Introduction
Att uppnå Axon återhämtning efter nervsystemet skada är en utmanande uppgift 1. För att studera misslyckande axonet förnyelse i det centrala nervsystemet (CNS), har forskarna använt en uppsjö av nervskada modeller. Som regioner i CNS skiljer sig är det viktigt att använda en anatomiskt lämplig modell för att studera Axon förnyelse. Genom att använda lämplig modell, kan forskarna formulera en särskild behandling baserad på hur allvarlig skada, nervcelltypen av intresse och den önskade spinal vägarna för att bedöma regeneration, i motsats till en "en-för-alla" behandlingsstrategi.
I ryggmärgsskada, till exempel de mest försvagande symptomen härrör från förlusten av känsel och rörelseförmåga. Förlust av känsel orsakas av skada på de stigande sensoriska vägar, medan förlusten av förflyttning orsakas av skada på de fallande motor vägar. På grund av cellulära och anatomiska skillnader mellan dessa two vägar, många riktade axonregeneration studier bara fokusera på den ena eller andra vägen, med motiveringen att en framgångsrik återhämtning av någon skulle vara av enorm nytta för patienterna. I denna artikel presenterar vi ett protokoll som använder en direkt dorsala rotganglier (DRG) injektion med en viral vektor och en samtidig dorsala krosskada i den lägre cervikal ryggmärgen hos en vuxen råtta som en modell för att studera sensorisk axonregeneration.
DRG sensoriska neuroner är ansvariga för återutläggning sensorisk information, såsom taktila känsla och smärta, från periferin till det centrala nervsystemet. De långa axonala projektioner av sensoriska neuroner i ryggmärgen tjäna som en god modell för att studera långväga axonregeneration. Dessutom, som gnagare kan överleva en sensorisk väg skada som en dorsala krosskada med minimala komplikationer välfärds kan forskarna studera CNS axon förnyelse utan att behöva helt Skada ryggmärgen. En fyrdubbel C5 - C8 (cervikal level 5-8) dorsala krosskada har visat sig vara en användbar modell för framtassarna deafferentation 2. Dessutom ger en dorsala krosskada en "renare" modell för att studera axon förnyelse än en direkt skada på ryggmärgen, eftersom det är okomplicerad av andra faktorer såsom glial ärrbildning.
Användningen av virala genterapi för att omprogrammera neuroner in i en regenerativ state har alltmer betraktas som en lovande behandling strategi för många neurologiska tillstånd 3. Studier har visat att applicering av en adeno-associerat virus (AAV) vektor som bär transgenen av en tillväxtbefrämjande protein kan uppnå robusta axonregeneration med beteende återhämtning 4, 5, 6. Den skenbara låga patogenicitet av AAV vid framkallande av ett immunsvar och förmågan att transducera icke-delande celler, såsom neuroner, gördet den optimala vektorn för genterapi. Dessutom är den rekombinanta AAV-formen som används för terapi. I denna form, är den oförmögen att integrera dess virala genomet i värdgenomet 7, vilket minskar risken för insertionsmutagenes i jämförelse med andra virala vektorer, såsom lentivirus. Detta gör AAV ett säkert val för genterapitillämpningar.
Som en DRG innehåller cellkropparna av sensoriska neuroner, är det den mest lämpliga anatomiska mål för administreringen av virus för genterapi för att studera och / eller främja sensorisk axonregeneration. I en studie som jämförde olika AAV-serotyper och lentivirus, var AAV-serotyp 5 (AAV5) visat sig vara de mest effektiva i att transducera DRG-neuroner under ett tidsförlopp av minst 12 veckor när den injiceras direkt in i DRG 8. Dessutom kan AAV uppnå mer än 40% transduktion effektivitet, transducera alla DRG neuronala subtyper, såsom neurofilament med stor diameter 200 kDa(NF200) -positiva neuroner och den kalcitonin liten diameter gen-relaterad peptid (CGRP) - eller isolectin b4 (IB4) -positiva neuroner 4, 8.
Som det kirurgiska ingreppet av DRG injektion och dorsala krosskada är extremt invasiva och delikat, tror vi att denna artikel kommer att hjälpa nya användare att lära sig förfarandet på ett mycket effektivt sätt. I den här artikeln visar vi representativa resultat från vuxna råttor fyra veckor efter injektionen av en kontroll virus AAV5-GFP (grönt fluorescerande protein) i C6 - C7 DRG med samtidig C5 - C8 dorsala krosskada. Denna modell är speciellt lämpad för forskare som undersöker användningen av viral genterapi för att främja sensorisk Axon förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla följande djurförsök genomfördes i enlighet med Förenade kungariket Djur (Scientific Procedures) Act 1986. Om obekant med dessa förfaranden, kontrollera med lokala / nationella bestämmelser och söka veterinär rådgivning innan protokollet.
1. Välja en lämplig stam av djur
En rygg rot krosskada resulterar i förlust av känsel och tass deafferentation: NOTE. Vanliga biverkningar av framtassarna deafferentation kan inkludera över grooming, självstympning och tass autotomy.
- Skaffa djur för förfarandet.
OBS: För råttor, de mer aktiva stammar, såsom Lister-Hooded och Wistar, har en högre förekomst av tass autotomy efter deafferentation jämfört med de mer fogliga stammar, såsom Lewis och Sprague-Dawley. Om möjligt bör den mest fogliga stam, Lewis, alltid övervägas först. Bör en särskilt aktiv stam vara nödvändigt för experimentet på grund av genetisk modification eller särskilda beteende krav på bedömning bör veterinärbehandling vara på plats för att ta itu med förväntade negativa effekter.
2. Förbereda Virus for Injection
VARNING: Hantera alla virus i enlighet med biologiska och laboratorie säkerhetsföreskrifter.
- Späda ut eller koncentrera viruset till en titer av 2 x 10 12 genomkopia (GC) / ml efter individuell virusförpackningsprotokoll 9.
OBS: Här var viruset utspätt i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) med 5% sackaros. Titern kan behöva optimeras beroende på vilken typ av virus, promotor, konstruera storlek, och riktade celltyp. - Tillval: Tillsätt 1% färgat färgämne (t.ex. Fast Green) för viruset lösning för enkel visualisering av injektions senare. Blanda lösningen mycket försiktigt.
- Förvara lösningen på is för omedelbar användning (inom 4 h) eller i en -80 ° C frys under lång-tids förvaring.
3. Utförande av Preoperativ Framställning av Animal
OBS: På grund av den extrema invasiv för operationen bör aseptisk teknik användas vid alla tillfällen.
- Förbereda och sterilisera alla kirurgiska verktyg och spinalstereotaktisk ram före start av operationen. Till exempel, sterilisera verktygen i en autoklav vid 134 ° C. Använd en ny uppsättning steriliserade verktyg för varje djur.
- Söva djuret. Bekräfta korrekt anesthetization genom att klämma tassen för att testa tillbakadragande reflex eller genom att trycka på hornhinnan för ögonlocksreflexen.
- För vuxna råttor med användning av inhalationsanestesi såsom isofluran, använda 4% isofluran i 2,0 L / min av syre för induktion. För underhåll under hela operationen, använd med 2 - 3% isofluran i 1,5 L / min av syre, att variera isofluran-koncentrationen enligt andningsmönstret hos djuret för att undvika över- eller underdosering.
- Påce djuret initialt sövda, spela in den preoperativa vikten av djuret.
- För hals DRG injektionen raka av pälsen på halsen från mellan öronen bara distalt om skulderbladen. Desinficera rakade området med en antiseptisk produkt.
- Injicera 2 ml koksaltlösning subkutant på flanken hos djuret, tillsammans med en lämplig dos av analgetikum (t ex 5 mg / kg karprofen) och antibiotika (t.ex., 5 mg / kg enrofloxacin).
- Applicera ögonsalva till båda ögonen för att förhindra hornhinnan torkning under förfarandet.
- Fortsätt till kirurgi på en spinal stereotaxisk ram med en värmedyna vid 37 ° C placerades under djuret.
4. Injicering DRG och Utföra en Dorsal Root krosskada
OBS: Detta är en extremt känslig operation. Det är lämpligt att öva på några döda djur först att bekanta sig med anatomin innan avancera till levande djur kirurgi.
- Locate framträdande C2 och T2 ryggkotornas processer över huden. Göra ett hudsnitt mellan C2 och T2 spinous processer med en no.10 skalpellblad (när huden öppnas, bör en vit, fibrös vävnadsmittlinjen vara synliga på det första lagret av muskler, det första lagret av muskler har en " geléliknande" textur).
- Göra en liknande storlek snitt på det första lagret av muskler längs den vita mittlinjen med användning av ett skalpellblad. Inte går utöver den framträdande T2 ryggkotornas process, eftersom det finns en stor arteriell gren från den nedåtgående aorta som ligger nära där.
OBS: Kraftiga blödningar kan uppstå var som helst från detta steg framåt. Stäng alltid av blödning och ta bort blodet med hjälp av steriliserade bomullspinnar eller kirurgiska absorber svampar för att möjliggöra tydlig visualisering vid alla tillfällen. Fortsätter med proceduren "blint" kan resultera i oönskade skador på ryggmärgen, DRG eller dorsalroten, vilket leder till oväntade negativa effekter i djur senare. - Dra tillbakaförsta lagret av muskler med användning av två sårhakar, en placerade rostrally och ett kaudalt; det andra lagret av muskler, med ett strimmigt utseende, bör vara synliga.
- Lokalisera mittlinjen av det andra skiktet av muskler (där kan observeras två längsgående muskler ansluten med en tunn, membranös vävnad). Dissekera den membranösa vävnad med användning av ett par microscissors för att åtskilja de två längsgående muskler. Undvik att använda en skalpell blad om möjligt, eftersom det kan leda till onödig muskelskada och blödning.
- Justera upprullningsdon därmed att exponera det tredje skiktet av tunn muskel täcker ryggraden. Spinalutskotten kan kännas genom lätt röra med en pincett under det tredje skiktet av muskeln.
- Gör ett litet snitt på det tredje skiktet av muskler med hjälp av mikrosax och försiktigt skrapa bort muskler från benet med hjälp av en kyrett eller skalpell i sidled sätt att tydligt exponera kotorna. Om det behövs, skär en del av muskeln eller senan bort för att göra Laminectomy lättare.
- Att exponera den vänstra C5 - C8 DRG, utföra en vänster halv laminektomi på C4 - T1 kotor genom att försiktigt ta bort en del av lamina och BLOMSTJÄLK hjälp av ett par fina rongeurs. DRG ligger nära de tvärgående foramen av kotorna.
OBS: C3 - C7 kotor inte har en framträdande ryggkotornas process. C5 DRG ligger mellan C4 och C5 kotor, är C6 DRG mellan C5 och C6 kotor, och så vidare, medan C8 DRG är mellan C7 och T1 kotor. Det finns ingen C8 kota, trots närvaron av en C8 DRG och C8 ryggmärgssegmentet. - Gång tillräckligt av DRG har exponerats för injektion, förbereda sprutan genom att placera mikroliter spruta virusfyllda utrustad med en skräddarsydd, 33-gauge trubbig nål på stereotaxic spruthållare. Före injektion, använd en 30-gauge avfasade nål för att göra en liten ytlig öppning på var och en av de riktade DRG att hjälpa till med införandet av injektionsnålen.
- Sätt i 33-gauge nålen in i centrum av DRG genom att vrida rattarna försiktigt för att justera stereotaxic koordinater. Inte över in nålen, eftersom detta kan orsaka att vätska läcker ut från den ventrala sidan av DRG. Skulle läckage inträffar justera läget av nålen omedelbart.
OBS: De numeriska stereotaktiska koordinater används inte; Men är det bra att använda ramen för att hålla nålen för injektion. - Injicera 1 mikroliter av viruset in i varje DRG vid 0,2 | il / min med användning av en infusionssprutpump. Vänta ytterligare tre minuter innan nålen dras ut. Under injektionen kommer DRG sakta ändra färg om viruset lösningen innehåller ett färgat färgämne.
- Att utföra en samtidig C5 - C8 dorsala krosskada, krossa varje rot tre gånger för 10 s vardera med användning av ett par av spetsig pincett (Bonn Micro), motstående ändarna av pincett helt; en vit linje i vävnaden ska visas på krossa platsen. Inte gå djupare än vad som krävs med Forceps, eftersom det kan orsaka skador på den ventrala roten.
- Efter injektionen och / eller krossa, se till att det inte finns någon blödning eller små bitar av benfragment kvar på snittet platsen innan stängning upp djuret. Om så önskas, placera en liten bit av kirurgisk absorber svamp ovanpå den exponerade ryggmärgen och DRG.
- Tillåta det tredje skiktet av muskeln för att dra tillbaka igen naturligt på ryggraden utan suturering. Löst sutur de två longitudinella musklerna på det andra skiktet (≈ 3 avbrutna suturer) med absorber 6-0 suturmaterial. Suturera det första lagret av muskler (≈ 5 avbrutna suturer) med absorber 6-0 suturmaterial.
- Sutur huden med absorber 5-0 suturmaterial (≈ 10 avbrutna suturer).
OBS: Se till att suturerna inte för hårt. Utbuktning av huden är ett tecken på över åtdragning och kan orsaka obehag för djuret. - Om kraftig blödning inträffade under operationen, subkutant injicera 1-2ml saltlösning för att fylla på förlust av vätska från djuret som tillåts enligt lokala föreskrifter.
- Tillhandahålla ätliga hydratiserande gel och tillåta djuret att återhämta sig helt från anestesi, utföra regelbunden övervakning under minst 1 timme innan de återvänder djuret tillbaka till uppehållsområdet.
- Hålla djuret under minst 3 veckor för optimal transgenexpression att bedöma sensoriska axonregeneration.
5. Utföra postoperativ vård av djur
- Ge mat mäsk och mjuk bomull sängkläder för djuret under den första veckan efter operationen. Vid behov administrera ytterligare doser av smärtstillande och antibiotika för att hjälpa med återhämtningen i enlighet med lokala / nationella bestämmelser och veterinär råd.
- Ta suturerna på huden efter 7 - 10 dagar.
OBS: Vanliga biverkningar av operationen omfattar bildandet av serom eller hematom på snittet platsen, skrapa märken på huden på grund av klåda som orsakas avde inre absorberbara suturer, subtila sensorisk eller locomotion underskott, och tecken på självstympning på deafferenterad tassen efter dorsala krosskada. För alla välfärdsfrågor som betydligt allvarligare än väntat, omedelbart söka veterinär rådgivning.
6. Utföra en Antero CTB injektion för axonal Tracing
OBS: Det rekommenderas att utföra koleratoxin B-subenhet (CTB) axonal spåra en vecka före uppsamling av vävnad.
- Bered 1% CTB lösning enligt tillverkarens instruktioner.
- Tillval: Tillsätt 1% färgat färgämne till lösningen för enkel visualisering av injektions senare. Blanda lösningen mycket försiktigt.
- Söva djuret (se steg 3.2.1) och stabilisera den vänstra framtassen genom att tejpa lemmen till bordet.
- Manuellt och långsamt injicera 1 mikroliter av 1% CTB subkutant i mitten av den kal trampdynan och fyra siffror med användning av en mikroliter spruta with en skräddarsydd, 33-gauge kort nål.
OBS: Före injektion, hjälper det att först använda en 30-gauge avfasade nål för att göra en liten ytlig öppning på huden, vilket hjälper till med införandet av injektionsnålen. - Låt djuret att återhämta sig helt från anestesi innan han återvände djuret till uppehållsområdet.
7. Samla Vävnad
- Att samla in viruset-injicerade DRG och ryggmärgen för immunohistokemi, administrera en överdos av anestetikum och transkardiellt BEGJUTA djuret med fosfatbuffrad saltlösning följt av kall 4% paraformaldehyd. utföra försiktigt en fullständig laminektomi på ryggraden för att samla den fasta vävnaden under ett mikroskop. Fortsätta med vävnadsberedning, snittning, och behandling som erfordras för analys 4, 5, 6.
OBS: Den utvunna snittstället bör vara uppenbart, såsom observeras genom närvaron av sbil vävnad. - Alternativt, för att samla in det virus-injicerade DRG för in vitro-odling, offra djuret humant med en godkänd metod, såsom en stigande koncentration av koldioxid. Försiktigt dissekera DRG under ett mikroskop, vilket garanterar aseptiska förhållanden när det är möjligt. Vidare med vävnadsodling såsom önskas 4, 5, 6, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en representation, är en tvärgående ryggmärgssektion med den bifogade DRG presenteras för att visa effektiviteten av detta protokoll i transducerande DRG-neuroner och spåra sensoriska axoner i ryggmärgen fyra veckor efter injicering av en kontrollvirus, AAV5-GFP, direkt in i C7 DRG utan en dorsal root krosskada (Figur 1A). Axoner i både dorsala kolonnen och det dorsala hornet av ryggmärgen uttrycka GFP (Figur 1B), såväl som cellkroppar och axoner i den injicerade DRG (Figur 1C). Ytterligare anatomisk analys av KILFORMIG kärnan, den sensoriska axonet terminalen i hjärnstammen, avslöjar positiv antero CTB spårande (figur 1D).
När DRG injektionen utförs samtidigt med en komplett C5-C8 dorsala krosskada, inga GFP-positiva axoner i ryggmärgen eller CTB-pluspolens i KILFORMIG kärnan observeras (Figur 2A). Det är dock värt att påpeka att axotomiserade sensoriska axoner fortfarande kan regenerera upp till dorsala posten zon i en helt krossad rygg rot, som är en PNS miljö, men inte längre än till ryggmärgen 4, 5 (figur 2A). I händelse av att det injicerade viruset innehåller transgenen av ett potentiellt tillväxtbefrämjande protein, kan närvaron av märkta axoner i ryggmärgen representera antingen regenerering eller en ofullständig dorsala krosskada (Figur 2B). För att skilja mellan dessa två resultat, bör CTB axonal spårning i KILFORMIG kärnan analyseras. Närvaron av CTB-positiva terminaler i KILFORMIG nucleus belyser sannolikheten för en ofullständig skada (figur 2C), medan frånvaron av CTB-positiva terminaler antyder partiell regenerering in i ryggmärgen, såsom regenererade axonersannolikt oförmögna att växa hela avstånd för att nå den KILFORMIG kärnan (figur 2D). Hittills har framgångsrikt sensoriska axon förnyelse till KILFORMIG kärnan främst rapporterats i fall med hög livmoderhalscancer skada 11, 12 eller med tillämpning av neurotrofiner 13, 14. Alla djur som uppvisar tecken på ofullständig skada bör undantas från Axon förnyelse studier.
Figur 1: DRG Injektion Utan Dorsal Root krosskada. (AC) Ryggmärgs sektion som visar GFP-positiva axoner i ryggmärgen (A), inklusive den dorsala kolonnen och dorsala hornet (B) och cellkroppar i DRG (C) fyra veckor efter injektionen av AAV5-GFP. <strong> (D) CTB-positiva sensoriska axon terminaler i KILFORMIG kärnan en vecka efter CTB injektion. Skalstrecket är 650 ^ m (AC) och 250 pm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Uppskatta Dorsal Root krosskada och Axon Regeneration. (A) En komplett dorsala krossa skada leder till inga märkta axoner i ryggmärgen eller CTB-positiva axonterminaler i KILFORMIG kärnan. Axotomiserade sensoriska axoner kan regenerera upp till dorsala posten zon, men inte längre än till ryggmärgen. (BD) Närvaron av märkta axoner i ryggmärgen representerar antingen ofullständig skada eller regeneratipå (B). Med ytterligare analys, antyder närvaron av CTB-positiva terminaler i KILFORMIG nucleus ofullständig skada (C), medan deras frånvaro antyder fullständig skada och potentiellt partiell regenerering i ryggmärgen (D). Skalstrecket är 250 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel presenterar vi en steg-för-steg guide för att utföra en DRG injektion och dorsala krosskada i den lägre cervikal ryggmärgen hos en vuxen råtta. Eftersom detta är en mycket invasiv och känslig operation, rekommenderar vi starkt att alla potentiella användare få tillräcklig utbildning och praktik innan avancera till levande djur kirurgi. Användarna bör känna inte bara med ryggmärgsanatomi, men också med de omgivande muskelvävnad, vertebral benstomme och kärl. Helst bör en kompetent användare kunna utföra proceduren med minimal skada på omgivande vävnader, som utför en ren laminektomi genom att ta bort en del av kotorna utan att inducera skador på ryggmärgen. Som framgår av ryggmärgsskada, kan en liten skada i ryggmärgen har en utbredd skadlig effekt på hela nervsystemet. Dessutom djur som har genomgått en "ren" kirurgi är mindre benägna att drabbas av oväntade Post-operativa komplikationer och välfärdsfrågor och är därför mindre sannolikt att behöva offras innan önskad experimentell tidpunkt.
Att administrera viruset i nervsystemet, det finns några möjliga administreringsvägar: intravenösa 15, intraperitoneal 16, intratekal 17, eller direkt injektion in i målet 4, 8. Även intravenösa och intraperitoneala injektioner är relativt icke-invasiv, kan passage av blod-hjärnbarriären vara ett problem 18 och dessa rutter resulterar i icke-specifik transduktion, vilket inte skulle vara användbar i en specialiserad axon förnyelse studie. På liknande sätt, för intratekal injektion in i det subaraknoidala utrymmet, en mer invasiv administrativ rutt, många neuronala och icke-neuronala celltyper i CNS kan transduceras, potentiellt generera icke-specifika eller off-target effekter. Sålunda, är den direkta injektionen av viruset in i DRG ett gynnsamt alternativ och sannolikt att resultera i en mycket högre transduktion effektivitet än andra metoder. Den största nackdelen med detta alternativ är dock invasions av kirurgiskt ingrepp, som kräver specialiserad utbildning.
När användare har bemästrat de nödvändiga kirurgisk kompetens, erbjuder detta protokoll ett stort mått av flexibilitet. I ett axon regeneration studie kan djuren studeras i kombination med andra tekniker, såsom in vivo-elektrofysiologi och sensorisk-motoriska beteendetester, medan de uppsamlade vävnader kan användas för anatomisk analys eller vävnadskultur 4. En kombination av dessa tekniker, med varierande experimentella tidpunkter, till exempel, kan användas för att studera utvecklingen av degenerering eller regenerering av olika fiber subtyper, såsom NF200, CGRP, och IB4 efter krosskada 4. Beroende på den experimentella requirements, den ena eller den andra av de presenterade förfarandena kan utföras ensam. Till exempel, kan DRG injektion ensamt användas för axonala spårning experiment, medan dorsala krossa ensam skada kan användas i några studier där det krävs framtassarna deafferentation. Dessutom kan användarna också variera typen av virus och transgen produkt för injektion, till den exakta DRG skall injiceras, och den exakta dorsala rot för skada. Om tillämpligt, kan också utföras celltransplantation eller farmakologisk administrering i DRG användning av detta protokoll. Bygga om förvärvade kirurgisk kompetens, kan en erfaren användare fortsätta till andra tekniker, såsom DRG injektion i ländryggsområdet (t ex in i L3 - L5 att bedöma bakbens funktion) 19 eller dorsala kolonn krosskada, att ytterligare studera ryggmärgsfunktion 5.
Sammanfattningsvis tror vi att DRG injektionen och dorsala krosskada att vara en användbar modell för att studera sensoriska axon regeneration. Trots kravet på specialiserad utbildning för att utföra invasiva kirurgiska ingrepp, är protokollet flexibel och potentiella användare kan ändra många delar för att tillgodose sina experimentella krav. Dessa procedurer kan fungera som en grund för dem som söker en lämplig djurmodell för sensoriska axon förnyelse studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Christopher och Dana Reeve Foundation, Vetenskapsrådet, Europeiska forskningsrådet ECMneuro och Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Vi vill uttrycka vår djupaste tacksamhet till Heleen Merel van 't Spijker och Justyna Barratt för deras tekniskt stöd under inspelningen. Vi vill tacka Dr Elizabeth Moloney och professor Joost Verhaagen (Nederländska institutet för neurovetenskap) för att bistå i AAV produktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
