Summary
Vi beskriver en metod för kvalitativ och kvantitativ analys av spänningsgranulbildning i däggdjursceller efter att cellerna utmanas med bakterier och ett antal olika spänningar. Detta protokoll kan appliceras för att undersöka det cellulära stressgranule-svaret i ett brett spektrum av värd-bakteriella interaktioner.
Abstract
Fluorescerande avbildning av cellulära komponenter är ett effektivt verktyg för att undersöka värd-patogen interaktioner. Patogener kan påverka många olika särdrag hos infekterade celler, inklusive organellens ultrastruktur, cytoskeletala nätverksorganisation, liksom cellulära processer som Stress Granule (SG) -bildning. Karakteriseringen av hur patogener undergräver värdprocesser är en viktig och integrerad del av patogenesens område. Medan variabla fenotyper kan vara lätt synliga är den exakta analysen av de kvalitativa och kvantitativa skillnaderna i de cellulära strukturerna inducerad genom patogenutmaning väsentlig för att definiera statistiskt signifikanta skillnader mellan experimentella och kontrollprover. SG-bildning är ett evolutionärt konserverat stressrespons som leder till antivirala reaktioner och har länge undersökts med hjälp av virusinfektioner 1 . SG-bildning påverkar också signalkaskader och kan ha andra fortfarande okända konseqUences 2 . Karakteriseringen av detta stressrespons på andra patogener än virus, såsom bakteriepatogener, är för närvarande ett framväxande forskningsområde 3 . För närvarande är kvantitativ och kvalitativ analys av SG-bildning ännu inte rutinmässigt använd, även i virussystemen. Här beskriver vi en enkel metod för att framkalla och karakterisera SG-bildning i oinfekterade celler och i celler infekterade med en cytosolisk bakteriell patogen, vilken påverkar bildandet av SG som svar på olika exogena spänningar. Analys av SG-bildning och komposition uppnås genom användning av ett antal olika SG-markörer och pluggdetektorinplikatorn för ICY, ett open source-bildanalysverktyg.
Introduction
Visualisering av värd-patogen interaktioner på cellulär nivå är en kraftfull metod för att få insikter i patogena strategier och för att identifiera viktiga cellulära vägar. Faktum är att patogener kan användas som verktyg för att identifiera viktiga cellulära mål eller strukturer, eftersom patogener har utvecklats för att undergräva centrala cellulära processer som en strategi för egen överlevnad eller förökning. Visualisering av cellulära komponenter kan uppnås genom rekombinant uttryck av fluorescensmärkta värdproteiner. Medan detta tillåter sanntidsanalys är genereringen av cellinjer med specifikt märkta värdproteiner mycket mödosam och kan resultera i oönskade bieffekter. Mer praktiskt är detekteringen av cellulära faktorer med användning av specifika antikroppar, eftersom flera värdfaktorer kan analyseras samtidigt och en är inte begränsad till en viss celltyp. En nackdel är att endast en statisk vy kan fångas eftersom immunofluorescensanalysen kräver värdcellfixatJon. En viktig fördel med immunfluorescensavbildning är emellertid att det lätt lutar sig åt både kvalitativ och kvantitativ analys. Detta kan i sin tur användas för att få statistiskt signifikanta skillnader för att ge nya insikter i värd-patogen interaktioner.
Fluorescerande bildanalysprogram är kraftfulla analysverktyg för att utföra 3D- och 4D-analys. Men den höga kostnaden för programvara och dess underhåll gör metoder som bygger på fri öppen källkodsprogram mer attraktiv. Noggrann bildanalys med bioanalysprogramvara är värdefull eftersom den underbygger visuell analys och vid tilldelning av statistiska signifikanser ökar förtroendet för korrektheten hos en given fenotyp. Tidigare har SGs analyserats med hjälp av den fria ImageJ-mjukvaran, vilket kräver att man manuellt identifierar enskilda SG 4 . Här tillhandahåller vi ett protokoll för induktion och analys av cellulär SG-bildning i samband med bacTeriella infektioner med hjälp av den kostnadsfria open source bio-image-analysprogrammet ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Bio-image-analysprogrammet har ett inbyggt spotdetektorprogram som är mycket lämpligt för SG-analys. Det gör det möjligt att finjustera den automatiska detekteringsprocessen i specificerade intresseområden (ROI). Detta övervinner behovet av manuell analys av enskilda SG och avlägsnar provtagningsförskjutning.
Många miljöbelastningar inducerar bildandet av SG, vilka är fas-täta cytosoliska, icke-membranösa strukturer med en diameter av 0,2 - 5 um i diameter 5 , 6 . Detta cellulära svar är evolutionärt konserverat i jäst, växter och däggdjur och uppträder när global proteinöversättning inhiberas. Det involverar aggregering av stoppade translationsinitieringskomplex i SG, vilka anses vara hållplatser för translationellt inaktiva mRNA, vilket möjliggör selektiv translation av en delmängd av cellulära mRNA.Vid avlägsnande av stress upplöses SG och globala hastigheter för proteinsyntesresume. SG är sammansatta av translationsförlängningsinitieringsfaktorer, proteiner som är involverade i RNA-metabolism, RNA-bindande proteiner, samt ställningsproteiner och faktorer som är involverade i värdcellsignalering 2 , fastän den exakta kompositionen kan variera beroende på den pålagda spänningen. Miljöfaktorer som inducerar SG-bildning innefattar aminosyrasvältning, UV-bestrålning, värmeschock, osmotisk chock, endoplasmisk retikulastress, hypoxi och virusinfektion 2 , 7 , 8 . Många framsteg har gjorts för att förstå hur virus inducerar och subventionerar även SG-bildning, medan lite fortfarande är känt om hur andra patogener, såsom bakteriella, svamp- eller protozoa patogener, påverkar detta cellulära stressrespons 1 , 7 .
ShigeLla flexneri är en gram-negativ fakultativ cytosolisk patogen hos människor och orsakssambandet till allvarlig diarré eller shigellos. Shigellosis är en stor folkhälsobördan och leder till 28 000 dödsfall årligen hos barn under 5 år 9 , 10 år . S. flexneri infekterar kolonepitelet och sprider cell till cell genom kapning av värdens cytoskeletalkomponenter 11 , 12 . Infektion av epitelet stöder replikationen av S. flexneri inom cytosolen, men infekterade makrofager dör genom en inflammatorisk celldödsprocess som kallas pyroptos. Infektion leder till en massiv rekrytering av neutrofiler och svår inflammation som åtföljs av värme, oxidativ stress och vävnadsförstöring. Således, medan infekterade celler utsätts för interna spänningar som induceras av infektion, såsom Golgi-störning, genotoxisk stress och cytoskeletala omläggningS, infekterade celler utsätts också för miljöbelastningar på grund av inflammatorisk process.
Karakterisering av effekten av S. flexneri- infektion på cellernas förmåga att reagera på miljöbelastningar med användning av ett antal SG-markörer har visat att infektion leder till kvalitativa och kvantitativa skillnader i SG-sammansättning 3 . Lite är dock känt om andra bakteriella patogener. Här beskriver vi en metod för infektion av värdceller med cytosolisk patogen S. flexneri , stressen av celler med olika miljöbelastningar, märkningen av SG-komponenter och den kvalitativa och kvantitativa analysen av SG-bildning och komposition i samband med infekterade Och icke-infekterade celler. Denna metod är allmänt tillämplig på andra bakteriepatogener. Dessutom kan bildanalysen av SG-bildningen användas för infektioner av virus eller andra patogener. Det kan användas för att analysera SGBildning vid infektion eller effekten av infektion på SG-bildning som svar på exogena spänningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av bakterier och värdceller
- Överför 12 eller 14 mm glasskyddsplattor i respektive 24- eller 12-brunnsplattor, med sterila pincett, räkna en brunn per experimentellt tillstånd. Sterilisera dessa genom UV-behandling i en vävnadskulturhuvud i 15 minuter.
OBS: Inkludera kontrollbrunnar för bakteriell utmaning och för SG-induktion genom exogena spänningar. - För en 24-brunnsplatta med 12 mm täckglas, frö 1 x 10 5 däggdjursceller ( t.ex. HeLa-celler) på täckglas; Tryck på täckglasen med en steril pipettspets. Låt cellerna klibba över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 vävnadsodlings-inkubator i odlingsmedium som är lämplig för varje celltyp.
OBS: Placera celler så att sammanflödet av cellerna är mellan 40 och 60% påföljande dag.- För HeLa-celler, inkubera i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med icke-essentiella aminosyror (NEAA) och 10% dekomplementerat fetalt kalvserum (FCS).Dekomplementera FCS genom upphettning i 30 minuter i ett 56 ° C vattenbad, som virvlar serumet en gång efter 15 minuter.
- För att stryka ut bakterier, använd en steril pipettspets för att ta bort en liten mängd från en bakteriell glycerollager (20% glycerol) som lagras i en -80 ° C frys och placera den på en märkt tallrik. Använd en steril slinga för att sprida bakterierna över ca 10% av plattan. Använd en ny steril slinga och dra den genom smeten för att göra 3 parallella linjer, en halv platta lång. Stryk genom dessa linjer som täcker resten av plattan. Inkubera plattan O / N vid 37 ° C.
- Välj en enda bakteriekoloni ( t.ex. S. flexneri ) från den nystribade plattan. Undvik att arbeta med bakteriekolonier äldre än 1 vecka.
- För S. flexneri- stammen M90T, inokulera en röd koloni från en nystrimad Tryptic Soy Agar-0,1% Congo-röd agarplatta i 8 ml Tryptic Soy-buljong i ett 15 ml rör; Dra åt locket och inkubera skakning vid 222 rpm O / N vid 306; C.
VARNING: Använd inte stora vita kolonier eftersom de har förlorat virulensplasmiden och är icke-infektiva.
2. Bakteriell utmaning av värdceller
- Förbered bakterier för att maximera infektionspotentialen.
- För S. flexneri subkultur bakterier genom att tillsätta 150 | il O / N-odling till 8 ml Tryptic Soy Agar och inkubera skakning 222 rpm vid 37 ° C till sen exponentiell fas (~ 2 h) för att inducera virulensgenuttryck och förbättra infektion.
- När kulturen är vid en optisk densitet mellan 0,6 och 0,9 (uppmätt vid 600 nm), överför 1 ml odling till ett 1,5 ml rör. Pelletsbakterier i 2 min vid 8 000 xg och resuspenderas i infektionsmedium (DMEM med NEAA, saknar FCS) vid OD 600 = 1. Om OD 600 är 0,85, resuspenderas sedan 850 μL.
OBS: För S. flexneri, vid OD 600 = 1, kommer det att finnas 8 x 10 8 bakterier per ml närOdlades i 8 ml medium. En mångfald infektion (MOI) på 20 är lämplig. För andra patogener måste antalet bakterier per ml vid en OD 600 och lämpligt MOI bestämmas empiriskt.
- När kulturen är vid en optisk densitet mellan 0,6 och 0,9 (uppmätt vid 600 nm), överför 1 ml odling till ett 1,5 ml rör. Pelletsbakterier i 2 min vid 8 000 xg och resuspenderas i infektionsmedium (DMEM med NEAA, saknar FCS) vid OD 600 = 1. Om OD 600 är 0,85, resuspenderas sedan 850 μL.
- För att förbättra bakterie-värd-interaktionerna, belägga bakterier med Poly-L-Lysin (PLL).
OBS: PLL-behandling av S. flexneri hade ingen effekt på SG-dynamiken. Andra patogener måste bedömas för deras förmåga att behandla PLL.- För att belägga bakterier med PLL, centrifugera 1 ml bakteriekultur i 2 min vid 8 000 xg och sedan resuspendera pelleten i 10 | ig / ml PLL i fosfatbuffert saltlösning (PBS) vid en OD 600 = 1.
- Tillsätt bakterielösningen till en liten tallrik, till exempel en brunn i en 12-brunnsplatta och inkubera vid RT (~ 20 ° C) i 10 minuter med försiktig agitation på en plattshake.
- Pelletsbakterier i 2 min vid 8 000 xg, avlägsna överskottet PLL. Resuspendera pelleten i 1 ml PBS anD upprepa detta tvättsteg två gånger. Efter den slutliga tvätten, resuspenderas i infektionsmedium vid OD 600 = 1.
OBS: Här är infektionsmediet för S. flexneri värdcellmedium med 20 mM HEPES utan FCS.
- För S. flexneri subkultur bakterier genom att tillsätta 150 | il O / N-odling till 8 ml Tryptic Soy Agar och inkubera skakning 222 rpm vid 37 ° C till sen exponentiell fas (~ 2 h) för att inducera virulensgenuttryck och förbättra infektion.
- Förbered celler för bakteriell utmaning.
- Ta bort medium från däggdjurs HeLa-celler med hjälp av en sugpump. Tillsätt 500 μL RT HeLa cellmedium för att tvätta cellerna, virvel, ta bort medium med en sugpump och byt ut med 500 μL RT lämpligt infektionsmedium ( t.ex. värdcellmedium med 20 mM HEPES utan FCS).
- OBS! För alla tvättsteg, arbeta snabbt och bearbeta bara upp till 4 täckglas i taget för att undvika uttorkning av cellerna.
- Utmaning utarbetade HeLa-celler med bakterier för att infektera 20-50% av cellerna.
OBS: Lämplig tid och MOI måste bestämmas för varje bakterieart. Generellt är en bra start 30 min vid 37° C med en MOI av 10.- För S. flexneri, utmanar HeLa celler celler med en av de två metoderna (steg 2.3.1.1 eller 2.3.1.2).
- Spin-icke-PLL-behandlade bakterier (20 | il OD 600 = 1 / brunn av 24-brunnsplatta i 500 | il medium) på celler i 10 minuter vid 13000 x g.
- Lägg till PLL-belagda bakterier (15 μl OD 600 = 1 / brunn av 24-brunnsplatta i 500 pl medium) under 15 minuter vid RT för att tillåta bakterier att sedimentera på celler.
- Låt infektionen inträffa genom att placera celler med sedimenterade bakterier i en 37 ° C vävnadsodlings-inkubator under 30 minuter.
ANMÄRKNING: För korta tidspunkter synkroniseras S. flexneri- infektion genom att placera plattor i ett 37 ° C vattenbad i 15 minuter istället för i vävnadsodlingsinkubatorn.
- För S. flexneri, utmanar HeLa celler celler med en av de två metoderna (steg 2.3.1.1 eller 2.3.1.2).
- Stoppa infektion genom att tvätta celler.
- För att tvätta celler och ta bort överflödiga bakterier, ta bort mediet med en sugpump, tillsätt 1 mlFriskt förvärmt (37 ° C) HeLa odlingsmedium (DMEM, 10% FCS, NEAA). Virvla mediet, ta av och byt ut med nytt medium. Upprepa två gånger och lämna färskt medium på cellerna.
- För S. flexneri eller andra intracellulära bakterier, efter infektion av HeLa-celler och tvättarna, ersätt medium med standardvävnadsodlingsmedium innehållande 50 | ig / ml gentamicin för att döda extracellulära bakterier och förhindra ytterligare cellinvasion.
OBS! Lägg inte antibiotika i mediet för extracellulära bakterier.
- För S. flexneri eller andra intracellulära bakterier, efter infektion av HeLa-celler och tvättarna, ersätt medium med standardvävnadsodlingsmedium innehållande 50 | ig / ml gentamicin för att döda extracellulära bakterier och förhindra ytterligare cellinvasion.
- För att tvätta celler och ta bort överflödiga bakterier, ta bort mediet med en sugpump, tillsätt 1 mlFriskt förvärmt (37 ° C) HeLa odlingsmedium (DMEM, 10% FCS, NEAA). Virvla mediet, ta av och byt ut med nytt medium. Upprepa två gånger och lämna färskt medium på cellerna.
- Inkubera bakterier med celler i önskad tid i en vävnadskultur inkubator.
OBS: För S. flexneri kan infektion vara så lång som 6 h beroende på celltypen. För HeLa-celler, låt smitta fortsätta i 1,5-2 h före tillsättning av exogena spänningar för att inducera SG-bildning. För Caco-2-infektioner, där Shigella sprider cell till cell, infekteras i 30 minuter till 6 timmar innan exogen stress läggs till. ceLls kan fixeras vid denna punkt utan att lägga till exogena påfrestningar för att bedöma bildandet av SG som ett resultat av bakterieinfektionen (i så fall fortsätt till avsnitt 4).
3. Inducerande stress-granulatbildning genom tillsats av exogena stressmedel
- Ta bort mediet från infekterade och icke-infekterade HeLa-celler med hjälp av en sugpump, byt medium med 500 μl lämpligt medium med eller utan stressor och inkubera.
OBS: Stressinducerande tillstånd innefattar följande (se nedan). För ytterligare behandlingar, se Kedersha et al . 13 .- För värmekokbehandling, använd vanlig medium innehållande 20 mM HEPES och placera plattan i 44 ° C vattenbad under 30 minuter.
- För behandling med clotrimazol (inducerar mitokondriell stress), använd regelbundet medium utan FCS med 20 μM klotrimazol och inkubera i en vävnadsodlings-inkubator i 1 timme.
ANMÄRKNING: Förvara engångsbruk av 20 mM-klotrimazol-stam i dimetylsulfoxid (DMSO) vid -20 ° C i upp till 4 månader. Använd DMSO-vehikel för kontrollceller. - För behandling av arsenit (inducerar oxidativ stress) använd regelbundet medium med 0,5 μM arsenit och inkubera i vävnadsodlings-inkubator under 1 timme.
ANMÄRKNING: Förvara engångsbruk av 0,5 mM arsenitbestånd vid -20 ° C i upp till 6 månader.
VARNING: Clotrimazol och arsenit är skadliga och miljöfarliga och måste kasseras på lämpligt sätt. - För behandling av desmetyl-des-amino (DMDA) -patamin (hämmar eukaryotisk translationsinitiering) använd regelbundet medium med 50-200 nM DMDA-pateamin och inkubera i vävnadsodlings-inkubator under 1 h.
OBS: Förvara DMDA-pateamin vid -80 ° C. Förvara reagens som små alikvoter för att undvika fryst upptining.
4. Fixering och immunfluorescensanalys av stresskristallbildning
OBS: Behandla kontrollen ochExperimentella täckglas samtidigt för att undvika färgningsskillnader som kan påverka bildanalys i efterföljande steg. Kontrollproverna innefattar ingen infektion med och utan SG-inducerande behandling och infekterade prover med och utan SG-inducerande behandling.
- Ta bort mediet helt med en sugpump och fixa prov genom att tillsätta 0,5 ml RT 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Inkubera i 30 min vid RT.
VARNING: PFA är skadligt för hanteraren och miljön. Ta lämpliga åtgärder för att skydda hanteraren och kassera med kemiskt avfall.
OBS: Alternativt fixa i 15 minuter och ersätt sedan med -20 ° C förkyld metanol i 10 minuter för att behålla mer cytoplasmisk lokalisering av SG-markörer 13 . - Ta bort PFA med en pipett och släng vätskan i en lämplig avfallsbehållare. Tvätta täckglaset med 1 ml Tris-buffrad saltlösning (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM NaCl). Inkuber täckglaset i 2 minuter med försiktig skakningPå en skivapparat under tvätt.
- Ta bort TBS helt med en sugpump och tillsätt 500 μL 0,3% Triton-X100 i TBS under 10 minuter för att permeabilisera cellerna.
- Ta bort permeabiliserande lösning med en sugpump. Byt ut med 1 ml TBS, virvla plattan försiktigt, ta bort TBS genom sugning och tillsätt 1 ml blockeringslösning (5% FCS i TBS) i 1 timme vid RT.
- Förbered den primära antikroppslösningen (1: 300 spädning) i 5% FCS i TBS. Beräkna 50 μL per 12 mm täckglas och gör tillräckligt för alla täckglas i en sats.
OBS: De gemensamma primära antikropparna som används är G3BP1, eIF3b och TIA1. - Ställ 50 μl av den primära antikroppsblandningen på en plastparafinfilm (parafilm) som är fastbandad på bänken eller kammaren.
OBS! En lista över kanoniska SG-markörer finns i Materialet , men kompositionen av SG kan bero på den pålagda spänningen. Andra SG-markörer är listade i Kedersha et al. 13 S. flexneri- infektion anges i tabell 1 . - Plocka upp täckglaset med pincett, dab kanten på täckglaset på vävnad, kort släpp pincett för att ta bort överskottsvätska och lägg försiktigt ansiktet nedåt på droppen. Inkuber täckglas i 1,5 h vid RT eller över natten vid 4 ° C i en fuktig kammare.
OBS! För att förbereda en fuktig kammare, placera förvävda vävnader längs kanterna på en ordentligt stängd kammare kantad med plastparafilm. - Överför varje täckglas med pincett till en brunn i en ny 24-brunnsplatta fylld med 1 ml TBS; Inkubera med försiktig skakning på en plattshakare under 5 min. Sug av TBS i varje brunn med hjälp av en sugpump, byt ut med 1 mL TBS och lägg tillbaka på skakapparaten i 5 minuter. Upprepa tvätt en gång till.
OBS! Återanvänd parafilmen genom att ta bort överskottsvätskan med en vävnad och tvätta ytan med vatten. Se till att paraffinfilmen är helt torr före usinG det för det efterföljande färgningssteget. - Förbered den sekundära antikroppslösningen i TBS (utspädning 1: 500-1: 2000). För att fläcka kärnan och bakterierna tillsätt 2 μg / ml DAPI till blandningen. För att fläcka aktin, tillsätt fluorescerande phalloidin. Pipett 50 μL sekundär antikropp blandas på plastparaffinfilmen.
ANMÄRKNING: Användning av högrenade, crossabsorberade åsna sekundära antikroppar rekommenderas för samlokaliseringsstudier av olika SG-markörer när G3BP1 (getantikropp) används. Välj fluorescensmärkta sekundära antikroppar med icke överlappande spektra. EIF3b fläckar tydligt cytoplasman av celler och är därför en bra markör för att avgränsa celler. Actin-fläcken bidrar vidare till att avgränsa celler vid cell-till-cellkontaktställen och områden av bakteriell inträde. - Plocka upp täckglaset med pincett, dab kanten på täckglaset på vävnad, släpp kort pincett, för att avlägsna överskottsvätska. Placera försiktigt täckglaset med ansiktet nedåt på droppen och inkubera täckglasenI mörkret i 1 timme vid RT.
- Använd pincett för att placera täckglaset i 24-brunnsplattorna fyllda med färsk 1 ml PBS. Kontrollera att täckglaset är fullt täckt av PBS. Tvätta cellerna 3x med försiktig skakning i 5 minuter vardera.
OBS! Håll tallriken under tvätten under ett lock för att skydda mot ljus eftersom fluoroforerna hos den sekundära antikroppen är ljuskänsliga. - Doppa försiktigt täckglaset i avjoniserat vatten för att avlägsna saltet, torka från kanten på en vävnad och montera täckglaset på 5 μl fluorescensmonteringsmedium på en glasskiva. Täta täckglaset före bildning med nagellack. Förvaras vid 4 ° C för korttid (vecka) eller vid -20 ° C för långvarig (månad) lagring.
OBS: Undvik luftbubblor vid tätning, eftersom detta kommer att skada bildkvaliteten.
5. Fluorescens Imaging
OBS! Se mikroskopets användarmanual för optimering av inställningen.
- Skaffa bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop med antingen en 40 eller 63X oljedjupslins. Välj önskade lysrör för bildupptagning. När du använder flera fluorescerande kanaler, välj sekventiellt upptagningsläge.
ANMÄRKNING: Börja med försöksproverna där SG har inducerats som starkast för att undvika överexponering på efterföljande prover. Se till att du inte har överexponerade SG i hela cellens djup.- Ange bitstorlek på 12 eller högre i mikroskopinställningarna för att säkerställa noggrannhet i bildanalysen.
- Ställ in bildstaplarna för att täcka hela celldjupet. Kolla in de olika kanalerna och för olika SG-markörer för att säkerställa att hela sortimentet ingår. Ställ in början av stapeln vid cellens botten och toppen av staplarna i höjden överst i cellerna där inga fler SG-markörer observeras.
- Hämta stapeln. Håll stackhöjden densamma för alla bilder.
OBS: Gör inteÄndra förvärvsinställningar mellan kontroll- och experimentprover som används för efterföljande jämförelse.
6. Bildanalys
OBS: Här beskrivs SG-analys på kollapsade staplar med freeware ICY. Bildanalys av 3D-rekonstruktioner kan också göras med hjälp av annan specialiserad programvara. SG-detektering kan utföras via ett helt automatiserat arbetsflöde som är etablerat för detta protokoll (tillgängligt på http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). För att använda detta protokoll måste kärnorna färgas med en DNA-fläck för att mjukvaran ska hitta mitten av varje cell och cellkanterna måste markeras med antingen en cytoplasmisk markör (såsom eIF3b) eller aktinfärg för mjukvaran Att identifiera cellgränserna. Det automatiska arbetsflödet kan användas för att validera manuellt härledda resultat eller direkt för analys när cellgränser upptäcks med högt förtroende, vilket kommer att vara moStly beror på cellens densitet och markören som används för att detektera cellgränserna.
- Använd ImageJ eller Fiji, kollapsa bildstaplarna (Bild> Stacks> Z-projektion) och spara som .tiff-filer.
OBS! Skapa en ny mapp för varje bild, eftersom bildanalysprogramvaran kommer att länka dess resultat till webbplatsen för originalbilden. - Ladda en kontroll och experimentell .tiff-bild till bildanalysplattformen (File> Open). Gå till sekvensfönstret. Bläddra ner i "Lookup Table" till kanalparametrarna.
- Inaktivera alla kanaler genom att klicka på kryssrutan för alla kanalflikar. Klicka på kanal 0 och välj sedan önskad färg genom att klicka på färgfältet ovan. Öka kanalens intensitet efter behov för att se alla strukturer genom att klicka och flytta linjen i intensitetsfältet. Upprepa detta för alla kanaler.
OBS! Avaktivera kanaler som inte krävs för en given uppgift för att minimera bias i provanalys. - SkrollaUpp och inom fliken Canvas, zooma in till ca 10 celler per fält genom att justera zoomfliken.
- Använd polygonfunktionsverktygen (i den övre fältet) för att avgränsa cellgränserna för cellerna i bilden. Använd aktin fläcken eller en cytosolisk markör för avgränsning av cellgränser ( t.ex. eIF3b).
- Klicka på polygonfunktionen i verktygen "Arkiv och avkastning". Börja avgränsa genom att klicka på cellen och sedan utöka linjen genom att göra ankar genom att repetera om cellgränsen. För att slutföra ett avkastning, klicka igen på polygonfunktionen inom verktygen "Arkiv och avkastning".
OBS: Identifiera subpopulationerna hos de avgränsade cellerna som är smittade. Provet består av en blandning av infekterade och icke-infekterade celler. För att identifiera bakterier, använd antingen DAPI-fläcken eller fluorescerande bakterier (såsom GFP-uttryckande bakterier). Öka intensiteten så att alla bakterier ses. - För att ange en avkastning, gå till ROI-fönstret till höger och cliCk på cellen av intresse i bilden. Detta kommer att markera motsvarande avkastning på fliken Avkastning. Dubbelklicka på ROI-namnet och ändra namnet ( t.ex. infekterad cell # 1).
OBS! Om en bild ska användas för att analysera både infekterade och icke-infekterade celler är det lättare att spara bilden i två separata mappar och avgränsa de infekterade och icke-infekterade cellerna separat och generera två olika kalkylblad, vilket underlättar analysen senare.
- Klicka på polygonfunktionen i verktygen "Arkiv och avkastning". Börja avgränsa genom att klicka på cellen och sedan utöka linjen genom att göra ankar genom att repetera om cellgränsen. För att slutföra ett avkastning, klicka igen på polygonfunktionen inom verktygen "Arkiv och avkastning".
- Öppna fläckdetektorprogrammet inom fliken "Detektion och spårning" (toppfältet). Inom fliken Inmatning kommer den aktuella bilden att väljas. Ändra inte någonting. På fliken Förbehandling väljer du den kanal som ska analyseras.
OBS! Endast en kanal kan analyseras vid en given tidpunkt. En satsanalys kan väljas här om man använder den helautomatiska analyssekvensen vars parametrar har kontrollerats för att ge tillfredsställande resultat.- På fliken Detektor väljer du "DeTect bright spots över mörk bakgrund ". Välj sedan lämplig skala och känslighet. Gör detta genom att testa olika inställningar och krypteringspunktsdetektering i både kontroll och experiment.
OBS! För en bild med en 2,048 x 2,048 upplösning och en pixelstorlek på 0,12 μm 2 är ett tröskelvärde på nivå 2 med en känslighet av 25 till 100 vanligtvis lämpligt men varje SG-markör måste testas empiriskt. Ställ in platsdetektering så att fläckar inte detekteras i det obehandlade kontrollprovet, medan i de experimentella proven med SGs räknas alla små och stora SG. - Inom ROI-fliken väljer du den föreslagna avkastningen från sekvensen. På fliken Filtrering väljer du Ingen filtrering. På fliken Utmatning väljer du lämplig utgång.
OBS! Att välja Aktivera specifik fil är till hjälp för att spara olika detekteringsförhållanden eller olika kanaler. Om du väljer att exportera binärbilden och originalbilden med avkastning och detektering är helPful för kvalitetskontroll analys. - Välj "Ta bort tidigare fläckar som returneras som ROI". Välj mappen för att spara filen genom att klicka på "ingen fil vald" -knapp. På fliken Display väljer du önskade alternativ. Klicka på "Starta upptäckt".
OBS! En mapp med namnet och den valda platsen skapas som innehåller de exporterade bildalternativen. Dessa bilder skrivs över för varje nytt testat tillstånd. För att behålla bilderna, byt namn på mappen så att en ny mapp skapas eller överför bilderna från mappen Spara till en ny mapp. För kvalitetskontroll av bilderna är det bra att välja visningsdetekteringsmärke, antal detektering av ROI och ROI-nummer och namn.
- På fliken Detektor väljer du "DeTect bright spots över mörk bakgrund ". Välj sedan lämplig skala och känslighet. Gör detta genom att testa olika inställningar och krypteringspunktsdetektering i både kontroll och experiment.
- Konsolidera och spara data för de olika parametrarna med hjälp av det genererade kalkylbladet för varje testad bild eller tillstånd.
OBS: Parametrarna som ska analyseras inkluderar antalet SG per ROI, SG ytarea och SG maxImum-, medel- och miniminivåer. - Överför data och analysera med hjälp av ett analysprogram som kan analysera, gradera och bestämma statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att förklara och demonstrera protokollet som beskrivs i detta manuskript karakteriserade vi bilden av klotrimazol-inducerad SG i HeLa-celler infekterade eller ej med cytosolisk patogen S. flexneri . En skiss av proceduren presenteras i figur 1 och innehåller virulenta och avirulenta S. flexneri- streckade på Kongo-röda plattor, bakterieberedning, infektion, tillsats av miljöbelastning, provfixering och färgning, provbildning och kvantifiering, såväl som bildanalys . Ett antal olika spänningar kan användas för att inducera SG-bildning och en mängd SG-markörer är tillgängliga för förhör. EIF3b är en kanonisk SG-markör som också tydligt fläckar den cytoplasmatiska facket i cellen och kan användas för att identifiera cellkanter. G3BP1 är en allmänt använd SG-markör som aggregerar i SG utan någon bakgrundsfärgning ( Figur 2 A, B D ). Cellerna är bäst avbildade med ett konfokalmikroskop, och staplarna som täcker hela celldjupet laddas på bildanalysen freeware ICY ( Figur 2 A-C ). För att bättre identifiera smittade celler och att sätta celler i antingen den infekterade eller icke-infekterade gruppen för senare analys är det användbart att öka intensiteten hos nukleinsyrafläcken ( Figur 2 D ). Inom bildanalysprogrammet används spotdetektorn då för att identifiera SG: er inom varje av de angivna ROI: erna ( Figur 2 E ) och en binär bild genereras som visar alla identifierade SG: er ( Figur 2 F ).
SG-analysen behöver skräddarsys för varje SG-markör som analyseras och lämplig inställning för analys måste noggrant väljas. Fokusera på SG maRker G3BP1, förändring av storlekskravet på den plats som detekterats eller ändrar känsligheten hos detekteringsparametrarna kommer att leda till varierande resultat, såsom visas i figur 3 A-C . Skalavalet (1 - 3, även om skalor kan läggas till) är baserad på pixelstorlek och därmed vid högre vågor, kommer inte mindre SGs att räknas och antalet SG-tal minskar ( Figur 3 C ). Känsligheten mäts från 1 till 100, varav 100 är känsligast. Genom att öka känsligheten ökar antalet SG som detekteras ( Figur 3 C ). Således måste de korrekta inställningarna hittas för att minimera falska positiva och falska negativ. Detta görs bäst genom att noggrant analysera de visuella bilderna som erhållits för varje inställning. För G3BP1 gav en skala av 2 med en känslighet av 100 (2 - 100, markerad i röd) det bästa resultatet. En skala av 2 med en lägre känslighet (50 eller 25) kvarstår litenSGs uncounted (se orange pilar). På samma sätt, en skala av 3 vänster liten SG avräknades medan en skala av 1 överskattades. Det är viktigt att ytterligare vågar läggas till för att fokusera endast på stora SG, om detta är motiverat. För eIF3b gav en skala av 2 med en känslighet på 55 (2-55) det bästa resultatet för eIF3b (markerad i rött), även om röda pilar markerar antingen under eller översampling i en skala 2 - 50 respektive 2 - 55.
När parametrarna för SG-analysen är korrekt inställda kan data analyseras på många sätt ( Figur 4 ). Spotdetektorn ger det antal SG som detekteras inom varje avkastning så att de oinfekterade och infekterade cellerna kan jämföras ( figur 4 A ). På liknande sätt ges storleken, i detta fall antal pixlar, från vilken ytan kan beräknas ( Figur 4 B ). Frekvensfördelning plOts är också användbara för att markera skift i storleken på SG som finns i olika cellpopulationer. Här blir en fullständig frånvaro av stora SG i S. flexneri- infekterade celler, liksom ett bestämt skifte i fördelningen tydligare ( Figur 4 C ). Dessutom ger intensiteten (visad här miniminivå och maximal intensitet) information om kvaliteten på de analyserade SG-erna. För S. flexneri- infekterade celler är SGs signifikant mindre intensiva. Dessa analyser ger statistiskt relevant information om både kvalitativ och kvantitativ natur hos SG som bildas som svar på exogen stress när celler smittas med eller utan S. flexneri .
Figur 1 : Översikt av försöksproceduren till infektionsceller med S. Flexneri ochAtt analysera effekten av infektion SG-formation. En Kongo-röd koloni, och en icke-virulös Kongo-röd-negativ koloni, plockas och odlas O / N i tryptisk sojaböna. Den övernattande kulturen subkultiveras till den sena exponentiella fasen innan bakterier beläggs med PLL för att främja vidhäftning. Värdceller som odlas på glasöverdrag i 12-brunnsplattor infekteras med bakterier i 30 minuter. Kontrollceller är inte infekterade. Celler tvättas och behandlas med stressinducerare för att inducera SG-bildning antingen genom att ersätta mediet med stresshaltigt medium eller utsätta cellerna för stressbetingelser, såsom värme. Celler fixeras sedan, permeabiliseras, färgas med immunofluorescerande SG-specifika markörer och avbildas med användning av konfokal mikroskopi. Z-projektioner görs med hjälp av ImageJ och analyseras med hjälp av spotdetektorn för bildanalysprogrammet. Därefter analyseras data. Vänligen klicka här för att se en storEr version av denna figur.
Figur 2 : Spotdetektoranalys av HeLa-celler infekterade med S. Flexneri i 1,5 h före tillsats av Clotrimazol i 1 timme. A. Immunfluorescerande bild av en z-projektion som visar celler färgade med SG-markörerna eIF3b och G3BP1, DAPI och actin. B. Samma bild som i (A) men utan aktinfärg för att lyfta fram användningen av eIF3b för att avgränsa cellgränserna. C. Skärmbild av bildanalysprogrammet med platsdetektormodulen. D. Gating av de infekterade och icke-infekterade cellerna som ses med olika kanaler. För att se alla bakterier ökar intensiteten. Celler med mer än 1 bakterie närvarande i cellen är märkta med en röd stjärna. E. Utmatning av spotdetekAnalys av enskilda ROI, vilket anger ROI-namnet, antalet fläckar och deras placering. F. Bild av fläckar som upptäckts i avkastningen. Skala bar = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Jämförelser av olika skala- och känslighetsinställningar för punktdetektor för detektering av SG genom olika SG-markörer. A. Inzoomning till HeLa-celler infekterade eller ej med S. flexneri och färgad med DAPI och SG-markören G3BP1, och analyserad i olika skalaer (pixelstorlek avskurna, 1-3) och känslighet (1 - 100). Grafisk representation av SG-nummer i oinfekterade och infekterade celler analyserade i olika skalaer (
Es / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
Figur 4 : Analys av punktdetektor Genererad SG-data erhållen från Clotrimazole-behandlade HeLa-celler infekterade med S. Flexneri . A. Antal G3BP1 SG per cell i infekterade och oinfekterade HeLa-celler. B. Ytarea av G3BP1-SG i infekterade och oinfekterade celler och deras procentdistributionsfrekvens ( C ). D. Minsta och maximala intensitetsvärden (godtyckliga) för G3BP1-SG. Värden inkluderar medelvärde med standardfel. Valda statistiska analyser ingår för tydlighet med hjälp av Wilcoxon rank summan test p-värden till vänster och varians F-test till höger. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = icke signifikant. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här beskriver induktion, lokalisering och analys av SG i icke-infekterade celler och celler infekterade med cytosolisk patogen S. flexneri i närvaro eller frånvaro av exogen stress. Med hjälp av fri bildhanteringsprogramvara möjliggör protokollerna den exakta kvalitativa och kvantitativa analysen av SG-bildning för att identifiera och statistiskt adressera skillnader i givna fenotyper.
Det finns flera kritiska steg inom protokollet för infektionen, SG-induktion och bildningsdelar. För infektionen är det viktigt att bakterieinteraktionen med värdceller, såsom invasion som skisserat protokoll här, synkroniseras så mycket som möjligt. Detta är särskilt viktigt när man undersöker effekterna av bakteriell utmaning tidigt under infektionsprocessen. Vi visade tidigare att vissa fenotyper, såsom eIF3b-lokalisering efter S. flexneri- infektion, störs tidigt under vildtypS. flexneri- utmaning medan andra fenotyper, såsom aggregering av G3BP1-innehållande SG, påverkas mer vid senare tidpunkter 3 . Således, för att precis beskriva den tidsmässiga effekten av bakteriell utmaning är synkronisering av infektion lämplig. I synnerhet för att analysera SG-bildning bör cellerna ligga i exponentiell tillväxtfas och sålunda är celldensitet vid tiden för stresstillägg också en viktig parameter. Det begränsar också SG-analys till icke-konfluenta cellinfektionsmodeller. En annan kritisk aspekt är sambehandlingen av kontroll- och experimentprover under både bearbetningen av proven för bildbehandling och under bildupptagning. För immunofluorescerande bearbetning bör alla prov färgas med samma antikroppsutspädningar under samma tid och under samma förhållanden ( dvs. RT Vs 4 ° C) samtidigt som de också behandlar varje täckglas på samma sätt under tvättstegen och Montering oF täckglasen. Detta kommer att säkerställa jämförbara immunofluorescerande färgämnen som kan analyseras både kvalitativt och kvantitativt. Skillnader i monteringsmedium kan ha signifikanta effekter på blekning av proverna under bildförvärv och bör därför hållas konstant. Likaså bör bildförvärv för alla prover som ska jämföras i analys utföras inom ett sittande och med samma inställningar för att minimera skillnader som uppstår på grund av laserstyrka eller provuppställning.
Vid användning av exogena belastningar är det viktigt att lagra reagenset ordentligt och att ofta skapa nya arbetslager. Förlängda perioder (> 4 månader för clotrimazol, till exempel) leder till minskad styrka av läkemedlet och kommer att påverka SG-bildningen. Reagenser bör tillsättas till odlingsmedium omedelbart före tillsats till cellerna; Om en minskning av SG-bildningen i kontrollceller observeras eller aggregeringen av SG visar sig avvikande, bör reagens testas för deras ACTivitet och nya lager bör göras.
En begränsning är att SG-identifieringen med hjälp av spotdetektor blir mindre tillförlitlig när för mycket bakgrundsfluorescens föreligger. Även om detta inte är ett problem för många SG-markörer är vissa, såsom eIF3b, vilken är en klar cytosolisk markör under både SG-inducerande och icke-inducerande tillstånd, svårare att analysera såsom visas i figur 3 . Dessutom måste skalor och känsligheter vara empiriskt bestämda för varje SG-markör. En annan begränsning är att analysen via bildanalysprogrammet är bäst med 2D-bilder, och fungerar därför bra på optiska skivor eller kollapsade staplar, vilket emellertid resulterar i förlust av 3D-information. Analysen på z-prognoser tenderar därför att överskatta storleken på SG och underskatta antalet SG. 3D-analys av SG kan utföras med Imaris för att ge en ännu mer exakt geografisk karakterisering, om det anses nödvändigt för en viss fenotyp. SG-karakterisering kan utföras snabbt och på ett standardiserat sätt med hjälp av den automatiska platsdetektorn för bildanalysprogrammet. I motsats därtill, manuell metod för att identifiera och avgränsa SG som tidigare utförts 4 , lämna analysen öppen för mer förspänning och är betydligt mer tidskrävande. SG-analys med användning av punktdetektor kan också skräddarsys för att inkludera eller utesluta små SG-aggregat genom att välja olika känslighets- och storleksgränser, vilket möjliggör flexibilitet vid utvärdering av olika aspekter av SG-bildning. SG-analys kan också utföras på ett helt automatiserat sätt med hjälp av ett etablerat automatiserat arbetsflöde 3 . Inom detta arbetsflöde identifieras cellens centrum genom en DAPI-fläck och programmet låter sedan en formbar sfär växa utåt för att avgränsa cellgränserna baserade på antingen en cytoplasmisk fläck (såsom eIF3b) eller aktin. Samtidigt använder man en halvautomatiserad analys avManuell avgränsning av enskilda celler för analys kan vara fördelaktig när celler växer i kluster och cellgränser är svåra för det automatiserade programmet att tydligt avgränsa. Under dessa omständigheter kan man definiera cellgränser manuellt eliminera falska positiva eller negativa värden.
Protokollet kan anpassas till andra SG-inducerande betingelser och till andra patogener, inklusive virus, bakterier, jäst och protozoaner. Av särskilt intresse kan vara andra cytosoliska patogener, såsom Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei och Listeria spp. 14 För varje smittämne, och eventuellt även olika cellinjer, måste infektionsprotokollet anpassas och provtiderna för exogena spänningar bestäms empiriskt. Dessutom kan SG-karaktärisering med hjälp av bildanalysprogramvara också utvidgas till levande cellbilder i framtiden. Realtids SG-analys skulle behövasItera uttrycket av en eller flera fluorescensmärkta SG-markörer i värdcellerna, men skulle därigenom tillåta frågor angående den tidsmässiga och speciella dynamiken hos SG-bildningen att behandlas under olika experimentella förhållanden. Fluorescensmärkta bakterier skulle då behövas för att komplettera realtids-SG-analysen i infekterade och oinfekterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
PS är mottagare av Bill och Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV stöddes av ett schweiziskt National Science Foundation Early Postdoc Mobility fellesskap och ett Roux-Cantarini postdoktoralt gemenskap. PJS stöds av ett HHMI-bidrag och ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1:300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1:500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1:500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1:500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140 | 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application - cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Paraformaldehyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application - cell culture |
| 12 mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application - image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application - data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application - data analysis |
References
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
