Summary
Descriviamo un metodo per l'analisi qualitativa e quantitativa della formazione di granuli di stress nelle cellule dei mammiferi dopo che le cellule sono sfidate con batteri e una serie di sollecitazioni diverse. Questo protocollo può essere applicato per indagare la risposta del granulo di stress cellulare in una vasta gamma di interazioni ospedaliere-batteriche.
Abstract
L'imaging fluorescente dei componenti cellulari è uno strumento efficace per indagare le interazioni host-patogeno. I patogeni possono influenzare molteplici caratteristiche delle cellule infette, tra cui l'organologia ultrastruttiva, l'organizzazione della rete citoscheletrica, nonché i processi cellulari come la formazione di Stress Granule (SG). La caratterizzazione di come i patogeni subiscono i processi dell'host è una parte importante e integrale del campo della patogenesi. Mentre i fenotipi variabili possono essere facilmente visibili, l'analisi precisa delle differenze qualitative e quantitative nelle strutture cellulari indotte dalla sfida patogena è essenziale per definire differenze statisticamente significative tra i campioni sperimentali e quelli di controllo. La formazione di SG è una risposta a stress evolutivamente conservata che conduce alle risposte antivirali e è stata da tempo studiata usando infezioni virali 1 . La formazione di SG influenza anche le cascate di segnalazione e possono avere altri conseq ancora sconosciuti2 . La caratterizzazione di questa risposta allo stress a patogeni diversi dai virus, come gli agenti patogeni batterici, è attualmente un'area emergente di ricerca 3 . Per ora, l'analisi quantitativa e qualitativa della formazione SG non è ancora abitualmente usata, anche nei sistemi virali. Qui descriviamo un metodo semplice per indurre e caratterizzare la formazione di SG in cellule non infettate e in cellule infettate da un patogeno batterico citosolico, che influenza la formazione di SG in risposta a varie sollecitazioni esogene. L'analisi della formazione e della composizione SG è ottenuta utilizzando un certo numero di differenti marcatori SG e il plug-in del rilevatore spot di ICY, uno strumento di analisi delle immagini open source.
Introduction
Visualizzare le interazioni host-patogeni a livello cellulare è un metodo potente per ottenere approfondimenti sulle strategie patogene e per identificare i principali percorsi cellulari. Infatti, gli agenti patogeni possono essere utilizzati come strumenti per individuare importanti bersagli o strutture cellulari, in quanto gli agenti patogeni si sono evoluti per subire i processi cellulari centrali come una strategia per la loro sopravvivenza o la loro propagazione. La visualizzazione dei componenti cellulari può essere ottenuta mediante espressione recombinante di proteine ad oscillazioni fluorescenti. Mentre questo consente l'analisi in tempo reale, la generazione di linee cellulari con proteine ad hoc specifiche tagliate è altamente laboriosa e può causare effetti indesiderati indesiderati. Più conveniente è la rilevazione di fattori cellulari che utilizzano anticorpi specifici, in quanto possono essere analizzati simultaneamente più fattori host e non si limitano ad un particolare tipo di cellula. Un inconveniente è che solo una visione statica può essere catturata in quanto l'analisi dell'immunofluorescenza richiede il fixat delle cellule hostionico. Tuttavia, un importante vantaggio dell'immagine di immunofluorescenza è che si presta facilmente ad analisi qualitative e quantitative. Questo a sua volta può essere utilizzato per ottenere differenze statisticamente significative per fornire nuove conoscenze sulle interazioni host-patogeno.
I programmi di analisi fluorescenti delle immagini sono potenti strumenti analitici per eseguire analisi 3D e 4D. Tuttavia, l'elevato costo del software e la sua manutenzione fanno dei metodi basati sul libero software open source più ampiamente attraenti. L'analisi approfondita dell'immagine usando il software di bioanalisi è preziosa in quanto dimostra l'analisi visiva e, quando assegna significati statistici, aumenta la fiducia nella correttezza di un determinato fenotipo. In precedenza, gli SG sono stati analizzati utilizzando il software gratuito ImageJ, che richiede l'identificazione manuale dei singoli SG4. Qui forniamo un protocollo per l'induzione e l'analisi della formazione cellulare SG nel contesto di bacLe infezioni da virus utilizzando il software gratuito di analisi bio-immagine open source ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Il software per l'analisi bio-image è dotato di un programma di rivelatore spot che è adatto per l'analisi SG. Consente di ottimizzare il processo di rilevamento automatico in specifiche aree di interesse (ROI). Ciò supera la necessità di analisi manuale dei singoli SG e rimuove la bias di campionamento.
Molte sollecitazioni ambientali inducono la formazione di SG, che sono strutture fisiologiche citocholiciche, non membranose di 0,2-5 μm di diametro 5 , 6 . Questa risposta cellulare è evolutamente conservata in lieviti, piante e mammiferi e si verifica quando la traduzione globale delle proteine è inibita. Comprende l'aggregazione di complessi di iniziazione di traduzione bloccati in SG, considerati come luoghi di detenzione per mRNA traslazionale-inattivi, consentendo la traduzione selettiva di un sottoinsieme di mRNA cellulari.Dopo la rimozione dello stress, SG si dissolvono e il tasso globale di sintesi proteica riprende. Gli SG sono composti da fattori di innesco di allungamento della traduzione, proteine coinvolte nel metabolismo RNA, proteine legate all'RNA, nonché proteine di ponteggio e fattori coinvolti nella segnalazione delle cellule ospite 2 , anche se la composizione esatta può variare a seconda dello stress applicato. I fattori ambientali che inducono la formazione di SG includono la fame di aminoacidi, irraggiamento UV, shock termico, shock osmotico, stress reticolare endoplasmatico, ipossia e infezione virale 2 , 7 , 8 . Molti progressi sono stati fatti per comprendere come i virus inducano e sovvertire la formazione di SG, mentre poco si sa ancora su come altri agenti patogeni, quali batteri, funghi o patogeni protozoi, influenzino questa risposta cellulare 1 , 7 .
ShigeLla flexneri è un patogeno citosolico facoltativo Gram-negativo di esseri umani e l'agente causale di grave diarrea o shigellosis. La Shigellosis è un grave onere della sanità pubblica e porta a 28.000 morti ogni anno nei bambini di età inferiore ai 5 anni 9 , 10 anni . S. flexneri infetta l'epitelio colonico e si diffonde da cellula a cellula perrottando i componenti citoscheletrici dell'host 11 , 12 . L'infezione dell'epitelio supporta la replica di S. flexneri all'interno del citosolo, ma i macrofagi infetti muoiono attraverso un processo di morte delle cellule infiammatorie chiamato pyroptosis. L'infezione porta ad un massiccio reclutamento di neutrofili e infiammazioni gravi che sono accompagnate da calore, stress ossidativo e distruzione dei tessuti. Pertanto, mentre le cellule infette sono soggette a sollecitazioni interne indotte dall'infezione, come la disfunzione di Golgi, lo stress genotossico e il riarrangiamento citoscheletricoLe cellule infette sono sottoposte anche a stress ambientali dovuti al processo infiammatorio.
La caratterizzazione dell'effetto dell'infezione di S. flexneri sulla capacità delle cellule di rispondere alle sollecitazioni ambientali con un numero di marcatori SG ha dimostrato che l'infezione porta a differenze qualitative e quantitative nella composizione SG 3 . Tuttavia, poco si sa di altri patogeni batterici. Qui descriviamo una metodologia per l'infezione di cellule ospitanti con il patogeno citosolico S. flexneri , l'accentuazione delle cellule con differenti sollecitazioni ambientali, l'etichettatura dei componenti SG e l'analisi qualitativa e quantitativa della formazione e della composizione SG nel contesto di infetti E le cellule non infette. Questo metodo è ampiamente applicabile ad altri patogeni batterici. Inoltre, l'analisi delle immagini della formazione SG può essere utilizzata per infezioni da virus o da altri agenti patogeni. Può essere utilizzato per analizzare SGFormazione sull'infezione o sull'effetto dell'infezione sulla formazione di SG in risposta a sollecitazioni esogene.
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Protocol
1. Preparazione dei batteri e delle cellule ospitanti
- Trasferimento di coperture in vetro da 12 o 14 mm, rispettivamente, in lastre da 24 o 12 pozzetti, con pinze sterili, contando un pozzetto per condizione sperimentale. Sterilizzare questi con trattamento UV in un cofano di tessuto per 15 minuti.
NOTA: includere i pozzetti di controllo per la sfida batterica e per l'induzione di SG da sollecitazioni esogene. - Per una piastra a 24 pozzetti con copertine da 12 mm, sementi da 1 x 10 5 cellule di mammiferi ( ad es., Cellule HeLa) sui coperchi; Premere i coperchietti con una punta pipetta sterile. Lasciare che le cellule si aderiscano per una notte a 37 ° C in un incubatore di coltura di tessuto di CO 2 del 5% in terreno di coltura adatto a ciascun tipo di cellula.
NOTA: Celle di piastre in modo che la confluenza delle cellule sia tra il 40 e il 60% il giorno successivo.- Per le cellule HeLa, incubare in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con Amino Acidi Non Essenziali (NEAA) e 10% di Vitamina Fetale Vitellata (FCS).Decomplementare FCS riscaldandosi per 30 minuti in un bagno d'acqua di 56 ° C, swirling il siero una volta dopo 15 min.
- Per estrarre i batteri, utilizzare una punta sterile per pipettare per rimuovere una piccola quantità da un glicerolo batterico (20% di glicerolo) immagazzinato in un congelatore -80 ° C e metterlo su una piastra etichettata. Utilizzare un ciclo sterile per diffondere i batteri in circa il 10% della piastra. Utilizzare un nuovo ciclo sterile e trascinarlo attraverso la striscia per fare 3 linee parallele, mezzo piatto lungo. Striate attraverso queste linee che coprono il resto della piastra. Incubare la piastra O / N a 37 ° C.
- Selezionare una singola colonia batterica ( ad esempio, S. flexneri ) dalla piastra appena striata. Evitare di lavorare con colonie batteriche superiori a 1 settimana.
- Per il ceppo S. flexneri M90T, inoculare una colonia rossa da una piastra rossa agarica Tryptic Soy Agar-0,1% Congo rosso in 8 ml di brodo Tryptic Soy in un tubo da 15 ml; Stringere il coperchio e incubare agitazione a 222 giri / min6; C.
ATTENZIONE: non utilizzare grandi colonie bianche perché hanno perso il plasmide di virulenza e non sono infettive.
2. Sfida batterica delle cellule ospitanti
- Preparare batteri per massimizzare il potenziale di infezione.
- Per S. flexneri , batteri di subcultura aggiungendo 150 μl di coltura O / N a 8 mL di Tryptic Soy Agar e incubare agitando 222 giri / min a 37 ° C fino alla fase tardiva esponenziale (~ 2 h) per indurre espressione genica virulenza e aumentare l'infezione.
- Quando la coltura è a densità ottica compresa tra 0,6 e 0,9 (misurata a 600 nm), trasferire 1 ml di coltura in un tubo da 1,5 ml. Pellet batteri per 2 min a 8000 xg e risospendere in mezzo infezione (DMEM con NEAA, privo di FCS) a OD 600 = 1. Quindi, se l'OD 600 è 0,85, risospendere in 850 μL.
NOTA: Per S. flexneri, a OD 600 = 1, saranno 8 x 10 8 batteri per ml quandoColtivata in mezzo di 8 mL. Una molteplicità di infezione (MOI) di 20 è appropriata. Per altri agenti patogeni è necessario determinare empiricamente il numero di batteri per ml ad un OD 600 e l'opportuno MOI.
- Quando la coltura è a densità ottica compresa tra 0,6 e 0,9 (misurata a 600 nm), trasferire 1 ml di coltura in un tubo da 1,5 ml. Pellet batteri per 2 min a 8000 xg e risospendere in mezzo infezione (DMEM con NEAA, privo di FCS) a OD 600 = 1. Quindi, se l'OD 600 è 0,85, risospendere in 850 μL.
- Per migliorare le interazioni batteri-host, coprire i batteri con Poly-L-Lysine (PLL).
NOTA: Il trattamento PLL di S. flexneri non ha avuto alcun effetto sulla dinamica SG. Altri agenti patogeni devono essere valutati per la loro amenabilità al trattamento PLL.- Per coprire i batteri con PLL, centrifugare 1 ml di coltura batterica per 2 minuti a 8000 xg e quindi risospendere il pellet in 10 μg / mL PLL in salina fosfata-bufferizzata (PBS) ad un OD 600 = 1.
- Aggiungere la soluzione batterica ad un piccolo piatto, come un pozzetto all'interno di una piastra a 12 pozzetti, e incubare a RT (~ 20 ° C) per 10 minuti con agitazione leggera su un agitatore a piastre.
- Pellet batteri per 2 minuti a 8.000 xg, rimuovere l'eccesso PLL. Resuspendere il pellet in 1 ml di PBSD ripetere due volte questo passaggio di lavaggio. Dopo il lavaggio finale, risospendere nel mezzo di infezione a OD 600 = 1.
NOTA: qui, il mezzo di infezione per S. flexneri è un mezzo di cellule host con 20 mM di HEPES senza FCS.
- Per S. flexneri , batteri di subcultura aggiungendo 150 μl di coltura O / N a 8 mL di Tryptic Soy Agar e incubare agitando 222 giri / min a 37 ° C fino alla fase tardiva esponenziale (~ 2 h) per indurre espressione genica virulenza e aumentare l'infezione.
- Preparare le cellule per la sfida batterica.
- Rimuovere il mezzo dalle cellule HeLa da mammiferi usando una pompa di aspirazione. Aggiungere 500 μL di cellule RT HeLa per lavare le cellule, turbinare, rimuovere il mezzo usando una pompa di aspirazione e sostituire con 500 μl di RT appropriato mezzo di infezione ( ad esempio , mezzo di cellule host con 20 mM HEPES senza FCS).
- NOTA: Per tutti i passaggi di lavaggio, lavorare in modo rapido e lavorare fino a 4 coperchi per volta per evitare l'essiccazione delle celle.
- Challenge ha preparato le cellule HeLa con batteri per infettare il 20-50% delle cellule.
NOTA: Per ogni specie batterica è necessario determinare il tempo e il MOI appropriati. In generale, un buon inizio è 30 minuti a 37° C con un MOI di 10.- Per S. flexneri, sfida le cellule di cellule HeLa usando uno dei due metodi (punto 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
- Spin non trattati con PLL trattati con batteri (20 μL di OD 600 = 1 / pozzetto di 24 pozzetti in 500 micron di mezzo) sulle cellule per 10 minuti a 13000 x g.
- Aggiungere batteri rivestiti con PLL (15 μL di OD 600 = 1 / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in 500 μl di mezzo) per 15 minuti a RT per consentire ai batteri di saltare sulle cellule.
- Lasciare che l'infezione si verifichi collocando le cellule con batteri regolati in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per 30 min.
NOTA: Per i tempi brevi, sincronizzare l'infezione da S. flexneri , posizionando le piastre in un bagno d'acqua di 37 ° C per 15 minuti anziché nell'incubatrice di coltura tissutale.
- Per S. flexneri, sfida le cellule di cellule HeLa usando uno dei due metodi (punto 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
- Interrompere l'infezione da celle di lavaggio.
- Per lavare le cellule e rimuovere batteri in eccesso, rimuovere il mezzo usando una pompa di aspirazione, aggiungere 1 mlCampione di coltura HeLa preriscaldato (37 ° C) fresco (DMEM, 10% FCS, NEAA). Girare il mezzo, rimuovere e sostituire con il mezzo fresco. Ripetere due volte e lasciare il mezzo fresco sulle cellule.
- Per S. flexneri o altri batteri intracellulari, dopo l'infezione di cellule HeLa e le lavaggi, sostituire il mezzo con un campione di coltura tissutale standard contenente gentamicina da 50 μg / mL per uccidere i batteri extracellulari e prevenire ulteriori invasioni di cellule.
NOTA: Non aggiungere antibiotici nel mezzo per i batteri extracellulari.
- Per S. flexneri o altri batteri intracellulari, dopo l'infezione di cellule HeLa e le lavaggi, sostituire il mezzo con un campione di coltura tissutale standard contenente gentamicina da 50 μg / mL per uccidere i batteri extracellulari e prevenire ulteriori invasioni di cellule.
- Per lavare le cellule e rimuovere batteri in eccesso, rimuovere il mezzo usando una pompa di aspirazione, aggiungere 1 mlCampione di coltura HeLa preriscaldato (37 ° C) fresco (DMEM, 10% FCS, NEAA). Girare il mezzo, rimuovere e sostituire con il mezzo fresco. Ripetere due volte e lasciare il mezzo fresco sulle cellule.
- Incubare i batteri con le cellule per la quantità desiderata di tempo in un incubatore di coltura tissutale.
NOTA: Per S. flexneri , l'infezione può durare fino a 6 h a seconda del tipo di cellula. Per le cellule HeLa, lasciare che l'infezione proceda per 1,5 - 2 ore prima di aggiungere stress esogeni per indurre la formazione SG. Per le infezioni Caco-2, in cui Shigella si diffonde da cellule a cellule, infetta per 30 minuti a 6 ore prima di aggiungere lo stress esogeno. CePossono essere fissate a questo punto senza aggiungere sollecitazioni esogene per valutare la formazione di SG come conseguenza dell'infezione batterica (in questo caso procedere alla sezione 4).
3. Indurre la formazione di granuli di stress mediante l'aggiunta di stress esogeni
- Rimuovere il mezzo dalle cellule HeLa infette e non infette usando una pompa di aspirazione, sostituire il mezzo con 500 μl di mezzo appropriato con o senza stressore e incubare.
NOTA: Le condizioni che inducono stress includono le seguenti (vedi sotto). Per ulteriori trattamenti vedi Kedersha et al . 13 .- Per il trattamento con shock termico, usare un mezzo regolare contenente 20 mM HEPES e posizionare la piastra in bagno d'acqua a 44 ° C per 30 min.
- Per il trattamento con clotrimazolo (indotta da stress mitocondriale), utilizzare un mezzo regolare senza FCS con 20 μM di clotrimazolo e incubare in un incubatore di coltura per 1 h.
NOTA: Conservare aliquote monouso di 20 mM clotrimazolo in dimetilsolfossido (DMSO) a -20 ° C per un massimo di 4 mesi. Utilizzare il veicolo DMSO per le celle di controllo. - Per l'arsenite (induce stress ossidativo), utilizzare un mezzo regolare con arsenito 0,5 μM e incubare in incubatore di coltura tissutale per 1 h.
NOTA: Conservare le aliquote monouso di 0,5 mM di arsenite a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
ATTENZIONE: Clotrimazolo e arsenito sono dannosi e pericolosi per l'ambiente e devono essere smaltiti in modo appropriato. - Per il trattamento con Desamethyl Des-Amino (DMDA) -patilamina (inibisce l'iniziazione della traduzione eucariotica), utilizzare un mezzo regolare con 50-200 nM di DMDA-pateamine e incubare in incubatore di coltura tissutale per 1 h.
NOTA: Conservare DMA-pateamine a -80 ° C. Conservare i reagenti come piccole aliquote per evitare lo scioglimento congelato.
4. Analisi della fissazione e immunofluorescenza della formazione di granuli di stress
NOTA: elaborare il controllo eLe copertine sperimentali contemporaneamente per evitare che le differenze di colorazione possano influenzare l'analisi delle immagini nei passaggi successivi. I campioni di controllo non includono infezioni con e senza trattamento indottante SG e campioni infetti con o senza trattamento indotto da SG.
- Rimuovere completamente il mezzo utilizzando una pompa di aspirazione e fissare i campioni aggiungendo 0.5 ml di RT 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS. Incubare per 30 minuti a RT.
ATTENZIONE: PFA è dannoso per il gestore e per l'ambiente. Prendere misure adeguate per proteggere il manipolatore e smaltire con i rifiuti chimici.
NOTA: In alternativa, fissare per 15 minuti e poi sostituire con metanolo prechillato -20 ° C per 10 minuti per mantenere la localizzazione più citoplasmatica dei marcatori SG13. - Rimuovere il PFA con una pipetta e smaltire il liquido in un apposito contenitore di rifiuti. Lavare la copertura con 1 ml di Tris-Buffered Saline (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3, 15 mM NaCl). Incubare il coperchio per 2 minuti con una leggera scossaSu un agitatore a piastra durante il lavaggio.
- Rimuovere completamente TBS utilizzando una pompa di aspirazione e aggiungere 500 μl di 0,3% di Triton-X100 in TBS per 10 minuti per permeabilizzare le cellule.
- Rimuovere la soluzione permeabilizzante con una pompa di aspirazione. Sostituire con 1 mL di TBS, ruotare leggermente la piastra, rimuovere TBS per aspirazione e aggiungere 1 mL di soluzione bloccante (5% FCS in TBS) per 1 h a RT.
- Preparare la soluzione anticorpale primaria (1: 300 diluizione) nel 5% FCS in TBS. Calcolare 50 μL per coperchio da 12 mm e fare abbastanza per tutti i coperchi in un unico pezzo.
NOTA: Gli anticorpi primari comuni utilizzati sono i target G3BP1, eIF3b e TIA1. - Posizionare 50 μL di miscela anticorpale primaria su un film paraffina di plastica (parafilm) saldamente fissato sulla panca o sulla camera.
NOTA: Un elenco di marcatori canonici SG è fornito nella tabella dei materiali , ma la composizione degli SG può dipendere dalla tensione applicata. Altri marcatori SG sono elencati in Kedersha et al. 13 S. flexneri sono elencati nella Tabella 1 . - Sollevare la copertura con le pinzette, applicare il bordo del coperchio sul tessuto, rilasciando brevemente le pinzette per rimuovere il liquido in eccesso e collocare delicatamente la faccia in giù sulla goccia. Incubare i coperchi per 1,5 ore a RT o per una notte a 4 ° C in una camera umida.
NOTA: Per preparare una camera umida, posizionare i tessuti prewetted lungo i bordi di una camera chiusa e chiusa rivestita con parafilm in plastica. - Trasferire ciascuna copertina con le pinzette in un pozzo di una nuova piastra a 24 pozzetti riempita di 1 mL di TBS; Incubare con agitazione leggera su un agitatore a piastra per 5 min. Aspirare TBS in ogni pozzetto usando una pompa di aspirazione, sostituire con 1 mL TBS e riposizionare su agitatore a piastra per 5 min. Ripetere la lavata ancora una volta.
NOTA: riutilizzare il parafilm rimuovendo il liquido in eccesso con un tessuto e lavando la superficie con acqua. Assicurarsi che la pellicola paraffina sia completamente asciutta prima di usinG per la successiva fase di colorazione. - Preparare la soluzione anticorpale secondaria in TBS (diluizione 1: 500 - 1: 2.000). Per macchiare il nucleo ei batteri, aggiungere 2 μg / mL DAPI al mix. Per macchiare l'actina, aggiungete phalloidin fluorescente. Pipettare 50 μL di miscele secondarie anticorpali sulla pellicola di paraffina di plastica.
NOTA: Si raccomanda l'uso di anticorpi secondari secondari ad alta trasparenza cross-assorbiti per studi di co-localizzazione di differenti marcatori SG quando viene utilizzato G3BP1 (anticorpi caprini). Scegli gli anticorpi secondari etichettati con fluorescenza con spettri non sovrapposti. EIF3b chiaramente macchia il citoplasma delle cellule ed è quindi un buon marcatore per delineare le cellule. La macchia di actina aiuta ulteriormente a delineare le cellule nei siti di contatto cellulare e nelle aree di ingresso batterico. - Prendete la copertura con le pinzette, schiacciando il bordo del coperchio sul tessuto, rilasciando brevemente le pinzette, per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare delicatamente il coperchio rivolto verso il basso sulla goccia e incubare le copertineAl buio per 1 ora a RT.
- Usate le pinzette per posizionare la copertura nel piatto da 24 pozzetti riempiti di PBS fresco da 1 ml. Assicurarsi che il coperchio sia completamente coperto dal PBS. Lavare le celle 3x con una leggera scossa per 5 minuti ciascuna.
NOTA: tenere la piastra durante i lavaggi sotto una copertura per proteggere dalla luce come i fluorofori dell'anticorpo secondario sono sensibili alla luce. - Inserire brevemente la copertura in acqua deionizzata per rimuovere il sale, asciugare dal bordo su un tessuto e montare la copertura in 5 μl di supporto di fluorescenza su una lastra di vetro. Sigillare la copertina prima dell'immagine con smalto. Mantenere le diapositive a 4 ° C per una breve durata (settimana) oa -20 ° C per l'immagazzinamento a lungo termine (mese).
NOTA: Evitare le bolle d'aria durante la sigillatura in quanto ciò ostacola la qualità dell'immagine.
5. Fluorescenza Imaging
NOTA: fare riferimento al manuale utente del microscopio per ottimizzare l'impostazione.
- Acquisire le immagini usando un microscopio confocale usando una lente di immersione a olio 40 o 63X. Selezionare i canali fluorescenti desiderati per l'acquisizione di immagini. Quando si utilizzano più canali fluorescenti, selezionare la modalità di acquisizione sequenziale.
NOTA: Iniziare con i campioni sperimentali in cui gli SG sono stati indotti il più forte per evitare sovraesposizione nei campioni successivi. Assicurarsi di non avere SG sovraesposti per tutta la profondità della cella.- Impostare la dimensione del bit di 12 o superiore nelle impostazioni del microscopio per garantire la precisione dell'analisi delle immagini.
- Impostare le pile di immagini per coprire l'intera profondità della cella. Controllare i diversi canali e per i diversi marcatori SG per assicurare che l'intera gamma sia inclusa. Impostare l'inizio dello stack alla base delle celle e la parte superiore degli stack all'altezza nella parte superiore delle celle in cui non vengono osservati più marcatori SG.
- Acquisizione dello stack. Tenere l'altezza dello stack uguale per tutte le immagini.
NOTA: non farloModificare le impostazioni di acquisizione tra controlli e campioni sperimentali utilizzati per il confronto successivo.
6. Analisi delle immagini
NOTA: Qui viene descritta l'analisi SG sulle pile crollate usando freeware ICY. L'analisi delle immagini delle ricostruzioni 3D può essere effettuata anche utilizzando altri software specializzati. Il rilevamento SG può essere eseguito tramite un flusso di lavoro completamente automatizzato stabilito per questo protocollo (disponibile all'indirizzo http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Per utilizzare questo protocollo, i nuclei devono essere macchiati con una macchia di DNA per il software per trovare il centro di ciascuna cella e i bordi delle cellule devono essere contrassegnati da un marcatore citoplasmatico (come ad esempio eIF3b) o da una colorazione attinica per il software Per identificare i confini delle cellule. Il flusso di lavoro automatico può essere utilizzato per convalidare i risultati derivanti manualmente o direttamente per l'analisi quando i limiti delle cellule sono rilevati con alta fiducia,Dipendono dalla densità delle cellule e dal marker utilizzato per rilevare i limiti delle cellule.
- Utilizzando ImageJ o Fiji, comprimere gli stack di immagini (Image> Stacks> Projection Z) e salvare come file .tiff.
NOTA: Crea una nuova cartella per ogni immagine poiché il software di analisi delle immagini legherà i suoi risultati al sito dell'immagine originale. - Carica un'immagine di controllo e sperimentale .tiff alla piattaforma di analisi delle immagini (File> Apri). Vai alla finestra Sequenza. Scorri verso il basso nella "Tabella di ricerca" i parametri del canale.
- Disattiva tutti i canali facendo clic sulla casella di controllo di tutte le schede del canale. Fai clic sul canale 0 e seleziona il colore preferito facendo clic sulla barra di colore qui sopra. Aumenta l'intensità del canale come necessario per vedere tutte le strutture facendo clic e spostando la riga nel campo di intensità. Ripetere questo per tutti i canali.
NOTA: Disattivare i canali che non sono necessari per una determinata attività per ridurre al minimo le anomalie nell'analisi dei campioni. - ScorrereUp e all'interno della scheda Canvas, ingrandire fino a circa 10 celle per campo regolando la scheda zoom.
- Utilizza gli strumenti della funzione poligonale (nella barra superiore) per delineare i limiti delle cellule delle celle nell'immagine. Utilizzare la macchia actina o un marcatore citosolico per la delimitazione del contorno cellulare ( ad es. EIF3b).
- Fai clic sulla funzione poligonale all'interno degli strumenti "File & ROI". Inizia la delineazione cliccando sulla cella e poi estendi la linea facendo gli ancoraggi ripetuti cliccando attorno al limite della cella. Per terminare un ROI, fare nuovamente clic sulla funzione poligonale all'interno degli strumenti "File & ROI".
NOTA: Identificare le sotto-popolazioni delle celle delineate che sono infette. Il campione è costituito da un mix di cellule infette e non infette. Per identificare i batteri, utilizzare la macchia DAPI oi batteri fluorescenti (come i batteri esprimenti GFP). Aumenta l'intensità per assicurare che tutti i batteri siano visibili. - Per denominare un ROI, andare alla finestra ROI a destra e cliCk sulla cella di interesse nell'immagine. Ciò evidenzierà il ROI corrispondente nella scheda ROI. Fare doppio clic sul nome ROI e modificare il nome ( ad esempio, cellula infetta # 1).
NOTA: se si desidera utilizzare un'immagine per analizzare le celle infette e non infette, è più facile salvare l'immagine in due cartelle separate e delineare separatamente le cellule infette e non infette, generando due fogli di calcolo diversi, che facilitano l'analisi dopo.
- Fai clic sulla funzione poligonale all'interno degli strumenti "File & ROI". Inizia la delineazione cliccando sulla cella e poi estendi la linea facendo gli ancoraggi ripetuti cliccando attorno al limite della cella. Per terminare un ROI, fare nuovamente clic sulla funzione poligonale all'interno degli strumenti "File & ROI".
- Aprire l'applicazione rivelatore spot all'interno della scheda "Rilevamento e monitoraggio" (barra superiore). All'interno della scheda Input, verrà selezionata l'immagine corrente. Non cambiare nulla. All'interno della scheda Pre-Processing, selezionare il canale da analizzare.
NOTA: Solo un canale può essere analizzato in un determinato momento. Qui è possibile selezionare un'analisi batch se si utilizza la sequenza di analisi completamente automatizzata i cui parametri sono stati controllati per dare risultati soddisfacenti.- All'interno della scheda Detector, scegliete "DeSeleziona la scala e la sensibilità appropriata. Esegue questa operazione testando diverse impostazioni e controllando il punto di rilevamento spot nei controlli e nei campioni sperimentali.
NOTA: Per un'immagine con una risoluzione di 2.048 x 2.048 e una dimensione di pixel di 0.12 μm 2 , è generalmente adatta una soglia di livello 2 con una sensibilità da 25 a 100, ma ciascun marker SG deve essere testato empiricamente. Impostare il rilevamento del punto in modo che nel campione di controllo non trattato non siano rilevati spot, mentre nel campione sperimentale con SG, vengono conteggiati tutti i SG piccoli e grandi. - All'interno della scheda ROI, selezionare il ROI suggerito dalla sequenza. All'interno della scheda Filtro, selezionare No Filtering. Nella scheda Output, scegliere l'output appropriato.
NOTA: la scelta di Abilita file specifico è utile per il salvataggio di differenti condizioni di rilevamento o di diversi canali. Selezionando per esportare l'immagine binaria e l'immagine originale con i ROI e il rilevamento è helPful per l'analisi di controllo di qualità. - Seleziona "Rimuovi punti precedenti resi come ROI". Scegliere la cartella per salvare il file facendo clic sul pulsante "nessun file selezionato". Nella scheda Display, selezionare le opzioni desiderate. Fare clic su "Avvia rilevamento".
NOTA: Verrà creata una cartella con il nome e la località scelta che contiene le opzioni di imaging esportate. Queste immagini verranno sovrascritte per ogni nuova condizione testata. Per mantenere le immagini, rinominare la cartella in modo che crei una nuova cartella o trasferisca le immagini dalla cartella di salvataggio in una nuova cartella. Per il controllo della qualità delle immagini, è utile selezionare il segno di rilevazione del display, il numero di rilevamento del ROI e del ROI numero e nome.
- All'interno della scheda Detector, scegliete "DeSeleziona la scala e la sensibilità appropriata. Esegue questa operazione testando diverse impostazioni e controllando il punto di rilevamento spot nei controlli e nei campioni sperimentali.
- Consolidare e salvare i dati per i diversi parametri utilizzando il foglio di calcolo generato per ogni immagine o condizione testata.
NOTA: I parametri da analizzare includono il numero di SG per ROI, le superfici SG e la SG maxImman, intensità media e minima. - Trasferire i dati e analizzare usando un programma di analisi in grado di analizzare, analizzare e determinare la significatività statistica.
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Representative Results
Per spiegare e dimostrare il protocollo descritto in questo manoscritto abbiamo caratterizzato l'immagine di SGs indotti da clotrimazolo nelle cellule HeLa infette o non con il patogeno citosolico S. flexneri . Una descrizione del procedimento è presentata in figura 1 e comprende la virulenza e avirulente S. flexneri su piastre rosse di Congo, preparazione dei batteri, infezione, aggiunta di stress ambientali, fissazione e colorazione dei campioni, imaging e quantitativi di campioni, nonché analisi delle immagini . Un certo numero di sollecitazioni diverse possono essere usate per indurre la formazione di SG e una varietà di marcatori SG sono disponibili per l'interrogazione. EIF3b è un marker canonico SG che chiaramente macchia il compartimento citoplasmatico della cella e può essere utilizzato per identificare i bordi delle cellule. G3BP1 è un marcatore SG ampiamente utilizzato che si aggrega in SG senza una colorazione di fondo ( Figura 2 A, B D ). Le celle sono meglio immagazzinate con un microscopio confocale e le pile che coprono tutta la profondità della cella vengono caricate sull'immagine di analisi dell'immagine freeware ICY ( Figura 2 A-C ). Per meglio identificare le cellule infette e per mettere le cellule nel gruppo infetto o non infetto per un'analisi successiva, è utile aumentare l'intensità della macchia dell'acido nucleico ( Figura 2D ). All'interno del software di analisi delle immagini, il rilevatore di punti viene utilizzato per identificare gli SG all'interno di ciascuno dei ROI designati ( Figura 2 E ) e viene generata un'immagine binaria che visualizza tutti gli SG identificati ( Figura 2 F ).
L'analisi SG deve essere adattata a ciascun indicatore SG analizzato e l'impostazione appropriata per l'analisi deve essere scelto con cura. Focusing sulla SG maRker G3BP1, modificando il requisito di dimensione del punto rilevato o cambiando la sensibilità dei parametri di rilevazione, porterà a risultati diversi, come dimostrato nella figura 3 A-C . La selezione della scala (1 - 3, sebbene le scale possono essere aggiunte) si basa sulla dimensione dei pixel e quindi alle bilance più alte, le SG più piccole non verranno conteggiate ei numeri di SG diminuiranno ( Figura 3 C ). La sensibilità è misurata da 1 a 100, con 100 essendo il più sensibile. Aumentando la sensibilità, il numero di SG rilevato aumenta ( Figura 3 C ). Quindi, occorre trovare le impostazioni corrette per minimizzare i falsi positivi e le false negative. Questo è fatto meglio analizzando attentamente le immagini ottenute per ogni impostazione. Per G3BP1, una scala di 2 con una sensibilità di 100 (2 - 100, evidenziata in rosso) ha dato il miglior risultato. Una scala di 2 con una sensibilità inferiore (50 o 25) rimane piccolaSG non indicati (vedi frecce arancione). Allo stesso modo, una scala di 3 lasciato piccola SG non contabilizzata mentre una scala di 1 oversampled. È importante aggiungere scalini aggiuntivi per concentrarsi solo su grandi SG, se ciò è garantito. Per eIF3b, una scala di 2 con una sensibilità di 55 (2 - 55) ha dato il miglior risultato per eIF3b (evidenziato in rosso), anche se le frecce rosse evidenziano sotto o sovrapposizione in una scala 2 - 50 e 2-55.
Una volta impostati correttamente i parametri per l'analisi SG, i dati possono essere analizzati in molti modi ( Figura 4 ). Il rilevatore di punti fornisce il numero di SG individuati all'interno di ciascun ROI in modo tale che le cellule non infette e infette possano essere confrontate ( Figura 4 A ). Allo stesso modo, viene fornita la dimensione, in questo caso numero di pixel, da cui è possibile calcolare la superficie ( Figura 4 B ). Distribuzione di frequenza plOts sono utili anche per evidenziare spostamenti nella dimensione di SG trovati in diverse popolazioni cellulari. Qui, una completa assenza di grandi SG in cellule infette da S. flexneri , così come un certo spostamento nella distribuzione diventa più chiara ( Figura 4 C ). Inoltre, l'intensità (mostrata qui è l'intensità minima e massima) fornisce informazioni sulla qualità degli SG analizzati. Per le cellule infette da S. flexneri , gli SG sono notevolmente meno intensi. Queste analisi forniscono informazioni statisticamente rilevanti sia sulla qualità qualitativa che quantitativa degli SG formata in risposta a stress esogeno quando le cellule sono infettate con o senza S. flexneri .
Figura 1 : Schema della procedura sperimentale per infezione delle cellule con S. Flexneri ePer analizzare l'effetto della formazione di SG Infezione. Una colonia Congo-rossa e una colonia nonvirulenta Congo-Rosso-negativa vengono raccolte e coltivate O / N nel brodo di soia tryptico. La coltura durante la notte viene subcultura alla fase tardiva esponenziale prima che i batteri siano rivestiti con PLL per promuovere l'adesione. Le cellule ospitanti coltivate su vetrini in lastre a 12 pozzetti vengono infettate da batteri per 30 min. Le cellule di controllo non vengono infettate. Le cellule vengono lavate e trattate con induttori di stress per indurre la formazione di SG sostituendo il mezzo con un mezzo contenente lo stress o sottoponendo le cellule a condizioni di stress, come il caldo. Le cellule vengono quindi fissate, permeabilizzate, macchiate con indicatori SG-specifici immunofluorescenti e immagazzinati utilizzando microscopia confocale. Le proiezioni Z vengono realizzate usando ImageJ e analizzate usando il rivelatore spot del software di analisi delle immagini. I dati vengono poi analizzati. Clicca qui per vedere un largoVersione di questa figura.
Figura 2 : Analisi del rilevatore di punti delle cellule HeLa infette da S. Flexneri per 1,5 ore prima dell'aggiunta di clotrimazolo per 1 h. A. Immagine immunofluorescente di una proiezione z che mostra le cellule colorate con i marcatori SG eIF3b e G3BP1, DAPI e actina. B. Stessa immagine come in (A) ma senza l'attin macchia per evidenziare l'uso di eIF3b per delineare i limiti delle cellule. C. Schermo dello schermo del software di analisi delle immagini con il modulo del rilevatore di punti. D. Gating delle cellule infette e non infette come visto attraverso diversi canali. Per vedere tutti i batteri, l'intensità è aumentata. Le cellule con più di un batterio presenti nella cellula sono etichettate con una stella rossa. E. Uscita del punto detecAnalisi dei singoli ROI, indicando il nome ROI, il numero di punti e la loro posizione. F. Immagine di macchie rilevate nei ROI. Barra di scala = 30 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : confronti di diverse impostazioni di scala e di sensibilità del rilevatore di punti per la rilevazione di SG tramite diversi indicatori SG. A. Ingrandire le cellule HeLa infette o meno con S. flexneri e colorate con DAPI e il SG marker G3BP1 e analizzate a diverse scale (dimensione pixel tagliata, 1-3) e sensibilità (1 - 100). Rappresentazione grafica dei numeri SG in cellule infette e infette analizzate a diverse scale (
Es / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
Figura 4 : Analisi dei dati SG generati dal rilevatore di punti ottenuti da cellule HeLa trattate con clotrimazolo infette da S. Flexneri . A. Numero di G3BP1 SG per cellula in cellule HeLa infette e non infette. B. Superficie di G3BP1-SG in cellule infette e non infette, e la loro frequenza di distribuzione percentuale ( C ). D. Valori di intensità minima e massima (arbitraria) di G3BP1-SG. I valori includono la media con l'errore standard. Analisi statistiche selezionate incluse per la chiarezza usando i p-valori di test di somma Wilcoxon a sinistra e la varianza F-test a destra. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = nonsignificante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto qui descrive l'induzione, la localizzazione e l'analisi di SG in cellule non infette e nelle cellule infette con il patogeno citosolico S. flexneri in presenza o in assenza di stress esogeno. Utilizzando il software di imaging gratuito, i protocolli consentono l'analisi precisa qualitativa e quantitativa della formazione SG per individuare e confrontare statisticamente le differenze in determinati fenotipi.
Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo per l'infezione, le parti di SG-induzione e di imaging. Per l'infezione, è importante che l'interazione batterica con le cellule ospite, come l'invasione come protocollo delineato, sia sincronizzata quanto più possibile. Ciò è particolarmente importante quando indaghi gli effetti della sfida batterica in anticipo durante il processo di infezione. Abbiamo mostrato in precedenza che alcuni fenotipi, come la localizzazione eIF3b dopo l'infezione da S. flexneri , sono perturbati presto durante il tipo di selvaggioLa sfida di S. flexneri mentre altri fenotipi, come l'aggregazione di SGs contenenti G3BP1, sono maggiormente colpiti nei punti successivi 3 . Pertanto, per descrivere con precisione l'effetto temporale della sfida batterica, è consigliabile sincronizzare l'infezione. In particolare, per analizzare la formazione di SG, le cellule dovrebbero essere in fase di crescita esponenziale, e quindi la densità cellulare in occasione dell'aggiunta di stress è anche un parametro importante. Limita anche l'analisi SG a modelli di infezione cellulare non confluenti. Un altro aspetto critico è la co-elaborazione dei controlli e dei campioni sperimentali durante la lavorazione dei campioni per l'imaging e durante l'acquisizione di immagini. Per l'elaborazione immunofluorescente, tutti i campioni devono essere macchiati con le stesse diluizioni di lavorazione anticorpi per la stessa quantità di tempo e nelle medesime condizioni ( vale a dire RT a 4 ° C), prendendo cura anche di trattare ogni copertura in modo simile durante le fasi di lavaggio e Montaggio oF le copertine. Ciò garantirà confronti immunofluorescenti che possono essere analizzati sia qualitativamente che quantitativamente. Le differenze nel supporto di montaggio possono avere effetti significativi sul sbiancamento dei campioni durante l'acquisizione di immagini e pertanto devono essere mantenuti costanti. Allo stesso modo, l'acquisizione di immagini per tutti i campioni da confrontare in analisi dovrebbe essere effettuata all'interno di una sola seduta e con le stesse impostazioni per ridurre al minimo le differenze derivanti dalla forza laser o dal set-up del campione.
Quando si utilizzano sollecitazioni esogene, è importante immagazzinare correttamente il reagente e spesso effettuare nuove scorte di lavoro. Periodi prolungati (> 4 mesi per clotrimazolo, ad esempio) portano alla diminuzione della potenza del farmaco e influenzeranno la formazione del SG. I reagenti devono essere aggiunti al terreno di coltura immediatamente prima dell'aggiunta alle cellule; Se si osserva una riduzione della formazione di SG nelle cellule di controllo o l'aggregazione di SG appare aberrante, i reagenti devono essere testati perDovrebbero essere fatte nuove azioni.
Una limitazione è che l'identificazione SG usando il rilevatore di punti diventa meno affidabile quando troppa presenza di fluorescenza di fondo è presente. Sebbene questo non sia un problema per molti marcatori SG, alcuni, come eIF3b, che sono un marcatore citosolico chiaro in entrambe le condizioni inducenti SG e non inducenti, sono più difficili da analizzare come dimostrato nella figura 3 . Inoltre, le bilance e le sensibilità devono essere determinate empiricamente per ciascun marker SG. Un'altra limitazione è che l'analisi attraverso il software di analisi delle immagini è meglio con le immagini 2D e quindi funziona bene su fette ottiche o pile crollate, che tuttavia provoca una perdita di informazioni 3D. L'analisi sulle proiezioni z dunque tende a sovrastare la dimensione degli SG e sottovalutare il numero di SG. L'analisi 3D degli SG può essere eseguita con Imaris per dare una caratterizzazione spaziale ancora più precisa, se ritenuta necessaria per un particolare fenotipo. La caratterizzazione SG può essere eseguita in modo rapido e in modo standardizzato utilizzando il rilevatore di punti automatizzato del software di analisi delle immagini. Al contrario, i metodi manuali per identificare e delineare gli SG come precedentemente eseguiti 4 , lasciano l'analisi aperta a più polarizzazione ed è notevolmente più tempo. L'analisi SG utilizzando il rilevatore di punti può anche essere adattata per includere o escludere piccoli aggregati SG selezionando diverse soglie di sensibilità e dimensioni, consentendo così flessibilità nella valutazione di diversi aspetti della formazione SG. L'analisi SG può anche essere eseguita in modo completamente automatizzato utilizzando un flusso di lavoro automatizzato stabilito 3 . All'interno di questo flusso di lavoro, il centro della cella viene identificato tramite una macchia DAPI e il programma consente quindi una crescita di una sfera malleabile verso l'esterno per delineare i limiti delle cellule in base a una macchia citoplasmatica (come ad esempio eIF3b) o all'attina. Allo stesso tempo, utilizzando un'analisi semiautomatica diDefinire manualmente singole celle per l'analisi, può essere vantaggioso quando le cellule crescono nei cluster e nei limiti delle cellule sono difficili per il programma automatico delineare chiaramente. In queste circostanze, la definizione dei limiti delle cellule manualmente può eliminare i valori falsi positivi o negativi.
Il protocollo può essere adattato ad altre condizioni indotte da SG e ad altri agenti patogeni, compresi virus, batteri, lieviti e protozoi. Di particolare interesse possono essere altri patogeni citosolici quali Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei e Listeria spp. 14 Per ogni agente infettivo, e possibilmente anche linee cellulari differenti, il protocollo dell'infezione dovrà essere adattato e i tempi di campionamento di sollecitazioni esogene sono determinate empiricamente. Inoltre, la caratterizzazione SG utilizzando il software di analisi delle immagini può essere estesa anche in imaging live-cell in futuro. Analisi SG in tempo reale sarebbe necessariaL'espressione di uno o più marker SG fluorescenti nelle cellule ospitanti, ma permetterebbe di affrontare in condizioni sperimentali diverse questioni relative alla dinamica temporale e speciale della formazione SG. Dovrebbero allora essere necessari batteri con etichettatura fluorescente per completare l'analisi SG in tempo reale in cellule infette e non infette.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
PS è un destinatario della Gran e del Gran Premio di Sfida Melinda Gates OPP1141322. PV è stato sostenuto da una borsa di studio della Posta Nazionale della Scienza Nazionale della Scienza Nazionale e una borsa post-dottorale Roux-Cantarini. PJS è supportato da una sovvenzione HHMI e ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1:300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1:500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1:500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1:500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140 | 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application - cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Paraformaldehyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application - cell culture |
| 12 mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application - image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application - data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application - data analysis |
References
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