Introduction
Oppnå axon regenerering etter skade nervesystemet er en utfordrende oppgave 1. For å studere svikt av axon regenerering i sentralnervesystemet (CNS), har forskere benyttet en mengde av nerveskade modeller. Som regioner av CNS variere, er det viktig å benytte en anatomisk hensiktsmessig modell for å studere axon regenerering. Ved å bruke den aktuelle modellen, kan forskere formulere en spesifikk behandling basert på alvorligheten av skaden, den neuronale celletype av interesse, og den ønskede spinalkanalen for å vurdere regenerering, i motsetning til en "en-til-all" behandlingsstrategi.
I ryggmargsskade, for eksempel de mest ødeleggende symptomer stammer fra tap av følelse og bevegelse. Tap av følelse er forårsaket av skade på stigende sensoriske baner, mens tap av bevegelse er forårsaket av skade på synkende motorveier. På grunn av mobilnettet og anatomiske forskjeller mellom disse two trasé, mange målrettede axon restitusjon studier bare fokusere på den ene eller den annen vei, med den begrunnelse at en vellykket gjenoppretting av enten ville være en stor fordel for pasientene. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll som bruker en direkte dorsalrotganglia (DRG) injeksjon med en viral vektor, og en samtidig dorsal rot knuseskade i det nedre cervikal ryggmargen til en voksen rotte som modell for å studere sensorisk axon regenerering.
DRG-sensoriske neuroner er ansvarlig for videresending sensorisk informasjon, slik som taktile følelse og smerte, fra periferien til CNS. De lange aksonal projeksjoner av sensoriske nevroner i ryggmargen tjene som en god modell for å studere langdistanse axon regenerering. I tillegg, som gnagere kan overleve en sensorisk sti lesjon, slik som en dorsal root knuseskade med minimale velferd komplikasjoner, kan forskere studere CNS axon regenerering uten behov for fullstendig lesjon på ryggmargen. En firedoble C5 - C8 (cervical level 5. - 8.) dorsal root knuseskade har vist seg å være en nyttig modell for forpoten deafferentation 2. I tillegg kan en dorsal root knuseskade gir en "renere" modell for å studere axon regenerering enn en direkte ryggmargsskade, fordi det er ukomplisert av andre faktorer, slik som glial arrdannelse.
Bruken av viral genterapi å omprogrammere neuroner inn i en regenererende tilstand har i økende grad betraktet som en lovende behandlingsstrategi for mange nevrologiske tilstander 3. Studier har vist at anvendelsen av en adenoassosiert virus (AAV) vektor som bærer transgenet av en vekstfremmende protein kan oppnå robust axon regenerering med atferdsmessige utvinning 4, 5, 6. Den tilsynelatende lav patogenitet AAV i å fremkalle en immunrespons, og evnen til å transdusere ikke-delende celler, såsom neuroner, gjørdet den optimale vektor for genterapi. I tillegg anvendes den rekombinante AAV form for terapi. I denne formen, er det ute av stand til å integrere dens virusgenomet i vertsgenomet 7, som reduserer risikoen for innskuddsmutagenese i forhold til andre virale vektorer, slik som lentivirus. Dette gjør AAV et trygt valg for genterapianvendelser.
Som en DRG inneholder cellelegemer av sensoriske neuroner, er den mest passende anatomisk mål for administrering av virus for genterapi for å studere og / eller fremme sensorisk axon regenerering. I en studie som sammenligner forskjellige serotyper av AAV og lentivirus, ble AAV serotype 5 (AAV5) vist seg å være den mest effektive i overførende DRG-neuroner i løpet av et tidsforløp på minst 12 uker, når de injiseres direkte inn i den DRG 8. I tillegg kan AAV oppnå mer enn 40% effektivitet transduksjon, transdusering av alle DRG-neuronal undertyper, slik som med stor diameter, neurofilament 200 kDa(NF200) -positive nevroner og liten diameter calcitonin-gen-relatert peptid (CGRP) - eller b4 isolectin (IB4) -positive neuroner 4, 8.
Som den kirurgiske prosedyren av DRG injeksjon og dorsal root knusningsskade er svært invasiv og delikat, tror vi at denne artikkelen vil hjelpe nye brukere til å lære prosedyren på en svært effektiv måte. I denne artikkelen, viser vi representative resultater fra voksne rotter fire uker etter injeksjon av en kontrollvirus AAV5-GFP (grønt fluorescerende protein) til C6 - C7 DRG med en samtidig C5 - C8 dorsale knuseskade. Denne modellen er spesielt egnet for forskere som undersøker bruk av viral genterapi for å fremme sensorisk axon regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de følgende dyr prosedyrer ble utført i samsvar med Storbritannia Dyr (Scientific Procedures) Act 1986. Hvis ukjent med disse prosedyrene, må du sjekke med lokale / nasjonale bestemmelser og kontakt veterinær råd før du starter protokollen.
1. Valg av et egnet Strain of Animals
MERK: En rygg root knusningsskade resulterer i tap av følelse og pote deafferentation. Vanlige bivirkninger av forpoten deafferentation kan inkludere over-grooming, selvskading, og pote autotomy.
- Skaff dyr for prosedyren.
NB: For rotter, de mer aktive stammer, slik som Lister-hette og Wistar, har høyere forekomst av pote autotomy etter deafferentation sammenlignet med de mer føyelige påkjenninger, som for eksempel Lewis og Sprague-Dawley. Hvis mulig, bør den mest føyelig belastning, Lewis, alltid vurderes først. Dersom en spesielt aktiv belastning være nødvendig for forsøket på grunn av genetisk modification eller spesifikke oppførselsbedømmelsen krav, bør veterinærbehandling være på plass for å ta opp forventede bivirkninger.
2. Klar Virus for Injection
FORSIKTIG: Håndter alle virus i samsvar med biologiske og laboratoriesikkerhetsforskrifter.
- Fortynn eller konsentrere viruset til en titer på 2 x 10 12 genomet kopi (GC) / mL følgende individuelle viruspakkeprotokoller 9.
MERK: Her ble det virus fortynnet i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (D-PBS) med 5% sakkarose. Titeren kan ha for å være optimalisert, avhengig av hvilken type virus, promoter, konstruere størrelse, og målrettede celletype. - Valgfritt: Legg 1% farget fargestoff (f.eks Fast Grønn) til virus løsning for enkel visualisering av injeksjons senere. Bland løsningen veldig forsiktig.
- La løsningen stå på is for umiddelbar bruk (i løpet av 4 h) eller i en -80 ° C fryser for lang-langtidslagring.
3. Utføre den preoperative Fremstilling av Animal
MERK: På grunn av den ekstreme invasivitet av kirurgi, bør aseptiske teknikker brukes til enhver tid.
- Utarbeide og sterilisere alle kirurgiske verktøy og rygg stereotaxic ramme før du starter operasjonen. For eksempel, sterilisere verktøyene i en autoklav ved 134 ° C. Bruke et nytt sett med sterilitet verktøy for hvert dyr.
- Bedøve dyret. Bekreft riktig anesthetization ved å knipe labben for å teste for tilbaketrekking refleks eller ved å berøre hornhinnen for øyelokket refleks.
- For voksne rotter ved hjelp av inhalering bedøvelse slik som isofluran, å bruke 4% isofluran i 2,0 l / min oksygen for induksjon. For vedlikehold i løpet av kirurgi, bruker 2 - 3% isofluran i 1,5 l / min oksygen, å variere konsentrasjonen isofluran i henhold til pustemønsteret for dyret for å unngå over- eller underdosering.
- Påce dyret er bedøvet innledningsvis, registrerer preoperativ vekten av dyret.
- For den cervikale DRG injeksjon, rake av pelsen på halsen fra mellom ørene til umiddelbart distalt til skulderbladene. Desinfisere det barberte området med en antiseptisk produkt.
- Injiserer 2 ml av saltvann subkutant på dyrets side, sammen med en egnet dose av analgetikum (for eksempel 5 mg / kg carprofen) og antibiotika (for eksempel 5 mg / kg enrofloksacin).
- Påfør øye salve til begge øynene for å hindre hornhinnen tørking under prosedyren.
- Fortsett til kirurgi på en rygg stereotaksisk ramme med en varmepute ved 37 ° C, plassert på undersiden av dyret.
4. Injisering DRG og Utføre en Dorsal Root Crush Injury
MERK: Dette er en svært delikat operasjon. Det er lurt å øve på noen få døde dyr først å bli kjent med anatomien før fremmarsj å leve dyr operasjon.
- Locate fremtredende C2 og T2 spinous behandler over huden. Foreta en hudsnitt mellom C2 og T2 spinous prosesser med en no.10 skalpellblad (når huden er åpnet, skal en hvit, fibrøs vev-midtlinjen være synlig på det første laget av muskler, det første lag av muskel har en " geleaktig" tekstur).
- Lag en tilsvarende størrelse snitt på det første laget av muskler langs den hvite midtlinjen ved hjelp av en skalpell blad. Ikke gå utover fremtredende T2 spinous prosess, som det er en stor arteriell gren fra synkende aorta ligger i nærheten der.
MERK: Kraftig blødning kan oppstå hvor som helst fra dette trinnet og utover. Alltid stoppe blødningen og fjerne blodet ved hjelp av steriliserte bomullspinner eller kirurgiske absorberbare svamper for klar visualisering til enhver tid. Ved å gå frem med prosedyren "blindt", kan føre til uønskede skader på ryggmargen, DRG, eller dorsal rot, noe som fører til uventede negative effekter i dyre senere. - Trekkførste lag av muskelen ved hjelp av to haker, som er lagt inn en rostrally og en caudally; det andre lag av muskel, med et stripet utseende, bør være synlig.
- Lokalmidtlinjen av det andre lag av muskel (hvor to langsgående muskler kan observeres forbundet ved hjelp av en tynn, membran vev). Dissekere vev membran ved hjelp av et par microscissors for å skille de to langsgående muskler. Unngå å bruke et skalpellblad hvis mulig, da dette kan resultere i unødvendig muskelskader og blødninger.
- Juster haker tilsvarende for å eksponere det tredje lag av tynt muskel dekker ryggraden. Spinous prosesser kan føles av lett berøring med en pinsett i løpet av det tredje lag av muskel.
- Lage et lite innsnitt på det tredje lag av muskelen ved hjelp av microscissors og forsiktig skrape av muskel fra benet ved bruk av en skalpell eller kyrette på en sideveis måte som tydelig eksponere ryggvirvlene. Om nødvendig, kutte noen av muskel eller sene bort for å gjøre laminectomy enklere.
- For å eksponere den venstre C5 - C8 DRG, utføre venstre hemi-laminektomi på C4 - T1 ryggvirvlene ved å forsiktig fjerne en del av arket og stilken ved hjelp av et par av fine Rongeurs. DRG ligger i nærheten av de tversgående foramen av ryggsøylen.
MERK: C3 - C7 ryggvirvlene ikke har en fremtredende spinous prosess. C5 DRG ligger mellom C4 og C5 ryggvirvlene, er det C6 DRG mellom C5 og C6 ryggvirvlene, og så videre, mens den C8 DRG er mellom C7 og T1 ryggvirvler. Det er ingen C8 vertebra, til tross for tilstedeværelsen av en C8 DRG og en C8 ryggmarg segmentet. - Når nok av DRG har vært utsatt for injeksjon, fremstille sprøyten ved å plassere den virusfylte mikroliter-sprøyte utstyrt med en skreddersydd, 33-gauge butt nål inn på stereotaksiske sprøyteholderen. Før injeksjon bruke en 30-gauge nål avfaset for å lage en liten overfladisk åpning på hver av de målrettede DRG for å hjelpe til med innsettingen av kanylen.
- Sett 33-gAuge nål inn i sentrum av DRG ved å dreie knottene forsiktig for å justere de stereotaksiske koordinater. Ikke over-føre nålen, da dette kan føre til at væske lekker ut fra den ventrale side av DRG. Skulle det oppstå lekkasje, justere plasseringen av kanylen umiddelbart.
MERK: De numeriske stereotaxic koordinater brukes ikke; men det er nyttig å bruke rammen til å holde nålen til injeksjon. - Injiser 1 ul av viruset inn i hver DRG på 0,2 ul / min ved anvendelse av en infusjonssprøytepumpe. Vent i ytterligere tre minutter før uttak av nålen. Under injeksjonen vil DRG sakte endrer farge hvis viruset løsningen inneholder et fargestoff.
- For å utføre en samtidig C5 - C8 dorsale knuseskade, knuse hver rot tre ganger i 10 sekunder hver ved hjelp av et par av fine spisser tang (Bonn mikro), motstående endene av tang helt; en hvit linje i vevet skal vises på trengselen nettstedet. Ikke gå dypere enn nødvendig med forceps, da dette kan forårsake skade på den ventrale roten.
- Etter injeksjonen og / eller knuse, sørge for at det ikke er noen blødning eller små biter av beinfragmenter ved snittstedet før stengning av dyret. Hvis foretrukket, plasserer en liten bit av kirurgisk absorberbare svamp på toppen av den eksponerte ryggmargen og DRG.
- Tillat den tredje lag av muskelen til å trekke tilbake naturlig på ryggen uten suturering. Løst sutur de to langsgående muskler på det andre lag (≈ tre avbrudte suturer) med absorberbare 6-0 suturmateriale. Suturer det første laget av muskel (≈ 5 avbrudte suturer) med absorberbare 6-0 suturmateriale.
- Suturer huden med absorberbare 5-0 suturmateriale (≈ 10 avbrudte suturer).
MERK: Pass på at sting ikke er for stramt. Utbuling av huden er et tegn på over-stramming og kan forårsake ubehag for dyret. - Hvis kraftig blødning oppsto under operasjonen, subkutant injisere 1-2ml saltoppløsning for å fylle væsketapet fra dyret som er tillatt i henhold til lokale reguleringer.
- Tilveiebringe spiselige fuktighetsgivende gel og at dyret kan komme seg helt fra bedøvelsen, utføre regelmessig overvåking i minst 1 time før retur dyret tilbake til holdeområdet.
- Holde dyret i minst 3 uker for optimal transgen ekspresjon for å vurdere sensorisk axon regenerering.
5. Utføre postoperativ behandling av dyr
- Gi mat mos og myk bomull sengetøy for dyret under den første uken etter operasjonen. Hvis det er nødvendig, administrere flere doser av smertestillende og antibiotika for å hjelpe med utvinning i henhold til lokale / nasjonale bestemmelser og veterinær råd.
- Fjern sting på huden etter 7 - 10 dager.
MERK: Vanlige bivirkninger av operasjonen omfatter dannelse av serom eller hematom på snittstedet, riper merker på huden på grunn av kløe forårsaket avde indre absorberbare suturer, subtile sensoriske eller locomotion underskudd, og tegn på selvskading på deafferented poten etter at den dorsale knuseskade. For noen velferdsproblemer som er vesentlig mer alvorlig enn forventet, søke øyeblikkelig veterinær råd.
6. Utførelse av en Antero CTB Injection for aksonal Tracing
NB: Det anbefales å utføre kolera toksin B subenhet (CTB) akson-tracing en uke før vevssamling.
- Fremstill 1% CTB-oppløsning i henhold til produsentens instruksjon.
- Valgfritt: Legg 1% farget fargestoff til løsningen for enkel visualisering av injeksjons senere. Bland løsningen veldig forsiktig.
- Bedøve dyret (se trinn 3.2.1) og stabilisere den venstre forpoten ved taping lem til bordet.
- Manuelt og injiser langsomt 1 pl 1% CTB subkutant inn i sentrum av den glabrous footpad og fire sifre ved hjelp av en mikroliter-sprøyte utstyrt with en skreddersydd, 33-gauge nål kort.
MERK: Før injeksjon, hjelper det å først bruke en 30-gauge nål avfaset for å lage en liten åpning overfladisk på huden, noe som hjelper til med innføringen av injeksjonsnålen. - At dyret kan komme seg helt fra bedøvelsen før retur dyret til holdeområdet.
7. Samle Tissue
- For å samle opp den injiserte virus-DRG og ryggmarg for immunhistokjemi, administrere en overdose av bedøvelse og tran perfuse dyret med fosfat-bufret saltvann, etterfulgt av kald 4% paraformaldehyd. Nøye utføre en fullstendig laminectomy på ryggraden for å samle den faste vevet under et mikroskop. Fortsett med vevspreparatet, snitting og behandling som er nødvendig for analysen 4, 5, 6.
MERK: gjenvinnes snittstedet vil være klart, som observert ved tilstedeværelse av sbil vev. - Alternativt, for å samle det virus injisert DRG for in vitro kultur, ofrer dyret humant med en godkjent metode, for eksempel av en økende konsentrasjon av karbondioksid. Disseker forsiktig DRG under et mikroskop, og sikrer aseptiske betingelser når det er mulig. Fortsett med vevskultur som ønskes 4, 5, 6, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en illustrasjon, er en tverrgående ryggmargen seksjon med den vedlagte DRG presentert for å vise effektiviteten av denne protokollen i transdusering av DRG-neuroner og sporing sensoriske axoner i ryggmargen fire uker etter injisering av en kontrollvirus, AAV5-GFP, direkte inn i C7 DRG uten en dorsal root knuseskade (figur 1A). Aksoner i både dorsale kolonnen og dorsalhornet i ryggmargen uttrykker GFP (figur 1B), samt cellelegemene og aksoner i den injiserte DRG (figur 1C). Ytterligere anatomiske analyse av cuneate kjernen, den sensoriske axon terminalen i hjernestammen, avslører positiv antero CTB tracing (figur 1D).
Når DRG injeksjonen utføres samtidig med en fullstendig C5-C8 dorsale knuseskade, ingen GFP-positive aksoner i ryggmargen eller CTB-positive terminals i cuneate kjernen er observert (figur 2A). Det er imidlertid verdt å påpeke at axotomized sensoriske axoner kan regenerere opp til den dorsale inngangssonen i en fullstendig knust dorsal rot, som er en PNS miljø, men ikke utover inn i ryggmargen 4, 5 (figur 2A). I det tilfelle at det injiserte virus inneholder transgenet til et potensielt vekstfremmende protein, kan nærværet av merkede aksoner i ryggmargen representere enten regenerering eller en ufullstendig dorsal root knuseskade (figur 2B). For å skille mellom disse to resultater, bør CTB aksonal oppsporings i cuneate kjernen skal analyseres. Tilstedeværelsen av CTB-positive terminaler i cuneate kjernen fremhever sannsynligheten for at en ufullstendig skade (figur 2C), mens fraværet av CTB-positive terminaler antyder delvise regenereringen i ryggmargen, som regenererte axonene framsannsynligvis ikke i stand til å vokse hele avstanden for å nå cuneate kjernen (figur 2D). Til dags dato har lykkes sensoriske axon regenerering til cuneate kjernen stort sett blitt rapportert i tilfeller med høy cervical skader 11, 12 eller med bruk av neurotrophins 13, 14. Noen dyr som viser tegn på ufullstendig skade bør utelukkes fra axon regenerering studier.
Figur 1: DRG Injection Uten Dorsal Root klemskade. (AC) ryggmargs snitt som viser GFP-positive aksoner i ryggmargen (A), inkludert de dorsale kolonnen og dorsal horn (B) og cellelegemer i den DRG (C) fire uker etter injeksjon av AAV5-GFP. <strong> (D) CTB-positive sensoriske nervefiberender i cuneate kjernen En uke etter CTB injeksjon. Målestaven er 650 mikrometer (AC) og 250 um (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Vurdering Dorsal Root knusningsskade og Axon Regeneration. (A) En komplett dorsalrot knuse skaden fører ikke noen merket aksoner i ryggmargen eller CTB-positive nervefiberender i cuneate kjernen. Axotomized sensoriske aksoner kan regenerere opp til dorsale inngangssone, men ikke utover i ryggmargen. (BD) Nærværet av merkede aksoner i ryggmargen representerer enten ufullstendig skade eller regeneratimed (B). Med ytterligere analyse, tilstedeværelsen av CTB-positive terminaler i cuneate kjernen antyder ufullstendig skade (C), mens deres fravær antyder fullstendig skade og potensielt delvise regenereringen i ryggmargen (D). Målestaven er 250 pm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en trinn-for-trinn-guide for å utføre en DRG-injeksjon og de dorsale knuseskade i det nedre cervikal ryggmargen til en voksen rotte. Ettersom dette er en svært invasiv og delikat operasjon, anbefaler vi på det sterkeste at alle potensielle brukere får tilstrekkelig opplæring og praksis før fremmarsj å leve dyr operasjon. Brukerne bør være kjent ikke bare med ryggmargs anatomi, men også med de omliggende muskler, ryggvirvel benbygning og blodkar. Ideelt sett, burde en dyktig bruker være i stand til å utføre fremgangsmåten med minimal skade på det omgivende vev, gjennomfører en ren laminektomi ved å fjerne en del av ryggsøylen uten å forårsake noen skade på ryggmargen. Som det fremgår av ryggmargsskader, kan en liten lesjon på ryggmargen har en utbredt skadelig effekt til hele nervesystemet. I tillegg dyr som har gjennomgått en "ren" kirurgi er mindre sannsynlig at lider av uventet post-operative komplikasjoner og velferdsspørsmål og er derfor mindre sannsynlig til å bli ofret før ønsket eksperimentelle tidspunkt.
For administrasjon av viruset inn i nervesystemet, er det noen mulige administrasjonsveier: 15 intravenøse, intraperitoneale 16, intratekal 17, eller direkte injeksjon inn i målet 4, 8. Selv om intravenøse og intraperitoneale injeksjoner er forholdsvis ikke-invasiv, kan kryssing av blod-hjerne-barrieren være et problem 18, og disse rutene resultere i en ikke-spesifikk transduksjon, noe som ikke ville være nyttig i en spesialisert axon regenerering studien. Tilsvarende for intratekal injeksjon i det subarachnoide plass, en mer invasive administrasjonsrute, mange neuronale og ikke-neuronale celletyper innen CNS kan bli transdusert, potensielt generering av ikke-spesifikk eller off-TARGEt effekter. Således er den direkte injeksjon av virus i DRG et gunstig alternativ, og vil sannsynligvis føre til en mye høyere transduksjon virkningsgrad enn andre metoder. Den store ulempen med dette alternativet, er imidlertid invasivitet av den kirurgiske prosedyren, som krever spesialisert trening.
Når brukere har mestret de nødvendige kirurgiske ferdigheter, denne protokollen tilbyr en stor mengde fleksibilitet. I en axon regenerering studie, kan dyrene bli undersøkt i kombinasjon med andre teknikker, slik som in vivo elektro og sensorisk-motoriske adferdstester, mens de oppsamlede vev kan brukes til anatomiske analyse eller vevskultur 4. En kombinasjon av disse teknikker, med ulike eksperimentelle tidspunkter, for eksempel, kan bli anvendt for å studere utviklingen av degenerasjon eller regenerering av forskjellige fiberundertyper, såsom NF200, CGRP, og IB4 etter knuseskade 4. Avhengig av den eksperimentelle requirements, den ene eller den annen av de presenterte prosedyrer kan utføres alene. For eksempel kan DRG injeksjon alene brukes for aksonale Tracing eksperimenter, mens de dorsale knuseskade alene kan brukes i noen studier hvor forpoten deafferentation er nødvendig. I tillegg kan brukerne også variere type virus og transgent produkt for injeksjon, s DRG som skal injiseres, og den eksakte dorsale for skade. Hvis det er aktuelt, kan celletransplantasjon eller farmakologisk administrering inn i den DRG også utføres ved bruk av denne protokollen. Ved å bygge på ervervede kirurgiske ferdigheter, kan en erfaren bruker videre til andre teknikker, slik som DRG injeksjon i korsryggen (f.eks, inn L3 - L5 for å vurdere bakbenet funksjon) 19 eller dorsal kolonne knuseskade, for ytterligere å studere ryggmarg funksjon 5.
Avslutningsvis mener vi at DRG injeksjon og dorsal root knusningsskade å være en nyttig modell for å studere sensoriske axon regeneration. Til tross for behovet for spesialisert opplæring for å utføre den invasive kirurgiske prosedyren, er protokollen fleksibel, og potensielle brukere kan endre mange deler for å tilpasse sine eksperimentelle krav. Disse fremgangsmåtene kan tjene som et fundament for de på jakt etter en egnet dyremodell for sensoriske axon regenerering studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Christopher og Dana Reeve Foundation, Medical Research Council, European Research Council ECMneuro og Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Vi ønsker å uttrykke vår dypeste takknemlighet til Heleen Merel van 't Spijker og Justyna Barratt for deres tekniske assistanse under filmingen. Vi ønsker å takke Dr. Elizabeth Moloney og professor Joost Verhaagen (Nederland Institute for Neuroscience) for å bistå i AAV produksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
