Introduction
Opnåelse axon regenerering efter nervesystemet skaden er en udfordrende opgave 1. For at undersøge den fejlslagne axon regeneration i centralnervesystemet (CNS) har forskere anvendt en overflod af nerve beskadigelsesmodeller. Som regioner i CNS er forskellige, er det vigtigt at anvende en anatomisk passende model til at studere axon regeneration. Ved anvendelse af passende model, kan forskerne formulere en specifik behandling baseret på sværhedsgraden af skade, den neuronale celletype af interesse, og den ønskede spinal tarmkanalen til vurdering regenerering, i modsætning til en "one-for-alle" behandlingsstrategi.
I rygmarvsskade, for eksempel de mest invaliderende symptomer stammer fra tab af følelse og bevægelse. Tab af fornemmelse er forårsaget af skader på de stigende orden sensoriske veje, mens tabet af bevægelse er forårsaget af skader på de faldende motoriske veje. På grund af cellulære og anatomiske forskelle mellem disse two veje, mange målrettede Axon restitution undersøgelser kun fokusere på den ene eller den anden vej, med formålet at vellykket genopretning af enten ville være af enorm gavn for patienterne. I denne artikel præsenterer vi en protokol, som anvender en direkte dorsalrodsganglier (DRG) injektion med en viral vektor og en samtidig dorsale knusningsbeskadigelse i den nedre cervikale rygmarv fra en voksen rotte som en model til at studere sensorisk axon regeneration.
DRG sensoriske neuroner er ansvarlig for at formidle sensorisk information, såsom taktil fornemmelse og smerte, fra periferien til CNS. De lange axonale projektioner af sensoriske neuroner i rygmarven tjene som en god model til at studere lange afstande axon regeneration. Hertil kommer, som gnavere kan overleve en sensorisk vej læsion såsom en dorsale crush skade med minimale velfærd komplikationer, kan forskerne studere CNS Axon regenerering uden behov for helt læsion rygmarven. En firedobbelt C5 - C8 (cervikal level 5-8) dorsale knusningsbeskadigelse har vist sig at være en nyttig model til forpote deafferentiering 2. Derudover en dorsale knusningsbeskadigelse tilvejebringer en "renere" model til at studere axon regeneration end en direkte rygmarvsskader, fordi den er ukompliceret af andre faktorer såsom glia ardannelse.
Anvendelsen af virale genterapi at omprogrammere neuroner i en regenerativ tilstand i stigende grad blevet betragtet som en lovende strategi behandling for mange neurologiske tilstande 3. Undersøgelser har vist anvendelsen af en adenoassocieret virus (AAV) vektor, der bærer transgenet af en vækstfremmende protein kan opnå robust axon regeneration med adfærdsmæssige genvinding 4, 5, 6. Den tilsyneladende lave patogenicitet AAV i at fremkalde et immunrespons og evnen til at transducere ikke-delende celler, såsom neuroner, gørdet den optimale vektor til genterapi. Derudover er rekombinante AAV formular til terapi. I denne form er det ude af stand til at integrere dets virale genom i værtsgenomet 7, hvilket reducerer risikoen for insertionsmutagenese sammenlignet med andre virale vektorer, såsom lentivirus. Dette gør AAV et sikkert valg for genterapianvendelser.
Som DRG indeholder cellelegemer af sensoriske neuroner, er det den mest passende anatomisk mål for virusadministration til genterapi for at studere og / eller fremme sensorisk axon regeneration. I en undersøgelse, der sammenligner forskellige AAV-serotyper og lentivirus blev AAV serotype 5 (AAV5) vist sig at være de mest effektive i transduktion DRG-neuroner over et tidsforløb på mindst 12 uger, når det injiceres direkte i DRG 8. Yderligere kan AAV opnå mere end 40% transduktionseffektivitet, transduktion alle DRG neuronale undertyper, såsom neurofilament stor diameter 200 kDa(NF200) -positive neuroner og den lille diameter calcitonin gen-relateret peptid (CGRP) - eller isolectin b4 (IB4) af positive neuroner, 4, 8.
Som den kirurgiske procedure af DRG injektion og dorsale knuse skade er ekstremt invasiv og delikat, mener vi, at denne artikel vil hjælpe nye brugere til at lære den procedure i en meget effektiv måde. I denne artikel, vi viser repræsentative resultater fra voksne rotter fire uger efter injektionen af en kontrol virus AAV5-GFP (grønt fluorescerende protein) i C6 - C7 DRG'er med en samtidig C5 - C8 dorsale knusningslæsion. Denne model er specielt velegnet til forskere, der undersøger anvendelsen af viral genterapi til at fremme sensorisk axon regeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de følgende procedurer dyr blev gennemført i overensstemmelse med Det Forenede Kongerige Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986. Hvis uvant med disse procedurer, skal du tjekke med lokale / nationale bestemmelser og søge dyrlæge, før du starter protokollen.
1. Valg af en egnet stamme af dyr
BEMÆRK: En dorsale crush skade resulterer i tab af følelse og pote deafferentiering. Almindelige bivirkninger af forepaw deafferentiering kan omfatte over-grooming, selv-lemlæstelse, og pote autotomi.
- Opnå dyr for proceduren.
BEMÆRK: For rotter, de mere aktive stammer, såsom Lister-Hooded og Wistar, har en højere forekomst af pote autotomi efter deafferentiering sammenlignet med de mere føjelige stammer, såsom Lewis og Sprague-Dawley. Hvis det er muligt, bør den mest føjelige stammen, Lewis, altid overvejes først. Bør en særlig aktiv stamme være nødvendigt for eksperimentet som følge af genetisk mNDRING eller specifikke adfærdsmæssige krav til vurdering, bør dyrlægebehandling være på plads for at imødegå de forventede negative virkninger.
2. Forberedelse af virus til injektion
ADVARSEL: Håndter alle vira i overensstemmelse med biologiske og laboratorie sikkerhedsbestemmelser.
- Fortynde eller koncentrere viruset til en titer på 2 x 10 12 genomkopi (GC) / ml efter individuel virus emballage protokoller 9.
BEMÆRK: Her blev viruset fortyndet i Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (D-PBS) med 5% sucrose. Titeren kan skal optimeres afhængig af typen af virus, promotoren, konstruere størrelse, og målrettet celletype. - Valgfrit: Tilføj 1% farvet farvestof (fx Fast Green) for virus løsning til nem visualisering af injektionen senere. Bland løsningen meget forsigtigt.
- Opløsningen opbevares på is i umiddelbar anvendelse (inden for 4 timer) eller i en -80 ° C fryser i langtids opbevaring.
3. Udførelse af Præoperativ Fremstilling af Animal
BEMÆRK: På grund af den ekstreme invasionsevne af operationen, bør aseptiske teknikker anvendes på alle tidspunkter.
- Forberede og sterilisere alle kirurgiske værktøjer og spinal stereotaktisk ramme forud for start af operationen. For eksempel sterilisere værktøjerne i en autoklave ved 134 ° C. Brug en frisk sæt steriliserede værktøjer for hvert dyr.
- Bedøve dyret. Bekræft ordentlig bedøvelse ved at knibe poten til at teste for tilbagetrækning refleks eller ved at trykke på hornhinden for øjenlåget refleks.
- For voksne rotter under anvendelse inhalationsanæstesi såsom isofluran, anvendes 4% isofluran i 2,0 L / min oxygen til induktion. For vedligeholdelse i hele operationen, bruge 2 - 3 i% isofluran i 1,5 l / minut oxygen, variation af isofluran koncentrationen i henhold til vejrtrækningsmønstret af dyret for at undgå over- eller underdosering.
- Påce dyret oprindeligt bedøvet, registrerer den præoperative vægt af dyret.
- For den cervikale DRG injektion, barbere pelsen på halsen fra mellem ørerne til bare distalt for scapulae. Desinficer det barberede område med en antiseptisk produkt.
- Injicere 2 ml saltvand subkutant på flanken af dyret, sammen med en passende dosis af analgetikum (fx 5 mg / kg carprofen) og antibiotika (fx 5 mg / kg enrofloxacin).
- Anvend øjensalve til både øjne for at forhindre hornhindens tørring under proceduren.
- Fortsæt til kirurgi på en spinal stereotaktisk ramme med en varmepude ved 37 ° C placeret under dyret.
4. Injektion DRG og Udførelse af en Dorsal Root Crush Skade
BEMÆRK: Dette er en yderst delikat operation. Det er tilrådeligt at øve på et par døde dyr først at blive fortrolig med anatomi før videre til levende dyr kirurgi.
- Locate de fremtrædende C2 og T2 torntappe over huden. Foretage en hudincision mellem C2 og T2 torntappe med et nr.10 skalpelblad (når huden bliver åbnet, vil en hvid, fibrøst væv midterlinjen være synlig på det første lag af muskel, det første lag af muskel har en " geléagtig" tekstur).
- Lav en tilsvarende størrelse snit på det første lag af muskel langs den hvide midterlinjen ved hjælp af en skalpel. Må ikke gå ud over den fremtrædende T2 torntappen, da der er et stort arteriel gren fra aorta descendens ligger i nærheden af der.
BEMÆRK: Kraftig blødning kan forekomme overalt fra dette trin og fremefter. Altid stoppe blødningen og fjern blodet ved anvendelse af steriliserede vatpinde eller kirurgiske absorberbare svampe for at tillade klar visualisering på alle tidspunkter. Fortsætter med proceduren "blindt" kan resultere i uønsket skade på rygmarven, DRG, eller dorsale, hvilket fører til uventede bivirkninger i dyret senere. - Kørførste lag af muskel under anvendelse af to retraktorer, en tilføjet rostralt og en kaudalt; det andet lag af muskel, med et stribet udseende, skal være synlig.
- Lokalisere midterlinjen af det andet lag af muskel (hvor kan observeres to langsgående muskler forbundet med en tynd, membranøs væv). Dissekere membranøs væv anvendelse af et par mikrosakse at adskille de to langsgående muskler. Undgå at bruge en skalpel hvis det er muligt, da dette kan resultere i unødvendig muskelskade og blødning.
- Juster retraktorer overensstemmelse hermed for at blotlægge det tredje lag af tynd muskel dækker rygsøjlen. Torntappene kan mærkes ved let berøring med en tang over det tredje lag af muskel.
- Lave et lille snit på det tredje lag af muskel under anvendelse mikrosakse og forsigtigt skrabe musklerne fra knoglen ved hjælp af en curette eller skalpel i en sideværts måde til klart eksponere hvirvlerne. Hvis det er nødvendigt, skære nogle af musklen eller senen væk for at gøre Laminectomy lettere.
- At blotlægge venstre C5 - C8 DRG'er, udføre en venstre hemi-laminektomi på C4 - T1 ryghvirvler ved omhyggeligt at fjerne en del af den tynde plade og stilken anvendelse af et par fine rongeurs. DRG ligger i nærheden af de tværgående foramen af ryghvirvler.
BEMÆRK: C3 - C7 ryghvirvler har ikke en fremtrædende spinosus proces. C5 DRG ligger mellem C4 og C5 ryghvirvlerne, C6 DRG er mellem C5 og C6 ryghvirvler, og så videre, mens C8 DRG er mellem C7 og T1 ryghvirvler. Der er ingen C8 ryghvirvel, på trods af tilstedeværelsen af en C8 DRG og en C8 rygmarven segment. - Når nok af DRG har været udsat for injektion, forberede sprøjten ved at placere virus fyldt mikroliter sprøjte forsynet med en specialfremstillet, 33-gauge stump nål på sprøjteholderen stereotaktisk. Før injektion anvendes en 30-gauge skrå nål for at lave en lille overfladisk åbning på hver af de målrettede DRG at bistå ved indsættelse af injektionsnålen.
- Indsæt 33-gauge nålen ind i midten af DRG ved at dreje skruerne forsigtigt for at justere stereotaksiske koordinater. Ikke over-indsætte nålen, da dette kan medføre væske til at sive ud fra den ventrale side af DRG. Skulle der opstå lækage, straks justere placeringen af nålen.
BEMÆRK: De numeriske stereotaksiske koordinater bruges ikke; men det er nyttigt at anvende rammen til at holde nålen til injektion. - Injicer 1 pi af virus i hver DRG 0.2 pl / min under anvendelse af en infusion sprøjtepumpe. Vent i yderligere tre minutter før nålen trækkes. Under injektionen, vil DRG langsomt skifter farve, hvis virussen opløsning indeholder et farvestof.
- For at udføre en samtidig C5 - C8 dorsale knusningslæsion, knuse hver rod tre gange i 10 s hver anvendelse af et par fine spids pincet (Bonn Micro), modstående ender tangen fuldstændigt; en hvid streg i vævet skal vises på crush site. Må ikke gå dybere end nødvendigt med den kræfeps, da dette kan forårsage skade på den ventrale rod.
- Efter injektion og / eller knuse, skal du sørge for, at der ikke er nogen blødning eller små stykker af knoglefragmenter tilbage på incisionssted, før du lukker op dyret. Hvis man foretrækker, skal du placere et lille stykke kirurgisk absorberbar svamp på toppen af den eksponerede rygmarv og DRG.
- Tillad det tredje lag af musklen til at trække tilbage naturligt på rygraden uden suturering. Løst sutur de to langsgående muskler på det andet lag (≈ 3 afbrudte suturer) med absorberbart 6-0 suturmateriale. Suturere det første lag af muskel (≈ 5 afbrudte suturer) med absorberbart 6-0 suturmateriale.
- Suturere huden med absorberbart 5-0 suturmateriale (≈ 10 afbrudte suturer).
BEMÆRK: Sørg for, at suturerne ikke sidder for stramt. Udbuling af huden er et tegn på overspænding og kan forårsage ubehag for dyret. - Hvis kraftig blødning under operationen, subkutant injicere 1 - 2 udml saltvand til at genopbygge tab af væske fra dyret som er tilladt i henhold lokale bestemmelser.
- Tilvejebringe spiselige fugtgivende gel og så dyret kan komme sig helt fra anæstesi, udføre regelmæssig overvågning i mindst 1 time før vender dyret tilbage til tilbageholdelsesområdet.
- Holde dyret i mindst 3 uger for optimal transgenekspression at vurdere sensorisk axon regeneration.
5. Udførelse af postoperativ pleje af dyr
- Give mad mask og blød bomuld strøelse til dyr i den første uge efter operationen. Hvis det er nødvendigt, administrere yderligere doser af smertestillende og antibiotika til støtte med opsvinget i overensstemmelse med de lokale / nationale bestemmelser og udstedelse rådgivning.
- Fjern suturerne på huden efter 7 - 10 dage.
BEMÆRK: Almindelige bivirkninger af kirurgi omfatter dannelsen af seroma eller hæmatom på incisionssted, ridse mærker på huden på grund af kløe forårsaget afde interne absorberbare suturer, subtile sensoriske eller i bevægelsen underskud, og tegn på selv-lemlæstelse på deafferenterede pote efter dorsale crush skade. For eventuelle velfærdsproblemer, der er væsentligt mere alvorlige end forventet, søge øjeblikkelig veterinær rådgivning.
6. Udførelse af Anterograd CTB Injection til axonale Tracing
BEMÆRK: Det anbefales at udføre kolera toksin B-subunit (CTB) axonal sporing en uge før væv samling.
- Forberede 1% CTB opløsning som pr producentens anvisninger.
- Valgfrit: Tilføj 1% farvet farvestof til løsningen til nem visualisering af injektionen senere. Bland løsningen meget forsigtigt.
- Bedøver dyret (se trin 3.2.1) og stabilisere venstre forpote ved at tape benet til bordet.
- Manuelt og langsomt injicere 1 pi af 1% CTB subkutant ind i centrum af den glatte trædepude og fire cifre ved anvendelse af en mikroliter sprøjte forsynet with et skræddersyet, 33-gauge kort kanyle.
BEMÆRK: Før injektion, hjælper det at først bruge en 30-gauge skrå nål for at lave en lille overfladisk åbning på huden, som bistår med indsættelse af injektionsnålen. - Lad dyret at komme sig helt fra bedøvelsen før han vendte tilbage dyret til den bedrift område.
7. Indsamling Tissue
- At indsamle virus-injicerede DRG og rygmarv for immunhistokemi, administrere en overdosis af bedøvelsesmiddel og transkardialt perfuse dyret med phosphatbufret saltvand efterfulgt af kold 4% paraformaldehyd. udføre omhyggeligt en fuld laminektomi på rygsøjlen til at indsamle de fikseret væv under et mikroskop. Fortsæt med vævspræparat, sektionering og forarbejdning som krævet til analyse 4, 5, 6.
BEMÆRK: udvundne incisionssted skulle fremgå, som observeret ved nærvær af sbil væv. - Alternativt at indsamle virus-injicerede DRG til in vitro kultur, ofre dyret humant med en godkendt metode, såsom en stigende koncentration af carbondioxid. dissekere omhyggeligt DRG under et mikroskop, sikrer aseptiske betingelser når det er muligt. Fortsætte med vævskultur som ønsket 4, 5, 6, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en repræsentation, er en tværgående rygmarv sektion med vedlagte DRG anføres for at vise effektiviteten af denne protokol i transduktion DRG-neuroner og sporing sensoriske axoner i rygmarven fire uger efter injektion af et kontrol-virus, AAV5-GFP, direkte ind i C7 DRG uden dorsale knusningsbeskadigelse (figur 1A). Axoner i både den dorsale søjle og det dorsale horn i rygmarven udtrykke GFP (figur 1B), samt cellelegemer og axoner inden den injicerede DRG (figur 1C). Yderligere anatomisk analyse af cuneate kerne, den sensoriske Axon terminal i hjernestammen, afslører positiv anterograd CTB sporing (figur 1D).
Når DRG injektionen udføres sideløbende med en komplet C5-C8 dorsale knusningslæsion, ingen GFP-positive axoner i rygmarven eller CTB-positive terminals i cuneate kernen observeres (figur 2A). Det er dog værd at påpege, at axotomiserede sensoriske axoner stadig kan regenerere op til den dorsale rod indgangszonen i en fuldstændig knust dorsale, hvilket er en PNS miljø, men ikke ud i rygmarven 4, 5 (figur 2A). I tilfælde af at den injicerede virus indeholder transgenet af en potentiel vækstfremmende protein kan tilstedeværelsen af mærkede axoner i rygmarven udgør enten regenerering eller en ufuldstændig dorsale knusningsbeskadigelse (figur 2B). At skelne mellem disse to udfald, bør analyseres CTB axonal sporing i cuneate kernen. Tilstedeværelsen af CTB-positive terminaler i cuneate kerne fremhæver sandsynligheden for en ufuldstændig skade (Figur 2C), mens fraværet af CTB-positive terminaler tyder delvis regenerering ind i rygmarven, som regenererede axonersandsynligvis stand til at vokse hele afstanden til det cuneate kernen (figur 2D). Til dato har succes sensoriske Axon regenerering til cuneate kerne meste blevet rapporteret i tilfælde med høj cervikal skade 11, 12 eller med anvendelsen af neurotrophiner 13, 14. Alle dyr, som viser tegn på ufuldstændig skade bør udelukkes fra Axon regenerering studier.
Figur 1: DRG Injektion Uden Dorsal Root knusningsbeskadigelse. (AC) Rygmarven snit, der viser GFP-positive axoner i rygmarven (A), herunder den dorsale søjle og dorsale horn (B) og cellelegemer i DRG (C) fire uger efter injektionen af AAV5-GFP. <strong> (D) CTB-positive sensoriske axonterminaler i cuneate kerne en uge efter CTB injektion. Skalalinjen er 650 um (AC) og 250 um (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vurdering Dorsal Root knusningsbeskadigelse og Axon Regeneration. (A) en fuldstændig dorsale knusningsbeskadigelse resulterer i ingen mærkede axoner i rygmarven eller CTB-positive axonterminaler i cuneate kernen. Axotomiserede sensoriske axoner kan regenerere op til den dorsale rod indgangszonen, men ikke ud i rygmarven. (BD) Tilstedeværelsen af mærkede axoner i rygmarven betegner enten ufuldstændig skade eller regeneratipå (B). Med yderligere analyse, tilstedeværelsen af CTB-positive terminaler i cuneate kerne antyder ufuldstændig skade (C), mens deres fravær antyder fuldstændig skade og potentielt delvis regenerering i rygmarven (D). Skalalinjen er 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en trin-for-trin guide til at udføre en DRG injektion og dorsale knusningsbeskadigelse i den nedre cervikale rygmarv fra en voksen rotte. Da dette er en yderst invasiv og delikat kirurgi, anbefaler vi, at alle potentielle brugere opnå tilstrækkelig uddannelse og praksis, før videre til levende dyr kirurgi. Brugerne bør være bekendt ikke kun med rygmarven anatomi, men også med de omgivende muskelvæv, vertebrale knogle struktur og kar. Ideelt set bør en kompetent bruger være i stand til at udføre proceduren med minimal skade på det omgivende væv, udfører en ren laminektomi ved at fjerne en del af ryghvirvlerne uden at fremkalde nogen skade på rygmarven. Som det fremgår af rygmarvsskade, kan en lille læsion i rygmarven har en udbredt skadelig effekt på hele nervesystemet. Desuden dyr, der har undergået en "ren" kirurgi er mindre tilbøjelige til at lide af uventet post-operative komplikationer og velfærdsområdet og er derfor mindre tilbøjelige til at have at aflive det ønskede eksperimentelle tidspunkt.
For at administrere virus i nervesystemet, der er et par mulige indgivelsesveje: intravenøse 15, intraperitoneal 16, intratekal 17, eller direkte injektion i målet 4, 8. Skønt intravenøse og intraperitoneale injektioner er relativt ikke-invasiv, kan passage af blod-hjerne-barrieren være et problem 18, og disse ruter resultere i ikke-specifik transduktion, hvilket ikke ville være nyttige i en specialiseret Axon regenerering undersøgelse. Tilsvarende for intratekal injektion i subarachnoidealrummet, en mere invasiv administrativ rute, mange neuronale og ikke-neuronale celletyper i CNS kan transduceres, potentielt frembringe uspecifik eller off-udsigt til rentenedsættelsert virkninger. Således direkte injektion af virus ind i DRG er en gunstig mulighed og vil sandsynligvis resultere i en meget højere transduktionseffektivitet end andre metoder. Den største ulempe ved denne løsning er imidlertid, invasiviteten af den kirurgiske procedure, som kræver specialiseret uddannelse.
Når brugerne har mestret de nødvendige kirurgiske færdigheder, denne protokol giver en stor grad af fleksibilitet. I en axon regeneration undersøgelse kan dyr undersøgt i kombination med andre teknikker, såsom in vivo elektrofysiologi og sensorisk-motoriske adfærdsmæssige forsøg, mens det indsamlede væv kan anvendes til anatomisk analyse eller vævskultur 4. En kombination af disse teknikker, med forskellige eksperimentelle tidspunkter, for eksempel, kan anvendes til at undersøge udviklingen af degeneration eller regenerering af forskellige fibre undertyper, såsom NF200, CGRP, og IB4 efter knusningslæsion 4. Afhængig af den eksperimentelle requirements, den ene eller den anden af de præsenterede procedurer kan udføres alene. For eksempel kan DRG injektion alene anvendes til axonale sporingsforanstaltninger eksperimenter, mens kan anvendes dorsale knusningsbeskadigelse alene i nogen undersøgelser, hvor der kræves forpote deafferentiering. Desuden kan brugerne også variere virustype og transgenprodukt til injektion, til den nøjagtige DRG skal injiceres, og den nøjagtige dorsale til skade. Givet fald kan celletransplantation eller farmakologisk indgivelse i DRG også udføres ved anvendelse af denne protokol. Med udgangspunkt i erhvervede kirurgiske færdigheder, kan en erfaren bruger videre til andre teknikker, såsom DRG injektion i lænden (fx i L3 - L5 at vurdere bagben funktion) 19 eller dorsale kolonne knuse skade, for yderligere at studere rygmarv funktion 5.
Afslutningsvis mener vi DRG injektion og dorsale knuse skade at være en nyttig model til at studere sensorisk Axon regeneration. På trods af krav om specialiseret uddannelse til at udføre den invasive kirurgiske procedure, protokollen er fleksibel, og potentielle brugere kan ændre mange dele til at imødekomme deres eksperimentelle krav. Disse procedurer kan tjene som grundlag for dem, der søger en egnet dyremodel for sensoriske Axon restitution undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Christopher og Dana Reeve Foundation, Medical Research Council, Det Europæiske Forskningsråd ECMneuro, og Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Vi vil gerne udtrykke vores dybeste taknemmelighed til Heleen Merel van 't Spijker og Justyna Barratt for deres tekniske bistand under indspilningen. Vi vil gerne takke Dr. Elizabeth Moloney og professor Joost Verhaagen (Holland institut for Neurovidenskab) for at bistå i AAV produktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
