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Chemistry

Espectroscopia de RMN como uma ferramenta robusta para a avaliação rápida do perfil lipídico do óleo de peixes suplementa

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55547
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Food Science and Technology, The Ohio State University, 2Foods for Health Discovery Theme, The Ohio State University

Summary

Aqui, de alta resolução de 1 H e 13 C de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi usada como uma ferramenta rápido e fiável para a análise quantitativa e qualitativa dos suplementos de óleo de peixe encapsulado.

Abstract

A dieta ocidental é deficiente em n-3 ácidos gordos, por conseguinte, o consumo de suplementos de óleo de peixe é recomendado para aumentar a ingestão desses nutrientes essenciais. O objectivo deste trabalho é mostrar a análise qualitativa e quantitativa de suplementos de óleo de peixe encapsulados usando de alta resolução de 1 H e 13 C RMN utilizando espectroscopia de RMN dois instrumentos diferentes; um a 500 MHz e num instrumento de 850 MHz. Ambos protão (1 H) e de carbono (13 C) os espectros de RMN pode ser usado para a determinação quantitativa dos principais constituintes de suplementos de óleo de peixe. Quantificação dos lidos nos suplementos de óleo de peixe é conseguida através da integração dos sinais de RMN apropriados nos espectros de 1D relevante. Os resultados obtidos por 1 H e 13 C RMN estão em boa concordância com o outro, não obstante a diferença de resolução e sensibilidade entre os dois núcleos e os dois instrumentos. 1 H RMN ofertasa análise mais rápida em comparação com 13 C RMN, como o espectro pode ser gravado em menos de 1 min, em contraste com 13 C Análise de RMN, que tem a duração de 10 minutos a uma hora. O espectro de RMN de 13 C, no entanto, é muito mais informativa. Ele pode fornecer dados quantitativos para um maior número de ácidos gordos individuais e pode ser utilizado para determinar a distribuição posicionai de ácidos gordos no esqueleto de glicerol. Ambos os núcleos podem proporcionar informação quantitativa em apenas uma experiência sem a necessidade de purificação ou de separação de passos. A força do campo magnético afecta principalmente a espectros de RMN de 1 H, devido à sua baixa resolução em relação à RMN de 13 C, no entanto, os instrumentos de RMN ainda mais baixo custo pode ser eficazmente aplicado como um método padrão pelos laboratórios da indústria alimentar e de controlo de qualidade.

Introduction

O consumo de n -3 ácidos gordos na dieta tem provado ser benéfico contra várias condições, tais como doenças do coração, 1, 2, 3, 4 doenças inflamatórias e diabetes 5. A dieta ocidental é considerada pobre em n -3 ácidos gordos e, portanto, o consumo de suplementos de óleo de peixe é recomendado para melhorar o n -6 / N -3 equilíbrio na alimentação 1 do consumidor. Apesar do recente aumento nos peixes consumo de suplemento de óleo, questões permanecem sobre a segurança, autenticidade e qualidade de alguns destes produtos. A análise de composição rápida e precisa de suplementos de óleo de peixe é essencial para avaliar adequadamente a qualidade destes produtos comerciais e garantir a segurança do consumidor.

As metodologias mais comuns para a avaliação do suplemento de óleo de peixes são a cromatografia gasosa (GC) e espectroscopia de infravermelho (IR). Enquanto estes métodos são altamente sensíveis, eles sofrem de várias desvantagens 6. A análise por CG é demorado (4-8 h), porque a separação e derivatização de compostos individuais é necessária 7 e oxidação lipídica pode ocorrer durante a análise 8, 9. Enquanto a espectroscopia de IR pode ser quantitativa, é requerido um modelo de previsão a ser construído usando regressão de mínimos quadrados parciais (PLSR), apesar de haver excepções em que bandas de IR podem ser atribuídas a um único composto 10. PLSR requer a análise de um grande número de amostras, o que aumenta o tempo de análise 11. Por esta razão, existe um interesse crescente no desenvolvimento de novas metodologias analíticas que permitem a análise rápida e precisa de um grande número de amostras de óleo de peixe. Organizações, tais como o Office de suplementos dietéticos (ODS) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e da Food and Drug Administration (FDA) têm colaborado com a Associação de Químicos Analíticos Oficiais (AOAC) para desenvolver estes novos métodos 12, 13.

Um dos métodos analíticos mais promissores para o rastreio e avaliação de matrizes multi-componentes, tais como suplementos dietéticos, é de Ressonância Magnética (RMN) nuclear 14, 15. espectroscopia de RMN tem várias vantagens: é uma técnica não-destrutiva e quantitativa, isto requer o mínimo de preparação da amostra, e caracteriza-se por uma excelente precisão e reprodutibilidade. Além disso, a espectroscopia de RMN é uma metodologia ambientalmente amigável porque utiliza apenas pequenas quantidades de solventes. O principal inconveniente da espectroscopia de RMN é a sua sensibilidade relativamente baixa em comparação com outros analytimétodos de cal, no entanto, avanços tecnológicos recentes em instrumentação, tais como campos magnéticos mais fortes, sondas criogénicos de vários diâmetros, processamento de dados avançados, e sequências de pulso versáteis e técnicas têm aumentado a sensibilidade até à gama de nM. Enquanto NMR instrumentação é de alto custo, a longa-vida de espectrómetros de RMN e as muitas aplicações da RMN reduzir o custo da análise a longo prazo. Este protocolo de vídeo detalhada destina-se a ajudar os novos profissionais no campo evitar perigos associados com um H e 13 C RMN análise espectroscópica de suplementos de óleo de peixe.

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Protocol

1. Preparação da Amostra RMN

Nota: Cuidado, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Clorofórmio deuterado (CDCl3) utilizados na preparação de amostras é tóxico. Utilize todas as práticas de segurança adequadas ao executar a preparação da amostra, incluindo o uso de um exaustor e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, fechou-toe sapatos).

  1. Preparação de 1 H e 13 C As amostras
    1. Extrair 120 ul (~ 110 mg) de óleo de peixe a partir de uma cápsula dietético usando uma seringa e colocá-lo em um frasco de vidro de 4 ml. Registar o peso do óleo de peixe.
    2. dissolução das amostras
      1. Dissolve-se cerca de 120 uL de óleo de peixe em 500 mL de CDCI3 contendo 0,01% de tetrametilsilano (TMS) que é usado como uma referência para o 1 H e 13 C deslocamentos químicos.
        NOTA: TMS é o usod apenas para a calibração de desvio químico (ver números de passos e 2.2.1.2.7 2.2.2.2.7), não para quantificação (ver números passo 2.2.1.3 e 2.2.2.3) fins.
      2. Prepara-se uma 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (BHT), solução estoque, se quantificação expressa em mg / g é desejado, por dissolução de cerca de 220 mg de BHT e 15 mg de crómio (III), acetilacetonato (Cr ( acac) 3) em 20 mL de CDCI3 contendo 0,01% de TMS. Use 500 uL da solução stock a dissolver-se 100 mg (± 10 mg) de óleo de peixe.
    3. Depois de dissolver o óleo (este leva alguns segundos), transferir toda a solução directamente para um tubo de RMN de alta qualidade de 5 mm e anexar uma tampa. Analisar as amostras dentro de 24 h após a preparação das amostras.

preparação 2. RMN Instrumento

Nota: Cuidado, cuidado para que a presença de fortes campos magnéticos produzidos pelos instrumentos de RMN pode afectar a dispositivos médicos e implformigas, como marca-passos e próteses cirúrgicas, bem como itens eletrônicos, como cartões de crédito, relógios, etc. é necessária precaução adicional quando a análise é realizada usando não-blindagem ímãs. Dois instrumentos de RMN foram utilizados para a aquisição de 1 H e 13 C RMN espectros; um espectrómetro operando a 850,23 MHz e 213,81 MHz para 1 H e 13 núcleos C, respectivamente, equipadas com um inversa de ressonância tripla arrefecida em hélio (TCI) sonda de 5 mm e um espectrómetro operando a 500,20 MHz e 125,77 MHz para o 1 H e 13 C núcleos, respectivamente, equipados com uma banda larga observada (BBO) de azoto arrefeceu-se-sonda de 5 mm. Todas as experiências foram realizadas a 25 ± 0,1 ºC e os espectros foram processados ​​por um pacote de dados de RMN de aquisição e análise de software de processamento padrão (ver Lista de Materiais).

  1. Preparação para a aquisição do espectros de RMN
    Nota: 1 H e 13 C RMN espectrospode ser adquirido, consequentemente, sem retirar a amostra do instrumento.
    1. Inserir o tubo de RMN em uma turbina rotativa (ver Lista de Materiais).
    2. Colocar o elemento rotativo e do tubo na parte superior de um medidor de profundidade graduada e suavemente empurrar o topo do tubo até a sua parte inferior toca no fundo do calibre.
    3. Colocar a amostra de RMN em um local aberto do SampleCase. Nota o número do slot a amostra é colocada em.
    4. Para carregar a amostra no RMN, volte para o computador de controle e digite 'sx #', onde # é o slot no SampleCase segurando sua amostra.
    5. Aguarde até que o sinal de deutério de CDCl3 para aparecer na tela da janela de bloqueio. Se ele não aparecer automaticamente, digite "lockdisp". Assim que o sinal de deutério é visível, tipo "bloquear" na linha de comando e seleccionar "CDCl3" da lista do solvente, a fim de bloquear a amostra usando a ressonância deutério CDCl3.
      NOTA: O deutério signal não pode aparecer se o utilizador anterior utilizado um solvente diferente. O usuário deve esperar para o indicador de que a amostra é baixo, em seguida, bloquear.
    6. Tipo "bsmsdisp" na linha de comando para garantir a fiação não está ativo. Se o botão "SPIN" é verde, clique nele para desativar spinning.
    7. Digite o "novo" comando para criar um novo conjunto de dados. Digite um nome para o conjunto de dados na guia "NAME" eo número de experiência no separador "EXPNO". Usar número "1" no separador "PROCNO". Na aba "Experiment", clique em "Select" e escolha a opção "PROTON" arquivo de parâmetro. Escreva o título do experimento na guia "TITLE". Clique em "OK".
    8. Tipo "getprosol" na linha de comando para obter os parâmetros padrão para a sonda de RMN corrente e solvente.
    9. Repetir o passo 2.1.7 em 13 C, da selecção da sequência de impulsos "C13IG" no separador "Experiment" para a 1D 13 C inversa gated dissociado experimento.
    10. Tipo "getprosol" na linha de comando para obter os parâmetros padrão para a sonda de RMN corrente e solvente.
    11. Digite o "Atma" comando para executar a sintonização automática e correspondência da sonda para ambos os núcleos de carbono e prótons.
    12. Executar gradiente unidimensional calços para conseguir um campo magnético altamente homogénea, e forma de linha, portanto óptimo para os sinais de RMN.
      1. Use o procedimento automático padrão para 1D calços, simplesmente executando sequencialmente os comandos "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss" e "qu topshim relatório" na linha de comando.
  2. otimização de parâmetros
    1. calibração 90 ° pulso
      1. Criar um novo conjunto de dados para um H (ver passos 2.1.7 e 2.1.8).
      2. Digite o "paropt" comando na linha de comando para iniciar o programa de automação para calibrar o pul 90 °se. Escolha duração do pulso, p1, como o parâmetro a ser modificado.
      3. Comece com "2" mS como o valor inicial de p1, digite "2" uS incrementos e realizar experimentos "16".
      4. Criar um novo conjunto de dados de 13 C (ver o passo 2.1.9) e repetir o processo para 13 núcleos C (ver passos 2.2.1.2 e 2.2.1.3).
    2. T uma medição medido pelo método nula 16 para 1H
      NOTA: O método nulo utiliza a sequência de impulsos de recuperação de inversão, que consiste de uma sequência de pulso de 180 ° por um atraso (tau), para permitir o relaxamento ao longo do eixo z e um final de 90 ° pulso que cria a magnetização transversal observável.
      1. Criar um novo conjunto de dados para um H (ver passos 2.1.7 e 2.1.8).
      2. Tipo "t1ir1d pulprog" para alterar a sequcia de pulso para a expericia de inversão-recuperação.
      3. Digite os seguintes comandos no commanA linha d para configurar a largura espectral em ppm, o centro do transmissor RF, o número de varrimentos o número de varrimentos do manequim e o número de pontos de dados "sw 8", "o1p 3,8", "ns 2" ", ds 2" e "64K td".
      4. "P1 (valor)" Tipo e entram os valores de duração de pulso de 90 °, tal como determinado pela calibragem do pulso (ver o passo 2.2.1) e tipo "p2 (valor)" para o pulso de 180 ° (o valor de duração para os 180 ° pulso é a duração de 90 ° pulso multiplicado por dois).
      5. Definir o atraso de reciclagem para um valor muito grande, como 10 s, digitando "d1 10".
      6. Definir tau a uma curta valor, como 10 ms, digitando "10ms D7" na linha de comando.
      7. Defina o ganho do receptor (RG) para um valor apropriado utilizando os "RGA" comando para cálculo automático de RG.
      8. Execute um espectro digitando o comando "zg".
      9. Executar Fourier-transformação, escrevendo "PQE"na linha de comando.
      10. Realizar correção de fase automática, digitando o comando "apk" na linha de comando. Se forem necessários ajustes de fase adicionais para melhorar ainda mais o espectro, clique na guia "Processos" e clique no ícone "Ajuste Fase" para entrar no modo de correção de fase.
        1. Utilizar a de ordem zero (0) e ícones de primeira ordem de correcção de fase (1), arrastando o rato até que todos os sinais estão no modo de absorção negativo. Aplicar e salvar os valores de correção de fase, clicando no botão "Return e Salvar" para sair do modo de correção de fase.
      11. Aumentar a tau até que todos os picos são positivos ou anulado por repetição dos passos 2.2.2.6-2.2.2.9. Para determinar o valor de t 1, basta dividir o valor de Tau em que o pico é anulado com ln2.
    3. T uma medição medido pelo método nula 16 para 13 C
      1. Criar um novo conjunto de dados de 13 C (veja o passo 2.1.9)
      2. Tipo "pulprog t1irpg" para alterar a sequcia de pulso para a expericia de inversão-recuperação para núcleos de carbono.
      3. Digitar os seguintes comandos na linha de comando para configurar a largura espectral em ppm, o centro do transmissor RF, o número de varrimentos, o número de varrimentos do manequim e o número de pontos de dados: "sw 200", "o1p 98" , "ns 8", "ds 2" e "64K td".
      4. "P1 (valor)" Tipo e entram os valores de duração de pulso de 90 °, tal como determinado pela calibragem do pulso (ver o passo 2.2.1) e "P2 (valor) de" tipo para o pulso de 180 ° (o valor de duração é os 90 ° duração do pulso multiplicado por dois).
      5. Definir o atraso de reciclagem para um valor muito grande, como 100 s, digitando "d1 100".
      6. Set tau a uma curta valor, como 100 ms, digitando "100ms D7" na linha de comando.
      7. Defina o receivganho er (RG) para um valor apropriado utilizando os "RGA" comando para cálculo automático de RG.
      8. Execute um espectro digitando o comando "zg".
      9. Executar Fourier-transformação, digitando "EFP" na linha de comando.
      10. Realizar correção de fase automática, digitando o comando "apk" na linha de comando. Se forem necessários ajustes de fase adicionais para melhorar ainda mais o espectro, clique no ícone "Ajuste Phase" e os ícones de correcção de fase para ordem zero (0) e fase (1) correção de primeira ordem.
        1. Enquanto clica nos ícones de correção de ordem zero e de fase de primeira ordem, arraste o mouse até que todos os sinais estão em modo de absorção negativa. Aplicar e salvar os valores de correção de fase, clicando no botão "Return e Salvar" para sair do modo de correção de fase.
      11. Aumentar a tau até que todos os picos são positivos ou anulado por repetição dos passos 2.2.3.6-2.2.3.9. Para determinaro valor de t 1, basta dividir o valor de Tau em que o pico é anulado com ln2.
  3. Unidimensional (1D) os espectros de RMN
    1. 1 H-RMN Os espectros
      1. Aquisição dos dados de RMN
        1. Ir para o conjunto de dados de 1 H criado no passo 2.1.7 e utilizar o "pulse-adquirem" sequência de impulsos padrão, "ZG", digitando "pulprog zg" na linha de comando.
        2. Digitar os seguintes comandos na linha de comando para configurar a largura espectral em ppm, o centro do transmissor RF, o número de varrimentos, o número de varrimentos do manequim, o número de pontos de dados e a duração do pulso para um ângulo de 90 ° pulso : "sw 8", "o1p 3,8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" e "P1 (conforme determinado pela calibragem pulso)" (ver o passo 2.2.1).
          NOTA: pontos de dados 32K pode ser usado para o instrumento 500 MHz.
        3. Definir um atraso de relaxamento de 7 s para o instrumento de 500 MHz ou 9 s para o instrumento de 850 MHz, escrevendo "7s D1" ou "9s d1", respectivamente, na linha de comando.
        4. Defina o ganho do receptor (RG) para um valor apropriado utilizando os "RGA" comando para cálculo automático de RG.
        5. Digite "baseopt digmod" para adquirir um espectro com uma melhor linha de base.
        6. Comece a aquisição, digitando o comando "zg" pulso adquirir na linha de comando.
      2. Processamento dos dados de RMN
        1. Digite "64K si" na linha de comando para aplicar zero enchimento e definir o tamanho do espectro real para 64K.
        2. Definir a linha de alargamento parâmetro para 0,3 Hz, escrevendo "lb 0,3" na linha de comando para aplicar uma função de ponderação (decaimento exponencial) com uma linha de factor de ampliação de 0,3 Hz antes da transformação de Fourier.
        3. Executar Fourier-transformação, digitando "EFP" no comandolinha.
        4. Realizar correção de fase automática, digitando o comando "apk" na linha de comando. Se forem necessários ajustes de fase adicionais para melhorar ainda mais o espectro, clique na guia "Processos" e clique no ícone "Ajuste Phase" e os ícones de correcção de fase para ordem zero (0) e correção de fase de primeira ordem (1) .
          1. Enquanto clica nos ícones de correção de ordem zero e de fase de primeira ordem, arraste o mouse até que todos os sinais estão em modo de absorção positiva. Aplicar e salvar os valores de correção de fase, clicando no botão "Return e Salvar" para sair do modo de correção de fase.
        5. Aplicar uma função polinomial de quarta ordem para correção de linha de base na integração, digitando o comando "abs n".
          NOTA: Este garante uma linha de base plana espectral com uma intensidade mínima.
        6. Deslocamentos químicos em ppm relatório de TMS (δ = 0). Clique na calibração ( "Calib. Axé "ícone), e coloque o cursor com a linha vermelha no topo do sinal de TMS RMN (pico mais próximo a 0). Clique esquerdo e digite '0'.
      3. Análise dos dados de RMN
        1. Integrar a região espectral de δ 1,1 a ô 0,6, bem como dos picos a δ 4,98, δ 5,05 e δ 5,81 utilizando o ícone "integrar" (sob a guia "Processo") e o destaque ícone ( "definir novos Region"). Esquerda clique e arraste pelas integrais.
          NOTA: Se não há necessidade de se concentrar em uma região, clique no ícone de destaque para desativar e clique esquerdo e arraste o mouse para fazer zoom sobre a região. Para ajustar a intensidade do limiar, use o botão do meio do mouse, se necessário. Clique no ícone destaque novamente para fazer a função de integração activa, em seguida, passar para o próximo pico.
          1. Normalizar a soma das integrais acima de 100 com o botão direito sobre o valor integral que aparecems sob o sinal e selecione "Normalizar soma de integrais". Introduza o valor "100" na caixa e clique no botão "Retorno e Save" para sair do modo de integração.
        2. Quando se utiliza o BHT como um padrão interno, integrar o pico a δ 6,98 e definir a igual parte integrante das milimoles de BHT por 0,5 mL da solução de estoque.
        3. Integrar os picos de interesse (ver passo 2.3.1.3.1) que se estende de 10 Hz a partir de cada lado do pico, quando possível.
        4. Avance para executar 13 C-RMN aquisição e processamento de espectro de uma forma semelhante.
    2. 13 C-RMN Os espectros
      1. Aquisição dos dados de RMN
        1. Ir para o conjunto de dados de 13 C e usar o inverso fechado sequência de impulsos dissociado, "zgig" digitando "pulprog zgig" na linha de comando.
          NOTA: Para executar um experimento de carbono com o decou banda larga padrãosequência de impulsos PLED, tipo "pulprog zgpg" na linha de comando.
        2. Digitar os seguintes comandos na linha de comando para configurar a largura espectral em ppm, o centro do transmissor RF, o número de varrimentos, o número de varrimentos do manequim, o número de pontos de dados e a duração do pulso para um ângulo de 90 ° pulso : "sw 200", "o1p 95", "16 ns" "ds 2", "td 64K" e "P1 (conforme determinado pela calibragem pulso)" (ver passo 2.2.1.4).
        3. Definir um atraso de relaxamento de 35 s para o instrumento de 500 MHz ou 45 s para o instrumento de 850 MHz, escrevendo "35s D1" ou "45s d1", respectivamente, na linha de comando. Quando se utiliza o BHT, o atraso de relaxamento deve ser de 50 s no instrumento de 500 MHz e 60 s no instrumento de 850 MHz.
        4. Defina o ganho do receptor (RG) para um valor apropriado utilizando os "RGA" comando para cálculo automático de RG.
        5. Digite "baseopt digmod" na linha de comando para adquirir um espectro wom base melhorada.
        6. Comece a aquisição, digitando o comando "zg" pulso adquirir na linha de comando.
      2. Processamento dos dados de RMN
        1. Digite "64K si" na linha de comando para aplicar zero enchimento e definir o tamanho do espectro real para 64K.
        2. Definir a linha de alargamento parâmetro para 1,0 Hz, escrevendo "lb 1,0" na linha de comando para aplicar uma função de ponderação (decaimento exponencial) com uma linha de factor de ampliação de 1,0 Hz antes da transformação de Fourier.
        3. Executar Fourier-transformação, digitando "EFP" na linha de comando.
        4. Realizar correção de fase automática, digitando o comando "apk" na linha de comando. Se forem necessários ajustes de fase adicionais para melhorar ainda mais o espectro, clique na guia "Processos" e clique no ícone "Ajuste Phase" e os ícones de correcção de fase para ordem zero (0) e (1) correção de fase de primeira ordem .
            NOTA: Para os espectros de carbono registrados na freqüência de Larmor de 214 MHz (o instrumento de 850 MHz) a correção dos erros dependentes de frequência (de primeira ordem) pode ser desafiador e demorado para os usuários menos experientes por causa dos grandes efeitos off-ressonância do 90 ° pulso.
        5. Aplicar uma função polinomial de quarta ordem para correção de linha de base na integração, digitando o comando "abs n" na linha de comando.
        6. Deslocamentos químicos em ppm relatório de TMS (δ = 0). Clique no ícone de calibração ( "Calib. Axis"), e coloque o cursor com a linha vermelha no topo do sinal de NMR a ser referenciado. clique esquerdo e digite "0".
      3. Análise dos dados de RMN
        1. Integrar a região espectral de δ 175 a ô 171 usando o ícone "integrar" (na guia "Processo") eo destaque ícone ( "Definir nova Região"). Esquerda clique e arraste pelas integrais.
          NOTA: Se não há necessidade de se concentrar em uma região, clique no ícone de destaque para desativar e clique esquerdo e arraste o mouse para fazer zoom sobre a região. Clique no ícone destaque novamente para fazer a função de integração activa, em seguida, passar para o próximo pico.
          1. Defina a integral a 100, fazendo um clique direito sobre o valor integral que aparece sob o sinal e selecione "Calibrar Corrente Integral". Introduza o valor "100" na caixa e clique no "Return e salvar" para sair do modo de integração.
        2. Quando se utiliza o BHT como um padrão interno, integrar o pico a 151,45 δ e definir a igual parte integranteas milimoles de BHT por 0,5 mL da solução de estoque.
        3. Integrar os picos de interesse que se estende de 5 Hz a partir de cada lado do pico (ver passo 2.3.2.3.1).

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Representative Results

1 H e 13 C espectros de RMN foram recolhidos para suplementos de óleo de peixe, disponíveis comercialmente, utilizando dois instrumentos de RMN; um 850 MHz e um espectrómetro de 500 MHz. Estes espectros podem ser usadas para a determinação quantitativa de componentes de óleo de peixe, tais como o ácido docosahexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA), bem como outros compostos, tais como n -1 cadeias acilo e índice importante nutricionalmente, tais como o n -6 / N -3 proporção. A quantificação pode ser efectuada mesmo sem o uso de um padrão interno, no entanto, os resultados quantitativos devem ser expressos como percentagens molares relativas. Quando os dados necessitam de ser expresso em valores absolutos (mg / g), um padrão interno é necessária. Os resultados obtidos por RMN são altamente reprodutível com desvios-padrão relativo (RSD) que variam de 0,3% a 2% por análise de RMN de 13 C e de 0,5% a 2,5% por análise de RMN de 1H, dependendo t ele lipídico. O RSD ligeiramente mais elevado para uma 'H RMN é frequentemente observada, porque os espectros de protões tendem a ser lotados, o que afecta a precisão da análise, especialmente para ressonâncias que têm um sinal inferior ao ruído (S / N). Uma muito boa concordância foi encontrada entre a 850 MHz e o instrumento de 500 MHz com RSD variando de 1% a 4%. Relativamente elevadas RSD (até 8%) foram observadas quando se comparam os resultados obtidos por 1 H e 13 C, especialmente para os compostos que aparecem em concentrações mais baixas, tais como n -1 cadeias acilo. espectroscopia de RMN foi anteriormente validada como uma ferramenta para a análise de lípidos, incluindo a determinação de alguns componentes de óleo de peixe. Os resultados mostraram que ele está em bom acordo com os métodos tradicionais, tais como a CG 17, 18.

Análise de RMN de 1H

"xfig"> A Figura 1 compara os espectros de 1 H RMN adquirido em (A) um 850 MHz e (B) um instrumento de 500 MHz. O espectro de 850 MHz é caracterizado por uma maior resolução, no entanto, os componentes principais do óleo de peixe, incluindo o DHA, EPA, e n -6 / N -3 relação também pode ser determinado a partir do espectro de 500 MHz. Os sinais de 1 H-RMN de ácidos gordos de óleo de peixe que podem ser usados para fins de quantificação estão apresentados na Tabela 1, enquanto que a atribuição de RMN completo do espectro de 1 H RMN de óleo de peixe pode ser encontrado em outros lugares 19.

1 H RMN deu dados fiáveis para a quantificação da quantidade total de n-3, n -6, DHA, ácidos gordos trans, n -1 cadeias acilo, e ácidos gordos saturados (AGS). Para a análise de RMN de 1H, a utilização de relações apropriadas é necessário porque a maior parte da signals pertencem a grupos de protões que são comuns a diferentes ácidos gordos e lípidos. Por esse motivo, na maioria dos casos, a concentração de ácidos gordos no óleo de peixe pode ser determinado apenas por meio de combinação de vários sinais de RMN 1 H, incorporada nas relações apropriadas. Além disso, estas equações conter coeficientes aritméticas que normalizam o número diferente de protões associados com cada grupo. Quando um padrão interno é usada a seguinte equação deve ser considerado: C = I / I IS × n é / N × Um × MW / m (1), em que C é a concentração da substância a analisar em mg / g de óleo de peixe, I é o integral de ressonância que é atribuído unicamente ao lípido de interesse, eu IS é a área de um sinal de protão que pertence exclusivamente para o padrão interno, N é o número de protões do grupo funcional, que é analisado,N é o número de protões do padrão interno que são utilizados para a análise, a é a milimoles de padrão interno, MW é o peso molecular do ácido gordo (expressa em ésteres de metilo), e m é a quantidade de óleo de peixe expressa em g.

Exemplo 1, DHA: A proporção de DHA é determinada pela equação C DHA = ¾ eu DHA / S, onde o DHA é o integral do sinal em δ 2,39 que pertence aos H? E H protões p de DHA, e S é a soma dos integrais dos protões de metilo de SFA, n -6, n-9, n-3, ácidos gordos trans além dos integrais dos picos de n -1 cadeias acilo em δ 4,98, ô 5,05 e 5,81 δ. O I DHA integrante é normalized multiplicando por 3/4 porque corresponde a quatro protões, enquanto o S integrante corresponde a três protões. 1 H RMN não é capaz de dar informação sobre a distribuição posicionai de ácidos gordos sobre a espinha dorsal de glicerol e, assim, só pode ser usado para a quantificação da quantidade total de ácidos gordos. A análise de RMN de 1H de um suplemento de óleo de peixe encapsulado e mostrou que ele é composto por 10,5% de DHA. A concentração de DHA na mesma amostra utilizando BHT foi encontrado para ser 105,23 mg / g. Estes valores são muito próximos dos valores obtidos com 13 C RMN (ver exemplo 2 para análise 13 C).

Exemplo 2, N-1 acilo cadeias: A concentração de n -1 cadeias acilo é dada pela relação C n-1 = 3 I n-1 / S, onde n-1 é o integral do sinal em δ 5,818. estesinal corresponde a um protão e, assim, necessita de ser normalizado pela multiplicação por três. Quando se utiliza o BHT, n -1 cadeias de acilo são determinados pela equação C n-1 = 2 I n-1 / I BHT. Os resultados não podem ser expressos em mg / g, pois o MW de n -1 cadeias acilo é desconhecido.

Exemplo 3, n -6 / N -3 relação: Este índice importante pode ser calculada a partir da razão das intensidades normalizadas da ressonância a δ 2,77, o que corresponde aos protões de bis-alílico de n -6 cadeias acilo (dois protões) sobre o tripleto a 0,97 δ que pertence aos ácidos gordos n-3 e corresponde a três protões. A relação é C n-6 / n-3 C = 3/2 I / I B, onde A e B que são os integrais dos sinaisem δ 2,77 e δ 0,97, respectivamente. n -6 ácidos gordos são determinadas a partir da relação C-6 n = 3 / 2I n-6 / S, onde n-6 é integral dos protões bis-alílicos em δ 2,77.

Exemplo 4, os ácidos gordos trans: ácidos gordos trans podem ser calculados a partir da equação C = I trans trans / S, onde I trans é o integral do sinal em δ 0,91. A presente amostra continha 3,07% de ácidos gordos trans, tal como determinado por RMN de 1H usando o instrumento de 850 MHz. A mesma amostra analisada num instrumento de 500 MHz revelou conter 3,03% de ácidos gordos trans.

Exemplo 5, ácidos gordos saturados (AGS): A concentração de SFA pode ser calculated a partir da equação C SFA = S - C N-3 - C n-6 - C N-9 - C N-1 - C trans. n -9 ácidos gordos (principalmente ácido oleico) pode ser quantificada de acordo com a equação C = N-9 (3/4 Q - 3/2 I n-6) / S, em que Q é o integral dos protões alílicos de n -6 e n -9 em δ 2,01. A quantidade de SFA em uma amostra de óleo de peixe comercialmente disponível verificou-se ser de 36,1%. A mesma amostra analisada com 13 C-NMR verificou-se conter 33,8% de SFA. SFA representar um grupo de vários FA (por exemplo, esteárico e palmítico) com PM diferente e, assim, a sua concentração se o óleo de peixe não pode ser expressa em mg / g.

Exemplo 6, esteróis totais: A quantidade de esteróis totais (livre e esterificado) pode ser determinada pelo signal dos protões metilo no carbono 18, o qual aparece em δ 0,68, utilizando a equação C = eu ste / S. A razão molar do total dos esteróis em uma amostra de óleo de peixe comercialmente disponível verificou-se ser 0,32%. BHT, também pode ser utilizado para a determinação da concentração absoluta de esteróis. Os principais esteróis no óleo de peixe são o colesterol e vitamina D (ou o seu precursor, 7-desidrocolesterol) e são muitas vezes adicionados nos suplementos. Estes compostos têm um peso molecular muito semelhante. Portanto, os resultados podem ser expressos em mg / g, e são calculados de acordo com a equação C = 2/3 I STE / I é um × STE MW / m, onde STE MW é o peso molecular (386) de colesterol, o que constitui o maioria da fracção esterólico no óleo de peixe 20. A quantidade de esteróis na mesma amostra utilizando BHT foi de 3,8 mg / g de óleo de peixe. A determinação individual de colesterol (δ (δ 0,678) é viável num instrumento de 850 MHz, após a aplicação de uma função de janela para melhoramento de resolução.

Análise 13 C RMN

A Figura 2 ilustra o espectro de 13 C RMN adquirido em (A) um 850 MHz e (B) um instrumento de 500 MHz em área de carbono do carbonilo. Os dois espectros são muito semelhantes e pode fornecer a mesma quantidade de informação. O espectro de RMN de 13 C pode ser usada com sucesso para a análise de ácidos gordos adicionais, tais como ácidos eicosatetraenóicos (ETA) estearidónico (SDA) e, no entanto mais verificações são necessários para as amostras em que estes ácidos são em concentrações mais baixas. Os espectros de 13 C são caracterizados por alta resolução devido à grande largura espectral e a aplicação de desacoplamento de banda larga, queelimina o efeito de acoplamento escalar e produz camisolas interiores. Por esta razão, não é limitada sobreposição mesmo quando se utiliza um instrumento de 500 MHz.

O espectro de RMN de 13 C é muito mais informativo em comparação com o espectro de H RMN 1 e pode fornecer dados quantitativos mais abrangentes porque menos sobreposição sinal seja observado (Figuras 1 e 2). A região espectral mais útil do espectro de 13 C é a região de carbono do carbonilo, pois fornece informação quantitativa para um grande número de ácidos gordos, assim como para a sua distribuição posicionai sobre o esqueleto de glicerol 19, 21, 22. A área do grupo metilo a partir de 14,5 a δ ô 13.5 pode ser usado para a rápida determinação da quantidade total de n-3, n -6, -9 e n gordo saturadoácidos (SFA), bem como os ácidos gordos trans. No entanto, no espectrómetro de RMN de 500 MHz, existe uma sobreposição parcial do n e n -6 -9 ácidos gordos saturados (AGS). A aplicação de uma função de janela para o realce resolução pode resolver este problema, embora o instrumento de 850 MHz é ainda considerada uma opção mais confiável. A região olefínica do espectro de carbono pode ser usado para a quantidade total de n-3 e n -1 cadeias acilo, bem como para a determinação de ácidos gordos individuais, tais como o DHA, EPA, ido araquidico (AA), linolénico (Ln) n -3, e ácido oleico (OL) (ver Tabela 2). 13 C RMN pode também ser aplicado para a caracterização de óleo de peixe a partir de outras fontes, tais como suplementos ricas em ésteres de etilo (EE), utilizando os sinais de carbono em δ 14,31 (metilo) e δ 60,20 (metileno).

Para a análise de carbono, ácidos gordos podem ser determinada pela divisão do integrante dos alifáticos, olefínico, e sinais de carbonilo apropriado com o integral total de todas as cadeias de acilo, de acordo com a relação geral C = E / S (2), em que C é a concentração da substância a analisar, em moles (% ), I é o integral de ressonância que é atribuído unicamente ao lípido de interesse, e s é o integral total de sinal (s) que representa o teor total de lípidos da amostra. O S integrante total de cadeias de acilo pode ser determinado através da integração da região de 175 a δ ô 171 e é definida como 100.

A quantificação de ácidos gordos em mg / g de óleo de peixe é realizada utilizando um padr interno com base na seguinte relação: C = I / I IS × Um × MW / m (3), em que C é a concentração da substância a analisar em mg / gde óleo de peixe, que é o integral de ressonância que é atribuído unicamente ao lípido de interesse, i é a área de um sinal de carbono que pertence exclusivamente para o padrão interno, a é a milimoles de padrão interno, MW é o molecular em peso do composto de interesse (por ácidos gordos expressos em ésteres de metilo), e m é a quantidade de óleo de peixe em g. Os sinais de RMN de 13C de ácidos gordos de óleo de peixe que podem ser usados para fins de quantificação estão apresentados na Tabela 2, ao passo que a atribuição de RMN completo do espectro de RMN de 13 C podem ser encontrados em outro lugar 19.

Exemplo 1, EPA na posição sn -2: A quantidade (%) de EPA na posição sn-2 é calculada dividindo-se o integral do sinal em δ 172,56 por S. A quantidade de EPA na posição sn-2 numa commercially amostra disponível verificou-se ser 3,4%, utilizando o instrumento de 850 MHz. Usando o mesmo espectrómetro e BHT como um padrão interno, a quantidade de EPA na posição sn-2 expressa em mg / g de óleo de peixe é 29,73 mg / g. A mesma amostra analisada num instrumento de 500 MHz revelou conter 3,6% ou 31,39 mg / g de EPA na posição sn-2. Resultados similares podem ser obtidos quando se calcula as proporções moleculares relativas de EPA em sn-2 utilizando um espectro totalmente desacoplada. Isto é porque o carbono do carbonilo de EPA é afectada pela dissociação de protões para o mesmo grau insignificante como os outros carbonos de carbonilo, os quais são utilizados como referência. No entanto, os grandes desvios são observados quando se utiliza o BHT, porque o carbono de BHT a δ 151,45, que é usado para a quantificação, receber um reforço NOE diferente em comparação com os carbonos de carbonilo de ácidos gordos. Por essa razão, o espectro totalmente dissociados deve ser evitado ao utilizar padrões internos ou integrar carbons com diferentes multiplicidades.

Exemplo 2, a quantidade total de DHA: A quantidade total (%) de DHA é simplesmente calculada adicionando as quantidades de DHA em sn -1,3 e posição sn -2, conforme determinado pelos sinais de RMN em δ 172,48 e 172,08 δ, respectivamente. A mesma amostra analisada com 1 H-NMR (ver exemplo 1 de uma análise H) verificou-se conter 10,3% de DHA de acordo com a análise 13 C RMN. A quantidade de DHA também pode ser expressa em mg / g, utilizando um padrão interno e Equação 3. A quantidade total de DHA foi de 103,25 mg / g.

Exemplo 3, a quantidade total de SDA: A quantidade total (%) de SDA é determinada pela adição dos integrais dos sinais a δ 172,99 e 172,60 δ que pertencem aos carbonos de carbonilo de SDA na posição sn -1,3 esn-2, respectivamente, em seguida, dividindo a soma por S. A amostra analisada foi verificou-se conter 3,93% SDA ou 34,54 mg / g.

Exemplo 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) pode ser determinada dividindo o integral do sinal em δ 131,85 com o S integrante. A razão molar de n -3 Ln na amostra de óleo de peixe analisado foi de 0,7%. A concentração absoluta utilizando BHT foi calculada como 5,5 mg / g.

Exemplo 5, os ácidos gordos trans: A razão molar de ácidos gordos trans é determinada dividindo o integral do sinal em δ 13,80 com S. A análise da mesma amostra que foi analisada por RMN de 1H e verificou-se ser 3,07% de trans FA, foi também analisada com 13 C RMN e o seu conteúdo de ácido gordo trans foi encontrado para ser 3,42%. Tele 13 C RMN análise da mesma amostra num instrumento de 500 MHz revelou um teor de 3,64% de ácidos gordos trans. A quantidade de trans FA em mmol / g de óleo de peixe pode ser determinada utilizando o BHT como um padrão interno e a equação C = I / I IS × A / m, no entanto os resultados não podem ser expressos em mg / g porque o pico a δ 13,80 corresponde a vários ácidos gordos trans, trans principalmente DHA e EPA trans, com PM diferente.

Exemplo 6, EE: A concentração de EE em uma amostra de óleo de peixe é calculado dividindo-se o integral da área espectral de δ 60,50 a ô 60,00, o que corresponde aos carbonos de metileno da EE de vários ácidos gordos, com S. A análise de uma amostra de óleo EE fish mostrou que consistiu em 100% de EE. Deve notar-se que nas amostras de EE, EPA cAn pode ser calculada com pelo pico do carbonilo a 173,60 δ ou pelo carbono de metileno EE em δ 60,20, enquanto o DHA pode ser calculado utilizando o sinal em δ 60,31 e / ou o sinal em δ 173,09.

Uma lista completa dos sinais de diagnóstico que podem ser utilizadas para fins de quantificação com 13 C e análise de RMN 1 H podem ser encontrados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente, enquanto uma descrição detalhada das equações que podem ser utilizados para esta análise pode ser encontrado noutro local 19.

RMN pode ser adicionalmente aplicado para a avaliação do estado de oxidação de suplementos de óleo de peixe. A Figura 3 compara a 1 H RMN Os espectros de uma amostra de óleo de peixe em duas condições de oxidação; exposição a aquecimento e exposição a radiação ultravioleta (UV)luz. a oxidação de lípidos é um processo complicado, e a composição de produtos de oxidação depende das condições de oxidação. Os principais produtos de oxidação são hidroperóxidos (ô 8,0-8,8), os dienos conjugados hidroperóxidos (δ 5,4-6,7), e aldeídos (ô 9.0- 10).

figura 1
Figura 1. A análise de 1H RMN. 850,23 (A) e 500,20 MHz (B) 1 H-RMN espectro de um suplemento de óleo de peixe em CDCl3 solução. Os sinais de RMN de EPA e DHA que podem ser utilizados para a sua determinação estão apresentados. O pico a 0,97 δ pode ser utilizado para a determinação da quantidade total de ácidos gordos n-3. O envelope em δ 1,39-1,20 é cortada, como a que pertence aos protões de metileno de todos cadeia gordas e não pode ser usado para quaisquer fins de identificação ou quantificação. O espectro de RMN 1H é caracterizada por uma largura espectral mais estreita (SW) em comparação com o espectro de 13 C RMN e assim por menor resolução espectral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A análise 13 C RMN. 213,81 (A) e 125,77 MHz (B) 13 C-RMN espectro de um suplemento de óleo de peixe em CDCl3 solução na região de carbonilo carbono. Os sinais de RMN de EPA e DHA em sn -1,3 e posição sn-2 são mostrados. Estes sinais podem ser utilizados para a determinação quantitativa de EPA e DHA. Embora o spectra gravado em 213,81 MHz são caracterizados por uma maior resolução e sensibilidade, os espectros de 125,77 MHz e também pode ser utilizado para a determinação dos compostos principais. A aplicação de dissociação no C RMN experimento 13 elimina o efeito de acoplamento escalar entre os núcleos de carbono e hidrogénio e, assim, os sinais aparecem como singuletos tornando mais fácil a análise em comparação com o espectro de 1 H RMN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A oxidação do óleo de peixe. O espectro de RMN 1 H de óleo de peixe oxidado depende das condições de oxidação. As ressonâncias atribuídas a hidroperóxidos (ô 8,0-8,8), conjugated dienos hidroperóxidos (δ 5,4-6,7), e aldeídos são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ppm δ próton Composto
0,677 CH3 (18) Colesterol
0,678 CH3 (18) 7-desidrocolesterol
0,88 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,27 Hz n -9, cadeias acilo SFA
0,883 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,08 Hz n -6 cadeias acilo
0,911 CH 2 CH 3 (t), J ω; 1, ω2 = 7,65 Hz Cadeias de acilo trans
0,973 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,63Hz n -3 cadeias acilo
1,25 CH 2 CH 3 (t), J = 7,20 Hz ésteres etílicos
1,697 OCOCH2CH 2 (t), J H α, Η β = Hz cadeia acilo EPA
2,391 OCOCH 2 CH 2 (t) cadeia acilo DHA
2.772 CH = CHCH 2 CH = CH n -6 cadeias acilo
2,81 CH = CHCH 2 CH = CH n -3 cadeias acilo
3.593 3'a-CH 2 OCO Glicerol de 1-MAG
3.722 3'a, 3217; b-CH 2 OCO (largo) Glicerol de 1,2-DAG
4.073 2'-CHOH (largo) Glicerol de 1,3-DAG
4.121 CH 2 CH 3 multipleto ésteres etílicos
4.173 1'b, 3'b-CH 2 OCO (dd) Glicerol de 1,3-DAG
4.238 1'a-CH 2 OCO (dd) Glicerol de 1,2-DAG
4.329 1'b-CH 2 OCO (dd) Glicerol de 1,2-DAG
4.989 -CH = CH2 cis (dd) n -1 cadeias acilo
5.052 -CH = CH2 trans (dd) n -1 cadeias acilo
5,082 2'-CHOCO Glicerol de 1,2-DAG
5.268 2';-CHOCO Glicerol de TAG
5,436 CH = CHCH 2 CH = CH 2 n -1 cadeias acilo
5.818 -CH = CH 2 n -1 cadeias acilo

Tabela 1: A atribuição do espectro de 1 H RMN. o 1 H-RMN os desvios químicos dos sinais de ácidos gordos de óleo de peixe que podem ser usados para fins de quantificação em CDCl3 solução são apresentados. Os desvios químicos são medidos em ppm e fornecer informação sobre o ambiente químico dos núcleos.

ppm δ Carbono
173,24 C1 SFA (sn -1,3)
172,21 C1 OL, LO (sn -1,3)
C1 ETA (sn -1,3)
173,13 C1 DPA (sn -1,3)
173,03 C1 SDA (sn -1,3)
172,97 C1 EPA (sn -1,3)
172,73 C1 ETA (sn-2)
172,69 C1 DPA (sn-2)
172,61 C1 SDA (sn-2)
172,56 C1 EPA (sn-2)
172,48 C1 DHA (sn -1,3)
172,08 C1 DHA (sn-2)
136,8 Cω1, n -1
131,85 Cω3 LN
130,37 C15 AA
130,11 C9 LN
130,06 C13 LO
129,54 C5 DHA sn-2
129,47 C5 DHA sn -1,3
128,94 C5 EPA
128,76 C6 EPA
128,45 C17 n-3
127,71 n -3
127,53 C4 DHA sn-2
127,5 C4 DHA sn -1,3
126,86 Cω4, todos os n -3
114,71 Cω2, n -1
60,08 Ésteres de DHA, etilo
59,96 EPA, ésteres etílicos
59,95-59,85 Outros ésteres de FA, etilo
33.48 C2 EPA sn-2
33.32 C2 EPA sn -1,3
31,44 C3 n -1
27.05 Alílico n -6
26.49 C4 EPA sn -1,3
26,47 C4 EPA sn-2
24,6 C3 EPA
24,48 C3 SDA -1,3 sn
24,44 C3 SDA sn-2
14,27 Cω1, todos os n -3
14.13 Cω1, SFA
14.11 Cω1, OL
14,07 Cω1, LO
13.8 Cω1, FA trans

Tabela 2: A atribuição do espectro de 13 C RMN. Os desvios quicos de 13 C-RMN de sinais de ácidos gordos de óleo de peixe que podem ser usados para quantificação purposes em CDCl3 solução são apresentados.

Suplementar Figura S1: Comparação entre os espectros de RMN do C 13 adquiridos utilizando o padrão de banda larga desacoplando (A) e o inverso fechado desacoplamento sequências de impulsos (B). Os espectros foram registados para a mesma amostra, com o mesmo número de varrimentos, processado com os mesmos parâmetros de processamento e são apresentados com o mesmo factor de escala. Por favor clique aqui para baixar este valor.

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Discussion

Modificações e Estratégias para a resolução de problemas

Qualidade espectral. A largura de linha do sinal de NMR e, assim, a resolução do espectro de RMN é altamente dependente de calço, o qual é um processo para a optimização da homogeneidade do campo magnético. Para análises de rotina, 1D calçamento está adequada e uma shimming 3D não é necessária, uma vez que é realizada por pessoal de RMN em uma base regular. Se este não for o caso, um calço 3D deve ser realizada antes da análise usando uma amostra contendo 0,6 mL de H 2 O: D 2 O (90:10). Para alcançar um melhor e mais rápida de calçamento, a amostra tem de ser centrada na região de excitação / detecção da bobina de radiofrequência (RF), utilizando o medidor de profundidade graduada, antes de ser colocado no interior do magneto. Outro factor que afecta calçamento está girando a amostra a uma velocidade de rotação de 10-20 Hz. Embora a girar a amostra a esta velocidade de rotação melhora os calços radiais (X, Y, XY, XZ, YZ, X 2 Y 2, etc.), geralmente não é recomendado, a fim de evitar o aparecimento de bandas laterais de spin do primeiro ou de ordem superior. No entanto, quando se trabalha em instrumentos que operam em Larmor as frequências inferiores a 400 MHz, a fiação é recomendado para as experiências de RMN 1D.

Resolução, bem como sensibilidade, são afectadas pelo receptor valor de ganho (RG). Baixos valores do ganho do receptor reduzir a sensibilidade, enquanto que valores superiores a causa estouro apropriada do conversor analógico-digital (ADC). resultados ADC estouro em linha formas assimétrica e os sinais não podem ser utilizados para fins quantitativos, porque os primeiros pontos da decadência de indução livre (FID) podem ser perdidos. Na maioria dos casos, o "RGA" comando calcula um valor rg apropriado. No entanto, em alguns casos, o valor rg calculada pelo software é mais elevado do que o valor ideal e existe uma distorção na forma Lorentziana do sinal de RMN. DentroNesse caso, o utilizador deve introduzir manualmente um valor menor rg digitando "rg (valor)" na linha de comando. Um valor típico para RG as amostras analisadas com que este protocolo é 8.

Muitas vezes, quando se utiliza criogenicamente arrefecida sondas de RMN com um elevado factor de qualidade (Q-factor), um grande atraso (tempo morto)> 200us entre o último impulso e o período de detecção é necessária para evitar artefactos, tais como uma protuberância em torno de frequência do transmissor e rolando na linha de base do espectro. No entanto, um atraso tão grande provoca um erro de fase de primeira ordem negativa, o que pode também apresentar um rolamento de linha de base e grandes depressões em torno da base dos sinais mais fortes. Nestes casos, uma sequência de impulso de spin-eco restaurado-z pode ser utilizado para produzir os espectros de RMN com as linhas de base significativamente melhorados, embora uma pequena redução da sensibilidade pode ocorrer 23.

Fosfolipídios. Para além da análise de óleo de peixeAs amostras ricas em triglicéridos e ésteres de etilo, RMN pode ser utilizado para a análise de amostras de óleo de peixe rico em fosfolidos (PL). No entanto, um cuidado especial é necessário para tais amostras porque PLs formam agregados, o que pode causar uma redução significativa na resolução espectral e sensibilidade. Para a análise destas amostras, uma mistura solvente de clorofórmio deuterado: metanol (CDCl 3: CD 3 OD) em uma proporção de 70:30 é necessária para a obtenção de espectros de alta qualidade.

Padrão interno. BHT foi escolhido como um padrão interno no presente estudo, uma vez que é uma molécula altamente simétrico com simples 1 H e 13 C RMN e espectros de nenhuma das suas picos sobrepõem com as dos constituintes do óleo de peixe. BHT tem um sinal no espectro de RMN de 1H, que aparece como um singuleto a 6,97 e δ pertence aos dois protões aromáticos equivalentes (ponto - de posição em relação ao grupo OH) e um sinal a151,45 δ no espectro de 13 C RMN que pertence ao carbono quaternário aromático que tem o grupo -OH. Ambos estes sinais não têm nenhuma sobreposição com qualquer dos constituintes do óleo de peixe, e, assim, pode ser utilizado para fins de quantificação. Outros compostos, tais como 1,2,4,5-tetracloro-3-nitrobenzeno (TCNB) ou cloreto de etileno também podem ser usadas como padrões internos alternativas, no entanto, eles são caracterizados por valores mais longos T 1.

Limitações da técnica

A quantificação de vários ácidos gordos e lípidos em suplementos de óleo de peixe é conseguida através da integração dos sinais de RMN de diagnóstico apropriados nos espectros de 1D. Tais sinais deve pertencer apenas a um componente específico da amostra e deve ter nenhuma interferência com sinais de outros compostos. Isto pode ser um problema para uma análise H RMN, uma vez o espectro de 1 H RMN é caracterizada por uma baixa resolução devido ao curto intervalo de chemudanças Mical. Além disso, a presença de acoplamento escalar (J) produz multipletos e torna a análise mais complexa. Por exemplo, ésteres de etilo (EE) pode ser quantificada utilizando RMN de 1H pelo tripleto de característica (J = 7,20 Hz) do grupo metilo em δ 1,25 e o multipleto na δ 4,12, que pertence aos protões de metileno do grupo éster. No entanto, quando se utiliza instrumentos de RMN que operam em Larmor as frequências mais baixas do que 850 MHz, a análise de EE utilizando 1 H RMN devem ser evitados devido à sobreposição parcial do pico a δ 4,12, com o pico a δ 4,14 de TGs, e a sobreposição de o sinal em δ 1,25 com o sinal largo dos protões de metileno alifáticos em δ 1,23-1,35. Grandes desvios também foram observadas entre a análise de 1 H e 13 C de EPA em algumas amostras, de 13 C RMN estava mais próxima da composição marcada fornecida por tEle fabricante. Isto é provavelmente devido a sobreposição do sinal a δ 1,69, que é utilizado para a análise de EPA, com sinais de outros compostos que aparecem em alguns tipos de suplementos de óleo de peixe. erros adicionais em quantificações podem surgir quando se utiliza um padrão interno, devido à pureza incerta do padrão interno e depois de erros de pesagem.

A análise da composição pode ser expresso, em concentrações molares relativas sem o uso de um padrão interno. Se os resultados precisam de ser expressas em concentrações absolutas, por exemplo, como miligramas de ácido gordo, por grama de óleo (mg / g), é necessária a utilização de um padrão interno. No entanto, nos casos em que o sinal de RMN de interesse pertence a vários compostos com pesos moleculares diferentes, os resultados podem não ser expressa em mg / g, mesmo quando se utiliza um padrão interno. Além disso, o uso de um padrão interno geralmente aumenta a duração da análise, porque o s interna mais comum ORMAS, tais como BHT, são pequenas moléculas com simetria de elevado peso molecular, o que resulta em longos tempos de relaxação. Uma vez que o tempo de repetição (atraso entre os impulsos de tempo de aquisição +) é definida de acordo com o tempo de relaxamento T1 mais longo na amostra, o uso de um padrão interno irá aumentar a duração das experiências, conforme são necessários longos atrasos entre os pulsos. Este é um factor particularmente importante para a análise 13 C RMN devido à excepcionalmente longa t um tempo de relaxamento de núcleos de carbono. A adição de um composto paramagnéticos, tais como Cr (acac) 3 pode reduzir eficazmente o tempo de relaxamento T1. A concentração recomendada de Cr (acac) 3 é de 0,75 mg / mL de solução. Maiores concentrações de Cr (acac) 3, podem ser considerados para a redução adicional de t 1, no entanto, são necessárias precauções de modo a evitar a diminuição do S / N devido ao alargamento de linha.

ntent "> Embora a C RMN 13 é caracterizado por uma resolução espectral muito mais elevada em comparação com um H, a sensibilidade do ensaio de 13 C RMN é significativamente menor devido à abundância baixa naturais (1,1%) e o rácio giromagnético baixo (67,26 10 6 rad s -1 T -1) de 13 núcleos C. Além disso, os longo T 1 tempos de relaxação de 13 C aumentar a duração da análise. Isso pode ser um problema quando o óleo disponível para análise é limitada, porque um aumento número de varreduras devem ser usados ​​para alcançar um sinal razoável à relação de ruído.

Limitações na sensibilidade e resolução dos espectros de RMN impedir a análise de muitos compostos pequenos em óleo de peixe que podem ser analisadas com outras técnicas, tais como a CG. Por exemplo, um Η RMN é incapaz de separar os esteróis individuais ou ácidos gordos (por exemplo ácido palmítico e esteárico), enquanto que 13 Cnão é capaz de determinar compostos que aparecem numa concentração muito baixa no óleo de peixe, tais como o ácido dodecanóico e mirístico, que se sobrepõem com os sinais de todos os ácidos gordos saturados na δ 173,24 e 172,82 δ. Embora o aumento da quantidade de amostra que é analisada faz com que a análise de alguns compostos minoritários viáveis, são necessárias precauções para amostras muito concentradas, por causa da sua elevada viscosidade. Soluções muito viscosas que contêm mais do que 150 mg de óleo deve ser evitada, porque não há um decréscimo em S / N devido ao alargamento de linha provocada pelos tempos de relaxação spin-spin T 2 reduzidas. Além disso, mais longos atrasos entre os pulsos são necessários por causa do tempo T 1 e há várias questões em calços e, portanto, na resolução.

Todos os compostos analisados ​​em óleo de peixe com RMN podem ser quantificadas simultaneamente, em um instantâneo sem o uso de quaisquer passos de separao ou purificao. A uma RMNANÁLISE é rápida como o espectro de 1 H pode ser gravado em menos de um minuto, enquanto que a aquisição 13 C RMN dura 10 min. Deve-se notar, no entanto, que existem alguns fatores que afetam o tempo de aquisição de dados. Especificamente, para 13 C RMN, o tempo de execução de 10 minutos só pode ser conseguida sem a utilização de padrões internos, e com o uso de sondas criogenicamente arrefecidas, em que a bobina de RF e o pré-amplificador são arrefecidas e, assim, o ruído térmico é minimizado. Um aumento de 10-15 vezes no tempo experimental deve ser esperado para análise 13 C RMN quando a temperatura do quarto sondas (convencionais) são usadas.

Significado com respeito aos métodos existentes

espectroscopia de RMN mostrou ser uma ferramenta poderosa para a determinação qualitativa e quantitativa da composição de suplementos de óleo de peixe, e devido à sua rapidez que tem o potencial de ser aplicada para o rastreio de alto rendimento de um grande nu mber de amostras de óleo de peixe. espectroscopia de RMN é, por definição, uma metodologia quantitativa uma vez que a área de sinal é directamente proporcional ao número de núcleos que causam o sinal. Enquanto os produtos químicos altamente tóxicos são necessários para preparar as amostras de RMN, este método é amigo do ambiente, porque tais pequenas quantidades de produtos químicos esta (por exemplo, CDCl 3) são usados em oposição a outros métodos que requerem grandes quantidades de solvente para eluir as amostras. Além disso, RMN tem várias vantagens em comparação com outros métodos analíticos. Sem calibração com padrões é necessária antes da análise, e uma preparação da amostra mínima, sem quaisquer passos de separação e purificação é geralmente adoptada, o que torna RMN uma ferramenta analítica muito rápido. Além disso, 13 C NMR é a melhor metodologia disponível para a determinação da distribuição posicionai de vários ácidos gordos sobre o esqueleto de glicerol. Embora a hidrólise enzimática tem sido utilizada como uma alternativa não é sempre fiável= "xref"> 24. Isto é de importância específica, porque há um interesse significativo em estudar a regioespecificidade de vários ácidos graxos em alimentos, uma vez que se verificou que isso afeta sua função na dieta humana 25, 26.

Aplicações futuras

Apesar do acordo entre a análise de RMN e rótulo dos produtos, bem como o fato de que existem alguns estudos que mostram acordo entre GC e NMR, acreditamos que os estudos intra-laboratório mais rigorosos e abrangentes são necessários para examinar o acordo entre NMR e tradicional metodologias para a análise dos constituintes do óleo de peixe usando um número maior de amostras, produtos de óleo de peixe de diferentes origens, e soluções-padrão de certificados.

Uma outra importante aplicação futura de RMN em análise de óleo de peixe será a determinação dos produtos de oxidação. Além da determinaçãodos principais compostos em óleo de peixe, vários produtos de oxidação primários e secundários em óleo de peixe, tais como os aldeídos e os peróxidos, estão presentes. 1 H RMN pode ser potencialmente aplicada para a avaliação do estado de oxidação em suplementos de óleo de peixe, sob diferentes condições de oxidação, tal como mostrado na Figura 3. O maior desafio nesta análise será a atribuição de RMN e a identificação de produtos de oxidação individuais. Avanços na sensibilidade do equipamento de RMN também permitirá a identificação de esteróis individuais usando 13 C RMN. espectroscopia de RMN também pode ser aplicado para a análise de tecidos de peixes, como um todo, mesmo sem qualquer extracção usando alta resolução mágica Angle Spinning RMN (HR-MAS).

Passos críticos dentro do Protocolo

Dois dos passos mais críticos que afectam a exactidão dos espectros de RMN quantitativos envolvem a selecção de um pulso de 90 ° e o uso de um atraso entre puLSE ≥ 5 × T 1. O ângulo de pulso é proporcional à largura de impulso que é um parâmetro RMN calibrado que depende da instrumentação e a amostra. Um pulso de 90 ° é essencial para a conversão completa dos longitudinal (z) de magnetização para a magnetização transversal observável (xy). É importante notar que antes da calibração de pulso, a RMN sondado precisa ser bem ajustado e combinado. Isto irá optimizar a transferência da energia de RF para a amostra e, assim, maximizar S / N e assegurar dissociação eficaz. A afinação da sonda é principalmente afectado pela constante dieléctrica da amostra, portanto, se existem diferenças na concentração entre amostras, repetir o processo de ajuste para cada um. A 1D 13 C RMN experiência envolve tanto a 13 C e 1 H canais de sintonização de modo automático e correspondente é necessária para ambos os núcleos.

Um atraso entre os impulsos de mais do que 5 × T 1 garante a rec completaovery da magnetização líquida ao seu valor inicial. Se todas as ressonâncias no espectro não completamente relaxado antes de cada pulso, o sinal é parcialmente suprimida e isso leva a imprecisões na integração. T um valor é um factor crítico que afecta a duração da experiência e que depende da intensidade do campo magnético, assim como a viscosidade da amostra. Dado que a viscosidade entre as amostras é similar, os tempos de relaxamento T1 deve ser determinado para cada instrumento, apenas no início da sessão de análise.

Outra característica importante da análise do óleo de peixe com 13 C-NMR é a selecção da sequência de pulso apropriado. O método mais fiável para a análise quantitativa de 13 C é o inverso fechado experimento desacoplamento, onde de protões de banda larga dissociação é aplicado apenas durante o período de aquisição e, assim, não há transferência de polarização de 1 H a 13C através do efeito nuclear de Overhauser (NOE). No entanto, enquanto a experiência de NMR totalmente dissociado pode ser utilizado para fins quantitativos, é preciso ter cuidado quando se utiliza esta experiência porque existem diferentes factores de NOE entre os átomos de carbono com diferentes multiplicidades e comparação portanto integrante entre metilo, metileno, de metano e de carbonilo carbonos deve ser evitada. Apesar disso, quando apenas carbonos de multiplicidade e semelhante ambiente químico são considerados na análise, o método totalmente dissociado é fiável. Um exemplo disto é carbonos de carbonilo de ácidos gordos que têm sido encontrados a ter não há diferenças significativas nos factores de NOE após desacoplamento 27. Além disso, para carbonos contendo protões, o experimento totalmente dissociado fornece maior sensibilidade devido às contribuições de NOE sobre a intensidade do sinal de NMR. Uma comparação entre os espectros de adquiridas com as duas sequências de impulsos é mostrado na Figura S1.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos Alimentos para Health Discovery tema no The Ohio State University e do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos no The Ohio State University. Os autores gostariam de agradecer a facilidade NMR no The Ohio State University ea facilidade NMR da Penn State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

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