Introduction
신경계 손상 후 축삭 재생을 달성하는 것은 어려운 과제 일 것입니다. 중추 신경계 (CNS)의 축삭 재생의 실패를 연구하기 위해 연구진은 신경 손상 모델의 과다를 사용했다. 중추 신경계의 지역이 다른, 축삭 재생을 연구하는 해부학 적절한 모델을 사용하는 것이 중요합니다. 해당 모델을 사용함으로써, 연구진은 "1 대 모든"치료 전략에 반대, 부상의 정도, 관심의 신경 세포 유형에 따라 특정 치료 및 재생을 평가하기위한 원하는 척추 기관을 공식화 할 수 있습니다.
척수 손상에서, 예를 들어, 대부분의 쇠약 증상은 감각과 운동의 손실에서 줄기. 운동의 손실이 하강 모터 경로의 손상에 의해 발생하는 동안 감각의 손실이 상승하는 감각 경로의 손상에 의해 발생합니다. 때문에 이러한 TW 사이의 셀룰러 및 해부학 적 차이O 경로, 많은 대상 축삭 재생 연구는 단지 하나의 성공적인 회복이 환자들에게 엄청난 도움이 될 것이라는 점을 근거로, 하나 개 또는 다른 경로에 초점을 맞 춥니 다. 이 글에서, 우리는 바이러스 성 벡터와 감각 축삭 재생을 연구하는 모델로 성인 쥐의 낮은 자궁 경부 척수의 동시 후근 호감 부상으로 직접 후근 신경절 (DRG) 주입을 사용하는 프로토콜을 제시한다.
DRG 감각 뉴런은 CNS에 주변에서, 같은 촉감과 통증 감각 정보를 중계 할 책임이 있습니다. 척수 감각 뉴런의 긴 축삭 돌기 장거리 축삭 재생을 연구하는 좋은 모델이 될. 또한, 설치류 등 최소한의 복지 합병증 지느러미 루트 압박 손상으로 감각 경로의 병변에서 살아남을 수있는, 연구진은 완전히 척수 병변 할 필요없이 CNS 축삭 재생을 공부할 수 있습니다. 사중의 C5 - C8 (자궁 리터레벨 레벨 5-8) 등의 루트 압박 손상은 앞발의 deafferentation 2에 유용한 모델이 될 것으로 나타났다. 또한, 지느러미 루트 압박 손상은이 같은 폐해 흉터 형성과 같은 다른 요인에 의해 복잡하기 때문에 직접 척수 손상보다 축삭 재생을 연구하는 "깨끗한"모델을 제공합니다.
회생 상태 뉴런 재 프로그램 바이러스 유전자 요법의 사용이 점점 더 많은 신경 학적 조건 3 유망한 치료 전략으로 간주되어왔다. 연구 행동 복구 4,5,6 견고한 축삭 재생을 달성 할 수있는 성장 촉진 단백질의 유전자를 나르는 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 적용을 도시 하였다. 면역 반응과 같은 뉴런 비 분열 세포를 형질 도입하는 능력을 유도의 AAV의 명백한 낮은 병원성이 만들어그 유전자 치료에 대한 최적의 벡터. 또한, AAV 재조합 형태는 치료에 사용된다. 이 형태에서는, 숙주 게놈 내로는 7 바이러스 게놈 통합 예컨대 렌티 바이러스와 같은 다른 바이러스 벡터에 비해 삽입 성 돌연변이 유발의 위험을 줄일 수없는 것이다. 이것은 AAV 유전자 치료 응용 프로그램을위한 안전한 선택을합니다.
DRG 감각 뉴런의 세포 기관을 포함, 연구 및 / 또는 감각 축삭의 재생을 촉진하는 유전자 치료에 대한 바이러스의 관리를위한 가장 적절한 해부학 적 대상입니다. 다른 AAV 혈청 형 및 렌티 바이러스를 비교 한 연구에서는 AAV 혈청 형 5의 (AAV5)는 DRG (8)에 직접 주입 할 때 적어도 12 주 시간 코스 위에 DRG 신경 세포를 형질 도입에서 가장 효율적인 것으로 나타났다. 또한, AAV는 대경 신경 미세 섬유 200 kDa의 모든 아형 DRG 신경 세포를 형질 도입, 40 % 이상 전달 효율을 얻을 수있다(NF200) 양성 뉴런 소경 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) - 또는 동종 렉틴 B4 (IB4) 양성 뉴런 4, 8.
DRG 주입 및 후근 압박 손상의 수술로 매우 침략하고 섬세한, 우리는이 문서가 새로운 사용자는 매우 효율적인 방식으로 절차를 학습하는 데 도움이 될 것입니다 믿습니다. C8 등의 루트 압박 손상 - 동시 C5와 C7의 DRGs -이 문서에서 우리는 성인 사주 C6로 제어 바이러스 AAV5-GFP (녹색 형광 단백질)의 주입 후 쥐에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 모델은 감각 축삭의 재생을 촉진하는 바이러스 성 유전자 치료의 사용을 조사하고 연구에 특히 적합합니다.
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Protocol
다음의 모든 동물 절차가 영국 동물에 따라 (과학적 절차) 법 1986이 절차에 익숙하지 않은 경우에 실시되었다, 국가 / 지역의 규정을 확인하고 프로토콜을 시작하기 전에 의학적 조언을 구하시기 바랍니다.
1. 동물의 적절한 변형을 선택
참고 : 감각과 발 deafferentation의 손실에서 후근 압박 손상의 결과. 앞발의 deafferentation의 일반적인 부작용은 오버 정리, 자기 절단 및 발 autotomy를 포함 할 수 있습니다.
- 절차는 동물을 얻습니다.
주 : 래트를 들면, 리스터-두건의 Wistar로서 더 활성 균주, 예컨대 루이스와 스프 라그 - 돌리로 더 다루기 균주에 비해 deafferentation 후 발 autotomy의 높은 발병률을 갖는다. 가능하면 가장 다루기 변형, 루이스는 항상 먼저 고려되어야한다. 특히 활성 균주는 유전 적 m에 실험에 필요하다면odification 또는 특정 행동 평가 요구 사항, 수의학 치료가 예상 부작용을 해결하기 위해 자리에 있어야합니다.
2. 사출에 대한 바이러스 준비
주의 : 생물 및 실험실 안전 규정에 따라 모든 바이러스를 처리합니다.
- 희석 또는 / ㎖ 개별 바이러스 패키징 프로토콜 9 다음 2 × 1012 게놈 카피 (GC)의 역가 바이러스를 농축시킨다.
주 : 여기에서, 바이러스 5 % 수 크로스와 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)로 희석 하였다. 역가, 바이러스, 프로모터의 종류에 따라 최적화 할 수있는 크기를 구축하고, 세포 유형을 대상으로 할 수있다. - 옵션 : 나중에 사출 쉽게 시각화를위한 바이러스 솔루션 1 %를 착색 염료 (예를 들어, 빠른 그린)를 추가합니다. 아주 부드럽게 솔루션을 섞는다.
- (4 시간 이내) 즉시 사용 얼음 솔루션을 유지하거나 장기를위한 -80 ° C의 냉동고에장기 저장.
3. 동물의 수술 준비를 수행
참고 : 수술의 극단적 인 침입으로 인해, 무균 기술을 항상 사용되어야한다.
- 준비하고 수술을 시작하기 전에 모든 수술 도구와 척추 고정대를 소독. 예를 들어, 134 ℃에서 오토 클레이브에서 멸균 도구. 각 동물에 대한 소독 도구의 새로운 세트를 사용합니다.
- 동물을 마취. 금단 반사 나 눈꺼풀 반사위한 각막을 터치하여 테스트 발을 집어 적절한 마취를 확인한다.
- 예를 흡입 이소 플루 란 마취를 이용하여 성숙한 래트를 들어, 2.0 L의 4 % 이소 플루 란을 사용 / 유도 산소 분. 과대 또는 과소 투여를 피하기 위해 동물의 호흡 패턴에 따라 다양한 농도의 이소 플루 란, 1.5 L / 분의 산소의 3 % 이소 플루 란 - 수술 내내 유지를 들어, 2를 사용한다.
- 에, 동물이 처음 마취 CE 동물의 수술 전 체중을 기록한다.
- 자궁 경부 DRG 주입의 경우, 견갑골에 원위부에 귀 사이에서 목에 털을 면도. 방부제 제품과 면도 영역 소독.
- 적절한 진통제의 투여 (예를 들어, 5 ㎎ / ㎏ 카프로 펜) 항생제 (예를 들어, 5 ㎎ / ㎏ enrofloxacin)과 함께, 동물의 옆구리에 피하 식염수 2 mL를 주입한다.
- 절차를 수행하는 동안 각막 건조를 방지하기 위해 두 눈에 눈 연고를 적용합니다.
- 동물의 아래에 배치 된 37 ℃ 가열 패드와 척추 고정대 수술을 진행.
4. DRG를 주입하고 도설 루트 압박 손상을 수행
참고 :이 매우 섬세한 수술이다. 동물의 수술을 살기를 진행하기 전에 해부학에 익숙해 처음 몇 죽은 동물을 연습하는 것이 좋습니다.
- 엘ocate 피부를 통해 저명한 C2 및 T2 극돌기. 10 호 메스 블레이드 (피부가 열리면, 백색 섬유질 조직 정중선 근육의 제 1 층에 보여야과 C2 및 T2 가시 돌기 사이의 피부 절개를, 근육의 제 1 층을 갖는 " ) 질감 "젤리처럼.
- 메스 블레이드를 사용하여 흰색 중간 선을 따라 근육의 첫 번째 레이어에 비슷한 크기의 절개를합니다. 이 근처에있는 하행 대동맥에서 주요 동맥의 가지가있는 한, 저명한 T2 극돌기 넘어하지 마십시오.
참고 : 심한 출혈 이후이 단계에서 어디서든 발생할 수 있습니다. 항상 출혈을 중지하고 항상 명확한 시각화 할 수 있도록 멸균 면봉이나 수술 흡수 스폰지를 사용하여 혈액을 제거합니다. 절차 진행 "맹목적으로"나중에 동물에 예기치 않은 부작용으로 이어지는, 척수, DRG, 또는 지느러미 루트에 원치 않는 손상 될 수 있습니다. - 후퇴두 견인기, 하나 rostrally 배치 한 꼬리 쪽을 이용하여 근육의 첫번째 층; 근육의 두번째 층은 가로 무늬 모양으로 표시한다.
- (두 길이 근육 얇은 멤브레인 조직 관찰에 의해 접속 될 수있다) 근육의 제 2 층의 정중선을 찾아. 두 종의 근육을 분리 microscissors 쌍을 사용하여 멤브레인을 해부 조직. 이 불필요한 근육 손상 및 출혈을 초래할 수 있으므로, 메스 블레이드 가능하다면 사용을 피.
- 척추를 덮는 얇은 근육의 제 3 층이 노출되도록 적절히 조정 견인기. 가시 돌기 가볍게 근육의 제 3 층 위에 집게 한 쌍의 터치 느낄 수있다.
- microscissors를 사용하여 근육의 제 3 층에 작은 절개를 부드럽게 명확하게 척추를 노출 옆길 방식으로 큐렛이나 메스를 사용하여 뼈에서 근육을 긁어. 필요한 경우, 라미을 마련하기 위해 근육이나 힘줄의 일부를 잘라nectomy 쉽게.
- , C8의 DRGs에 C4를 좌측 헤미 절제술 수행 - - 좌측 C5 노출되도록 신중 박판의 일부를 제거하고 미세 rongeurs 유경의 쌍을 이용하여 척추를 T1. DRG는 척추의 가로 난원 근처에 위치한다.
참고 : C3 - C7 척추는 눈에 띄는 극돌기이 없습니다. DRG C5는 C4 및 C5 척추골 사이에 위치되는 C8 DRG는 C7 및 척추 사이 T1 동안, C6 DRG는 등등 C5 및 C6 척추 사이이며. 더 C8 척추는 C8의 DRG의 존재와 C8 척수 세그먼트에도 불구하고,이 없다. - DRG 충분한 사출 노출되면, 정위 주사기 홀더 상 주문품, 33 게이지 바늘이 장착 무딘 바이러스 채워진 마이크로 리터 주사기를 배치하여 주사기를 준비한다. 주입 전에 주사 바늘의 삽입을 돕기 위해 타겟 DRG 각 표면에 작은 구멍을 만들어 30 게이지 바늘을 사용하여 경사.
- 33 g을 넣고정위 좌표를 조정하기 위해 부드럽게 손잡이를 돌려 DRG의 중심으로 AUGE 바늘. 이 유체가 DRG의 복부 측면에서 누출 될 수 있습니다로, 바늘을 통해 삽입하지 마십시오. 발생 즉시 바늘의 위치를 조정 누설해야한다.
참고 : 숫자 정위 좌표가 사용되지 않습니다; 그러나, 주사 바늘을 유지하기 위해 프레임을 사용하는 것이 도움이된다. - 주입 주사기 펌프를 이용하여 0.2 μL / 분으로 각각 DRG에 바이러스 1 μL를 주입한다. 바늘을 철회하기 전에 추가로 3 분 동안 기다립니다. 바이러스 솔루션은 색깔의 염료를 포함하는 경우 주입하는 동안, DRG 천천히 색상을 변경합니다.
- 동시 C5 수행하려면 - C8 등의 루트 호감 부상을, 각각의 루트 (10)의 3 회 호감 각각 사용하여 완전히 집게의 끝 반대 끝이 뾰족한 집게 (본 마이크로), 한 쌍의 조직에서 흰색 선은 호감 사이트에서 나타납니다. forc으로 요구되는 것보다 더 깊게하지 마십시오이 같은 EPS는 복부 루트가 손상 될 수 있습니다.
- 주입 및 / 또는 분쇄 후, 어떤 출혈이나 동물을 닫기 전에 절개 사이트에서 왼쪽 뼈 조각의 작은 조각이 없는지 확인하십시오. 선호하는 경우, 노출 된 척수 및 DRG의 상단에 수술 흡수 스폰지의 작은 조각을 놓습니다.
- 근육의 세 번째 레이어는 봉합하지 않고 척추에 자연적으로 다시 철회 할 수 있습니다. 느슨하게 번째 층의 두 길이 근육 6-0 흡수성 봉합사 재료 (≈ 3 중단 봉합) 봉합. 6-0 흡수성 봉합사로 근육의 제 1 층 (5 ≈ 중단 봉합) 봉합.
- 흡수 5-0 봉합사로 피부를 (≈ 10 중단 봉합) 봉합.
주 : 봉합이 너무 타이트하지 있는지 확인하십시오. 피부의 팽창하는 것은 과도한 긴축의 표시이고, 동물에게 불편 함을 줄 수있다. - 무거운 출혈은 수술 중 발생한 경우, 피하는 주입 1-2지역 규정 하에서 허용 식염수 용액은 동물로부터 유체의 손실을 보충한다.
- 식용 하이 드레이팅 젤을 제공하고 유지 영역으로 다시 동물을 반환하기 전에 적어도 1 시간 동안 정기적으로 모니터링을 수행하는 동물은 마취에서 완전히 회복 할 수 있습니다.
- 감각 축삭 재생을 평가하기 위해 최적의 유전자 발현을 위해 최소 3 주 동안 동물을 유지합니다.
동물의 5. 수행 수술 후 케어
- 첫 번째 주 후 수술 중 동물 용 식품 매쉬와 부드러운면 침구를 제공합니다. 필요한 경우, 국가 / 지역의 규정 및 수의학 조언에 따라 복구를 돕기 위해 진통제와 항생제의 추가 용량을 관리 할 수 있습니다.
- 십일 - 7 후 피부에 봉합사를 제거합니다.
참고 : 수술의 일반적인 부작용은 절개 사이트에서 장액 또는 혈종의 형성을 포함 인해으로 인한 가려움증에 피부에 자국을 긁어내부 흡수성 봉합사, 미묘한 감각 또는 운동 결손 및 후근 압박 손상 후 deafferented 발에 자해의 흔적. 실질적으로 예상보다 더 심각 어떤 복지 문제에 대해서는 즉시 수의사의 조언을 구해야한다.
제 축삭 추적하는 선행 성 CTB 분사를 수행
참고 :이 조직 컬렉션에 일주일 전에 추적 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB) 축삭을 수행하는 것이 좋습니다.
- 제조업체의 지시에 따라 1 % CTB 솔루션을 준비합니다.
- 옵션 : 나중에 사출 쉽게 시각화를위한 솔루션 1 % 색깔의 염료를 추가합니다. 아주 부드럽게 솔루션을 섞는다.
- 동물을 마취하고 (단계 3.2.1 참조) 표 사지 테이핑하여 좌측 앞발을 안정화.
- 수동 천천히 피하 털이 발바닥의 중심에 1 % CTB 1 μL를 주입하고 네 자리는 마이크로 리터 주사기 장착 (WI)를 사용주문품, 33 게이지 바늘을 짧은 토륨.
참고 : 주입하기 전에, 먼저 주사 바늘의 삽입에 도움 피부에 작은 피상적 인 개방을 만들기 위해 30 게이지 경 바늘을 사용하는 데 도움이됩니다. - 동물이 유지 영역으로 동물을 반환하기 전에 마취에서 완전히 복구 할 수 있습니다.
7. 수집 티슈
- 면역 용 바이러스 주입 DRG 척수를 수집하기 위해 마취제 과다 투여로 transcardially하고 차가운 4 % 파라 포름 알데히드이어서 인산 완충 식염수 동물 관류. 조심스럽게 현미경으로 고정 된 조직을 수집하기 위해 척추에 전체 추궁 절제술을 수행합니다. 분석 4, 5, 6에 필요한 티슈 제조, 절편, 및 가공을 진행.
참고 : S의 존재에 의해 관찰 회수 절개 사이트, 자명하다자동차 조직. - 대안 적으로, 시험 관내 배양 용 바이러스 주입 DRG를 수집하는 이산화탄소의 농도 상승 등의 승인 방법 인도적으로 동물을 희생. 조심스럽게 가능한 무균 조건을 보장 현미경으로 DRG를 해부. 10 6, 5, 4 원하는대로 조직 배양을 진행.
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Representative Results
표현 된 바와 같이, 부착 DRG와 횡 척수 부는 C7에 직접, DRG 신경 세포를 형질 도입 4 주 제어 바이러스 AAV5-GFP를 주사 한 후 척수 감각 축삭 추적이 프로토콜의 효과를 보여주기 위해 제시 지느러미 루트 압박 손상 (그림 1A)없이 DRG. 등쪽 칼럼 척수 후각 축삭 모두 GFP (도 1b),뿐만 아니라 주입 DRG (도 1C) 내의 균체 및 축삭을 표현한다. cuneate 핵 외 해부 분석, 뇌간의 감각 축삭 단말은 선행 성 포지티브 CTB는 (도 1D)을 추적 보여준다.
DRG 주입은 완전한 C5-C8 등의 루트 호감 부상으로 동시에 수행 될 때, 척수 또는 CTB-양극 단자에는 GFP 양성 축삭 없습니다cuneate 핵들에서 (도 2a)를 관찰한다. 그러나, axotomized 감각 축삭은 아직 아닌 이상 척수 4, 5 (그림 2A)로하는 PNS 환경입니다 완전히 분쇄 등의 루트에있는 지느러미 루트 항목 영역까지 재생할 수 있다는 지적 가치가있다. 주입 된 바이러스가 잠재적 인 성장 촉진 단백질의 유전자를 포함하는 경우, 척수에 표시된 축삭의 존재는 재생 또는 불완전한 후근 압박 손상 (그림 2B) 중 하나를 나타낼 수있다. 이 두 결과를 구별하기 위해, cuneate 핵의 CTB 축삭 추적이 분석되어야한다. CTB-양극 단자 부재가 재생 축삭와 척수로 부분 재생을 제시하면서 cuneate 핵 CTB에 양성 단자의 존재는 불완전한 손상 (도 2c)의 가능성을 강조cuneate 핵 (그림 2D)에 도달하는 전체 거리를 성장 가능성이 없습니다. 현재까지 cuneate 핵에 성공적으로 감각 축삭 재생은 대부분 높은 자궁 부상 11, 12 또는 뉴로 13, 14의 응용 프로그램의 경우보고 된 바있다. 불완전 손상의 흔적을 보여주는 모든 동물은 축삭 재생 연구에서 제외되어야한다.
그림 1 : 지느러미 루트 압박 손상없이 DRG 사출. (AC) 사주 AAV5-GFP 주입 후에 DRG (C)의 등쪽 열과 지느러미 호른 (B)과 균체를 포함하는 척수 GFP 양성 축삭 (A)를 나타내는 척수 부. <cuneate 핵 강한> (D) CTB 양성 감각 축삭 단자 CTB 주입 다음 일주. 스케일 바는 650 ㎛의 (AC) 및 250 ㎛의 (D)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 지느러미 루트는 상해와 축삭 재생 크러시 평가. (A)를 cuneate 핵에서 척수 또는 CTB 양성 축삭 터미널에서 어떤 표시 축삭의 완전한 후근 압박 손상의 결과. Axotomized 감각 축색 돌기는하지만 넘어 척수로, 지느러미 루트 항목 영역까지 재생성 할 수 있습니다. (BD)은 척수 축삭 표지의 존재는 불완전한 손상 또는 regenerati 하나를 나타낸다에 (B). 이들 부재는 척추 (D)로 전체 부상 잠재적 부분의 재생을 제시하면서 추가 분석으로, cuneate 핵 CTB 양성 단자의 존재는 불완전한 손상 (C)를 제안한다. 스케일 바는 250 ㎛의 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서 우리는 성인 쥐의 낮은 자궁 경부 척수의 DRG 주입 및 후근 압박 손상을 수행하는 단계별 가이드를 제시한다. 이것은 매우 침략하고 섬세한 수술이기 때문에, 우리는 강력하게 모든 잠재적 인 사용자가 동물 수술을 살기를 진행하기 전에 충분한 훈련과 연습을받는 것이 좋습니다. 사용자는 척수의 해부학뿐만 아니라 주변의 근육 조직, 척추 뼈 구조, 그리고 혈관에뿐만 아니라 잘 알고 있어야합니다. 이상적으로, 사용자 권한은 척수 손상을 유발하지 않고 척추의 일부를 제거하여 깨끗한 절제술을 실시, 주변 조직에 최소한의 손상의 절차를 수행 할 수 있어야한다. 척수 손상의 증거로서, 척수의 작은 병변은 전체 신경계에 광범위하게 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, "깨끗한"수술을받은 동물은 예상치 못한 포스트에서 고통 가능성이 적습니다합병증 및 복지 문제와 따라서 원하는 실험 시점 전에 희생해야 할 가능성이 적습니다.
15 정맥 내, 복강 내 (16), 경 막내 (17) 또는 직접 분사 대상 4, 8로 : 신경계로 바이러스를 투여하기 위해, 투여 경로 같은 몇 가지가있다. 정맥 및 복강 내 주사는 비교적 비 침습적이지만, 혈액 - 뇌 장벽의 교차점이 문제가 18 일 수 있으며,이 노선들은 전문 축삭 재생 연구에서 유용하지 않을 것 비특이적 전달, 결과. 마찬가지로, 거미 막밑 공간보다 침습적 관리 행으로 척수강 내 주사의 CNS 내에서 많은 신경 및 비 신경 세포 타입 잠재적 비특이적 또는 오프 타지 생성 형질 도입 될 수있다t 효과. 따라서, DRG에 바이러스의 직접 분사 유리한 옵션과 다른 방법보다 훨씬 높은 전달 효율이 발생할 가능성이 높습니다. 이 옵션의 가장 큰 단점은, 그러나, 전문 교육을 필요로하는 수술의 침입이다.
사용자가 필요한 수술 기술을 마스터하면,이 프로토콜은 유연성의 큰 금액을 제공합니다. 수집 된 조직의 해부학 적 분석 또는 조직 배양 (4)에 사용될 수 있지만 축삭 재생 연구에서, 동물 등 생체 전기 생리학 감각 모터 행동 검사와 같은 다른 기술들과 조합하여 연구 될 수있다. 다양한 실험 시점과 이들 기술의 조합은 예를 들어, 압박 손상 후 4 변성증 또는 NF200, CGRP 및 IB4 상이한 섬유 아형의 재생의 진행을 연구하는데 사용될 수있다. 실험의 requireme에 따라NTS, 하나 이상의 제시된 절차의 다른 단독으로 행할 수있다. 혼자 후근 압박 손상이 앞발의 deafferentation이 요구되는 모든 연구에 사용 할 수 있습니다 예를 들어, 혼자 DRG 주입은, 축삭 추적 실험에 사용 할 수 있습니다. 또한, 사용자는 바이러스 및 주입을위한 형질 전환 유전자 제품의 유형을 변화 할 수있다, 정확한 DRG 주입하고, 정확한 후근 부상한다. 해당되는 경우, DRG에 세포 이식이나 약물 투여는이 프로토콜을 이용하여 수행 될 수있다. 더 척수 기능 (5)을 연구하기 위해, 19 등의 열 압박 손상 - (사지의 기능을 평가하기 위해 L5 L3에 예) 인수 수술 기술을 구축, 숙련 된 사용자는 요추에서 DRG 주입과 같은 다른 방법으로 진행할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 DRG 주입 및 지느러미 루트 압박 손상은 감각 축삭 등록을 연구하는 유용한 모델이 될 생각하는eneration. 침략적인 수술 절차를 수행하는 전문 교육에 대한 요구에도 불구하고, 프로토콜은 유연하고, 잠재적 인 사용자는 자신의 실험적인 요구 사항을 수용하기 위해 많은 부분을 수정할 수 있습니다. 이러한 절차는 감각 축삭 재생 연구에 적합한 동물 모델을 찾는 사람들을위한 토대 역할을 할 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 크리스토퍼와 다나 리브 재단, 의학 연구위원회 (Medical Research Council), 유럽 연구위원회 ECMneuro 및 캠브리지 NHMRC 생물 의학 연구 센터에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 촬영하는 동안 자신의 기술 지원을 헬린 메렐 반 't Spijker 및 저스티나 바렛에 깊은 감사의 말씀을드립니다. 우리는 AAV 생산 지원을 위해 박사 엘리자베스 몰 로니 교수 유스트 버헤건 (신경 과학을위한 네덜란드 연구소) 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
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