Introduction
神经系统损伤后实现轴突再生是一项艰巨的任务1。研究轴突再生的中枢神经系统（CNS）的失败，研究人员利用神经损伤模型过多。由于中枢神经系统的地区不同，它使用一个适当的解剖模型来研究轴突再生是非常重要的。通过使用合适的模型，研究人员可以制定基于损伤的严重程度，感兴趣的神经元细胞类型的特定处理，并评估再生所需的脊髓束，而不是“一个对所有人”的治疗策略。
在脊髓损伤，例如，最衰弱的症状，从感觉和运动的损失造成的。感觉丧失是由在上行感觉通路造成的损害，而运动的损失是由该下行运动路径造成的损害。由于这些TW之间的蜂窝和解剖学上的差异Ø途径，许多有针对性的轴突再生的研究只专注于一个或另一个途径，与逻辑，即任一成功恢复将是巨大的利益给患者。在本文中，我们提出一种使用直接背根神经节（DRG）注射用病毒载体和在成年大鼠作为模型来研究感觉轴突再生的下颈脊髓并发背根挤压伤的协议。
DRG感觉神经元负责中继感官信息，如触觉和疼痛，从外围到中枢神经系统。在脊髓中的感觉神经元的轴突长突起作为一个很好的模型来研究长途轴突再生。此外，由于啮齿动物可以生存感觉传导通路的病变，如背根挤压伤以最小的福利并发症，研究人员可以研究中枢神经系统轴突再生，而无需完全损伤脊髓。一个四C5 - C8（宫颈升伊维尔基尼5 - 8）背根挤压伤已被证明是用于前爪传入神经阻滞2的有用模型。此外，背根挤压伤提供了一个“更清洁”的模型来研究轴突再生比直接脊髓损伤，因为它是由其他因素简单如胶质瘢痕的形成。
重编程为神经元再生状态使用病毒基因治疗已越来越多地被视为对许多神经系统疾病3有前途的治疗策略。研究表明携带生长促进蛋白的转基因可以实现鲁棒轴突再生与行为恢复4，5，6的腺相关病毒（AAV）载体的应用。在引发免疫应答和转导非分裂细胞，如神经元的能力AAV的表观低致病性，使它用于基因治疗的最佳载体。另外，重组AAV形式用于治疗。在这种形式中，它不能其病毒基因组整合到宿主基因组7，减少相对于其他的病毒载体，如慢病毒插入诱变的风险。这使得AAV基因治疗应用的安全选择。
作为一个包含DRG感觉神经元的细胞体，它是病毒的基因治疗管理的最合适的解剖目标，研究和/或促进感觉轴突再生。在比较不同的AAV血清型和慢病毒的研究中，AAV血清型5（AAV5）被证明是最有效的在当直接注射到DRG 8超过至少12周的时间过程转导的DRG神经元。此外，AAV可以实现40％以上的转导效率，转导所有DRG神经元亚型，如大直径神经丝200kDa的（NF200）阳性神经元和小直径降钙素基因相关肽（CGRP） -或同工凝集素B4（IB4）阳性神经元4,8。
由于DRG注射和背根挤压伤的手术过程是非常侵入性的细腻，我们认为，这篇文章将帮助新用户学习在一个非常有效的方式方法。在这篇文章中，我们将展示来自成年大鼠注射对照病毒AAV5-GFP（绿色荧光蛋白）到C6四个星期后有代表性的结果 - C7病种付费用并发C5 - C8背根挤压伤。这种模式特别适用于谁的研究人员正在研究利用病毒基因疗法来促进感觉轴突再生。
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Protocol
以下所有动物的程序是按照英国动物（科学程序）法案1986年如果不熟悉这些程序进行的，请向当地/国家法规检查并启动协议前寻求兽医的意见。
1.选择动物的合适的应变
注：背根挤压伤引起的轰动和爪的传入神经阻滞的损失。前爪传入神经阻滞常见的不良影响包括过度修饰，自残，和爪自残。
- 获得动物的程序。
注：对于大鼠，更具活性的菌株，例如利斯特-带帽和Wistar，具有相比于更服帖菌株，如Lewis和的Sprague-Dawley传入神经阻滞后爪自残的发生率较高。如果可能的话，最温顺的应变，刘易斯，应始终优先考虑。应该特别活跃的菌株所必需的实验由于遗传米odification或特定行为的考核要求，兽医治疗应到位，以满足预期的不利影响。
2.制备用于注射的病毒
注意：处理所有病毒，根据生物学和实验室安全规定。
- 稀释或病毒浓缩至2×10 12基因组拷贝（GC）的滴度/毫升以下单个病毒包装协议9。
注意：在此，在病毒的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（D-PBS），用5％的蔗糖稀释。滴度可以具有被优化取决于病毒，启动子的类型，构建体大小，和靶向的细胞类型。 - 可选：有色染料（ 例如，固绿）添加1％，为以后的注射方便的可视化病毒解决方案。轻轻搅拌溶解。
- 保持立即使用在冰上将该溶液（在4小时内）或在-80℃冷冻机中长长期储存。
3.执行动物的术前准备
注：由于手术的极度侵袭，无菌技术应该在任何时候都可以使用。
- 准备和消毒之前，要启动手术的所有手术工具和脊柱立体框架。例如，消毒在134℃的高压釜中的工具。使用一套全新的消毒工具，对每个动物。
- 麻醉动物。按捏爪子，以测试撤回反射或者通过触摸为眼睑反射角膜确认正确的麻醉。
- 对于使用吸入麻醉如异氟烷成年大鼠，使用4％异氟烷在2.0L /氧气感应分钟。在整个手术维护，使用2 - 3％异氟烷在1.5L /分钟的氧，改变异氟烷浓度根据动物的呼吸模式，以避免过度或不足的剂量。
- 上CE动物最初麻醉，记录动物的术前体重。
- 对于宫颈DRG注射，从耳朵之间剃去毛发上颈部刚好远侧的肩胛骨。消毒用消毒产品剃光面积。
- 注入2毫升盐水皮下对动物的侧腹，具有止痛的适当剂量（ 例如，5毫克/公斤卡洛芬）和抗生素（ 例如，5mg / kg的恩氟沙星）沿。
- 应用眼膏两眼，以防止在手术过程中角膜干燥。
- 进行到手术在37℃下放置在动物下方的加热垫脊柱立体定位框架上。
4.注射DRG和表演背根挤压伤
注：这是一个非常精细的外科手术。明智的做法是先练上几个动物尸体推进到活的动物在手术前与解剖熟悉。
- 大号ocate在皮肤上的突出C2和T2棘突。使用10号解剖刀刀片（一旦皮肤被打开，白色，纤维状组织中线应该是肌肉的第一层上可见的C2和T2棘突之间的皮肤切口;肌肉的第一层具有“果冻状”结构）。
- 使肌肉的沿使用解剖刀刀片的白色中线所述第一层上的类似尺寸的切口。不要超越突出T2棘突，因为有来自附近还有降主动脉的主要动脉分支。
注：可以从这一步骤起任何地方发生大量出血。始终止血，并用消毒棉签或手术吸收海绵，允许在任何时候都清晰的可视清除血液。与该过程继续进行“盲目地”可以导致对脊髓，DRG，或背根不希望的损坏，从而导致意外的不利影响在动物以后。 - 缩回使用两个牵引器，一个吻侧放置和一个尾部肌肉的第一层;肌肉的第二层，具有纹状外观，应该是可见的。
- 定位肌肉（其中可以观察到两个纵向肌肉由薄的，膜状组织连接）的所述第二层的中线。解剖使用一对microscissors以分离两个纵向肌肉的膜状组织。避免使用手术刀刀片如果可能的话，因为这可能导致不必要的肌肉损伤和出血。
- 相应地调整牵开器，以暴露薄肌覆盖脊柱的第三层。棘突可通过用一对镊子的过度的肌肉的第三层轻轻触摸感觉到。
- 使肌肉的第三层上的一个小切口使用microscissors，轻轻刮去使用刮匙或手术刀以侧向的方式清楚地暴露椎骨从骨肌。如果需要的话，削减一些肌肉或肌腱的客场让拉米nectomy容易。
- 以暴露左C5 - C8的DRG，执行对C4左半侧椎板 - 通过仔细移除该薄片的一部分，并使用一对细咬骨钳椎弓根T1椎骨。在DRG靠近椎骨横突孔。
注：C3 - C7椎体没有突出的棘突。该C5 DRG位于C4和C5的椎骨之间，所述C6 DRG是C5和C6椎骨之间，等等，而C8 DRG是C7和T1椎骨之间。没有C8椎骨，尽管C8 DRG的存在和C8脊髓节段。 - 一旦足够的DRG的已经暴露于注射，通过将装配有定制的，33号钝针头到立体定位注射器保持器的病毒填充微升注射器准备注射器。注射前，用30号针头斜面，使每个目标DRG的小肤浅的开放，以帮助注射针头的插入。
- 插入33克由AuGe针入DRG的轻轻转动旋钮调整立体坐标的中心。不要过度插入针，因为这可能导致流体从DRG的腹侧泄漏出来。如果发生泄漏，立即调整针的位置。
注：数字立体坐标不被使用;但是，它有利于利用框架保持针注射。 - 注入病毒1μL成使用输注注射泵以0.2微升/分钟的每个DRG。等待抽出针头之前进一步进行3分钟。在注射过程中，如果病毒解决方案包含彩色染料的DRG会慢慢变色。
- 要执行并发C5 - C8背根挤压伤，挤压各根为10秒三次，每次使用一对细尖镊子（波恩微），相对完全钳子的端部;在组织中的白线应该出现在粉碎网站。不要去更深比用FORC要求EPS，因为这可能导致向腹侧根损害。
- 继注入和/或挤压，确保没有出血或小件收涨动物之前在切口部位留下骨头碎片。如果优选的话，放置一小块吸收手术海绵的在暴露的脊髓和背根神经节的顶部。
- 允许肌肉的第三层，以自然缩回到脊柱不缝合。松散地缝合在第二层上的两个纵向肌肉用可吸收6-0缝合线材料（≈3间断缝合）。缝合肌肉的所述第一层（5≈间断缝合）用可吸收缝合线6-0的材料。
- 缝合皮肤可吸收5-0缝合线材料（≈10间断缝合）。
注：确保缝合不太紧。皮肤的鼓胀是过度收紧的迹象，可能会导致不适的动物。 - 如果手术过程中发生大量出血，皮下注入1 - 2盐水中的溶液，以从动物补充流体的损失下当地法规所允许的。
- 提供食用保湿凝胶，并允许动物从麻醉中完全恢复，返回动物返回到保持区之前至少1个小时进行定期监测。
- 保持动物为至少3周以获得最佳的转基因表达，以评估感觉轴突再生。
5.表演动物的术后护理
- 第一个星期后手术过程中向动物提供食物捣烂柔软的棉被褥。如果需要的话，管理附加剂量的止痛和抗生素的使用符合当地/国家法规和兽医建议恢复提供帮助。
- 10日 - 7后取下皮肤上的缝线。
注：该手术的常见不良反应包括血清肿或血肿的切口部位的形成，划伤皮肤痕迹，由于引起瘙痒内部吸收缝合线，微妙的感觉或运动障碍，和自残的背根挤压伤后deafferented爪子迹象。对于实质上比预期更严重的任何福利问题，应立即寻求兽医的意见。
6.执行顺行CTB注射轴突跟踪
注：建议进行霍乱毒素B亚基（CTB）轴突跟踪一周之前组织收集。
- 准备1％CTB的解决方案，根据制造商的说明书。
- 可选：1％有色染料添加到了后来就注射方便的可视化解决方案。轻轻搅拌溶解。
- 麻醉动物（见步骤3.2.1），并通过胶带肢体表稳定左前爪。
- 手动和缓缓注入1％CTB的1μL皮下注射到无毛足垫的中心，并使用微升注射器装配无线四位数字TH定制的，33号短针。
注：注射前，最好先用30号斜口针，使皮肤上的小口浅，这与注射针插入助攻。 - 让动物动物返回到保持区域之前从麻醉中完全恢复。
7.收集组织
- 为了收集用于免疫组织化学的病毒注射的DRG和脊髓，施用麻醉剂的过量和穿心灌注用磷酸缓冲盐水，随后冷的4％多聚甲醛的动物。仔细对脊柱执行完全椎板切除术，以收集在显微镜下被固定的组织。与组织制备，切片，并且处理继续进行根据需要进行分析4，5，6。
注：将回收的切口部位应该是显而易见的，由s的存在所观察到的汽车组织。 - 可替代地，以收集在体外培养的病毒注射的DRG，与经批准的方法入道牺牲动物，例如二氧化碳的浓度上升。小心解剖DRG在显微镜下，确保无菌条件只要有可能。与组织培养根据需要4，5，6，10进行。
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Representative Results
作为代表性，呈现与所连接的DRG的横向脊髓部分直接显示该协议的有效性在转导DRG神经元和注射对照病毒，AAV5-GFP后过四星期跟踪在脊髓感觉轴突，入C7 DRG而不背根挤压伤（ 图1A）。在这两个背柱和脊髓背角神经轴突表达GFP（ 图1B），以及注入的DRG（ 图1C）中的细胞体和轴突。所述楔形核的额外的解剖分析，在脑干中的感觉轴突终端，揭示了正顺行CTB跟踪（ 图1D）。
当DRG注射用一个完整的C5-C8背根挤压伤执行的并发，脊髓或CTB-正极端子没有GFP阳性神经轴突S IN的楔形核中观察到（ 图2A）。然而，值得指出的是金黄地鼠感觉轴突仍然可以再生到在一个完全粉碎背根，这是一个PNS环境背根进入区，但不超出到脊髓4,5（ 图2A）。在所注入的病毒包含潜在促生长蛋白的转基因的情况下，标记的轴突在脊髓的存在可表示再生或不完整的背根挤压伤（ 图2B）。这两个结果之间区分，在楔形核CTB轴突跟踪应分析。在楔形核CTB-正极端子的存在突出的不完全损伤（ 图2C）的可能性，而没有CTB-正极端子的提示部分再生进入脊髓，作为再生轴突很可能不能生长的整个距离到达楔形核（ 图2D）。迄今为止，成功的感觉轴突再生的楔形核问题大多出现在案件高宫颈损伤11，12或13神经营养因子，14的应用。显示不完全损伤的迹象，任何动物应该被排除在轴突再生的研究。
图1：DRG 注射没有背根挤压伤。 （AC）表示AAV5-GFP注射后四周脊髓GFP阳性轴突（A），包括背柱和背角（B）和细胞体在DRG（C）脊髓部。 <强>（D）CTB-阳性感觉轴突终端在楔形核一周后CTB注射。比例尺是650微米（AC）和250微米（D）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 评估背根挤压伤和轴突再生。 （A）一个完整的背根挤压伤导致在楔形核脊髓或CTB-阳性轴突终末没有标记的轴突。金黄地鼠的感觉轴突可以再生至背根进入区，但不超过到脊髓。 （BD）标记的轴突的脊髓中的存在表示要么不完全损伤或regenerati上（B）。用额外的分析，CTB-正极端子在楔形细胞核中的存在表明不完全损伤（C），而其不存在表明完全损伤和潜在的部分再生到脊髓（D）。比例尺为250μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在本文中，我们提出了一种一步一步的指导，在成年大鼠的下颈脊髓进行DRG注射和背根挤压伤。由于这是一个非常侵入性和精细的外科手术，我们强烈建议所有潜在用户推进到活的动物在手术前获得足够的培训和实践。用户应该熟悉不仅与脊髓的解剖结构，而且还与周围的肌肉组织，椎体骨质结构，和血管。理想情况下，主管用户应该能够执行以最小的损伤的过程向周围的组织，通过而不诱导脊髓任何损害去除椎骨的部分进行清洁的椎板切除术。由于脊髓损伤明显，脊髓小病变可以有整个神经系统普遍不利影响。此外，经历了一个“干净”手术的动物不太可能受到意外后遭受因此，手术并发症和福利问题，并不太可能有希望的实验时间点之前被牺牲。
施用病毒进入神经系统中，有施用的几个可能的路线：静脉15内，腹膜内16，鞘内17，或直接注射到靶4,8。尽管静脉内和腹膜内注射是相对非侵入性的，血-脑屏障的交叉可能是一个问题18，这些路由导致非特异性转导，这不会是在一个专门的轴突再生研究是有用的。类似地，用于鞘内注射至蛛网膜下隙，更侵入性的管理途径，CNS中的许多神经元和非神经元细胞类型可以被转导的，这可能产生非特异性或断开圆盾Ť效果。因此，直接注射病毒进入DRG是一个有利的选择，并可能导致更高的转染效率比其他方法。该选项的主要缺点，但是，是外科手术，这需要专门培训的侵袭。
一旦用户已经掌握所需的手术技巧，该协议提供了极大的灵活性量。在一个轴突再生的研究中，动物可以结合研究了其他的技术，例如在体内电生理和感觉运动行为测试，而收集的组织可以用于解剖分析或组织培养4。这些技术，具有变化的实验时间点的组合，例如，可以被用来研究变性或不同纤维亚型，如NF200，CGRP，和IB4的再生的挤压伤4之后的进展。根据实验requiremeNTS，一个或另一个的所呈现的程序可以单独执行。例如，单独注射DRG可以用于轴突跟踪实验，而单独的背根挤压伤可以在需要前爪传入神经阻滞任何研究中使用。此外，用户还可以改变病毒和用于注射的转基因产物的类型，确切DRG被注入，并且确切的背根受伤。如果适用，也可以使用该协议来进行细胞移植或药理学施用到DRG。上获取的手术技巧的基础上，有经验的用户可进行到其它的技术，如DRG注射在腰部区域（ 例如，进入L3 - L5评估后肢功能）19或背柱破碎损伤，进一步研究脊髓功能5。
总之，我们认为，DRG注射和背根挤压伤是一个有用的模型来研究感觉轴突REGeneration。尽管进行专门培训，以进行微创手术的要求，协议是灵活的，用户和潜在用户可以修改很多地方，以满足他们的实验要求。这些程序可以作为那些寻找合适的动物模型感觉轴突再生的研究奠定了基础。
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Acknowledgments
这项工作是由从克里斯托弗和戴纳·里夫基金会，医学研究理事会，欧洲研究理事会ECMneuro和NHMRC剑桥生物医学研究中心的资助。我们想表达我们最深切的感谢海琳·梅勒范“T Spijker和贾斯泰纳·巴拉特在拍摄过程中的技术援助。我们要感谢伊丽莎白·莫洛内博士和乔斯特·弗哈根教授（荷兰神经科学研究所）在AAV生产协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
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