Immunofluorescens Analyse af Stress Granulformation Efter Bakteriel Udfordring af Pattedyrceller

Summary

Vi beskriver en metode til den kvalitative og kvantitative analyse af spændingsgranuldannelse i pattedyrsceller, efter at cellerne er udfordret med bakterier og en række forskellige belastninger. Denne protokol kan anvendes til at undersøge det cellulære stress-granuleringsrespons i en bred vifte af værtsbakterielle interaktioner.

Abstract

Fluorescerende billeddannelse af cellulære komponenter er et effektivt redskab til at undersøge værtspatogen-interaktioner. Patogener kan påvirke mange forskellige træk ved inficerede celler, herunder organelle-ultrastruktur, cytoskeletal netværksorganisation, såvel som cellulære processer som Stress Granule (SG) formation. Karakteriseringen af, hvordan patogener undergraver værtsprocesser er en vigtig og integreret del af patogenesen. Mens variable fænotyper let kan ses, er den nøjagtige analyse af de kvalitative og kvantitative forskelle i de cellulære strukturer induceret ved patogenudfordring afgørende for at definere statistisk signifikante forskelle mellem eksperimentelle og kontrolprøver. SG-dannelse er et evolutionært konserveret stressrespons, der fører til antivirale reaktioner og er længe blevet undersøgt ved brug af virale infektioner ¹ . SG-dannelse påvirker også signaleringskaskader og kan have andre stadig ukendte konseqUences ² . Karakteriseringen af ​​dette stressrespons til andre patogener end vira, såsom bakteriepatogener, er i øjeblikket et voksende forskningsområde ³ . For tiden er kvantitativ og kvalitativ analyse af SG-dannelsen endnu ikke rutinemæssigt anvendt, selv i virussystemerne. Her beskriver vi en simpel metode til at fremkalde og karakterisere SG-dannelse i uinficerede celler og i celler inficeret med et cytosolisk bakterielt patogen, hvilket påvirker dannelsen af ​​SG'er som reaktion på forskellige eksogene stress. Analyse af SG dannelse og sammensætning opnås ved at anvende et antal forskellige SG markører og stedet detektor plugin i ICY, et open source image analyse værktøj.

Introduction

Visualisering af værtspatogen-interaktioner på et cellulært niveau er en stærk metode til at få indsigt i patogene strategier og til at identificere nøglecellulære veje. Faktisk kan patogener bruges som redskaber til at bestemme vigtige cellulære mål eller strukturer, da patogener har udviklet sig til at undergrave centrale cellulære processer som en strategi for deres egen overlevelse eller udbredelse. Visualisering af cellulære komponenter kan opnås ved rekombinant ekspression af fluorescensmærket hostproteiner. Selvom dette tillader realtidsanalyse, er frembringelsen af ​​cellelinier med specifikt mærket hostproteiner yderst arbejdskrævende og kan resultere i uønskede bivirkninger. Mere praktisk er detektion af cellulære faktorer ved anvendelse af specifikke antistoffer, fordi flere værtsfaktorer kan analyseres samtidigt, og en er ikke begrænset til en bestemt celletype. En ulempe er, at kun en statisk visning kan indfanges, da immunofluorescensanalyse nødvendiggør værtscellefixation. Imidlertid er en vigtig fordel ved immunofluorescensbilleddannelse, at den let udmærker sig til både kvalitativ og kvantitativ analyse. Dette kan igen bruges til at opnå statistisk signifikante forskelle for at give nye indsigter i værtspatogeninteraktioner.

Fluorescerende billedanalyseprogrammer er kraftfulde analytiske værktøjer til udførelse af 3D- og 4D-analyse. Men de høje omkostninger ved software og vedligeholdelse gør metoder baseret på fri open source-software mere generelt attraktiv. Omhyggelig billedanalyse ved hjælp af bioanalysesoftware er værdifuld, da den understøtter visuel analyse og ved tildeling af statistiske signifikanser øger tilliden til korrektiteten af ​​en given fænotype. Tidligere er SG'er blevet analyseret ved hjælp af den gratis ImageJ-software, som nødvendiggør den manuelle identifikation af individuelle SG'er ⁴ . Her tilvejebringer vi en protokol til induktion og analyse af cellulær SG-dannelse i sammenhæng med bacTerielle infektioner ved hjælp af den gratis open source bio-image analyse software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Bio-image analyse software har et indbygget spot detektor program, der er yderst velegnet til SG analyse. Det gør det muligt at finjustere den automatiserede detekteringsproces i bestemte interesserede interesser (ROI'er). Dette overvinder behovet for manuel analyse af individuelle SG'er og fjerner prøveudtagning.

Mange miljøbelastninger fremkalder dannelsen af ​​SG'er, som er fasetætte cytosoliske, ikke-membranøse strukturer på 0,2 - 5 μm i diameter ^{5 , 6} . Denne cellulære respons bevares evolutionært i gær, planter og pattedyr og opstår, når global proteinoversættelse er hæmmet. Det indebærer aggregering af stablede translationsinitieringskomplekser i SG'er, der betragtes som holdingssteder for translationelt inaktive mRNA'er, hvilket tillader selektiv translation af en delmængde af cellulære mRNA'er.Efter fjernelse af stress opløses SG'er og globale hastigheder for proteinsyntese genoptages. SG'er er sammensat af translationsforlængelsesinitieringsfaktorer, proteiner involveret i RNA-metabolisme, RNA-bindende proteiner, såvel som stilladsproteiner og faktorer involveret i værtscellesignalering ² , skønt den nøjagtige sammensætning kan variere afhængigt af den påførte belastning. Miljøfaktorer, som fremkalder SG-dannelse, omfatter aminosyre sult, UV-bestråling, varmeskok, osmotisk shock, endoplasmatisk retikulumspænding, hypoxi og viral infektion ^{2 , 7 , 8} . Der er gjort store fremskridt med at forstå, hvordan vira inducerer og undergraver også SG-dannelse, mens der endnu ikke er meget kendt, hvordan andre patogener, såsom bakterielle, svampe- eller protozoanpatogener, påvirker dette cellulære stressrespons ^{1 , 7} .

ShigeLla flexneri er et gram-negativt fakultativt cytosolisk patogen hos mennesker og det forårsagende middel til svær diarré eller shigellose. Shigellose er en stor folkesundhedsbyrde og fører til 28.000 dødsfald årligt hos børn under 5 år ^{9 , 10 år} . S. flexneri inficerer colonepitelet og spredes celle-til-celle ved at kapre værtens cytoskeletalkomponenter ^{11 , 12} . Infektion af epitelet understøtter replikationen af S. flexneri inden for cytosolen, men inficerede makrofager dør gennem en inflammatorisk celledødsproces kaldet pyroptose. Infektion fører til en massiv rekruttering af neutrofiler og svær inflammation, der ledsages af varme, oxidativ stress og ødelæggelse af væv. Således, mens inficerede celler er underkastet interne spændinger induceret af infektion, såsom Golgi-afbrydelse, genotoksisk stress og cytoskeletisk omlejringS, inficerede celler er også udsat for miljøbelastninger på grund af den inflammatoriske proces.

Karakterisering af effekten af S. flexneri infektion på cellernes evne til at reagere på miljøbelastninger ved anvendelse af et antal SG markører har vist, at infektion fører til kvalitative og kvantitative forskelle i SG-sammensætning ³ . Imidlertid er lille kendt om andre bakterielle patogener. Her beskriver vi en metode til infektion af værtsceller med cytosolisk patogen S. flexneri , stress af celler med forskellige miljøbelastninger, mærkning af SG-komponenter og den kvalitative og kvantitative analyse af SG-dannelse og sammensætning i forbindelse med inficerede Og ikke-inficerede celler. Denne metode er meget anvendelig for andre bakterielle patogener. Derudover kan billedanalysen af ​​SG-dannelsen anvendes til infektioner af virus eller andre patogener. Det kan bruges til at analysere SGDannelse ved infektion eller effekten af ​​infektion på SG-dannelse som reaktion på eksogene stress.

Protocol

1. Fremstilling af bakterier og værtsceller

1. Overfør 12 eller 14 mm glasdækslister i henholdsvis 24- eller 12-brøndsplader med sterile pincet, der tæller en brønd pr. Eksperimentel tilstand. Steriliser disse ved UV-behandling i en vævskulturhætte i 15 minutter.
   BEMÆRK: Inkluder kontrolbrønde for bakteriel udfordring og for SG induktion ved eksogene stress.
2. Til en 24-brønds plade med 12 mm dækslip, frø 1 x 10 ⁵ pattedyrsceller ( f.eks. HeLa-celler) på coverlips; Tryk dækslipene ned med en steril pipettespids. Lad celler klæbe natten over ved 37 ° C i en 5% CO ₂ vævskultur inkubator i dyrkningsmedium, der er passende for hver celletype.
   BEMÆRK: Pladesceller, således at sammenløbet mellem celler er mellem 40 og 60% den følgende dag.
   1. For HeLa-celler inkuberes i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) og 10% dekomplementeret føtal kalvserum (FCS).Dekomplementere FCS ved opvarmning i 30 minutter i et 56 ° C vandbad, hvirvler serumet en gang efter 15 minutter.
3. For at udstråle bakterier skal du bruge en steril pipettespids til at fjerne en lille mængde fra en bakteriel glycerolbestand (20% glycerol), der er opbevaret i en -80 ° C fryser, og læg den på en mærket plade. Brug en steril sløjfe til at sprede bakterierne over ca. 10% af pladen. Brug en ny steril løkke og træk den gennem smøret for at lave 3 parallelle linjer, en halv plade lang. Strik gennem disse linjer, der dækker resten af ​​pladen. Inkubér plade O / N ved 37 ° C.
   1. Vælg en enkelt bakteriekoloni ( f.eks. S. flexneri ) fra den nystribede plade. Undgå at arbejde med bakteriekolonier ældre end 1 uge.
   2. For S. flexneri stamme M90T inokulere en rød koloni fra en nystribet tryptisk Soy Agar-0,1% Congo rød agarplade i 8 ml Tryptic Soy bouillon i et 15 ml rør; Stram låget og inkubér rysten ved 222 o / min O / N ved 30 ° C6; C.
      FORSIGTIG: Brug ikke store hvide kolonier, da de har mistet virulensplasmidet og ikke er infektive.

2. Bakteriel udfordring af værtsceller

1. Forbered bakterier for at maksimere infektionspotentialet.
   1. For S. flexneri subkultur bakterier ved at tilsætte 150 μl O / N kultur til 8 ml Tryptic Soy Agar og inkubere omrystning 222 omdr./min. Ved 37 ° C til sen eksponentiel fase (~ 2 timer) for at inducere virulensgenekspression og forøge infektion.
      1. Når kulturen er ved en optisk tæthed mellem 0,6 og 0,9 (målt ved 600 nm), overfør 1 ml kultur til et 1,5 ml rør. Pellet bakterier i 2 minutter ved 8.000 xg og resuspenderes i infektionsmedium (DMEM med NEAA, mangler FCS) ved OD ₆₀₀ = 1. Således, hvis OD ₆₀₀ er 0,85, resuspenderes i 850 μl.
         BEMÆRK: For S. flexneri ved OD ₆₀₀ = 1 vil der være 8 x 10 ⁸ bakterier per ml, nårDyrket i 8 ml medium. En multiplikation af infektion (MOI) på 20 er passende. For andre patogener skal antallet af bakterier pr. Ml ved en OD ₆₀₀ og det passende MOI bestemmes empirisk.
   2. For at forbedre bakterie-værtsinteraktioner, belæg bakterier med Poly-L-Lysin (PLL).
      BEMÆRK: PLL-behandling af S. flexneri havde ingen effekt på SG-dynamikken. Andre patogener skal vurderes for deres evne til PLL behandling.
      1. For at belægge bakterier med PLL, centrifuger 1 ml bakteriekultur i 2 minutter ved 8.000 xg og resuspender derefter pelleten i 10 μg / ml PLL i phosphatbufferet saltvand (PBS) ved en OD ₆₀₀ = 1.
      2. Tilsæt bakterieopløsningen til en lille skål, f.eks. En brønd i en 12-brønds plade, og inkuber ved RT (~ 20 ° C) i 10 minutter med forsigtig omrøring på en pladeskakeren.
      3. Pellet bakterier i 2 minutter ved 8.000 xg, fjern overskydende PLL. Resuspender pelleten i 1 ml PBS anD Gentag dette vaske trin to gange. Efter den endelige vask resuspenderes i infektionsmedium ved OD ₆₀₀ = 1.
         BEMÆRK: Her er infektionsmediet for S. flexneri værtscellemedium med 20 mM HEPES uden FCS.
2. Forbered celler til bakteriel udfordring.
   1. Fjern medium fra pattedyr HeLa celler ved hjælp af en sugepumpe. Tilsæt 500 μL RT HeLa cellemedium for at vaske cellerne, hvirvel, fjern medium ved hjælp af en sugepumpe og udskift med 500 μL RT passende infektionsmedium ( fx værtscellemedium med 20 mM HEPES uden FCS).
   2. BEMÆRK: For alle vask trin skal du arbejde hurtigt og kun behandle op til 4 dæksler ad gangen for at undgå udtørring af cellerne.
3. Udfordre forberedte HeLa celler med bakterier til at inficere 20-50% af cellerne.
   BEMÆRK: Den relevante tid og MOI skal bestemmes for hver bakterieart. Generelt er en god start 30 min ved 37° C med en MOI på 10.
   1. For S. flexneri udfordrer HeLa celler celler ved hjælp af en af ​​de to metoder (trin 2.3.1.1 eller 2.3.1.2).
      1. Spin-non-PLL-behandlede bakterier (20 μl OD ₆₀₀ = 1 / brønd af 24 brønds plade i 500 μl medium) på celler i 10 minutter ved 13000 x g.
      2. Tilsæt PLL-belagte bakterier (15 μl OD ₆₀₀ = 1 / brønd af 24 brøndsplader i 500 μl medium) i 15 minutter ved stuetemperatur for at tillade bakterier at sedere på celler.
   2. Tillad infektionen at forekomme ved at placere celler med aflejrede bakterier i en 37 ° C vævskultur-inkubator i 30 minutter.
      BEMÆRK: Ved korte tidspunkter synkroniseres S. flexneri- infektion ved at placere plader i et 37 ° C vandbad i 15 minutter i stedet for i vævskulturkuvøsen.
4. Stop infektion ved at vaske celler.
   1. For at vaske celler og fjerne overskydende bakterier, fjern mediet ved hjælp af en sugepumpe, tilsæt 1 mlFrisk forvarmet (37 ° C) HeLa dyrkningsmedium (DMEM, 10% FCS, NEAA). Skær mediet, fjern og udskift med frisk medium. Gentag to gange, og lad frisk medium være på cellerne.
      1. For S. flexneri eller andre intracellulære bakterier, efter infektion af HeLa-celler og vaskerne, erstatter medium med standardvævskulturmedium indeholdende 50 μg / ml gentamicin for at dræbe ekstracellulære bakterier og forhindre yderligere celleinvasion.
         BEMÆRK: Tilsæt ikke antibiotika i mediet for ekstracellulære bakterier.
5. Inkuber bakterier med celler i den ønskede mængde tid i en vævskultur inkubator.
   BEMÆRK: For S. flexneri kan infektion være så lang som 6 timer afhængig af celletypen. For HeLa celler, lad infektion fortsætte i 1,5-2 h før tilsætning af eksogene stress for at inducere SG dannelse. For Caco-2-infektioner, hvor Shigella spredes celle-til-celle, inficeres i 30 minutter til 6 timer, før der tilsættes eksogen stress. CeLls kan fastsættes på dette tidspunkt uden at tilføje eksogene stress for at vurdere dannelsen af ​​SG'er som følge af bakterieinfektionen (i så fald fortsæt til afsnit 4).

3. Inducing Stress Granule Formation ved Tilsætning af Eksogene Stressorer

1. Fjern mediet fra inficerede og ikke-inficerede HeLa-celler ved hjælp af en sugepumpe, udskift medium med 500 μL passende medium med eller uden stressor og inkuber.
   BEMÆRK: Stressinducerende tilstande omfatter følgende (se nedenfor). For yderligere behandlinger se Kedersha et al . ¹³ .
   1. Til varmchokbehandling skal der anvendes almindeligt medium indeholdende 20 mM HEPES og anbring pladen i 44 ° C vandbad i 30 minutter.
   2. For behandling med clotrimazol (inducerer mitokondriel stress), brug regelmæssigt medium uden FCS med 20 μM clotrimazol og inkuber i en vævskulturinkubator i 1 time.
      BEMÆRK: Gem alikvoter af engangsbrug på 20 mM clotrimazol stamme i dimethylsulfoxid (DMSO) ved -20 ° C i op til 4 måneder. Brug DMSO-vehikel til kontrolceller.
   3. Ved behandling med arsenit (inducerer oxidativ stress) skal der anvendes regelmæssigt medium med 0,5 μM arsenit og inkuberes i vævskultur-inkubator i 1 time.
      BEMÆRK: Gem alikvoter med engangsbrug på 0,5 mM arsenitlager ved -20 ° C i op til 6 måneder.
      FORSIGTIG: Clotrimazol og arsenit er skadelige og miljøfarlige og skal bortskaffes på passende vis.
   4. For behandling med DesMethyl Des-Amino (DMDA) -patamin (hæmmer eukaryotisk translationsinitiering), brug regelmæssigt medium med 50-200 nM DMDA-pateamin og inkuber i vævskultur inkubator i 1 time.
      BEMÆRK: Opbevar DMDA-pateamin ved -80 ° C. Opbevar reagenser som små portioner for at undgå frysning optøning.

4. Fastgørelse og immunfluorescensanalyse af stress-granulatdannelse

BEMÆRK: Foretag kontrollen ogEksperimentelle coverlips på samme tid for at undgå farveskillede forskelle, der kan påvirke billedanalyse i efterfølgende trin. Kontrolprøverne indbefatter ingen infektion med og uden SG inducerende behandling og inficerede prøver med og uden SG-inducerende behandling.

1. Fjern mediet fuldstændigt ved hjælp af en sugepumpe og fiks prøver ved at tilsætte 0,5 ml RT 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Inkubér i 30 minutter ved stuetemperatur.
   FORSIGTIG: PFA er skadelig for håndtereren og miljøet. Tag passende foranstaltninger for at beskytte håndtereren og bortskaffe med kemisk affald.
   OBS: Alternativt fikseres i 15 minutter og erstattes derefter med -20 ° C forkølet methanol i 10 minutter for at bibeholde mere cytoplasmisk lokalisering af SG markører ¹³ .
2. Fjern PFA med en pipette og kassér væsken i en passende affaldsbeholder. Vask dækslet med 1 ml Tris-Buffered Saline (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM NaCl). Inkubér dækslet i 2 minutter med forsigtig omrystningPå en plade shaker under vask.
3. Fjern TBS fuldstændigt ved hjælp af en sugepumpe og tilsæt 500 μL 0,3% Triton-X100 i TBS i 10 minutter for at permeabilisere cellerne.
4. Fjern permeabiliserende opløsning med en sugepumpe. Udskift med 1 ml TBS, hvirv pladen forsigtigt, fjern TBS ved sugning, og tilsæt 1 ml blokeringsopløsning (5% FCS i TBS) i 1 time ved stuetemperatur.
5. Forbered den primære antistofopløsning (1: 300 fortynding) i 5% FCS i TBS. Beregn 50 μL pr. 12 mm dækslip og lav nok til alle dækslister i et parti.
   BEMÆRK: De fælles primære antistoffer, der anvendes, er målrettet G3BP1, eIF3b og TIA1.
6. Spot 50 μL af den primære antistofblanding på en plastparafinfilm (parafilm), der er fastgjort på bænken eller kammeret.
   BEMÆRK: En liste over kanoniske SG markører findes i Materialetabellen , men sammensætningen af ​​SG'er kan afhænge af den påførte belastning. Andre SG markører er opført i Kedersha et al. ¹³ S. flexneri infektion er angivet i tabel 1 .
7. Tag dækslipet op med pincet, dæk kanten af ​​dækslet på vævet, kortvarigt frigør pinceterne for at fjerne overskydende væske, og læg forsigtigt nedad på dråben. Inkubér coverlips i 1,5 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer.
   BEMÆRK: For at forberede et fugtigt kammer placeres forvævede væv langs kanterne af et fast lukket kammer foret med plastparafilm.
8. Overfør hver dæksel med pincet i en brønd af en ny 24-brønds plade fyldt med 1 ml TBS; Inkubere med forsigtig omrystning på en plade shaker i 5 min. Sug off TBS i hver brønd ved hjælp af en sugepumpe, udskift med 1 mL TBS og sæt den tilbage på pladeskakeren i 5 minutter. Gentag vask endnu en gang.
   BEMÆRK: Genbrug parafilmen ved at fjerne overskydende væske med et væv og vask overfladen med vand. Sørg for, at paraffinfilmen er helt tør før usinG det til det efterfølgende farvningstrin.
9. Forbered den sekundære antistofopløsning i TBS (fortynding 1: 500-1: 2000). For at plette kernen og bakterierne tilsættes 2 μg / ml DAPI til blandingen. Til pletaktin tilsættes fluorescerende phalloidin. Pipette 50 μL sekundært antistof blandes på plastparaffinfilmen.
   BEMÆRK: Brug af stærkt rensede tværabsorberede æsel sekundære antistoffer anbefales til co-lokaliseringsundersøgelser af forskellige SG markører, når G3BP1 (ged-antistof) anvendes. Vælg fluorescensmærkede sekundære antistoffer med ikke-overlappende spektre. EIF3b pletter tydeligvis cytoplasmaet af celler og er derfor en god markør til afgrænsning af celler. Actin-farven hjælper yderligere med at afgrænse celler ved celle-til-celle kontaktsteder og områder med bakteriel indgang.
10. Tag dækslipet med pincet op, luk kanten af ​​dækslip på vævet, frigør kort pinceterne for at fjerne overskydende væske. Læg forsigtigt dækslet nedad på dråbet og inkubér dækglaseneI mørke i 1 time ved RT.
11. Brug pincet til at sætte dækslet tilbage i 24-brøndspladerne fyldt med frisk 1 ml PBS. Sørg for, at dækslet er fuldt dækket af PBS. Vask cellerne 3 gange med let omrystning i 5 minutter hver.
    BEMÆRK: Hold pladen under vaskerne under et dæksel for at beskytte mod lys, da fluoroforerne i det sekundære antistof er lysfølsomme.
12. Dyk forsigtigt dækslet til deioniseret vand for at fjerne saltet, tør tørre fra kanten på et væv og monter dækslet på 5 μl fluorescensmonteringsmedium på en glasskinne. Aflåg dækslet før billedbehandling ved brug af neglelak. Opbevar dias ved 4 ° C til kortvarig (uge) eller ved -20 ° C til langtidsopbevaring (måned).
    BEMÆRK: Undgå luftbobler ved forsegling, da dette vil skade billedkvaliteten.

5. Fluorescens Imaging

BEMÆRK: Se mikroskopets brugervejledning til optimering af opsætningen.

1. Få billeder ved hjælp af et konfokalmikroskop ved brug af enten en 40 eller 63X olieinddrivningsobjektiv. Vælg de ønskede fluorescerende kanaler til billedkøb. Når du bruger flere fluorescerende kanaler, skal du vælge sekventiel opkøbsmodus.
   BEMÆRK: Start med de eksperimentelle prøver, hvor SG'er er blevet induceret, den stærkeste for at undgå overeksponering på efterfølgende prøver. Sørg for ikke at have overeksponerede SG'er gennem hele dybden af ​​cellen.
   1. Indstil bitstørrelse på 12 eller højere i mikroskopindstillingerne for at sikre nøjagtigheden af ​​billedanalysen.
   2. Indstil billedstablerne til at dække hele dybden af ​​cellen. Tjek de forskellige kanaler og for forskellige SG markører for at sikre, at hele sortimentet er inkluderet. Indstil begyndelsen af ​​stakken i bunden af ​​cellerne og toppen af ​​stablerne i højden øverst på cellerne, hvor der ikke observeres mere SG markører.
   3. Hent stakken. Hold stakken højde ens for alle billeder.
      BEMÆRK: Må ikkeSkift overtagelsesindstillinger mellem kontrol- og eksperimentelle prøver, som vil blive brugt til efterfølgende sammenligning.

6. Billedanalyse

BEMÆRK: Her beskrives SG-analyse af sammenbrudte stabler med freeware ICY. Billedanalyse af 3D-rekonstruktioner kan også gøres ved hjælp af anden specialiseret software. SG-detektion kan udføres via en fuldt automatiseret arbejdsgang etableret for denne protokol (tilgængelig på http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). For at anvende denne protokol skal kernerne farves med en DNA-plet for softwaren til at finde midten af ​​hver celle, og cellekanterne skal markeres med enten en cytoplasmisk markør (såsom eIF3b) eller actin-plet til softwaren At identificere cellegrænserne. Den automatiske arbejdsgang kan bruges til at validere manuelt afledte resultater eller direkte til analyse, når cellegrænser opdages med stor tillid, hvilket vil moStly afhænger af tætheden af ​​celler og markøren bruges til at detektere celle grænser.

1. Brug ImageJ eller Fiji, sammenbrud billedstablerne (Image> Stacks> Z projection) og gem som .tiff-filer.
   BEMÆRK: Opret en ny mappe for hvert billede, da billedanalyseprogrammet vil linke sine resultater til stedet for det originale billede.
2. Indlæs et kontrol- og eksperimentelt .tiff-billede til billedanalyseplanen (Fil> Åbn). Gå til sekvensvinduet. Rul ned i "Opslagstabel" til kanalparametrene.
3. Deaktiver alle kanaler ved at klikke på afkrydsningsfeltet for alle kanalfaner. Klik på kanal 0 og vælg derefter den foretrukne farve ved at klikke på farvelisten ovenfor. Forøg kanalens intensitet efter behov for at se alle strukturer ved at klikke og flytte linjen i intensitetsfeltet. Gentag dette for alle kanaler.
   BEMÆRK: Deaktiver kanaler, der ikke er nødvendige for en given opgave, for at minimere bias i stikprøveanalyse.
4. RulOp og inden for fanen Canvas, zoom ind til ca. 10 celler pr. Felt ved at justere zoomfanen.
5. Brug polygonfunktionsværktøjerne (i øverste bjælke) til at afgrænse cellegrænser for celler i billedet. Brug actin-pletten eller en cytosolisk markør til deling af cellegrænser ( fx eIF3b).
   1. Klik på polygonfunktionen i "Filer og afkast" -værktøjer. Start afgrænsning ved at klikke på cellen og derefter udvide linjen ved at gøre forankringer gennem gentagne klik rundt om cellegrænsen. For at afslutte et afkast skal du klikke igen på polygonfunktionen inden for "Filer og afkast" -værktøjer.
      BEMÆRK: Identificer subpopulationerne for de afgrænsede celler, der er inficerede. Prøven består af en blanding af inficerede og ikke-inficerede celler. For at identificere bakterier skal du enten bruge DAPI-pletten eller fluorescerende bakterier (såsom GFP-udtrykkende bakterier). Forøg intensiteten for at sikre, at alle bakterier ses.
   2. For at nævne et investeringsafkast skal du gå til afkastvinduet til højre og cliCk på den celle af interesse i billedet. Dette vil fremhæve det tilsvarende afkast i afkast-fanen. Dobbeltklik på ROI-navnet og ændre navnet ( f.eks . Inficeret celle # 1).
      BEMÆRK: Hvis et billede skal bruges til at analysere både inficerede og ikke-inficerede celler, er det lettere at gemme billedet i to separate mapper og afgrænse de inficerede og ikke inficerede celler separat og generere to forskellige regneark, hvilket vil lette analysen senere.
6. Åbn spotdetektorapplikationen inden for fanen "Detektion og sporing" (øverste bjælke). Inden for fanen Indgang vælges det aktuelle billede. Du må ikke ændre noget. Vælg den kanal, der skal analyseres, inden for fanen Forbehandling.
   BEMÆRK: Kun en kanal kan analyseres til enhver tid. En batchanalyse kan vælges her, hvis man bruger den fuldt automatiserede analysesekvens, hvis parametre er blevet kontrolleret for at give tilfredsstillende resultater.
   1. På fanen Detektor vælges "DeTekt lyspunkter over mørk baggrund. "Vælg derefter den passende skala og følsomhed. Gør dette ved at teste forskellige indstillinger og krydskontrol stedet detektion i både kontrol og eksperimentelle prøver.
      BEMÆRK: For et billede med en 2.048 x 2.048 opløsning og en pixelstørrelse på 0,12 μm ² er en niveau 2 tærskel med en følsomhed på 25 til 100 generelt passende, men hver SG markør skal testes empirisk. Opsæt punktdetektering, således at der i den ikke-behandlede kontrolprøve ikke registreres pletter, mens i den eksperimentelle prøve med SG'er tælles alle de små og store SG'er.
   2. Inden for ROI-fanen skal du vælge den foreslåede ROI From Sequence. På fanen Filtrering skal du vælge Ingen filtrering. Vælg den ønskede udgang i fanen Output.
      BEMÆRK: Valg af Aktiver Specifik fil hjælper til at gemme forskellige registreringsbetingelser eller forskellige kanaler. Hvis du vælger at eksportere det binære billede og det originale billede med ROI og detektion er helPful for kvalitetskontrol analyse.
   3. Vælg "Fjern tidligere punkter gengivet som ROI'er". Vælg mappen for at gemme filen ved at klikke på knappen "ingen fil valgt". På fanen Display skal du vælge de ønskede indstillinger. Klik på "Start registrering".
      BEMÆRK: Der oprettes en mappe med navnet og det valgte sted, der indeholder de eksporterede billedoptioner. Disse billeder overskrives for hver ny testet tilstand. For at beholde billederne skal du enten omdøbe mappen, så der oprettes en ny mappe eller overfør billederne fra gemmappen til en ny mappe. For kvalitetskontrol af billederne er det nyttigt at vælge displaydetekteringsmærke, antal påvisning af ROI og ROI-nummer og navn.
7. Konsolidér og gem dataene for de forskellige parametre ved hjælp af det genererede regneark for hvert af de testede billeder eller tilstand.
   BEMÆRK: Parametrene til analyse skal omfatte antallet af SG'er pr. ROI, SG-overfladearealerne og SG maxImum, gennemsnit og minimum intensiteter.
8. Overfør dataene og analyser ved hjælp af et analyseprogram, der er i stand til at analysere, grave og bestemme den statistiske betydning.

Representative Results

For at forklare og demonstrere protokollen beskrevet i dette manuskript karakteriserede vi billedet af clotrimazol-inducerede SG'er i HeLa-celler inficeret eller ej med cytosolisk patogen S. flexneri . En oversigt over proceduren er vist i figur 1 og omfatter virulent og avirulent S. flexneri stribet på Congo Røde plader, bakterieforberedelse, infektion, tilsætning af miljøspænding, prøvefiksering og farvning, prøveafbildning og kvantificering samt billedanalyse . En række forskellige belastninger kan anvendes til at inducere SG-dannelse, og en række SG markører er tilgængelige for afhøring. EIF3b er en kanonisk SG markør, der også klart blokerer det cytoplasmatiske rum i cellen og kan bruges til at identificere cellekanter. G3BP1 er en udbredt SG-markør, der aggregerer i SG'er uden nogen baggrundsfarvning ( Figur 2 A, B D ). Celler er bedst billedet med et konfokalmikroskop, og stablerne dækker hele celledybden lægges på billedanalysen freeware ICY ( Figur 2 A - C ). For bedre at identificere inficerede celler og at sætte celler ind i enten den inficerede eller ikke-inficerede gruppe til senere analyse, er det nyttigt at forøge intensiteten af ​​nukleinsyrefladen ( Figur 2 D ). Inden for billedanalysesoftwaren bruges stedet detektoren til at identificere SG'er inden for hver af de udpegede ROI'er ( Figur 2 E ), og der genereres et binært billede, der viser alle de identificerede SG'er ( Figur 2 F ).

SG analyse skal skræddersys til hver SG markør analyseret, og den relevante indstilling til analyse skal vælges omhyggeligt. Fokuserer på SG maRker G3BP1, ændrer størrelseskravet for det sted, der registreres eller ændrer følsomheden af ​​detektionsparametrene, vil føre til varierende resultater som vist i figur 3 A-C . Skalevalget (1 - 3, skønt skalaer kan tilføjes) er baseret på pixelstørrelse og dermed ved højere skalaer, vil mindre SG'er ikke blive talt, og antallet af SG'er vil falde ( figur 3C ). Følsomhed måles fra 1 til 100, hvor 100 er mest følsomme. Ved at øge følsomheden øges antallet af registrerede SG'er ( figur 3 C ). Således skal de korrekte indstillinger findes for at minimere falske positive og falske negativer. Dette gøres bedst ved omhyggeligt at analysere de viste billeder for hver indstilling. For G3BP1 gav en skala på 2 med en følsomhed på 100 (2 - 100, fremhævet i rødt) det bedste resultat. En skala på 2 med en lavere følsomhed (50 eller 25) venstre lilleSGs uncounted (se orange pile). Tilsvarende blev en skala på 3 venstre lille SG uregistreret, mens en skala på 1 oversampled. Det er vigtigt at tilføje yderligere skalaer for kun at fokusere på store SG'er, hvis dette er berettiget. For eIF3b gav en skala på 2 med en følsomhed på 55 (2-55) det bedste resultat for eIF3b (fremhævet i rødt), selv om røde pilene fremhæver enten under eller oversampling i en skala fra henholdsvis 2 - 50 og 2 - 55.

Når parametrene for SG-analyse er korrekt indstillet, kan dataene analyseres på mange måder ( figur 4 ). Spotdetektoren giver det antal SG'er, der registreres inden for hvert ROI, således at de uinficerede og inficerede celler kan sammenlignes ( Figur 4 A ). Tilsvarende er størrelsen, i dette tilfælde antal pixels, givet, hvorfra overfladearealet kan beregnes ( figur 4 B ). Frekvensfordeling plOts er også nyttige for at fremhæve forskydninger i størrelsen af ​​SG'er fundet i forskellige cellepopulationer. Her bliver en fuldstændig fravær af store SG'er i S. flexneri- inficerede celler samt et klart skift i fordelingen klarere ( Figur 4 C ). Desuden giver intensiteten (vist her minimum og maksimal intensitet) information om kvaliteten af ​​de analyserede SG'er. For S. flexneri inficerede celler er SG'er signifikant mindre intense. Disse analyser giver statistisk relevant information om både den kvalitative og kvantitative karakter af SG'er dannet som reaktion på eksogen stress, når cellerne er inficeret med eller uden S. flexneri .

Figur 1 : Oversigt over forsøgsprocessen til inficere celler med S. Flexneri ogAt analysere effekten af ​​infektion SG formation. En Congo-rød koloni, og en ikke-viruløs Kongo-rød-negativ koloni, plukkes og dyrkes O / N i tryptisk sojabølle. Den overnattende kultur er subkultiveret til den late eksponentielle fase, før bakterierne er belagt med PLL for at fremme adhærens. Værtsceller dyrket på glasdæksler i 12-brønds plader inficeres med bakterier i 30 minutter. Kontrolceller er ikke inficerede. Celler vaskes og behandles med spændingsinduktorer for at inducere SG-dannelse enten ved at erstatte mediet med stressholdigt medium eller udsætte cellerne for stressbetingelser, såsom varme. Cellerne fastgøres derefter, permeabiliseres, farves med immunofluorescerende SG-specifikke markører og afbildes ved anvendelse af konfokal mikroskopi. Z-fremskrivninger laves ved hjælp af ImageJ og analyseres ved hjælp af stedet detektor af billedanalysesoftwaren. Dataene analyseres derefter. Klik her for at se en storEr version af denne figur.

Figur 2 : Spotdetektoranalyse af HeLa-celler inficeret med S. Flexneri i 1,5 timer før tilsætning af Clotrimazole i 1 time. A. Immunfluorescerende billede af en z-projektion, der viser celler farvet med SG markørerne eIF3b og G3BP1, DAPI og actin. B. Samme billede som i (A), men uden aktin plet for at fremhæve brugen af ​​eIF3b for at afgrænse celle grænser. C. Skærmbillede af billedanalysesoftwaren med stedet detektormodulet. D. Gating af de inficerede og ikke-inficerede celler som set ved hjælp af forskellige kanaler. For at se alle bakterier øges intensiteten. Celler med mere end 1 bakterie til stede i cellen er mærket med en rød stjerne. E. Output af stedet detecAnalyse af individuelle investeringsafkast, der angiver ROI-navnet, antallet af pletter og deres placering. F. Billede af pletter opdaget i ROI'erne. Skalbjælke = 30 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3 : Sammenligninger af forskellige skala- og følsomhedsindstillinger af punktdetektor til detektering af SG'er gennem forskellige SG markører. A. Zoom-in til HeLa celler inficeret eller ej med S. flexneri og farvet med DAPI og SG markøren G3BP1, og analyseret i forskellige skalaer (pixelstørrelse afskåret, 1 - 3) og følsomhed (1 - 100). Grafisk repræsentation af SG-numre i uinficerede og inficerede celler analyseret på forskellige skalaer ( > B) og følsomheder ( C ). Visuals ( D ) og grafisk repræsentation ( E ) af SG nummer detektion af SG markøren eIF3b for det samme billede, når du ændrer følsomhedsgrænsen uden at ændre punktstørrelsen. Rød skrivning og røde symboler angiver de bedste parametre. Røde pile peger mod falske positive og orange pile til manglende SG-detektion. Værdier indbefatter gennemsnit med standardafvigelse. De bedste resultater er markeret med rødt. Udvalgt statistisk analyse inkluderet for klarhed ved hjælp af Wilcoxon rank sum test p-værdierne til venstre og varians F-test til højre. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = ikke-signifikant. Målestang = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Es / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
Figur 4 : Analyse af steddetektorgenereret SG-data opnået fra Clotrimazole-behandlede HeLa-celler inficeret med S. Flexneri . A. Antal G3BP1 SG'er pr. Celle i inficerede og uinficerede HeLa-celler. B. Overfladeareal af G3BP1-SG'er i inficerede og uinficerede celler og deres procentdistributionsfrekvens ( C ). D. Minimum og maksimum intensitetsværdier (vilkårlig) af G3BP1-SG'er. Værdier indbefatter gennemsnit med standardfejl. Udvalgt statistisk analyse inkluderet for klarhed ved hjælp af Wilcoxon rank sum test p-værdierne til venstre og varians F-test til højre. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = ikke-signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Protokollen skitseret her beskriver induktion, lokalisering og analyse af SG'er i ikke-inficerede celler og celler inficeret med cytosolisk patogen S. flexneri i nærvær eller fravær af eksogen stress. Ved hjælp af gratis billedsoftware tillader protokollerne den præcise kvalitative og kvantitative analyse af SG-dannelsen til at identificere og statistisk adressere forskelle i givne fænotyper.

Der er flere kritiske trin inden for protokollen til infektionen, SG-induktion og billeddannelsesdele. Til infektionen er det vigtigt, at bakterieinteraktionen med værtsceller, såsom invasion som skitseret protokol her, synkroniseres så meget som muligt. Dette er især vigtigt, når man undersøger virkningerne af bakteriel udfordring tidligt under infektionsprocessen. Vi har tidligere vist, at nogle fænotyper, såsom eIF3b lokalisering efter S. flexneri infektion, forstyrres tidligt under vildtypeS. flexneri- udfordring, mens andre fænotyper, såsom aggregering af G3BP1-holdige SG'er, påvirkes mere ved senere tidspunkter ³ . For at præcist beskrive den tidsmæssige virkning af bakteriel udfordring er synkronisering af infektion derfor tilrådeligt. Specielt for at analysere SG-dannelse bør celler være i eksponentiel vækstfase, og dermed er celledensitet ved stresstilsætningen også en vigtig parameter. Det begrænser også SG-analyse til ikke-konfluente celleinfektionsmodeller. Et andet kritisk aspekt er sambehandlingen af ​​kontrol- og eksperimentelle prøver under både behandling af prøverne til billeddannelse og under billedindsamling. Til immunfluorescerende behandling skal alle prøver farves med de samme antistoffens fortyndinger i samme tid og under de samme betingelser ( dvs. RT Vs 4 ° C), samtidig med at de også behandles med hver dækslip på samme måde i vaskefasen og Montering oF dækslipene. Dette vil sikre sammenlignelige immunofluorescerende farvninger, der kan analyseres både kvalitativt og kvantitativt. Forskelle i monteringsmedium kan have signifikante virkninger på blegning af prøverne under billedopsamlingen og bør derfor holdes konstant. På samme måde skal billedkøb for alle prøver, der skal sammenlignes i analyse, udføres inden for et møde og med de samme indstillinger for at minimere forskelle, der opstår som følge af laserstyrke eller prøveopsætning.

Ved anvendelse af eksogene belastninger er det vigtigt at lagre reagenset korrekt og til at lave nye arbejdsstande ofte. Forlængede perioder (> 4 måneder for clotrimazol, for eksempel) fører til nedsat styrke af lægemidlet og vil påvirke SG-dannelsen. Reagenser bør tilsættes til dyrkningsmedium umiddelbart før tilsætning til cellerne; Hvis der observeres en reduktion i SG-dannelsen i kontrolceller, eller aggregeringen af ​​SG'er forekommer afvigende, skal reagenser testes for deres acTivitet og nye lagre bør foretages.

En begrænsning er, at SG-identifikation ved hjælp af stedet detektor bliver mindre pålidelig, når der er for meget baggrundsfluorescens til stede. Selv om dette ikke er et problem for mange SG markører, er nogle, såsom eIF3b, som er en klar cytosolisk markør under både SG-inducerende og ikke-inducerende betingelser, vanskeligere at analysere som vist i figur 3 . Derudover skal skalaer og følsomheder bestemmes empirisk for hver SG-markør. En anden begrænsning er, at analysen via billedanalysesoftwaren er bedst med 2D-billeder og fungerer derfor godt på optiske skiver eller sammenfaldne stabler, hvilket dog medfører tab af 3D-information. Analysen på z-prognoser har derfor tendens til at overstige størrelsen af ​​SG'er og undergrave antallet af SG'er. 3D-analyse af SG'er kan udføres med Imaris for at give en endnu mere præcis rumlig karakterisering, hvis det anses for nødvendigt for en bestemt fænotype. SG karakterisering kan udføres hurtigt og på en standardiseret måde ved hjælp af den automatiserede spotdetektor af billedanalysesoftwaren. I modsætning hertil, manuelle metoder til at identificere og afgrænse SG'er som tidligere udført ⁴ , lad analysen være åben for mere bias og er betydeligt mere tidskrævende. SG-analyse ved hjælp af stedet detektor kan også skræddersys til at inkludere eller ekskludere små SG-aggregater ved at vælge forskellige følsomheds- og størrelse-tærskler, hvilket giver mulighed for fleksibilitet ved evaluering af forskellige aspekter af SG-dannelsen. SG analyse kan også udføres på en fuldstændig automatiseret måde ved hjælp af en etableret automatiseret workflow ³ . Inden for denne arbejdsgang identificeres cellecentret gennem en DAPI-farve, og programmet lader så en formbar sfære vokse udad for at afgrænse cellegrænserne baseret på enten en cytoplasmisk plet (såsom eIF3b) eller actin. På samme tid bruger en semi-automatiseret analyse afManuel afgrænsning af individuelle celler til analyse kan være fordelagtig, når celler vokser i klynger, og cellegrænser er vanskelige for det automatiserede program at afgrænse tydeligt. Under disse omstændigheder kan man definere cellegrenser manuelt for at fjerne falske positive eller negative værdier.

Protokollen kan tilpasses til andre SG-inducerende betingelser og til andre patogener, herunder vira, bakterier, gær og protozoer. Af særlig interesse kan være andre cytosoliske patogener, såsom Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei og Listeria spp. For hvert infektiøst middel og muligvis også forskellige cellelinier skal infektionsprotokollen tilpasses og prøvestiderne for eksogene belastninger bestemmes empirisk. Desuden kan SG karakterisering ved hjælp af billedanalysesoftware også udvides til live-celle-billeddannelse i fremtiden. Real-time SG analyse ville nødvendiggøreItate ekspressionen af ​​et eller flere fluorescensmærket SG markører i værtscellerne, men ville derved tillade spørgsmål vedrørende SG-dannelsens tidsmæssige og specielle dynamik at blive behandlet under forskellige eksperimentelle betingelser. Fluorescensmærkede bakterier ville da være nødvendige for at komplementere SG-analysen i realtid i inficerede og uinficerede celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1:300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1:500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1:500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1:500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1:500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1:500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal Calf Serum (FCS)	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Life Technologies	11140	1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
Paraformaldehyde (PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12 mm  glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis