zurückgewonnene Inzisionsstelle sollte offensichtlich sein, wie durch die Anwesenheit von s beobachtetAuto Gewebe. - Alternativ kann das Virus injiziert DRG für in - vitro - Kultur zu sammeln, um das Tier opfern artgerecht mit einem genehmigten Verfahren, wie beispielsweise eine ansteigende Konzentration an Kohlendioxid. Sorgfältig seziert die DRG unter einem Mikroskop, aseptische Bedingungen, wann immer möglich zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Gewebekultur nach Wunsch 4, 5, 6, 10.
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Representative Results
Als Darstellung ist eine quer verlaufende Rückenmark Abschnitt mit dem daran befestigten DRG präsentiert die Wirksamkeit dieses Protokoll zeigen DRG Neurone in transduzierende und sensorischen Axonen im Rückenmark von vier Wochen nach einer Kontrollvirus, AAV5-GFP, direkt in die C7 Verfolgungs Injizieren DRG ohne dorsale Wurzel Quetschverletzungen (Abbildung 1A). Axone in sowohl der dorsalen Säule und dem Hinterhorn des Rückenmarks GFP exprimieren (1B) sowie die Zellkörper und Axone innerhalb des injizierten DRG (1C). Zusätzliche anatomische Analyse des Nucleus Cuneatus, die sensorische Axonendigung im Hirnstamm, offenbart positive anterograde CTB Tracing (1D).
Wenn die DRG-Injektion wird mit einer vollständigen C5-C8 dorsal root Quetschverletzung, keine GFP-positiven Axone im Rückenmark oder CTB-positiven Anschluss gleichzeitig durchgeführts in der Nucleus Cuneatus beobachtet (2A). Jedoch ist es erwähnenswert, dass axotomisierten sensorische Axonen noch in einer vollständig zerdrückt dorsalen Wurzel zu der dorsalen Wurzeleintrittszone regenerieren können, die eine PNS - Umgebung ist, aber nicht darüber hinaus in das Rückenmark 4, 5 (Figur 2A). Für den Fall , dass das injizierte Virus das Transgen eines potentiellen wachstumsförderndes Proteins enthält, kann das Vorhandensein von markiertem Axone im Rückenmark repräsentiert entweder Regeneration oder eine unvollständige dorsal root Quetschverletzung (2B). Zu unterscheiden, sollte zwischen diesen beiden Ergebnissen, CTB axonalen Verfolgung im Nucleus Cuneatus analysiert werden. Das Vorhandensein von CTB-positiven Klemmen im Nucleus Cuneatus hebt die Wahrscheinlichkeit einer unvollständigen Verletzung (Figur 2C), während die Abwesenheit von CTB-positiven Anschlüssen teilweise Regeneration in das Rückenmark schon sagt, als regenerierte Axonewahrscheinlich nicht in der Lage ist , die gesamte Strecke wachsen , um den cuneate Kern (2D) zu erreichen. Bis heute erfolgreich sensorische Axonregeneration zum Nucleus Cuneatus hat meist in Fällen mit hohen zervikaler Verletzung 11, 12 oder mit der Anwendung von Neurotrophinen 13, 14 berichtet. Jegliche Tiere Anzeichen einer unvollständigen Verletzung zeigen sollten aus Axonregeneration Studien ausgeschlossen.
Abbildung 1: DRG Injektion ohne eine Quetschverletzung Dorsal Kennziffern. (AC) Spinal Kordabschnitt GFP-positive Axone im Rückenmark (A) zeigt, einschließlich der dorsalen Säule und dorsal horn (B) und der Zellkörper in der DRG (C) vier Wochen nach der Injektion von AAV5-GFP. <strong> (D) CTB-positive sensorische Axonenden im cuneate Kern eine Woche nach CTB Injektion. Der Maßstab beträgt 650 & mgr; m (AC) und 250 & mgr; m (D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Beurteilung der dorsalen Wurzelschäden und Axonregeneration Crush. (A) eine vollständige dorsal root Quetschverletzung führt zu keinem markierten Axone im Rückenmark oder CTB-positiven Axonterminalen im Nucleus Cuneatus. Axotomisierten sensorischen Axonen kann bis zur dorsalen Wurzeleintrittszone, aber nicht darüber hinaus in das Rückenmark regenerieren. (BD) , um das Vorhandensein von markiertem Axone im Rückenmark repräsentiert entweder unvollständig Verletzung oder regeneratiauf (B). Mit zusätzlicher Analyse die Anwesenheit von CTB-positiven Klemmen im Nucleus Cuneatus schlägt unvollständige Schädigung (C), während ihre Abwesenheit vollständige Schädigung schlägt und möglicherweise teilweise Regeneration in das Rückenmark (D). Der Maßstab beträgt 250 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung eine DRG Injektion und dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark eines erwachsenen Ratte durchzuführen. Da dies eine sehr invasive und empfindliche Operation ist, empfehlen wir dringend, dass alle potentielle Anwender vor vorrückenden ausreichende Ausbildung und Praxis erhalten Tierchirurgie zu leben. Der Anwender sollte nicht nur mit Rückenmark Anatomie, sondern auch mit der umgebenden Muskelgewebe, Wirbelknochenstruktur und Gefäße vertraut sein. Idealerweise sollte ein Benutzer zuständigen Lage sein, das Verfahren mit minimalen Schäden an dem umgebenden Gewebe durchzuführen, wobei eine saubere Laminektomie Durchführung durch, ohne einen Teil der Wirbelsäule zu entfernen, um Schäden am Rückenmark zu induzieren. Wie aus einer Rückenmarksverletzung, kann eine kleine Läsion im Rückenmark eine weit verbreitete schädliche Wirkung auf das gesamte Nervensystem. Darüber hinaus Tiere, die eine „saubere“ Operation unterzogen worden sind weniger wahrscheinlich von unerwarteten post- leidenoperative Komplikationen und Schutzfragen und sind daher weniger wahrscheinlich, dass vor dem gewünschten experimentellen Zeitpunkt geopfert werden zu lassen.
Um Virus in das Nervensystem gibt es einige mögliche Verabreichungswege zu verabreichen: 15 intravenös, intraperitoneal 16, intrathekale 17 oder direkte Injektion in das Ziel - 4, 8. Obwohl die intravenöse und intraperitoneale Injektionen relativ nicht-invasive sind, kann die Überquerung der Blut-Hirn - Schranke sein ein Problem 18, und diese Wege führen in unspezifischer Übertragung, die in einem spezialisierten Axonregeneration Studie nicht sinnvoll wäre. In ähnlicher Weise für die intrathekale Injektion in den Subarachnoidalraum, ein invasiven administrativen Weg, viele neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen im ZNS können transduziert werden, was möglicherweise zu erzeugen unspezifischer oder off-target-Effekte. Somit ist die direkte Injektion von Virus in die DRG eine günstige Option und wahrscheinlich in einer viel höheren Transduktionswirksamkeit als andere Methoden führen. Der größte Nachteil dieser Option ist jedoch die Invasivität des chirurgischen Eingriffs, die spezielle Ausbildung erfordert.
Sobald Benutzer die erforderlichen chirurgischen Fähigkeiten beherrschen, bietet dieses Protokoll eine große Menge an Flexibilität. In einer Axonregeneration Studie Tiere können in Kombination mit anderen Techniken, wie beispielsweise in - vivo - Elektrophysiologie und sensomotorischen Verhaltenstests untersucht werden, während die gesammelten Gewebe können für anatomische Analyse oder Gewebekultur - 4 verwendet werden. Eine Kombination dieser Techniken mit unterschiedlichen experimentellen Zeitpunkt, zum Beispiel, kann verwendet werden , um den Fortschritt der Degeneration oder Regeneration von verschiedener Faser Subtypen zu untersuchen, wie NF200, CGRP und IB4 nach Quetschverletzung 4. Je nach Versuch requirements, die eine oder andere der vorgestellten Verfahren können alleine durchgeführt werden. Zum Beispiel DRG Injektion allein kann für axonalen Tracing Experimente verwendet werden, während dorsale Wurzel Crush allein Verletzung in allen Studien verwendet werden kann, wo forepaw Deafferentation erforderlich ist. Darüber hinaus können Benutzer auch die Art des Virus und Transgenproduktes zur Injektion variieren können, um die genaue DRG injiziert werden, und die genaue Hinterwurzel für Verletzungen. Gegebenenfalls Zelltransplantation oder pharmakologische Verabreichung in die DRG kann auch mit diesem Protokoll durchgeführt werden. Aufbauend auf erworbene chirurgischen Fähigkeiten, kann ein erfahrener Benutzer zu anderen Techniken, wie DRG - Injektion in der Lendengegend gehen - 19 oder dorsale Säule Quetschverletzungen (zB in L3 L5 bis hindlimb Funktion beurteilen), zum weiteren Rückenmark - Funktion 5 zu studieren.
Abschließend glauben wir, die DRG-Injektion und dorsalen Wurzel Quetschverletzungen ein nützliches Modell sein reg zu studieren sensorischen Axoneneration. Trotz der Forderung nach Fachausbildung des invasive chirurgische Verfahren durchzuführen, ist das Protokoll, flexibel und potenzieller Anwender viele Teile ändern kann ihre experimentellen Anforderungen gerecht zu werden. Diese Verfahren können als Grundlage für die auf der Suche nach einem geeigneten Tiermodell dienen für die sensorischen Axonregeneration Studien.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Christopher und Dana Reeve Foundation, dem Medical Research Council, der European Research Council ECMneuro und der Cambridge NHMRC Biomedical Research Center unterstützt. Wir möchten unsere tiefste Dankbarkeit ‚zu Heleen Merel van während der Dreharbeiten t Spijker und Justyna Barratt für ihre technische Unterstützung zum Ausdruck bringen. Wir möchten, dass Dr. Elizabeth Moloney und Professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) zur Unterstützung bei AAV-Produktion danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
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