Introduction
El logro de la regeneración axonal después de una lesión del sistema nervioso es una tarea difícil 1. Para estudiar el fracaso de la regeneración axonal en el sistema nervioso central (SNC), los investigadores han utilizado una gran cantidad de modelos de lesión del nervio. Como regiones del SNC difieren, es importante utilizar un modelo anatómicamente apropiado para estudiar la regeneración de axones. Al utilizar el modelo apropiado, los investigadores pueden formular un tratamiento específico basado en la gravedad de la lesión, el tipo de célula neuronal de interés, y el tracto espinal deseada para la evaluación de la regeneración, en contraposición a una estrategia de tratamiento "uno para todos".
En la lesión de la médula espinal, por ejemplo, los síntomas más debilitantes derivan de la pérdida de la sensibilidad y la locomoción. La pérdida de sensibilidad es causada por el daño a las vías sensoriales ascendentes, mientras que la pérdida de la locomoción es causada por el daño a las vías motoras descendentes. Debido a las diferencias anatómicas entre celulares y éstos two vías, muchos estudios de regeneración de los axones dirigidos sólo se centran en una u otra vía, con el argumento de que la recuperación exitosa de cualquiera sería de gran beneficio para los pacientes. En este artículo, se presenta un protocolo que utiliza una inyección directa de ganglios de la raíz dorsal (DRG) con un vector viral y una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal concurrente en la médula espinal cervical inferior de una rata adulta como un modelo para estudiar la regeneración axonal sensorial.
DRG neuronas sensoriales son responsables de la transmisión de información sensorial, como la sensación táctil y el dolor, desde la periferia hacia el sistema nervioso central. Las largas proyecciones axonales de las neuronas sensoriales en la médula espinal sirven como un buen modelo para estudiar a larga distancia la regeneración axonal. Además, como los roedores pueden sobrevivir a una lesión vía sensorial tal como una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal con complicaciones mínimas de bienestar, los investigadores pueden estudiar CNS regeneración axonal sin la necesidad de lesionar completamente la médula espinal. A C5 cuádruple - C8 (l cervicalevel 5 - 8) dorsal lesión por aplastamiento raíz se ha demostrado ser un modelo útil para pata deaferentación 2. Además, una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal proporciona un modelo "más limpia" para estudiar la regeneración axonal de una lesión de la médula espinal directa, ya que no es complicado por otros factores tales como la formación de cicatriz glial.
El uso de la terapia génica viral para reprogramar las neuronas en un estado regenerativo ha sido considerado cada vez más como una estrategia prometedora para el tratamiento de muchos trastornos neurológicos 3. Los estudios han demostrado la aplicación de un vector de virus adeno-asociado (AAV) que lleva el transgén de una proteína promotora del crecimiento puede lograr robusto regeneración axonal con recuperación conductual 4, 5, 6. La aparente baja patogenicidad de AAV en provocar una respuesta inmune y la capacidad de transducir células que no se dividen, tales como neuronas, hacenque el vector óptimo para la terapia génica. Además, la forma de AAV recombinante se utiliza para la terapia. En esta forma, es incapaz de integrar su genoma viral en el genoma huésped 7, reduciendo el riesgo de mutagénesis de inserción en comparación con otros vectores virales, tales como lentivirus. Esto hace que el AAV una opción segura para aplicaciones de terapia génica.
Como DRG contiene los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, es el objetivo anatómico más apropiado para la administración de virus para la terapia génica para estudiar y / o promover la regeneración axonal sensorial. En un estudio comparativo de diferentes serotipos de AAV y lentivirus, AAV de serotipo 5 (AAV5) ha demostrado ser el más eficiente en la transducción de las neuronas DRG más de un curso de tiempo de al menos 12 semanas cuando se inyecta directamente en el DRG 8. Además, AAV puede lograr la eficiencia de transducción de más del 40%, la transducción de todos los subtipos neuronales DRG, como el neurofilamento de gran diámetro 200 kDa(NF200) neuronas positivas y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina de pequeño diámetro (CGRP) - o b4 isolectina (IB4), las neuronas positivas 4, 8.
A medida que el procedimiento quirúrgico de la inyección de DRG y la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal es muy invasivo y delicada, creemos que este artículo va a ayudar a los nuevos usuarios a aprender el procedimiento de una manera muy eficiente. En este artículo, se muestra resultados representativos de ratas adultas cuatro semanas después de la inyección de un virus de control AAV5-GFP (proteína fluorescente verde) en C6 - GRD C7 con un C5 concurrente - C8 de la raíz dorsal lesión por aplastamiento. Este modelo es especialmente adecuado para los investigadores que investigan el uso de la terapia génica viral para promover la regeneración axonal sensorial.
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Protocol
Todos los siguientes procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el Reino Unido Animales (Procedimientos Científicos) Act 1986. Si no está familiarizado con estos procedimientos, por favor consulte con la normativa local / nacional y consultar al veterinario antes de iniciar el protocolo.
1. La elección de una cepa adecuada de los Animales
NOTA: A raíz dorsal resultados lesión por aplastamiento en la pérdida de la sensibilidad y de la pata deaferentación. Los efectos adversos comunes de deaferentación pata pueden incluir exceso de aseo, automutilación, y autotomia pata.
- Obtener animales para el procedimiento.
NOTA: Para las ratas, las cepas más activas, tales como Lister-capucha y Wistar, tienen una mayor incidencia de autotomy pata después de desaferenciación en comparación con las cepas más dóciles, como Lewis y Sprague-Dawley. Si es posible, la cepa más dócil, Lewis, siempre se debe considerar en primer lugar. En caso de ser necesario para el experimento una cepa particularmente activo debido a m genéticaODIFICACIÓN o requisitos de evaluación de comportamiento específicos, tratamiento veterinario deben estar en su lugar para hacer frente a los efectos adversos esperados.
2. Preparación del Virus para Inyección
PRECAUCIÓN: manipule todos los virus de acuerdo con las regulaciones de seguridad biológica y de laboratorio.
- Diluir o concentrar el virus a un título de 2 x 10 copia 12 genoma (GC) / ml siguiendo los protocolos de envasado de virus individuales 9.
NOTA: Aquí, el virus se diluyó en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) con 5% de sacarosa. El título puede tener que ser optimizada en función del tipo de virus, el promotor, la construcción de tamaño, y específica de tipo celular. - Opcional: Añadir 1% de colorante de color (por ejemplo, Fast Green) a la solución de virus para una fácil visualización de la inyección de más adelante. Mezclar la solución muy suavemente.
- Mantener la solución en hielo para uso inmediato (dentro de 4 h) o en un congelador de -80 ° C durante largoalmacenamiento a largo plazo.
3. Realización de la preparación preoperatoria de la Animal
NOTA: Debido a la extrema invasividad de la cirugía, técnicas asépticas deben ser utilizados en todo momento.
- Preparar y esterilizar todas las herramientas quirúrgicas y el marco estereotáxico espinal antes de comenzar la cirugía. Por ejemplo, esterilizar las herramientas en un autoclave a 134 ° C. Use un nuevo conjunto de herramientas esterilizadas para cada animal.
- Anestesiar al animal. Confirmar la anestesia adecuada pellizcando la pata para probar el reflejo de retirada o tocando la córnea para el reflejo palpebral.
- Para ratas adultas utilizando anestesia de inhalación tales como el isoflurano, utilizar 4% de isoflurano en 2,0 L / min de oxígeno para la inducción. Para el mantenimiento durante toda la cirugía, utilizar 2 - 3% isoflurano en 1,5 L / min de oxígeno, la variación de la concentración de isoflurano de acuerdo con el patrón de respiración del animal para evitar la dosificación bajo-sobre-o.
- EnCE El animal se anestesió inicialmente, registrar el peso preoperatoria del animal.
- Para la inyección de DRG cervical, rasurar la piel en el cuello de entre los oídos para justo distal a la escápula. Desinfectar la zona afeitada con un producto antiséptico.
- Inyectar 2 ml de solución salina por vía subcutánea en el flanco del animal, junto con una dosis apropiada de analgésico (por ejemplo, 5 mg / kg carprofeno) y antibióticos (por ejemplo, 5 mg / kg de enrofloxacino).
- Aplicar ungüento para los ojos tanto a los ojos para evitar el secado corneal durante el procedimiento.
- Proceder a la cirugía en un marco estereotáxico espinal con una almohadilla de calentamiento a 37 ° C colocado por debajo de la animal.
4. La inyección de DRG y la realización de una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal
NOTA: Esta es una cirugía extremadamente delicada. Es aconsejable practicar en unos pocos animales muertos primero para familiarizarse con la anatomía antes de avanzar a vivir la cirugía animal.
- LOcate los prominentes apófisis espinosas C2 y T2 sobre la piel. Hacer una incisión en la piel entre las apófisis espinosas C2 y T2 con una cuchilla de bisturí no.10 (una vez que se abre la piel, una línea media blanco, de tejido fibroso debe ser visible en la primera capa de músculo, la primera capa de músculo tiene una " gelatinosa" textura).
- Haga una incisión de tamaño similar en la primera capa de músculo a lo largo de la línea media blanco utilizando una hoja de bisturí. No vaya más allá de la prominente apófisis espinosa T2, ya que hay una gran rama arterial de la aorta descendente ubicada cerca de allí.
NOTA: El sangrado abundante puede ocurrir en cualquier lugar de este paso adelante. Siempre detener el sangrado y extraer la sangre mediante el uso de bastoncillos de algodón esterilizados o esponjas absorbibles quirúrgicos para permitir una visualización clara en todo momento. Continuar con el procedimiento "a ciegas" puede resultar en daños no deseados a la médula espinal, DRG, o la raíz dorsal, dando lugar a efectos adversos inesperados en el animal más adelante. - retraer elprimera capa de músculo usando dos retractores, uno colocado rostral y un caudal; la segunda capa de músculo, con una apariencia estriada, debe ser visible.
- Busque la línea media de la segunda capa de músculo (donde se pueden observar dos músculos longitudinales conectados por un tejido delgado, membranosa). Diseccionar el tejido membranoso usando un par de microtijeras para separar los dos músculos longitudinales. Evitar el uso de una hoja de bisturí, si es posible, ya que esto puede resultar en daño muscular innecesaria y sangrado.
- Ajuste los retractores en consecuencia para exponer la tercera capa de músculo delgada que cubre la columna vertebral. Las apófisis espinosas se pueden sentir por tocando ligeramente con un par de pinzas sobre la tercera capa de músculo.
- Hacer una pequeña incisión en la tercera capa de músculo usando micro tijeras y suavemente raspar el músculo del hueso usando una cureta o escalpelo de una manera sideway para exponer claramente las vértebras. Si es necesario, cortar una parte del músculo o tendón de distancia para hacer la Laminectomy más fácil.
- Para exponer la C5 izquierda - GRD C8, realizar una hemi-laminectomía izquierdo en el C4 - vértebras T1 eliminando cuidadosamente parte de la lámina y pedículo usando un par de pinzas gubias finas. El DRG se encuentra cerca del foramen transversas de las vértebras.
NOTA: C3 - C7 vértebras no tienen una apófisis espinosa prominente. El C5 DRG está situado entre el C4 y C5 vértebras, el C6 DRG es entre el C5 y C6 vértebras, y así sucesivamente, mientras que el C8 DRG es entre el C7 y T1 vértebras. No hay vértebra C8, a pesar de la presencia de un DRG C8 y un segmento de médula espinal C8. - Una vez suficiente de la DRG ha sido expuesto para inyección, preparar la jeringa mediante la colocación de la jeringa de microlitros lleno virus-equipada con una aguja a medida, de calibre 33 roma en el soporte de jeringa estereotáxica. Antes de la inyección, utilizar una aguja biselada de calibre 30 para hacer una pequeña abertura superficial sobre cada uno de los DRG apuntado para ayudar con la inserción de la aguja de inyección.
- Insertar el 33-gaguja auge en el centro de la DRG girando la perillas suavemente para ajustar las coordenadas estereotáxicas. No sobre-insertar la aguja, ya que esto puede hacer que el líquido se escape hacia fuera desde el lado ventral de la DRG. En caso de fugas se producen, ajustar la posición de la aguja inmediatamente.
NOTA: Las coordenadas estereotáxicas numéricos no se utilizan; sin embargo, es útil utilizar el bastidor para sujetar la aguja para la inyección. - Inyectar 1 l de virus en cada DRG a 0,2 l / min usando una bomba de jeringa de infusión. Espere tres minutos adicionales antes de retirar la aguja. Durante la inyección, los GRD va a cambiar lentamente de color si la solución virus contiene un tinte de color.
- Para realizar una C5 concurrente - C8 lesión por aplastamiento de la raíz dorsal, aplastar cada raíz tres veces para 10 s cada uno usando un par de pinzas de punta fina (Bonn Micro), opuestos los extremos de las pinzas completamente; una línea blanca en el tejido debería aparecer en el sitio de aplastamiento. No ir más profundo que requiere con el forceps, ya que esto puede causar daños a la raíz ventral.
- Después de la inyección y / o aplastamiento, asegúrese de que no hay sangrado o pequeños trozos de fragmentos óseos dejados en el lugar de la incisión antes de cerrar el animal. Si se prefiere, colocar un pequeño trozo de esponja absorbible quirúrgico en la parte superior de la médula espinal expuesta y DRG.
- Dejar que la tercera capa del músculo se retraiga de nuevo de forma natural en la columna vertebral sin sutura. suturar sin apretar los dos músculos longitudinales sobre la segunda capa (≈ 3 suturas interrumpidas) con material 6-0 sutura absorbible. Suturar la primera capa de músculo (≈ 5 suturas interrumpidas) con material 6-0 sutura absorbible.
- Suturar la piel con material absorbible 5-0 sutura (≈ 10 suturas interrumpidas).
NOTA: Asegúrese de que las suturas no están demasiado ajustadas. Protrusión de la piel es una señal de exceso de apriete y puede causar incomodidad para el animal. - Si se ha producido sangrado intenso durante la cirugía, por vía subcutánea inyectar 1 - 2ml de solución salina para reponer la pérdida de líquido del animal según lo permitido por las normas locales.
- Proporcionar gel hidratante comestible y permitir que el animal se recupere completamente de la anestesia, la realización de un seguimiento regular durante al menos 1 h antes de volver al animal de nuevo a la zona de espera.
- Mantenga al animal durante al menos 3 semanas para la expresión del transgén óptima con el fin regeneración axonal sensorial.
5. Realización de atención post-operatoria de los Animales
- Proporcionar puré de alimentos y ropa de cama de algodón suave para el animal durante la primera semana posterior a la cirugía. Si es necesario, administrar dosis adicionales de analgésicos y antibióticos para ayudar a la recuperación de conformidad con los reglamentos locales / nacionales y asesoramiento veterinario.
- Retire las suturas en la piel después de 7 - 10 días.
NOTA: Los efectos adversos más comunes de la cirugía incluyen la formación de seroma o hematoma en el lugar de la incisión, se rascan las marcas en la piel debido a la picazón causada porlas suturas internas absorbibles, déficits sensoriales o de locomoción sutiles, y signos de automutilación en la pata deafferented después de la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal. Para cualquier problema de bienestar que son sustancialmente más severa de lo esperado, consulte a su veterinario inmediatamente.
6. Realización de una inyección anterógrada CTB para el trazado axonal
NOTA: Se recomienda realizar axonal toxina del cólera subunidad B (CTB) trazando una semana antes de la recogida de tejidos.
- Prepare la solución de CTB 1% según las instrucciones del fabricante.
- Opcional: Añadir tinte de color 1% a la solución para una fácil visualización de la inyección de más adelante. Mezclar la solución muy suavemente.
- Anestesiar al animal (véase la etapa 3.2.1) y estabilizar la pata delantera izquierda con cinta adhesiva la extremidad a la mesa.
- Manualmente e inyecte lentamente 1 l de 1% CTB por vía subcutánea en el centro de la almohadilla de la pata glabros y cuatro dígitos usando una wi microjeringa equipadoth a, aguja corta de calibre 33 a medida.
NOTA: Antes de la inyección, que ayuda a utilizar primero una aguja biselada calibre 30 para hacer una pequeña abertura superficial en la piel, que ayuda con la inserción de la aguja de inyección. - Permitir que el animal se recupere completamente de la anestesia antes de devolver el animal a la zona de espera.
7. recogida de tejido
- Para recoger el DRG inyectado virus-y la médula espinal para inmunohistoquímica, administrar una sobredosis de anestésico y transcardially perfundir el animal con solución salina tamponada con fosfato seguido de frío 4% de paraformaldehído. realizar cuidadosamente una laminectomía completa en la columna vertebral para recoger el tejido fijado bajo un microscopio. Proceder con la preparación del tejido, seccionamiento, y el procesamiento como se requiere para el análisis de 4, 5, 6.
NOTA: El sitio de la incisión recuperado debe ser evidente, como se observa por la presencia de spañuelos coche. - Alternativamente, para recoger el DRG inyectado virus-para el cultivo in vitro, sacrificar el animal humano con un método aprobado, tal como una concentración creciente de dióxido de carbono. Cuidadosamente diseccionar el DRG bajo un microscopio, asegurando condiciones asépticas siempre que sea posible. Proceder con el cultivo de tejidos según se desee 4, 5, 6, 10.
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Representative Results
Como una representación, una sección de la médula espinal transversal con el DRG adjunto se presenta para mostrar la eficacia de este protocolo en la transducción de las neuronas DRG y el rastreo de los axones sensoriales en la médula espinal cuatro semanas después de la inyección de un virus de control, AAV5-GFP, directamente en el C7 DRG sin una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal (Figura 1A). Los axones tanto en la columna dorsal y el cuerno dorsal de la médula espinal expresan GFP (Figura 1B), así como los cuerpos celulares y axones dentro del DRG inyectada (Figura 1C). Análisis anatómico adicional del núcleo cuneiforme, el axón terminal sensorial en el tronco cerebral, revela anterógrada positivo CTB rastreo (Figura 1D).
Cuando la inyección de DRG se lleva a cabo simultáneamente con una lesión completa aplastamiento de la raíz dorsal C5-C8, no hay axones GFP-positivas en la médula espinal o terminal CTB-positivos en el núcleo cuneiforme se observó (Figura 2A). Sin embargo, vale la pena señalar que los axones sensoriales axotomizadas todavía pueden regenerarse hasta la zona de entrada de la raíz dorsal en una raíz dorsal completamente aplastado, que es un entorno de PNS, pero no más allá en la médula espinal 4, 5 (Figura 2A). En el caso de que el virus inyectado contiene el transgén de una proteína potencial de promoción del crecimiento, la presencia de axones marcados en la médula espinal puede representar ya sea la regeneración o una lesión por aplastamiento de la raíz dorsal incompletos (Figura 2B). Para discriminar entre estos dos resultados, CTB trazado axonal en el núcleo cuneate debe ser analizado. La presencia de terminales de CTB-positivas en el núcleo cuneate pone de manifiesto la probabilidad de una lesión incompleta (Figura 2C), mientras que la ausencia de terminales de CTB-positivas sugiere regeneración parcial en la médula espinal, como axones regeneradoses probable incapaces de crecer toda la distancia para alcanzar el núcleo cuneiforme (Figura 2D). Hasta la fecha, el éxito de la regeneración axonal sensorial al núcleo cuneiforme en su mayoría se ha informado en los casos con alto lesión cervical 11, 12 o con la aplicación de las neurotrofinas 13, 14. Todo tipo de animales que muestran signos de lesión incompleta deben ser excluidos de los estudios de regeneración del axón.
Figura 1: DRG inyección sin una lesión por aplastamiento de raíz dorsal. (AC) sección de la médula espinal que muestra axones GFP-positivas en la médula espinal (A), incluyendo la columna dorsal y dorsal horn (B) y cuerpos celulares en el DRG (C) cuatro semanas después de la inyección de AAV5-GFP. <strong> (D) positivos CTB-terminales de los axones sensoriales en el núcleo cuneiforme de una semana después de la inyección CTB. La barra de escala es de 650 m (AC) y 250 m (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la raíz dorsal lesión por aplastamiento y Axon Regeneración. (A) un completo de la raíz dorsal resultados lesión por aplastamiento en ningún axones marcados en la médula espinal o terminales de los axones CTB-positivas en el núcleo cuneiforme. axones sensoriales axotomizadas pueden regenerarse hasta la zona de entrada de la raíz dorsal, pero no más allá en la médula espinal. (BD) La presencia de los axones marcados en la médula espinal representa o bien lesión incompleta o regeneratien (B). Con el análisis adicional, la presencia de terminales de CTB-positivas en el núcleo cuneate sugiere lesión incompleta (C), mientras que su ausencia sugiere lesión completa y regeneración potencialmente parcial en la médula espinal (D). La barra de escala es de 250 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo, se presentan una guía paso a paso para llevar a cabo una inyección de DRG y la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal de la médula espinal cervical inferior de una rata adulta. Como se trata de una cirugía muy invasiva y delicado, se recomienda encarecidamente que todos los usuarios potenciales obtengan la suficiente formación y la práctica antes de avanzar a vivir la cirugía animal. Los usuarios deben estar familiarizados no sólo con la anatomía de la médula espinal, pero también con los tejidos que rodean los músculos, la estructura ósea vertebral, y la vasculatura. Idealmente, un usuario competente debe ser capaz de realizar el procedimiento con un daño mínimo a los tejidos circundantes, la realización de una laminectomía limpio mediante la eliminación de parte de las vértebras sin inducir ningún daño a la médula espinal. Como es evidente de lesión de la médula espinal, una pequeña lesión en la médula espinal puede tener un efecto perjudicial extendido a todo el sistema nervioso. Además, los animales que han sido sometidos a una cirugía de "limpia" son menos propensos a sufrir de post- inesperadocomplicaciones operatorias y cuestiones de bienestar y son por lo tanto menos probabilidades de tener que ser sacrificados antes del punto de tiempo experimental deseado.
Para administrar virus en el sistema nervioso, hay algunas rutas posibles de administración: intravenosa 15, intraperitoneal 16, intratecal 17, o inyección directa en el objetivo 4, 8. Aunque las inyecciones intravenosas e intraperitoneales son relativamente no invasiva, el cruce de la barrera hematoencefálica puede ser un problema 18, y estas rutas como resultado la transducción no específica, lo cual no sería útil en un estudio especializado regeneración axonal. Del mismo modo, para la inyección intratecal en el espacio subaracnoideo, una ruta de administración más invasivo, muchos tipos de células neuronales y no neuronales en el SNC pueden ser transducidas, potencialmente generar no específica o fuera de targeefectos t. Por lo tanto, la inyección directa de virus en el DRG es una opción favorable y es probable que resulte en una eficiencia de transducción mucho mayor que otros métodos. El principal inconveniente de esta opción, sin embargo, es la invasividad del procedimiento quirúrgico, que requiere una formación especializada.
Una vez que los usuarios han llegado a dominar las habilidades quirúrgicas necesarias, este protocolo ofrece una gran cantidad de flexibilidad. En un estudio de la regeneración de axones, los animales pueden ser estudiados en combinación con otras técnicas, tales como in vivo electrofisiología y pruebas de comportamiento sensorial-motor, mientras que los tejidos recogidos se pueden utilizar para el análisis anatómico o de cultivo de tejidos 4. Una combinación de estas técnicas, con puntos de tiempo experimentales variadas, por ejemplo, se puede utilizar para estudiar el progreso de la degeneración o la regeneración de los diferentes subtipos de fibra, tales como NF200, CGRP, y IB4 después de la lesión por aplastamiento 4. Dependiendo de la requireme experimentalnts, uno u otro de los procedimientos presentados pueden llevarse a cabo solo. Por ejemplo, la inyección de DRG solo se puede utilizar para experimentos de rastreo axonal, mientras que la lesión por aplastamiento de la raíz dorsal solo se puede utilizar en todos los estudios que se requiere deaferentación pata delantera. Además, los usuarios también pueden variar el tipo de virus y producto transgénico para la inyección, el DRG exacta para ser inyectado, y la raíz dorsal exacta de la lesión. Si procede, el trasplante de células o la administración farmacológica en el DRG también se pueden realizar usando este protocolo. Basándose en habilidades quirúrgicas adquiridos, un usuario experimentado puede proceder a otras técnicas, tales como la inyección de DRG en la región lumbar (por ejemplo, en L3 - L5 para evaluar la función de las extremidades posteriores) 19 o columna dorsal lesión por aplastamiento, para estudiar aún más la función de la médula espinal 5.
En conclusión, creemos que la inyección de DRG y dorsal lesión por aplastamiento raíz a ser un modelo útil para estudiar reg axón sensorialeneration. A pesar de la necesidad de formación especializada para realizar el procedimiento quirúrgico invasivo, el protocolo es flexible, y los usuarios potenciales puede modificar muchas partes para acomodar sus necesidades experimentales. Estos procedimientos pueden servir como una base para aquellos en busca de un modelo animal adecuado para estudios de regeneración de los axones sensoriales.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas del Centro de Investigación Biomédica de Cambridge NHMRC Fundación Christopher y Dana Reeve, el Consejo de Investigación Médica, el Consejo de Investigación ECMneuro Europea, y. Nos gustaría expresar nuestro más profundo agradecimiento a Heleen Merel van 't Spijker y Justyna Barratt por su asistencia técnica durante el rodaje. Nos gustaría agradecer a la doctora Elizabeth Moloney y Profesor Joost Verhaagen (Instituto Holandés de Neurociencia) para ayudar en la producción de AAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
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