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Neuroscience

पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट संवेदी अक्षतंतु उत्थान के लिए एक मॉडल के रूप में चोट क्रश

Published: May 3, 2017 doi: 10.3791/55535
Automatic Translation
1, 1, 2,3
1John van Geest Center for Brain Repair, University of Cambridge, 2School of Medicine, University of St. Andrews, 3Department of Biological Sciences, University of Southampton

Introduction

तंत्रिका तंत्र की चोट के बाद अक्षतंतु उत्थान प्राप्त करना एक चुनौती भरा काम 1 है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में अक्षतंतु उत्थान की विफलता का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं तंत्रिका चोट मॉडल की अधिकता का इस्तेमाल किया है। सीएनएस के क्षेत्रों अलग रूप में, यह अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए एक संरचनात्मक रूप से उचित मॉडल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। उचित मॉडल का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने एक विशिष्ट चोट की गंभीरता, ब्याज की न्यूरोनल सेल प्रकार के आधार पर उपचार, और उत्थान का आकलन करने के लिए वांछित रीढ़ की हड्डी संबंधी मार्ग तैयार कर सकते हैं, के रूप में एक "एक के लिए सभी" उपचार रणनीति का विरोध किया।

रीढ़ की हड्डी की चोट, उदाहरण के लिए, सबसे दुर्बल लक्षण सनसनी और हरकत के नुकसान से स्टेम। संवेदना में कमी, आरोही संवेदी रास्ते क्षति के कारण होता है, जबकि हरकत की हानि उतरते मोटर रास्ते को नुकसान के कारण होता है है। इन tw के बीच सेलुलर और संरचनात्मक मतभेद के कारणओ रास्ते, कई लक्षित अक्षतंतु उत्थान के अध्ययन केवल तर्क यह है कि या तो के सफल वसूली रोगियों को जबरदस्त लाभ का हो जाएगा के साथ एक या अन्य मार्ग पर ध्यान केंद्रित,। इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटोकॉल एक वायरल वेक्टर और संवेदी अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में एक वयस्क चूहे के निचले गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में एक समवर्ती पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के साथ एक सीधा पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) इंजेक्शन का उपयोग करता है प्रस्तुत करते हैं।

डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स, इस तरह के स्पर्श सनसनी और दर्द के रूप में संवेदी जानकारी, प्रसारण सीएनएस के लिए परिधि से लिए जिम्मेदार हैं। रीढ़ की हड्डी में संवेदी न्यूरॉन्स की लंबी axonal अनुमानों लंबी दूरी की अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। इसके अलावा, के रूप में इस तरह के कम से कम कृन्तकों कल्याण जटिलताओं के साथ एक पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के रूप में एक संवेदी मार्ग घाव जीवित रह सकते हैं, शोधकर्ताओं सीएनएस अक्षतंतु उत्थान पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी घाव की आवश्यकता के बिना अध्ययन कर सकते हैं। एक चौगुनी सी 5 - सी 8 (ग्रीवा एलevel 5 - 8) पृष्ठीय रूट कुचलने चोट forepaw deafferentation 2 के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, एक पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के लिए एक सीधा रीढ़ की हड्डी की चोट से अक्षतंतु उत्थान अध्ययन करने के लिए है क्योंकि यह इस तरह के glial दाग गठन के रूप में अन्य कारकों से गैर है "स्वच्छ" मॉडल उपलब्ध कराता है।

वायरल जीन थेरेपी का उपयोग एक पुनर्योजी राज्य में न्यूरॉन्स रिप्रोग्राम तेजी से कई स्नायविक स्थिति 3 के लिए एक आशाजनक उपचार रणनीति के रूप में माना गया है। अध्ययन एक एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) एक विकास को बढ़ावा देने के प्रोटीन की ट्रांस्जीन ले जाने व्यवहार वसूली 4, 5, 6 के साथ मजबूत अक्षतंतु उत्थान को प्राप्त कर सकते वेक्टर के आवेदन से पता चला है। एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में गैर विभाजित होने वाली कोशिकाओं, transduce करने की क्षमता eliciting में एएवी के स्पष्ट कम pathogenicity, बनानायह जीन थेरेपी के लिए इष्टतम वेक्टर। साथ ही, रीकॉम्बीनैंट एएवी प्रपत्र उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है। इस रूप में, यह, मेजबान जीनोम 7 में अपने वायरल जीनोम को एकीकृत इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस के जोखिम को कम ऐसे lentivirus के रूप में अन्य वायरल वाहक के की तुलना में में असमर्थ है। यह एएवी जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक सुरक्षित विकल्प बनाता है।

एक DRG संवेदी न्यूरॉन्स की सेल शरीर होता है, यह अध्ययन और / या संवेदी अक्षतंतु उत्थान को बढ़ावा देने के जीन थेरेपी के लिए वायरस के प्रशासन के लिए सबसे उपयुक्त संरचनात्मक लक्ष्य है। विभिन्न एएवी सीरमप्रकारों और lentivirus की तुलना एक अध्ययन में, एएवी सीरोटाइप 5 (AAV5) कम से कम 12 सप्ताह के एक समय पाठ्यक्रम पर DRG न्यूरॉन्स transducing जब डीआरजी 8 में सीधे इंजेक्ट में सबसे कुशल होना दिखाया गया था। साथ ही, एएवी, 40% से अधिक पारगमन दक्षता हासिल कर सकते हैं इस तरह के बड़े व्यास neurofilament 200 केडीए के रूप में सभी डीआरजी न्यूरोनल उपप्रकार, transducing(NF200) पॉजिटिव न्यूरॉन्स और छोटे व्यास कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP) - या isolectin B4 (IB4) पॉजिटिव न्यूरॉन्स 4, 8।

डीआरजी इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट की शल्य प्रक्रिया के रूप में बेहद आक्रामक और नाजुक है, हमें विश्वास है कि इस लेख नए उपयोगकर्ताओं एक बहुत ही कुशल तरीके से प्रक्रिया जानने के लिए मदद मिलेगी। सी 8 पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट - एक समवर्ती सी 5 के साथ सी 7 DRGs - इस अनुच्छेद में, हम वयस्क चूहों चार सप्ताह एक नियंत्रण वायरस AAV5-GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के इंजेक्शन सी 6 में के बाद से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। यह मॉडल शोधकर्ताओं जो वायरल जीन थेरेपी के उपयोग की जांच कर रहे संवेदी अक्षतंतु उत्थान को बढ़ावा देने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।

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Protocol

सभी निम्नलिखित पशु प्रक्रियाओं यूनाइटेड किंगडम पशु के अनुसार (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 में इन प्रक्रियाओं के साथ अपरिचित हैं में आयोजित की गई, स्थानीय / राष्ट्रीय नियमों के साथ की जाँच करें और प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले पशु चिकित्सा सलाह लेनी कृपया।

1. पशु का एक उपयुक्त तनाव का चयन

नोट: एक पृष्ठीय रूट सनसनी और पंजा deafferentation के नुकसान में कुचलने की चोट का परिणाम है। forepaw deafferentation की आम प्रतिकूल प्रभाव ओवर-संवारने, आत्म विकृति, और पंजा autotomy शामिल कर सकते हैं।

  1. प्रक्रिया के लिए जानवरों प्राप्त करें।
    नोट: चूहों के लिए, ऐसे लिस्टर-Hooded और Wistar के रूप में और अधिक सक्रिय तनाव,, इस तरह के लुईस और Sprague-Dawley रूप में और अधिक विनम्र उपभेदों, की तुलना में deafferentation के बाद पंजा autotomy के एक उच्च घटना है। यदि संभव हो, सबसे विनम्र तनाव, लुईस, हमेशा पहले विचार किया जाना चाहिए। एक विशेष रूप से सक्रिय तनाव आनुवंशिक मीटर की वजह से प्रयोग के लिए आवश्यक होना चाहिएodification या विशिष्ट व्यवहार मूल्यांकन आवश्यकताओं, पशु चिकित्सा उपचार जगह की उम्मीद प्रतिकूल प्रभाव को संबोधित करने में होना चाहिए।

2. इंजेक्शन के लिए तैयार कर रहा है वायरस

चेतावनी: जैविक और प्रयोगशाला सुरक्षा नियमों के अनुसार सभी वायरस संभाल।

  1. पतला या 2 एक्स 10 से 12 जीनोम प्रतिलिपि (जीसी) के एक अनुमापांक वायरस ध्यान केंद्रित / एमएल व्यक्ति वायरस पैकेजिंग प्रोटोकॉल 9 निम्नलिखित।
    नोट: यहाँ, वायरस Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (डी-पीबीएस) 5% sucrose के साथ में पतला था। अनुमापांक, वायरस, प्रमोटर के प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना है आकार का निर्माण, और कोशिका प्रकार लक्षित कर सकते हैं।
  2. वैकल्पिक: बाद में इंजेक्शन के लिए आसान दृश्य के लिए वायरस समाधान के लिए रंग का डाई (जैसे, फास्ट ग्रीन) जोड़े 1%। बहुत धीरे समाधान मिक्स।
  3. तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर समाधान (4 घंटे के भीतर) रखें या लंबे समय के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर मेंअवधि के भंडारण।

3. पशु के शल्यक्रिया तैयारी प्रदर्शन

नोट: सर्जरी के चरम invasiveness के कारण, अपूतित तकनीक हर समय किया जाना चाहिए।

  1. तैयार करें और सभी सर्जिकल उपकरण और सर्जरी शुरू करने से पहले रीढ़ की stereotaxic फ्रेम नसबंदी। उदाहरण के लिए, 134 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव में उपकरण नसबंदी। प्रत्येक जानवर के लिए निष्फल उपकरणों की एक ताजा सेट का उपयोग करें।
  2. पशु anesthetize। वापसी पलटा के लिए या पलक पलटा के लिए कॉर्निया को छूकर परीक्षण करने के लिए पंजा पिंच करके उचित anesthetization की पुष्टि करें।
    1. इस तरह के isoflurane के रूप में साँस लेना संज्ञाहरण का उपयोग वयस्क चूहों के लिए, 2.0 एल में 4 isoflurane% का उपयोग / शामिल करने के लिए ऑक्सीजन की मि। जानवर की सांस लेने पैटर्न के अनुसार, 1.5 एल / ऑक्सीजन की मिनट में 3% isoflurane isoflurane एकाग्रता बदलती अधिक या कम-खुराक से बचने के लिए - सर्जरी भर रखरखाव के लिए, 2 का उपयोग करें।
  3. परसीई पशु शुरू में संज्ञाहरण है, जानवर के पूर्व शल्य चिकित्सा वजन रिकॉर्ड है।
  4. ग्रीवा डीआरजी इंजेक्शन के लिए, बंद फर गर्दन पर कान के बीच से सिर्फ बाहर का करने के लिए scapulae के लिए दाढ़ी। एक एंटीसेप्टिक उत्पाद के साथ मुंडा क्षेत्र कीटाणुरहित।
  5. , पशु की दिशा में खारा subcutaneously के 2 एमएल इंजेक्षन एक उपयुक्त एनाल्जेसिक की खुराक (जैसे, 5 मिलीग्राम / किग्रा carprofen) और एंटीबायोटिक (जैसे, 5 मिलीग्राम / किग्रा Enrofloxacin) के साथ।
  6. दोनों आंखों को नेत्र मरहम लागू प्रक्रिया के दौरान कॉर्निया सुखाने को रोकने के लिए।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग पैड पशु नीचे रखा के साथ एक रीढ़ की stereotaxic फ्रेम पर सर्जरी करने के लिए आगे बढ़ें।

4. डीआरजी इंजेक्शन और एक पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के प्रदर्शन

नोट: यह एक बहुत ही नाजुक सर्जरी है। यह पशु शल्य चिकित्सा जीने के लिए आगे बढ़ने से पहले शारीरिक रचना के साथ परिचित करने के लिए पहले कुछ मरे हुए जानवरों पर अभ्यास करने के लिए सलाह दी जाती है।

  1. एलocate त्वचा पर प्रमुख सी 2 और टी 2 spinous प्रक्रियाओं। सी 2 और टी 2 एक No.10 स्केलपेल ब्लेड (एक बार त्वचा को खोला जाता है, एक सफेद, रेशेदार ऊतक मध्य रेखा मांसपेशी की पहली परत पर दिखाई देना चाहिए साथ spinous प्रक्रियाओं के बीच एक त्वचा चीरा बनाने, मांसपेशियों की पहली परत है एक " जेली की तरह "बनावट)।
  2. सफेद मध्य रेखा एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर के साथ मांसपेशियों की पहली परत पर एक समान आकार चीरा बनाओ। प्रमुख टी 2 spinous प्रक्रिया से परे जाना नहीं है, वहाँ के रूप में उतरते वहाँ के पास स्थित महाधमनी से एक प्रमुख धमनी शाखा है।
    ध्यान दें: भारी खून बह रहा है इस कदम के बाद से कहीं भी हो सकता है। हमेशा रक्तस्राव को रोकने और निष्फल कपास की कलियों या सर्जिकल अवशोषित स्पंज का उपयोग कर हर समय स्पष्ट दृश्य की अनुमति देने के द्वारा रक्त को हटा दें। प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने "आँख बंद करके" रीढ़ की हड्डी, डीआरजी, या पृष्ठीय रूट करने के लिए अवांछित नुकसान हो सकता है, पर बाद में पशु में अप्रत्याशित प्रतिकूल प्रभाव के लिए अग्रणी।
  3. वापस लेनादो रिट्रैक्टर, एक rostrally रखा जाता है और एक दुमदारी का उपयोग कर मांसपेशियों की पहली परत; मांसपेशी की दूसरी परत, एक धारीदार उपस्थिति के साथ, दिखाई देना चाहिए।
  4. मांसपेशी (जहां दो अनुदैर्ध्य मांसपेशियों एक पतली, झिल्लीदार ऊतक से जुड़े हुए देखा जा सकता है) की दूसरी परत के मध्य रेखा का पता लगाएँ। microscissors के दो अनुदैर्ध्य मांसपेशियों को अलग करने की एक जोड़ी का उपयोग कर झिल्लीदार ऊतक काटना। एक स्केलपेल ब्लेड यदि संभव हो तो प्रयोग करने से बचें के रूप में इस अनावश्यक मांसपेशियों की क्षति और खून बह रहा हो सकता है।
  5. पतली रीढ़ को कवर मांसपेशियों की तीसरी परत बेनकाब करने के लिए तदनुसार रिट्रैक्टर समायोजित करें। spinous प्रक्रियाओं हल्के से मांसपेशियों की तीसरी परत के ऊपर संदंश की एक जोड़ी के साथ स्पर्श करके महसूस किया जा सकता है।
  6. microscissors का उपयोग कर पेशी के तीसरी परत पर एक छोटा सा चीरा बनाने और धीरे एक sideway ढंग से एक curette या छुरी का उपयोग कर स्पष्ट रूप से कशेरुकाओं को बेनकाब करने की हड्डी से मांसपेशियों बंद स्क्रैप। यदि आवश्यक हो, मांसपेशियों या कण्डरा से कुछ दूर कटौती lami बनाने के लिएnectomy आसान।
  7. छोड़ दिया सी 5 का पर्दाफाश करने के लिए - सी 8 DRGs, सी 4 पर एक बाईं अर्ध-laminectomy प्रदर्शन - ध्यान से लामिना का हिस्सा हटाने और डंठल ठीक rongeurs की एक जोड़ी का उपयोग करके टी 1 कशेरुकाओं। डीआरजी कशेरुकाओं के अनुप्रस्थ रंध्र के पास स्थित है।
    नोट: सी 3 - सी 7 कशेरुकाओं एक प्रमुख spinous प्रक्रिया नहीं है। सी 5 डीआरजी C4 और C5 कशेरुकाओं के बीच स्थित है, सी 6 डीआरजी, सी 5 और सी 6 कशेरुकाओं के बीच है, और इतने पर है, जबकि सी 8 डीआरजी सी 7 और टी 1 कशेरुकाओं के बीच है। कोई सी 8 बांस एक सी 8 डीआरजी की उपस्थिति और एक सी 8 रीढ़ की हड्डी खंड के बावजूद नहीं है।
  8. डीआरजी के लिए पर्याप्त एक बार इंजेक्शन के लिए उजागर किया गया है, वायरस से भरे माइक्रोलीटर सिरिंज stereotaxic सिरिंज धारक पर एक विशेष रूप से निर्मित, 33 गेज कुंद सुई के साथ लगे रखकर सिरिंज तैयार करते हैं। इंजेक्शन से पहले, इंजेक्शन की सुई की प्रविष्टि के साथ सहायता के लिए लक्षित डीआरजी में से प्रत्येक पर एक छोटा सा सतही उद्घाटन करने के लिए एक 30 गेज beveled सुई का उपयोग करें।
  9. 33-जी डालेंstereotaxic निर्देशांक समायोजित करने के लिए धीरे घुंडी बदल कर डीआरजी के केन्द्र में auge सुई। सुई ओवर-द न डालें, क्योंकि यह तरल पदार्थ डीआरजी के उदर की ओर से बाहर लीक करने के लिए कारण हो सकता है। हो भी सकती तुरंत सुई की स्थिति को समायोजित रिसाव चाहिए।
    नोट: सांख्यिक stereotaxic निर्देशांक का प्रयोग नहीं किया जाता है; तथापि, यह फ्रेम का उपयोग करने के इंजेक्शन के लिए सुई धारण करने के लिए उपयोगी है।
  10. एक जलसेक सिरिंज पंप का उपयोग कर 0.2 μL / मिनट प्रत्येक डीआरजी में वायरस के 1 μL इंजेक्षन। सुई वापस लेने से पहले एक अतिरिक्त तीन मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन के दौरान, डीआरजी धीरे-धीरे रंग बदल जाएगा, तो वायरस समाधान के लिए एक रंगीन डाई शामिल हैं।
  11. एक समवर्ती सी 5 निष्पादित करने के लिए - सी 8 पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट, प्रत्येक जड़ 10 एस के लिए तीन बार कुचलने प्रत्येक का उपयोग कर ठीक टिप संदंश (बॉन माइक्रो), संदंश पूरी तरह से के सिरों का विरोध करने की एक जोड़ी; ऊतक में एक सफेद लाइन को कुचलने स्थल पर दिखाई देनी चाहिए। गहरी मत जाओ forc साथ आवश्यकता सेइस रूप में ईपीएस, उदर जड़ को नुकसान हो सकता है।
  12. इंजेक्शन और / या कुचलने के बाद, सुनिश्चित करें कि कोई खून बह रहा है या हड्डी के टुकड़े चीरा स्थल पर छोड़ दिया पशु ऊपर बंद करने से पहले के छोटे टुकड़े है कि वहाँ हैं। अगर पसंद किया, उजागर रीढ़ की हड्डी और डीआरजी के शीर्ष पर शल्य अवशोषित स्पंज की एक छोटा सा टुकड़ा रखें।
  13. पेशी के तीसरी परत suturing बिना रीढ़ की हड्डी पर स्वाभाविक रूप से वापस वापस लेना करने की अनुमति दें। शिथिल सीवन दूसरी परत पर दो अनुदैर्ध्य मांसपेशियों अवशोषित 6-0 टांका सामग्री के साथ (≈ 3 टांके बाधित)। पहले (≈ 5 टांके बाधित) अवशोषित 6-0 टांका सामग्री के साथ मांसपेशियों की परत सीवन।
  14. अवशोषित 5-0 टांका सामग्री के साथ त्वचा (≈ 10 टांके बाधित) सीवन।
    ध्यान दें: यह सुनिश्चित करें कि टांके बहुत तंग नहीं हैं। त्वचा का उभड़ा ओवर-कस का एक संकेत है और पशुओं के लिए परेशानी का कारण हो सकता है।
  15. तो भारी खून बह रहा है सर्जरी के दौरान हुई, subcutaneously इंजेक्षन 1 - 2के रूप में स्थानीय नियमों के तहत अनुमति दी नमक की एमएल जानवर से तरल पदार्थ के नुकसान की भरपाई करने के लिए।
  16. खाद्य हाइड्रेटिंग जेल प्रदान करें और पशु पकड़े क्षेत्र के लिए वापस लौटने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए नियमित निगरानी प्रदर्शन, पशु संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं।
  17. इष्टतम ट्रांस्जीन अभिव्यक्ति के लिए कम से कम 3 सप्ताह के लिए पशु रखें संवेदी अक्षतंतु उत्थान का आकलन करने के।

5. प्रदर्शन पशु के पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल

  1. पहले सप्ताह के बाद सर्जरी के दौरान खाद्य मैश और पशुओं के लिए नरम कपास के बिस्तर प्रदान करें। यदि आवश्यक हो, एनाल्जेसिक और एंटीबायोटिक की अतिरिक्त खुराक स्थानीय / राष्ट्रीय विनियमों और पशु चिकित्सा सलाह के अनुसार वसूली के साथ सहायता करने के लिए प्रशासन के।
  2. 10 दिन - 7 के बाद त्वचा पर टांके निकालें।
    नोट: सर्जरी के आम प्रतिकूल प्रभाव की वजह से खुजली के कारण त्वचा पर निशान खरोंच, चीरा स्थल पर seroma या रक्तगुल्म के गठन में शामिलआंतरिक अवशोषित टांके, सूक्ष्म संवेदी या हरकत घाटे, और पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के बाद deafferented पंजा पर आत्म विकृति के लक्षण। किसी भी कल्याण के मुद्दों है कि काफी हद तक उम्मीद से अधिक गंभीर हैं, उनके लिए तत्काल पशु चिकित्सा सलाह लेनी।

6. Axonal ट्रेसिंग के लिए एक अग्रगामी CTB इंजेक्शन प्रदर्शन

नोट: यह हैजा विष बी सबयूनिट (CTB) axonal एक सप्ताह ऊतक संग्रह करने से पहले पता लगाने के प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1% CTB समाधान तैयार करें।
  2. वैकल्पिक: बाद में इंजेक्शन के लिए आसान दृश्य के लिए समाधान के लिए 1% रंग का डाई जोड़ें। बहुत धीरे समाधान मिक्स।
  3. पशु anesthetize (कदम 3.2.1 देखें) और मेज पर अंग टेप से बाईं forepaw को स्थिर।
  4. मैन्युअल रूप से और धीरे धीरे subcutaneously अरोमिल लुटेरा के केन्द्र में 1% CTB का 1 μL इंजेक्षन और एक माइक्रोलीटर सिरिंज फिट वाई का उपयोग कर चार अंकएक कस्टम निर्मित, 33 गेज कम सुई th।
    नोट: इंजेक्शन से पहले, यह पहले त्वचा पर एक छोटा सा सतही उद्घाटन, जो इंजेक्शन की सुई की प्रविष्टि के लिए सहायता करने के लिए एक 30 गेज beveled सुई का उपयोग करने में मदद करता है।
  5. पशु पकड़े क्षेत्र के लिए पशु लौटने से पहले संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक करने की अनुमति दें।

7. एकत्रित ऊतक

  1. इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री के लिए वायरस इंजेक्शन डीआरजी और रीढ़ की हड्डी को इकट्ठा करने के लिए, संवेदनाहारी की अधिक मात्रा के लिए प्रशासन और transcardially फॉस्फेट बफर खारा ठंड 4% paraformaldehyde द्वारा पीछा के साथ पशु छिड़कना। ध्यान से एक खुर्दबीन के नीचे तय ऊतक इकट्ठा करने के लिए रीढ़ की हड्डी पर एक पूर्ण laminectomy प्रदर्शन। ऊतक तैयारी, सेक्शनिंग, और प्रसंस्करण के साथ आगे बढ़ें के रूप में विश्लेषण 4, 5, 6 के लिए की आवश्यकता है।
    नोट: के रूप में की मौजूदगी से मनाया बरामद चीरा साइट, स्पष्ट होना चाहिएकार ऊतक।
  2. वैकल्पिक रूप से, इन विट्रो संस्कृति के लिए वायरस इंजेक्शन डीआरजी इकट्ठा जैसे कार्बन डाइऑक्साइड की बढ़ती एकाग्रता के रूप में एक अनुमोदित विधि के साथ साथ मानवता का पशु बलि, करने के लिए। ध्यान से एक खुर्दबीन के नीचे डीआरजी काटना, अपूतित स्थिति यह सुनिश्चित जब भी संभव हो। 4 वांछित, 5, 6, 10 के रूप में टिशू कल्चर के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

एक प्रतिनिधित्व के रूप में, संलग्न DRG के साथ एक अनुप्रस्थ रीढ़ की हड्डी खंड सी 7 में DRG न्यूरॉन्स transducing और चार सप्ताह के एक नियंत्रण वायरस, AAV5-GFP इंजेक्शन लगाने के बाद रीढ़ की हड्डी में संवेदी एक्सोन अनुरेखण में इस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को दिखाने के लिए, सीधे प्रस्तुत किया है एक पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट (चित्रा 1 ए) के बिना डीआरजी। दोनों पृष्ठीय स्तंभ और रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग में एक्सोन GFP (चित्रा 1 बी), और साथ ही इंजेक्शन डीआरजी (चित्रा 1C) के भीतर सेल निकायों और एक्सोन व्यक्त करते हैं। फन्नी के आकार का नाभिक के अतिरिक्त संरचनात्मक विश्लेषण, मस्तिष्क में संवेदी अक्षतंतु टर्मिनल, का पता चलता है सकारात्मक अग्रगामी CTB अनुरेखण (चित्रा 1 डी)।

जब डीआरजी इंजेक्शन एक पूरी सी 5-सी 8 पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के साथ समवर्ती किया जाता है, रीढ़ की हड्डी या CTB पॉजिटिव टर्मिनल में कोई GFP पॉजिटिव एक्सोनफन्नी के आकार का नाभिक में रों (चित्रा 2A) मनाया जाता है। हालांकि, यह है कि axotomized संवेदी एक्सोन अभी भी एक पूरी तरह से कुचल दिया पृष्ठीय रूट है, जो एक पीएन माहौल है में पृष्ठीय रूट प्रविष्टि क्षेत्र के लिए ऊपर को पुनर्जीवित कर सकते हैं, लेकिन परे नहीं रीढ़ की हड्डी 4, 5 (चित्रा 2 ए) में उनका कहना है लायक है। घटना में है कि इंजेक्शन वायरस एक संभावित वृद्धि को बढ़ावा देने प्रोटीन की ट्रांस्जीन होता है, रीढ़ की हड्डी में लेबल एक्सोन की उपस्थिति या तो उत्थान या एक अधूरी पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट (चित्रा 2 बी) का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इन दो परिणामों के बीच भेदभाव करने के लिए, फन्नी के आकार का नाभिक में CTB axonal ट्रेसिंग विश्लेषण किया जाना चाहिए। फन्नी के आकार का नाभिक में CTB पॉजिटिव टर्मिनलों की उपस्थिति, एक अधूरी चोट (चित्रा 2C) की संभावना पर प्रकाश डाला गया, जबकि CTB पॉजिटिव टर्मिनलों के अभाव रीढ़ की हड्डी में आंशिक उत्थान, पुनर्जीवित एक्सोन के रूप में पता चलता हैसंभावना फन्नी के आकार का नाभिक (चित्रा 2 डी) तक पहुँचने के लिए पूरे दूरी बढ़ने में असमर्थ हैं। तिथि करने के लिए, फन्नी के आकार का नाभिक के सफल संवेदी अक्षतंतु उत्थान ज्यादातर उच्च ग्रीवा चोट 11, 12 के साथ या neurotrophins 13, 14 के आवेदन के साथ मामलों में सूचना दी गई है। अधूरा चोट के संकेत दे रहा कोई भी जानवरों अक्षतंतु उत्थान के अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए।

आकृति 1
चित्र 1: एक पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के बिना डीआरजी इंजेक्शन। (एसी) रीढ़ की हड्डी GFP पॉजिटिव चार सप्ताह AAV5-GFP के इंजेक्शन के बाद रीढ़ की हड्डी में एक्सोन (ए), पृष्ठीय स्तंभ और पृष्ठीय सींग (बी) और डीआरजी (सी) शरीर में सेल सहित दिखा अनुभाग। <strong> (डी) CTB पॉजिटिव संवेदी अक्षतंतु फन्नी के आकार का नाभिक में टर्मिनलों CTB इंजेक्शन के बाद एक सप्ताह। पैमाने बार 650 सुक्ष्ममापी (एसी) और 250 सुक्ष्ममापी (डी) है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: का आकलन पृष्ठीय रूट क्रश चोट और एक्सोन पुनर्जनन। (ए) एक पूरा पृष्ठीय रूट रीढ़ की हड्डी या कीलक नाभिक में CTB पॉजिटिव अक्षतंतु टर्मिनलों में कोई लेबल एक्सोन में कुचलने की चोट का परिणाम है। Axotomized संवेदी एक्सोन पृष्ठीय रूट प्रविष्टि क्षेत्र के लिए ऊपर को पुनर्जीवित कर सकते हैं, लेकिन परे नहीं रीढ़ की हड्डी में। (BD) रीढ़ की हड्डी में लेबल एक्सोन की उपस्थिति या तो अधूरा चोट या regenerati का प्रतिनिधित्व करता हैपर (बी)। अतिरिक्त विश्लेषण के साथ, फन्नी के आकार का नाभिक में CTB पॉजिटिव टर्मिनलों की उपस्थिति, अपूर्ण चोट (सी) से पता चलता है, जबकि उनकी अनुपस्थिति रीढ़ की हड्डी (डी) में पूरा चोट और संभावित आंशिक उत्थान पता चलता है। पैमाने बार 250 सुक्ष्ममापी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम एक वयस्क चूहे के निचले गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में एक DRG इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड प्रस्तुत करते हैं। जैसा कि इस एक बेहद आक्रामक और नाजुक सर्जरी है, हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि सभी संभावित उपयोगकर्ताओं पशु शल्य चिकित्सा जीने के लिए आगे बढ़ने से पहले पर्याप्त प्रशिक्षण और अभ्यास प्राप्त करते हैं। उन परिचित न केवल रीढ़ की हड्डी शरीर रचना के साथ, बल्कि आसपास के मांसपेशियों के ऊतकों, कशेरुका हड्डियों के ढांचे, और वाहिका संरचना के साथ होना चाहिए। आदर्श रूप में, एक सक्षम उपयोगकर्ता, आसपास के ऊतकों को कम से कम नुकसान के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन करने रीढ़ की हड्डी को कोई नुकसान उत्प्रेरण के बिना कशेरुकाओं के हिस्से को हटाने के द्वारा एक साफ laminectomy बाहर ले जाने में सक्षम होना चाहिए। रीढ़ की हड्डी की चोट से स्पष्ट रूप में, रीढ़ की हड्डी में एक छोटा सा घाव पूरे तंत्रिका तंत्र के लिए एक व्यापक हानिकारक प्रभाव हो सकता है। इसके अलावा, जानवरों है कि एक "क्लीन" सर्जरी आया है कम अप्रत्याशित पोस्ट से ग्रस्त होने की संभावना हैऑपरेटिव जटिलताओं और कल्याण के मुद्दों और इसलिए कम वांछित प्रयोगात्मक समय बिंदु से पहले बलिदान किया जा करने के लिए की संभावना है।

नसों में 15, इंट्रापेरिटोनियल 16, अंतः मस्तिष्कावरणीय 17, या प्रत्यक्ष इंजेक्शन लक्ष्य 4, 8 में: तंत्रिका तंत्र में वायरस प्रशासन के लिए, वहाँ प्रशासन के कुछ ही संभव रास्ते हैं। हालांकि नसों और इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव हैं, रक्त मस्तिष्क बाधा के पार एक मुद्दा 18 हो सकती है और इन मार्गों गैर विशिष्ट पारगमन है, जो एक विशेष अक्षतंतु उत्थान अध्ययन में उपयोगी नहीं होगा में परिणाम। इसी तरह, अंतरिक्ष अवजालतनिका, एक और अधिक आक्रामक प्रशासनिक मार्ग में अंतः मस्तिष्कावरणीय इंजेक्शन के लिए, सीएनएस के भीतर कई neuronal और गैर neuronal प्रकार की कोशिकाओं ट्रांसड्यूस किया जा सकता है, संभवतः गैर विशिष्ट या ऑफ-targe पैदाटी प्रभाव। इस प्रकार, डीआरजी में वायरस के प्रत्यक्ष इंजेक्शन एक अनुकूल विकल्प और अन्य तरीकों की तुलना में बहुत अधिक पारगमन दक्षता में परिणाम की संभावना है। इस विकल्प की बड़ी खामी है, तथापि, शल्य प्रक्रिया है, जो विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है के invasiveness है।

एक बार जब उन आवश्यक शल्य कौशल में महारत हासिल है, इस प्रोटोकॉल लचीलापन का एक बड़ा राशि प्रदान करता है। एक अक्षतंतु उत्थान अध्ययन में, जानवरों, इस तरह के इन विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और संवेदी मोटर व्यवहार परीक्षण के रूप में अन्य तकनीकों, के साथ संयोजन में अध्ययन किया जा सकता है, जबकि एकत्र ऊतकों संरचनात्मक विश्लेषण या टिशू कल्चर 4 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन तकनीकों, विभिन्न प्रयोगात्मक समय अंकों के साथ का एक संयोजन, उदाहरण के लिए, कुचलने की चोट के 4 के बाद अध: पतन या इस तरह के NF200, CGRP, और IB4 के रूप में विभिन्न फाइबर उपप्रकार, के उत्थान की प्रगति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं पर निर्भर करता हैएनटीएस, एक या एक से प्रस्तुत प्रक्रियाओं के अन्य अकेले किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डीआरजी अकेले इंजेक्शन, axonal ट्रेसिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अकेले पृष्ठीय रूट कुचलने की चोट के किसी भी पढ़ाई जहां forepaw deafferentation की आवश्यकता है में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं को भी वायरस और इंजेक्शन के लिए ट्रांस्जीन उत्पाद के प्रकार भिन्न हो सकते हैं, सटीक डीआरजी इंजेक्ट किया जा करने के लिए, और चोट के लिए सटीक पृष्ठीय रूट। यदि लागू हो, कोशिका प्रत्यारोपण या डीआरजी में औषधीय प्रशासन भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। 19 या पृष्ठीय स्तंभ कुचलने की चोट - (hindlimb समारोह का आकलन करने के L5 जैसे, में L3), आगे रीढ़ की हड्डी समारोह 5 अध्ययन करने के लिए अधिग्रहण कर लिया शल्य कौशल पर बिल्डिंग, एक अनुभवी उपयोगकर्ता इस तरह के काठ का क्षेत्र में डीआरजी इंजेक्शन के रूप में अन्य तकनीकों, करने के लिए आगे बढ़ सकते हैं।

अंत में, हमें विश्वास है कि डीआरजी इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट कुचलने चोट संवेदी अक्षतंतु reg अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल के लिएeneration। विशेष प्रशिक्षण इनवेसिव शल्य प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यकता के बावजूद, प्रोटोकॉल लचीला है, और संभावित उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को समायोजित करने कई हिस्सों को संशोधित कर सकते हैं। इन प्रक्रियाओं संवेदी अक्षतंतु उत्थान के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल की तलाश में लगे लोगों के लिए एक आधार के रूप में सेवा कर सकते हैं।

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Acknowledgments

इस काम क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन, चिकित्सा अनुसंधान परिषद, यूरोपीय अनुसंधान परिषद ECMneuro, और कैम्ब्रिज NHMRC जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। हम शूटिंग के दौरान उनके तकनीकी सहायता के लिए हेलीन मेराल वैन 'टी Spijker और जस्टिना बैरट के लिए हमारी गहरी आभार व्यक्त करना चाहते हैं। हम एएवी उत्पादन में सहायता के लिए डॉ एलिजाबेथ मोलोनी और प्रोफेसर जूस्ट वरहागन (तंत्रिका विज्ञान के लिए नीदरलैंड संस्थान) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fast Green FCF dye Sigma-Aldrich F7258 For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1%
Cholera Toxin B subunit List Biological Laboratories 104 For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1%
IsoFlo Zoetis 115095 Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane)
Baytril 2.5% injectable Bayer 05032756093017 Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg
Carprieve 5.0% w/v Norbrook 02000/4229 Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg
Lacri-Lube Allergan PL 00426/0041 Eye ointment
Olsen-Hegar Needle Holder Fine Science Tools FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup Fine Science Tools FST 16121-14
Bonn Micro Forceps Fine Science Tools FST 11083-07 For performing dorsal root crush injury
Tissue Separating Scissors Fine Science Tools FST 14072-10
Fine Scissors Fine Science Tools FST 14058-11
Micro-Adson Forceps Fine Science Tools FST 11018-12
Goldstein Retractor Fine Science Tools FST 17003-03
Vannas Spring Scissors (straight) Fine Science Tools FST 15018-10
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge Ethicon 1972 For bleeding control
Microliter Syringe RN701 (10 μL) Hamilton 80330
Custom-made Removable Needle (for DRG injection) Hamilton 7803-05 33 gauge, 38 mm, point style 3
Custom-made Removable Needle (for CTB injection) Hamilton 7803-05 33 gauge, 10 mm, point style 3
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-1

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 123 पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि इंजेक्शन पृष्ठीय रूट क्रश चोट एक्सोन पुनर्जनन एडिनो से जुड़े वायरस रीढ़ की हड्डी संवेदी तंत्रिका तंत्र
पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि इंजेक्शन और पृष्ठीय रूट संवेदी अक्षतंतु उत्थान के लिए एक मॉडल के रूप में चोट क्रश
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Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration. J. Vis. Exp. (123), e55535, doi:10.3791/55535 (2017).

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