Introduction
Достижение регенерации аксонов после травмы нервной системы является сложной задачей 1. Изучить отказ регенерации аксонов в центральной нервной системе (ЦНС), исследователи использовали множество моделей травмы нерва. В области центральной нервной системы отличаются, важно использовать анатомически подходящую модель для изучения регенерации аксонов. Используя соответствующую модель, исследователи могут сформулировать конкретное лечение, основанное на степени тяжести травмы, нейронного типа клеток, представляющих интерес, и желаемый спинномозговой тракт для оценки регенерации, в отличие от стратегии лечения «один-для-всех».
В травмы спинного мозга, например, наиболее изнурительных симптомы обусловлены потерей ощущения и передвижения. Потеря чувствительности вызвана повреждением восходящих чувствительных путей, в то время как потеря локомоции вызвана повреждением нисходящих двигательных путей. Благодаря сотовой связи и анатомических различий между этими ТВтО пути, многие целевые исследования регенерации аксонов сосредоточиться только на одном или другом пути, с обоснованием, что успешное восстановление либо имело бы огромную пользу пациентам. В этой статье мы приводим протокол, который использует прямую спинную ганглии (DRG) инъекцию с вирусным вектором с одновременным спинномозговым размозжение в нижнем шейном отделе спинного мозга взрослой крысы в качестве модели для изучения сенсорной регенерации аксонов.
DRG сенсорные нейроны отвечают за передачу сенсорной информации, например, тактильного ощущения и боли, от периферии к ЦНС. Длинная аксональная проекция сенсорных нейронов в спинном мозге служит хорошей моделью для изучения на дальних расстояния аксонов регенерации. Кроме того, как грызуны могут выжить сенсорное поражение тропинки, такие как размозжение спинномозговых с минимальными осложнениями благосостояния, исследователи могут изучать ЦНС аксоны регенерации без необходимости полностью поражения спинного мозга. Четверку С5 - С8 (шейный лEvel 5 - 8) дорсальных корешков размозжение было показано, что полезная модель для передней лапы деафферентации 2. Кроме того, спинные травмы корня раздавить обеспечивает модель «чистую» для изучения регенерации аксонов, чем прямое повреждение спинного мозга, так как он неосложненный другими факторами, таких как образование глиальных рубцов.
Использование вирусной генной терапии перепрограммировать нейроны в генераторном режиме все чаще рассматривается в качестве перспективного стратегии лечения для многих неврологических заболеваний 3. Исследования показали , применение в адено-ассоциированный вирус (AAV) вектора , несущего трансген белка стимулирующие рост может достичь надежной регенерации аксонов с поведенческой восстановления 4, 5, 6. Очевидно низкое патогенность AAV в индукции иммунного ответа и способность передавать не-делящиеся клетки, такие как нейроны, сделатьэто оптимальный вектор для генной терапии. Кроме того, рекомбинантная форма ААВ используется для терапии. В таком виде он не способен интегрировать его вирусный геном в геном хозяина 7, снижая риск инсерционного мутагенеза по сравнению с другими вирусными векторами, такие как лентивирусы. Это делает AAV безопасным выбором для генной терапии.
Как DRG содержит клеточные тела чувствительных нейронов, является наиболее подходящей мишенью для анатомического введения вируса для генной терапии для изучения и / или способствовать сенсорную регенерации аксонов. В сравнительном исследовании различных серотипов AAV и лентивирус, AAV серотипа 5 (AAV5) было показано, что наиболее эффективным в трансдукции DRG нейроны в течение времени течение по крайней мере 12 недель при введении непосредственно в DRG 8. Кроме того, ААВ может достичь более 40% эффективности трансдукции, трансдукции всех нейрональных подтипов DRG, таких как нейрофиламенты большого диаметра 200 кД(NF200) -положительные нейроны и кальцитонин малого диаметра , связанный с геном пептид (CGRP) - или isolectin b4 (IB4) -положительные нейроны 4, 8.
В хирургической процедуры DRG инъекции и спинномозговых размозжение чрезвычайно агрессивен и деликатная, мы считаем, что эта статья поможет новым пользователям узнать процедуру в очень эффективной манере. В этой статье мы покажем, репрезентативные результаты от взрослых крыс через четыре недели после инъекции вируса управления AAV5-GFP (зеленый флуоресцентный белок) в C6 - C7 КСГ с одновременным C5 - C8 дорсальных корешков размозжение. Эта модель особенно подходит для исследователей, изучающих использование вирусной генной терапии для содействия сенсорной регенерации аксонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все последующие процедуры на животных были проведены в соответствии с Соединенным Королевством животных (научные процедуры) Закон 1986. Если не знакомы с этими процедурами, пожалуйста, проконсультируйтесь с местными / национальными правилами и обратиться к ветеринару консультацию перед началом протокола.
1. Выбор подходящего Штамм животных
Примечание: спинная корневые результаты размозжение к потере ощущения и лапе деафферентации. Общие побочные эффекты могут деафферентации передней лапы включают более-груминг, членовредительство, и лапу аутотомию.
- Получить животное для данной процедуры.
Примечание: Для крыс, тем более активные штаммы, такие как Lister-капюшон и Wistar, имеет более высокую частоту лапы аутотомии после деафферентации по сравнению с более послушными штаммами, такие как Льюис и Sprague-Dawley. Если это возможно, самый послушный штамм, Льюис, всегда следует рассматривать в первую очередь. В случае особо активный штамм необходим для эксперимента из-за генетический мodification или специфические требования поведенческих оценок, ветеринарное лечение должно быть на месте для решения ожидаемых негативных последствий.
2. Подготовка вирусов для инъекций
ВНИМАНИЕ: Обращайтесь со всеми вирусами, в соответствии с биологическими и лабораторными правилами техники безопасности.
- Развести или концентрат вируса до титра 2 × 10 12 копии генома (GC) / мл по индивидуальной упаковке вирусных протоколам 9.
Примечание: Здесь, вирус разводили в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (D-PBS) с 5% сахарозы. Титр может должны быть оптимизированы в зависимости от типа вируса, промоутер, построить размер, и целевой тип клеток. - Необязательно: Добавьте 1% цветной краситель (например, Fast Green) к вирусу решения для легкой визуализации инъекции позже. Приготовьте раствор очень осторожно.
- Хранить раствор на льду для немедленного использования (в течение 4 ч) или в -80 ° C морозильнике в течение долгосрочныхсрок хранения.
3. Выполнение предоперационной подготовки животного
Примечание: Из-за крайней инвазивности операции, асептические методы должны быть использованы в любое время.
- Подготовка и стерилизовать все хирургические инструменты и спинную стереотаксическую раму Перед началом операции. Так, например, стерилизации инструментов в автоклаве при 134 ° C. Используйте свежий комплект стерилизованных инструментов для каждого животного.
- Обезболить животное. Подтвердите надлежащее обезболивание, зажимая лапу, чтобы проверить для снятия рефлекса или прикосновения к роговице для века рефлекса.
- Для взрослых крыс с использованием ингаляционной анестезии, таких как изофлуран, использовать 4% изофлуран в 2,0 л / мин кислорода для индукции. Для поддержания всей операции, используют 2 - 3% изофлуран в 1,5 л / мин кислорода, изменяя концентрацию изофлурана в соответствии с образцом дыхания животного, чтобы избежать избыточного или недостаточного дозирования.
- Насе животное сначала под наркозом, запись предоперационного веса животного.
- Для шейки матки инъекции DRG, сбрить шерсть на шее от между ушами только дистальнее лопатками. Лечить бритую область с антисептическим продуктом.
- Вводят 2 мл физиологического раствора подкожно на бок животного, наряду с соответствующей дозы анальгетика (например, 5 мг / кг карпрофена) и антибиотика (например, 5 мг / кг Энрофлоксацин).
- Нанести глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры.
- Перейду к операции на спинной стереотаксической раму с грелкой при 37 ° C помещен под животным.
4. Инъекционное DRG и Выполнение размозжение дорсальных корешков
Примечание: Это очень деликатная операция. Желательно, чтобы практиковать на несколько мертвых животных первым ознакомиться с анатомией, прежде чем перейти жить хирургии животных.
- Locate видные С2 и Т2 остистые отростки по коже. Делают разрез кожи между С2 и Т2 отростков с No.10 скальпелем (как только кожа будет открыта, по средней линии белый, фиброзно-ткань должна быть видна на первом слое мышц, первый слой мышц имеет " желеобразный»текстуры).
- Сделать подобный размера надрез на первом слое мышц вдоль белой срединной линии, используя лезвие скальпеля. Не выходить за пределы известных остистых Т2, так как существует большая артериальная ветвь от нисходящей аорты, расположенной поблизости.
Примечание: Сильное кровотечение может произойти в любом месте от этого шага вперед. Всегда остановить кровотечение и удалить кровь с помощью стерилизованных ватных палочек или хирургических рассасывающихся губок, чтобы позволить четкую визуализацию во все времена. Исходя с процедурой «вслепую», может привести к нежелательному повреждению спинного мозга, DRG или спинной корня, что приводит к неожиданным неблагоприятным последствиям в животном позже. - Отводпервый слой мышц с использованием двух ретракторов, один помещенными рострален и один каудально; второй слой мышц, с полосатым внешним видом, должен быть виден.
- Расположить средней линии второго слоя мышц (где можно наблюдать две продольные мышцы соединены тонкой, перепончатой ткани). Рассеките мембранную ткань с помощью пары microscissors, чтобы отделить два продольных мышц. Избегайте использование лезвия скальпеля, если это возможно, так как это может привести к излишнему повреждению мышц и кровотечению.
- Отрегулируйте ретракторы соответствующим образом, чтобы выставить третий слой тонкой мышцы, покрывающей позвоночник. Отростков может ощущаться легким касанием с парой щипцов над третьим слоем мышц.
- Сделать небольшой надрез на третий слой мышц с помощью microscissors и осторожно соскабливают мышцы от кости с помощью кюретки или скальпель в боковом образом, чтобы четко выставить позвонки. При необходимости вырезать некоторые мышцы или сухожилия прочь, чтобы сделать Ламиnectomy легче.
- Для того, чтобы выставить левую C5 - C8 ДРГ, выполнить левую гую-ламинэктомию на С4 - позвонках T1 пути тщательного удаления части листовых пластинок и ножка с помощью пару тонких кусачек. DRG расположен вблизи поперечного отверстия позвонков.
Примечание: С3 - С7 позвонка не видную остистый отросток. С5 КСГ расположен между С4 и С5 позвонками, С6 КСГ находится между С5 и С6 позвонками, и так далее, в то время как С8 КСГ находится между C7 и T1 позвонками. Там нет C8 позвонка, несмотря на наличие С8 DRG и сегмент спинного мозга С8. - После того, как достаточное количество DRG было выставлены для инъекций, подготовить шприц, поместив вирус заполненного микролитрового шприца, снабженный на заказ, 33-го калибра тупой иглы на стереотаксическом держатель шприца. Перед инъекцией, использует 30-калибровочную иглу скошенной сделать небольшое поверхностное отверстие на каждом из целевых DRG, чтобы помочь с введением инъекционной иглы.
- Вставьте 33-гAuge иглу в центр DRG, вращая ручку аккуратно, чтобы настроить стереотаксическую координату. Не более вставьте иглу, так как это может вызвать утечку жидкости из брюшной стороны DRG. В случае утечки происходит, отрегулируйте положение иглы сразу.
Примечание: Числовые стереотаксической координаты не используются; Однако, полезно использовать рамку для фиксации иглы для инъекций. - Вводит 1 мкл вируса в каждый DRG в 0,2 мкл / мин с использованием инфузионных шприцевого насоса. Подождите в течение дополнительных трех минут до снятия иглы. Во время инъекции DRG будет медленно менять цвет, если раствор вируса содержит цветной краситель.
- Чтобы выполнить параллельную C5 - C8 травмы дорсального корня раздавливание, раздавить каждый корень три раза по 10 с каждый с использованием пара остроконечного пинцета (Bonn Micro), противоположные концы щипцов полностью; белая линия в ткани должна появиться на месте давки. Не идти глубже, чем требуется с ForcEPS, так как это может привести к повреждению вентральному корню.
- После инъекции и / или раздавливания, убедитесь, что нет кровотечения или небольших кусочков отломков, оставшихся на месте разреза перед закрытием до животного. При желании разместить небольшой кусочек хирургических рассасывающихся губок поверх обнаженного спинного мозга и DRG.
- Разрешить третий слой мышц втягиваться обратно, естественно, на позвоночник без прошивания. Неплотно сшивать две продольные мышцы на втором слое (≈ 3 узловыми швами) с рассасывающиеся 6-0 шовного материала. Шовный первый слой мышц (≈ 5 узловыми швами) с рассасывающиеся 6-0 шовного материала.
- Шовный кожу рассасывающиеся 5-0 шовного материала (≈ 10 узловыми швами).
Примечание: Убедитесь, что швы не слишком плотно. Выпячивание кожи является признаком чрезмерного затягивания и может вызвать дискомфорт животного. - Если сильное кровотечение произошло во время операции, подкожно вводят 1 - 2мл физиологического раствора, чтобы пополнить потери жидкости от животного, разрешенные в соответствии с местными правилами.
- Обеспечить съедобный гель увлажняющий и позволить животному, чтобы полностью восстановиться после анестезии, выполняя регулярный мониторинг в течение по крайней мере 1 ч перед возвращением животного обратно в зону ожидания.
- Держите животное в течение по крайней мере 3-х недель для оптимальной экспрессии трансгена для оценки сенсорной регенерации аксонов.
5. Выполнение Послеоперационный уход за животных
- Обеспечить затора продуктов питания и мягкий хлопковое постельное белье для животного в течение первой недели после операции. При необходимости введения дополнительных доз анальгетика и антибиотика, чтобы помочь с восстановлением в соответствии с местными / национальными правилами и ветеринарные консультации.
- Удалить швы на коже после 7 - 10 дней.
Примечание: Общие неблагоприятные эффекты операции включают образование серома или гематомы в месте разреза, царапины на коже из-за зуда, вызванноговнутренние рассасывающиеся швы, тонкая сенсорная или локомоция дефициты, и признаки членовредительства на деафферентированной лапу после травмы раздавливания спинномозговых. Для любых вопросов социального обеспечения, которые являются значительно более серьезными, чем ожидалось, немедленно обратитесь к ветеринарному советы.
6. Выполнение инъекции Антероградного CTB для аксональной Tracing
Примечание: Рекомендуется выполнять холерного токсина субъединица (CTB) аксонов трассировку за неделю до сбора ткани.
- Готовят 1% раствор CTB в соответствии с инструкцией изготовителя.
- Необязательно: Добавьте 1% цветной краситель в раствор для легкой визуализации инъекции позже. Приготовьте раствор очень осторожно.
- Обезболить животное (смотрите стадию 3.2.1) и стабилизировать левую переднюю лапу ленты конечности к столу.
- Вручную и медленно вводит 1 мклы 1% CTB подкожно в центр голой подушечки и четыре цифры с помощью шприца, снабженного микролитра Wiго заказных, 33-калибровочный иглу короткий.
Примечание: Перед инъекцией, это помогает сначала использовать 30-калибровочную иглу скошенного сделать небольшое поверхностное отверстие на коже, который помогает при введении инъекционной иглы. - Дайте животным, чтобы полностью восстановиться после анестезии перед возвращением животного в зоне ожидания.
7. Сбор тканей
- Для сбора вируса впрыском DRG и спинной мозг для иммуногистохимии, управлять передозировки анестетика и транскардиальную заливать животное с фосфатно-буферном растворе с последующим холодным 4% параформальдегидом. Тщательно выполнить полную ламинэктомии на позвоночник, чтобы собрать неподвижную ткани под микроскопом. Продолжайте препарата ткани, секционирования, и обработки в соответствии с требованиями для анализа 4, 5, 6.
Примечание: Восстановленный участок разреза должно быть очевидно, как это наблюдалось в присутствии савтомобиль ткань. - В качестве альтернативы, для сбора вируса-впрыскивают DRG для культуры в пробирке, принести в жертву животное гуманно с утвержденным способом, таким как восходящая концентрации углекислого газа. Осторожно рассекают DRG под микроскопом, обеспечивая асептические условия, когда это возможно. Продолжить с культурой ткани в качестве желаемого 4, 5, 6, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В представлении, поперечный спинной секции корд с присоединенным DRG представлена показать эффективность этого протокола в трансдукции DRG нейронов и прослеживание сенсорных аксонов в спинном мозге через четыре недели после инъекции вируса управления, AAV5-GFP, непосредственно в С7 DRG без повреждения дорсального корня давки (рис 1А). Аксоны в обоих колонке спинного и дорсального рога спинного мозга выражают GFP (рис 1B), а также клеточные тела и аксоны в пределах введенного DRG (рис 1C). Дополнительное анатомическое анализ клиновидным ядра, сенсорный аксон терминал в стволе головного мозга, показывает положительные антероградная CTB трассировки (рис 1D).
Когда инъекция КСГА выполняется одновременно с полным С5-С8 травмой дорсального корня раздавливания, нет GFP-положительных аксонов в спинном мозге или CTB-положительной клеммеs в ядре клиновидного наблюдается (фиг.2А). Тем не менее, следует отметить, что аксотомизированных сенсорные аксоны все еще может регенерировать до входной зоне задних корешков в полностью раздавлен спинной корень, который представляет собой среду ПНС, но не выходит за рамки в спинной мозг 4, 5 (рис 2A). В том случае, когда вводил вирус содержит трансген потенциального роста способствующего белка, присутствие меченых аксонов в спинном мозге может представлять собой либо регенерацию или неполное повреждение дорсального корня на раздавливании (Фигура 2В). Для того, чтобы различать между этими двумя результатами, CTB аксонами трассировка в ядре клиновидного должна быть проанализирована. Наличие CTB-положительных терминалы в ядре клиновидного выделяет вероятность неполного повреждения (рис 2C), в то время как отсутствие CTB-положительных терминалы предполагает частичную регенерацию в спинной мозг, как регенерированные аксоны, скорее всего , не в состоянии расти все расстояние , чтобы достичь клиновидные ядра (рис 2D). На сегодняшний день, успешно сенсорен аксон регенерация ядра клиновидного в основном сообщались в случаях с высокой шейкой матки травмой 11, 12 или с применением нейротропинов 13, 14. Любые животные, имеющие признаки неполного повреждения должны быть исключены из исследований регенерации аксонов.
Рисунок 1: DRG Инъекции Без размозжение дорсальных корешков. (АС) спинного мозга участок , показывающий GFP-положительных аксонов в спинном мозге (А), в том числе спинной колонки и дорсального рога (B) и клеточных тел в DRG (C) через четыре недели после инъекции AAV5-GFP. <сильные> (D) CTB-положительные сенсорные терминалы аксонов в ядре клиновидного одной недели после инъекции. CTB Шкалы составляет 650 мкм (АС) и 250 мкм (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оценка дорсальных корешков размозжение и Axon Регенерация. Полноценное дорсальных корешков приводит размозжение в не меченых аксонов в спинном мозге или CTB-положительных аксонов в ядре клиновидным (А). Аксотомизированных сенсорные аксоны могут регенерировать до входной зоне дорсальных корешков, но не выходит за рамки в спинной мозг. (BD) , присутствие меченых аксонов в спинном мозге представляет собой либо неполное повреждение или regeneratiна (В). С дополнительным анализом, присутствие CTB-положительных терминалами в ядре клиновидного предполагает неполную травму (С), в то время как их отсутствие предполагает полную травму и , возможно , частичную регенерацию в спинной мозг (D). Шкалы составляет 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем руководство шага за шагом, чтобы выполнить инъекцию DRG и спинной корень размозжение в нижнем шейном отделе спинного мозга взрослого крысы. Поскольку это чрезвычайно агрессивна и тонкая операция, мы настоятельно рекомендуем, чтобы все потенциальные пользователи получают достаточную подготовку и практику, прежде чем перейти жить хирургии животных. Пользователи должны быть знакомы не только с спинного мозга анатомии, но и с окружающими тканями мышц, позвоночника структуры костей и сосудов. В идеале, компетентный пользователь должен иметь возможность выполнить процедуру с минимальным повреждением окружающих тканей, выполняя чистые ламинэктомии пути удаления части позвонков, не вызывая какие-либо повреждения спинного мозга. Как видно из травмы спинного мозга, небольшое повреждение спинного мозга может иметь широкое пагубное воздействие на всю нервную систему. Кроме того, животные, перенесшие «чистая» хирургия, менее вероятно, страдают от неожиданного пост-послеоперационных осложнений и вопросы социального обеспечения и, следовательно, менее вероятно, должны быть принесены в жертву до желаемой экспериментальной точки времени.
Для введения вируса в нервную систему, есть несколько возможных путей введения: внутривенные введение 15, 16 внутрибрюшинный, интратекальные 17, или прямая инъекция в мишень 4, 8. Несмотря на то, внутривенные и внутрибрюшинные инъекции являются относительно неинвазивным, переход через гематоэнцефалический барьер может быть проблемой 18, и эти маршруты приводят к неспецифической трансдукции, которые не были бы полезны в специализированном исследовании регенерации аксонов. Аналогично, для интратекального введения в субарахноидальное пространство, более инвазивной административного маршрута, многие нейрональные и не нейрональные типы клеток в ЦНС могут быть трансдуцированных, потенциально генерации неспецифического или вне таргт эффекты. Таким образом, прямая инъекция вируса в DRG является благоприятным вариантом, и, скорее всего, приведет к гораздо более высокой эффективности трансдукции по сравнению с другими методами. Основной недостаток этого варианта, однако, является инвазивностью хирургической процедуры, которая требует специальной подготовки.
После того, как пользователи освоили необходимые хирургические навыки, этот протокол обеспечивает большую степень гибкости. В исследовании регенерации аксонов, животные могут быть изучены в сочетании с другими методами, такие как электрофизиологии в естественных условиях и сенсорно-двигательные поведенческие тесты, в то время как собранные ткани могут быть использованы для анализа анатомического или тканевой культуры 4. Сочетание этих методов, с различными экспериментальными точками времени, например, может быть использовано для изучения хода дегенерации или регенерации различных подтипов волокна, таких как NF200, CGRP, и IB4 после травмы раздавливания 4. В зависимости от экспериментальной requiremeNTS, один или другой из представленных процедур может быть выполнена в одиночку. Например, одна DRG инъекция может быть использована для аксонов экспериментов трассировки, в то время как задний корешок размозжение только может быть использовано в любых исследованиях, где требуется лапка деафферентация. Кроме того, пользователи могут также изменять тип вируса и трансгенный продукт для инъекций, точный DRG, который будет введен, и точный спинной корень травмы. Если это применимо, клеточная трансплантация или фармакологическое введение в DRG также может быть выполнено с использованием этого протокола. Основываясь на приобретенных хирургических навыков, опытный пользователь может перейти к другим методам, например, DRG инъекции в поясничной области (например, в L3 - L5 для оценки функции задних конечностей) 19 или спинной колонке размозжение, для дальнейшего изучения функции спинного мозга 5.
В заключение, мы считаем, что инъекции DRG и спинной травмы корень раздавить быть полезной моделью для изучения сенсорных аксонов регeneration. Несмотря на необходимость специальной подготовки для выполнения инвазивной хирургической процедуры, протокол является гибким, и потенциальные пользователи могут изменять многие части, чтобы приспособить их к своим экспериментальным требованиям. Эти процедуры могут служить основой для тех, кто в поисках подходящей животной модели для сенсорных исследований регенерации аксонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Кристофера и Даны Рив Фонда, Медицинского исследовательского совета, Европейского исследовательского совета ECMneuro и научно-исследовательский центр Cambridge NHMRC Biomedical. Мы хотели бы выразить нашу глубокую благодарность Хелин Мерел фургон «т Spijker и Юстина Барратт за техническую помощь во время съемок. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Элизабет Молони и профессор Джоост Верхааген (Нидерландский институт Neuroscience) для оказания помощи в производстве AAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
