Introduction
神経系損傷後の軸索再生を達成することは困難な作業である1。中枢神経系（CNS）における軸索再生の失敗を研究するために、研究者は神経損傷モデルの茄多を使用していました。 CNSの領域が異なるので、軸索再生を研究するために解剖学的に適切なモデルを使用することが重要です。適切なモデルを使用することにより、研究者は、「1対すべて」治療戦略とは反対に、傷害の重症度、関心の神経細胞の種類に基づいて特定の治療、および再生を評価するための必要な脊髄路を策定することができます。
脊髄損傷では、例えば、最も衰弱症状は感覚と運動の損失から生じます。運動の損失が下降運動経路への損傷によって引き起こされている間の感覚の喪失は、昇順感覚経路への損傷によって引き起こされます。これらTWの間の細胞および解剖学的な違いによるO経路、多くの標的に軸索再生の研究では、いずれか一方のみの成功回復が患者に多大な利益となることを根拠に、どちらか一方の経路に焦点を当てます。この記事では、ウイルスベクターおよび感覚軸索再生を研究するためのモデルとして、成体ラットの下頸髄における同時後根挫滅損傷との直接の後根神経節（DRG）の注入を使用するプロトコルを提示します。
DRG感覚ニューロンは、周囲からCNSには、そのような触覚感覚や痛みなどの感覚情報を中継する責任があります。脊髄における感覚ニューロンの長い軸索投射は、長距離の軸索再生を研究するための良いモデルとなります。また、げっ歯類は、最小限の福祉合併症と後根挫滅損傷としての感覚経路の病変を生き残ることができるよう、研究者は完全に脊髄を病変部を必要とせずにCNSの軸索再生を学ぶことができます。四C5 - C8（頸部LEVEL 5から8）後根圧潰損傷は、前足の求心路遮断2のために有用なモデルであることが示されています。また、後根挫滅損傷は、それが、このようなグリア瘢痕形成など他の要因によって複雑ではないので、直接脊髄損傷よりも、軸索再生を研究する「クリーナー」モデルを提供します。
回生状態に神経細胞を再プログラムするウイルス遺伝子治療の使用は、ますます多くの神経学的状態3のための有望な治療戦略と考えられてきました。研究は、行動回復4、5、6とロバスト軸索再生を達成することができる成長促進タンパク質の導入遺伝子を担持するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの適用を示しています。免疫応答およびニューロンなどの非分裂細胞を形質導入する能力を誘発におけるAAVの見かけの低病原性は、作成しますその遺伝子治療のための最適のベクター。また、組換えAAV形態は、治療のために使用されます。この形態では、それは、宿主ゲノム7にそのウイルスゲノムを統合するようなレンチウイルスのような他のウイルスベクターに比べて挿入突然変異誘発のリスクを低減することができません。これは、AAV遺伝子治療用途のための安全な選択肢となります。
DRGは、感覚ニューロンの細胞体が含まれているとして、勉強および/または感覚軸索再生を促進するための遺伝子治療用ウイルスの投与のための最も適切な解剖学的な目標です。異なるAAV血清型およびレンチウイルスを比較した研究では、AAV血清型5（AAV5）がDRG 8に直接注射したとき、少なくとも12週間の時間経過にわたってDRGニューロンを形質導入において最も効率的であることが示されました。さらに、AAVは、大径ニューロフィラメント200 kDaのような全てのDRGニューロンのサブタイプを、形質導入、40％以上の形質導入効率を達成することができます（NF200）陽性ニューロンと小径カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP） -またはイソレクチンB4（IB4）陽性ニューロン4,8。
DRG注射および後根挫滅損傷の手術手順としては非常に侵襲的で繊細で、我々はこの記事では、新しいユーザーは非常に効率的な方法で手順を学ぶために役立つと信じています。 C8後根挫滅損傷 - 同時C5とC7のDRGに - 本稿では、成人の4週間C6に対照ウイルスAAV5-GFP（緑色蛍光タンパク質）の注射後のラットからの代表的な結果を示しました。このモデルは、感覚軸索再生を促進するためのウイルス遺伝子療法の使用を調査している研究者のために特に適しています。
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Protocol
以下のすべての動物の手順はイギリスの動物に従って行った（科学的処置）法1986これらの手続きに慣れていない場合は、全国/地域の規制にチェックして、プロトコルを開始する前に、獣医の助言を求めてください。
1.動物の適切ひずみを選びます
注：感覚と足求心路遮断の損失の後根挫滅損傷の結果。前足の求心路遮断の一般的な副作用は、オーバーグルーミング、自傷、および足の自切を含めることができます。
- 手続きのために動物を取得します。
注：ラットの場合、そのようなリスター・フードおよびWistar系などのより活性な株は、このようなルイスとのSprague-Dawley系のような、より従順株と比較して、求心路遮断後の足自切の発生率が高いです。可能であれば、最も従順な歪み、ルイスは、常に最初に考慮しなければなりません。特に活性株は、遺伝mまでの実験のために必要でなければなりませんodificationまたは特定の行動評価の要件は、獣医学的治療が期待される悪影響に対処するための場所である必要があります。
2.注射用ウイルスの準備
注意：生物学的および実験室安全規定に従ってすべてのウイルスを処理します。
- 個々のウイルスパッケージングプロトコル9以下、2×10 12ゲノムコピー（GC）/ mLの力価にウイルスを希釈または濃縮します。
注記：ここでは、ウイルスは、5％のスクロースをダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で希釈しました。力価は、ウイルスの種類に応じて最適化する必要がある、プロモーター、サイズを構築、および細胞型を標的にします。 - オプション：後で注入を簡単に可視化のためのウイルス液に1％着色染料（ 例えば、ファストグリーン）を追加します。非常に優しくソリューションを混ぜます。
- （4時間以内）すぐに使用氷上で溶液を維持または長期のために-80℃の冷凍庫で長期保存。
3.動物の術前の準備を行います
注：手術の極端な侵襲性のため、無菌技術を常に使用する必要があります。
- 手術を開始する前に、すべての手術器具および脊髄定位フレームを準備し、滅菌します。例えば、134℃のオートクレーブ中でツールを殺菌します。各動物のための滅菌のツールの新鮮なセットを使用してください。
- 動物を麻酔。引っ込め反射またはまぶたの反射のために角膜に触れることによって、テストするために足をつまんで、適切な麻酔を確認してください。
- 例えば、イソフルランなどの吸入麻酔を用いて、成体ラットについて、2.0 Lの4％イソフルランを使用/誘導のための酸素の分。過剰または過少投与を避けるために、動物の呼吸パターンに従ってイソフルラン濃度を変える、1.5 L /酸素の分3％イソフルラン - 手術全体メンテナンスのため、2を使用します。
- に動物が最初に麻酔し、CE、動物の術前体重を記録します。
- 子宮頸部DRG注入のため、肩甲骨のすぐ遠位の耳の間から首に毛を剃り落とします。防腐剤製品と剃らエリアを消毒します。
- 適切な鎮痛剤の投与量（ 例えば、5ミリグラム/ kgのカルプロフェン）および抗生物質（ 例えば、5ミリグラム/ kgのエンロフロキサシン）とともに、動物の脇腹に生理食塩水を皮下の2ミリリットルを注入します。
- 手続きの際に角膜の乾燥を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。
- 動物の下に配置された37℃での加熱パッド付き脊椎定位フレーム上の手術に進みます。
4. DRGを注入し、後根のクラッシュ傷害の実行
注：これは非常に繊細な手術です。動物の手術を生きることを進める前に、解剖学で理解するために、最初の数死んだ動物で練習することをお勧めします。
- L肌の上に著名なC2およびT2棘突起をocate。皮膚が開かれると、白色の繊維状組織の中線は、筋肉の最初の層の上に表示されなければならない（10番のメスの刃でC2およびT2棘突起の間に皮膚切開を行い、筋肉の最初の層は、「有しますゼリー状」テクスチャ）。
- 手術用メスの刃を用いた白色正中線に沿って筋肉の1層目と同様のサイズの切開を行います。そこの近くにある下行大動脈からの主要幹線の分岐があるとして、著名なT2棘突起を越えないでください。
注：重い出血以降、このステップからどこでも発生する可能性があります。必ず出血を停止し、すべての回で明確な可視化を可能にするために滅菌綿棒または外科吸収性スポンジを使用して血液を除去。手続きを進める「盲目的」後に動物に予期せぬ悪影響につながる、脊髄、DRG、または後根への不要な損傷をもたらすことができます。 - 撤回2つの開創器、吻側に配置され1つずつ尾を使用して、筋肉の最初の層と筋の第2の層が、横紋外観と、表示されなければなりません。
- （二縦筋が薄く、膜状組織によって接続観察することができる）筋の第2の層の正中線を見つけます。二つの長手方向の筋肉を分離するmicroscissorsのペアを使用して膜状組織を切開。これは、不必要な筋肉の損傷や出血をもたらすことができるよう、可能な場合は手術用メスの刃を使用しないでください。
- 脊椎を覆う薄い筋の第三の層を露出するために応じてリトラクターを調整します。棘突起を軽く筋の第三の層の上にピンセットで触れることによって感じることができます。
- microscissorsを使用して、筋肉の三層の上に小さな切開を行い、ゆっくりとはっきりと椎骨を露出するように横向き的にキューレットまたはメスを用いて骨から筋肉を削り取ります。必要な場合は、ラミを作るために離れて筋肉や腱の一部をカットnectomy容易になります。
- 注意深く細かい骨鉗子のペアを使用して薄層と茎の一部を除去することにより、T1の椎骨 - 左C5を露出させる - C8のDRGを、C4の左半椎弓切除術を行います。 DRGは、椎骨の横孔の近くに位置しています。
注：C3 - C7椎骨が目立つ棘突起を持っていません。 C8 DRGはC7とT1椎骨の間であるC5 DRGは、C6 DRGのようにC5とC6の椎骨の間にある、そして、C4及びC5椎骨の間に配置されています。何C8の椎骨はC8 DRGの存在とC8脊髄セグメントにもかかわらず、ありません。 - DRGの十分な一回注入のために露出されている、定位シリンジホルダーにカスタムメイド、33ゲージ鈍針を取り付けたウイルスを充填したマイクロシリンジを配置することによって注射器を準備します。注射の前に、注射針の挿入を支援することを目的とDRGの各上の小さな表面的な開口部を作るために30ゲージベベル針を使用しています。
- 33-Gを挿入定位座標を調整するために穏やかにノブを回すことにより、DRGの中心部へのAuGe針。これは、流体がDRGの腹側から漏れるする原因となり、針を介して、挿入しないでください。 、発生漏洩すぐに針の位置を調整する必要があります。
注：数値の定位座標が使用されていません。しかし、注射用の針を保持するためのフレームを利用すると便利です。 - 注入シリンジポンプを用いて0.2μL/分で各DRGへのウイルスの1μLを注入します。針を引き抜く前に、追加の3分間待ってください。ウイルス溶液が着色染料が含まれている場合は、注射時には、DRGはゆっくりと色が変わります。
- 同時C5実行する - C8の後根圧潰損傷を、10秒間3回各完全鉗子の両端、先の細いピンセット（ボンマイクロ）のペアを使用して、各ルートをつぶします。組織内の白い線がクラッシュサイトで表示されます。 FORCで必要とされるよりも深く行ってはいけませんこのようEPSは、前根への損傷を引き起こす可能性があります。
- 注入および/またはクラッシュの後、出血や動物を閉じる前に切開部位に残さ骨片の小片がないことを確認してください。好適な場合には、暴露脊髄およびDRGの上に手術用吸収性スポンジの小片を配置します。
- 筋肉の第3層は縫合せずに脊椎に自然に戻って撤回することを許可します。緩く吸収6-0縫合材料と（≈3は、縫合糸を中断）は、第2の層の2つの長手方向の筋肉を縫合。筋肉の最初の層を縫合吸収6-0縫合材料と（≈5は、縫合糸を中断）。
- 吸収5-0縫合材料（≈10縫合糸を中断）で皮膚を縫合。
注：縫合糸はあまりにもタイトではないことを確認してください。皮膚の膨らみは、過剰引き締めの兆候であると動物に不快感を引き起こす可能性があります。 - 重い出血が手術中に発生した場合、皮下注射1 - 2地域の規制の下で許可された動物からの流体の損失を補充するための生理食塩水のミリリットル。
- 食用水和ゲルを提供し、動物が麻酔から完全に回復することができ、バック保持領域に動物を戻す前に少なくとも1時間、定期的なモニタリングを行います。
- 感覚軸索再生を評価するために、最適な導入遺伝子発現のために、少なくとも3週間は動物を保管してください。
動物の術後ケアを行う5.
- 最初の一週間後に手術中の動物用食品のマッシュと柔らかい綿の寝具を提供します。必要であれば、全国/地域の規制や獣医の助言に従い、回復を支援するために鎮痛剤や抗生物質の追加的な用量を投与。
- 10日 - 7後に皮膚に縫合糸を外します。
注：手術の一般的な副作用は、切開部位に起因するかゆみのために皮膚に傷マークを血清腫や血腫の形成、内部吸収性縫合糸、微妙な感覚や運動不足、および後根挫滅損傷後の求心路遮断足に自傷の兆候。 、実質的に予想以上に深刻である任意の福祉の問題については、すぐに獣医の助言を求めます。
6.軸索トレース用順行CTBの噴射を行います
注：前の組織コレクションに週を追跡コレラ毒素Bサブユニット（CTB）軸索を実行することをお勧めします。
- メーカーの指示に従って1％CTB溶液を調製します。
- オプション：後で注入を簡単に可視化するためのソリューションに1％着色染料を追加します。非常に優しくソリューションを混ぜます。
- 動物を麻酔（ステップ3.2.1を参照）、テーブルに手足をテーピングすることにより、左前足を安定化させます。
- 手動でゆっくりと皮下無毛フットパッドの中心に1％CTBの1μLを注入し、4桁の数字は、マイクロリットルシリンジ嵌合のWiを用いてカスタムメイド、33ゲージの短い針番目。
注：注射の前に、まず注射針の挿入を支援し、皮膚に小さな表面的な開口部を作るために30ゲージベベル針を使用することができます。 - 動物が保持領域に動物を返す前に麻酔から完全に回復することを許可します。
7.組織の収集
- 免疫組織化学のためにウイルス注入DRGおよび脊髄を収集するために、麻酔薬の過剰投与を投与し、経冷4％パラホルムアルデヒドに続くリン酸緩衝生理食塩水で動物を灌流。慎重に、顕微鏡下で固定された組織を収集するために、背にフル椎弓切除術を行います。分析4、5、6の必要に応じて組織調製、切片、および処理を進めます。
注：Sの存在によって観察として回収切開部位は、明らかであるべきです車の組織。 - あるいは、in vitro培養のためにウイルス注入DRGを収集するために、そのような二酸化炭素の上昇する濃度として承認された方法を用いて人道的に動物を犠牲に。慎重に可能な限り無菌状態を確保すること、顕微鏡下でDRGを解剖。 4、5、6、10を所望のように組織培養を進めます。
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Representative Results
表現として、添付のDRGと横脊髄部C7に直接、DRGニューロンを形質導入し、四週間対照ウイルス、AAV5-GFPを注入した後に、脊髄における感覚軸索をトレースにこのプロトコルの有効性を示すために提示されています後根圧潰損傷（ 図1A）ことなくDRG。脊柱及び脊髄後角の両方における軸索はGFP（ 図1B）、ならびに注入DRG（ 図1C）内の細胞体と軸索を発現します。楔核の追加の解剖学的分析は、脳幹における感覚軸索端末は、正の順行CTBが（ 図1D）をトレース明らかにする。
DRG注射は、脊髄またはCTB-正端子にはGFP陽性の軸索は、完全なC5-C8後根挫滅損傷と同時に行われていない場合楔核におけるSは（ 図2A）が観察されます。しかし、軸索切断感覚軸索がまだなく超えて脊髄4,5（ 図2A）に、PNS環境で完全に粉砕後根における後根進入ゾーンまで再生することができることを指摘する価値があります。注入されたウイルスは、潜在的な成長促進タンパク質の導入遺伝子を含んでいる場合には、脊髄における標識された軸索の存在は、再生または不完全な脊髄後根圧潰損傷（ 図2B）のいずれかを表すことができます。これら2つの結果を区別するために、楔核内CTB軸索トレースが分析されるべきです。 CTB陽性端末の不在が再生軸索のように、脊髄内に部分再生を示唆しつつ楔核におけるCTB陽性端末の存在は、不完全損傷（ 図2C）の可能性を強調します楔核（ 図2D）に到達する全距離を成長しやすいことができません。現在までに、楔の核に成功した感覚軸索再生は、主に高頸椎損傷の11、12またはニューロトロフィン13、14のアプリケーションを例に報告されています。不完全損傷の兆候を示す任意の動物は、軸索再生の研究から除外すべきです。
図1： 後根の圧挫なしDRG注入。 （AC）は 、4週間AAV5-GFPの注射後DRG（C）における脊柱及び背角（B）と細胞体を含む脊髄におけるGFP陽性の軸索（A）に示す脊髄セクション。 <楔核における強い>（D）CTB陽性感覚軸索端子CTB注射後一週間。スケールバーは650ミクロン（AC）と250μmの（D）です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 後根は傷害と軸索再生をつぶす評価。 （A）、脊髄または楔核におけるCTB陽性の軸索末端で標識された軸索における完全な後根挫滅損傷の結果。軸索切断感覚軸索ではなく、超えた脊髄に、後根のエントリーゾーンまで再生することができます。 （BD）、脊髄における標識された軸索の存在は、不完全損傷またはregeneratiのいずれかを表します。上の（B）。その不在は、脊髄（D）への完全な損傷および潜在的に部分再生を示唆しながら、追加の分析と、楔核内CTB陽性端末の存在は、不完全損傷（C）を示唆しています。スケールバーは250μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、我々は、成体ラットの下頸髄におけるDRG注射および後根挫滅損傷を実行するためのステップバイステップのガイドを提示します。これは非常に侵襲的で繊細な手術であるように、私たちは強く、すべての潜在的なユーザーは、動物の手術を生きるために進む前に、十分な訓練と実践を取得することをお勧めします。ユーザーは、脊髄の解剖学ではなく、周囲の筋肉組織、椎骨の構造、および血管系を持つだけでなく、理解しておく必要があります。理想的には、有能なユーザは、脊髄に損傷を引き起こすことなく、椎骨の一部を除去して清浄な椎弓切除術を行う、周囲組織に対して最小限の損傷に手順を実行することができなければなりません。脊髄損傷から明らかなように、脊髄の小さな病変は全体の神経系への広範な有害な影響を与える可能性があります。また、「クリーン」な手術を受けた動物は予想外の後に苦しむ可能性が低いです手術合併症や福祉の問題とは望ま実験の時点の前に犠牲にする必要があります可能性が低いです。
15静脈内、腹腔内16、髄腔内17、または直接注入ターゲット4,8へ：神経系にウイルスを投与する、投与のいくつかの可能な経路が存在します。静脈内および腹腔内注射は、比較的非侵襲性であるが、血液脳関門の横断を発行18であってもよく、これらの経路は、特殊な軸索再生の研究に有用ではない非特異的な形質導入をもたらします。同様に、くも膜下腔、より侵襲的な投与経路に髄腔内注射のために、CNS内の多くの神経および非神経細胞タイプは、潜在的に、非特異的またはオフタージェ生成、形質導入され得ますトン効果。このように、DRGへのウイルスの直接注入は、良好なオプションや他の方法よりもはるかに高い形質導入効率につながる可能性があります。このオプションの主な欠点は、しかし、特別な訓練を必要とし、外科的処置の侵襲性です。
ユーザーが必要な外科的なスキルを習得したら、このプロトコルは、柔軟性の偉大な量を提供しています。採取した組織は、解剖学的分析または組織培養4のために使用することができるが軸索再生の研究では、動物は、 インビボ電気生理学及び感覚運動行動試験のような他の技術と組み合わせて検討することができます。これらの技術の組み合わせは、多様な実験的な時点で、例えば、圧潰損傷後4例えばNF200、CGRP、およびIB4などの異なる繊維サブタイプの変性又は再生の進行を研究するために使用することができます。実験requiremeに応じて、NTS、提示の手順のいずれかまたは他の単独で行うことができます。単独の後根挫滅損傷は前足の求心路遮断が必要とされるあらゆる研究に使用することができますしながら、例えば、単独のDRG注射は、軸索の追跡実験のために使用することができます。また、ユーザは、注射のためのウイルスおよびトランスジーン産物の種類、注入すべき正確なDRG、および損傷の正確な後根をも変化させることができます。該当する場合、DRGへの細胞の移植または薬理学的投与もこのプロトコルを用いて行うことができます。さらに脊髄機能5を研究するために、19または後柱圧壊損傷- （後肢の機能を評価するためにL5 L3に例えば、）取得した外科技術を踏まえ、経験豊富なユーザは、腰部領域におけるDRG注入のような他の技術に進むことができます。
結論として、我々は、DRG注射および後根挫滅損傷は、感覚軸索REGを研究するための有用なモデルであると信じますeneration。侵襲的な外科手順を実行するには、専門的なトレーニングの必要性にもかかわらず、プロトコルは柔軟性があり、かつ潜在的なユーザーが自分の実験的な要件に対応するために多くの部分を変更することができます。これらの手順は、感覚軸索再生研究のための適切な動物モデルのお探しの方のための基盤としての役割を果たすことができます。
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Acknowledgments
この作品は、クリストファーとデイナ・リーブ財団、医学研究評議会、欧州研究評議会ECMneuro、ケンブリッジNHMRC生物医学研究センターからの助成金によってサポートされていました。私たちは、撮影時の彼らの技術支援のためのヘリーン・メレルバン「トンSpijkerとユスティナバラットに心から感謝の意を表したいと思います。私たちは、AAVの生産を支援するために博士エリザベス・モロニー教授ジョースト・バーハーゲン（神経科学のためのオランダ研究所）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
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