Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR الطيفي كأداة قوية لتقييم السريع من الدهون الملف من السمك ملاحق النفط

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55547
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Food Science and Technology, The Ohio State University, 2Foods for Health Discovery Theme, The Ohio State University

Summary

هنا، تم استخدام عالية الدقة 1 H و 13 C النووية الرنين المغناطيسي (NMR) الطيفي كأداة سريعة وموثوق بها للتحليل الكمي والنوعي للمكملات زيت السمك مغلفة.

Abstract

النظام الغذائي الغربي هو فقير في الأحماض ن -3 الدهنية، لذلك ينصح استهلاك مكملات زيت السمك لزيادة تناول هذه المواد الغذائية الأساسية. والهدف من هذا العمل هو للتدليل على التحليل الكمي والكيفي للمكملات زيت السمك مغلفة باستخدام عالية الدقة 1 H و 13 C NMR الطيفي باستخدام الرنين المغناطيسي النووي صكين مختلفة. ميغاهيرتز 500 وأداة 850 ميغاهيرتز. كل من البروتون (1 H) والكربون (13 C) NMR الأطياف يمكن استخدامها لتحديد كمية المكونات الرئيسية من مكملات زيت السمك. ويتحقق الكمي من الدهون في مكملات زيت السمك خلال دمج إشارات الرنين المغناطيسي النووي المناسبة في أطياف 1D ذات الصلة. النتائج التي حصل عليها 1 H و 13 C NMR هي في اتفاق جيد مع بعضها البعض، على الرغم من الاختلاف في القرار، وحساسية بين اثنين من النوى والصكوك اثنين. 1 H NMR العرضسا تحليل أسرع مقارنة مع 13 C NMR، كما يمكن تسجيل الطيف في أقل من 1 دقيقة، على النقيض من 13 تحليل C NMR، الذي يستمر من 10 دقيقة إلى ساعة واحدة. وNMR الطيف 13 C، ومع ذلك، هو أكثر إفادة بكثير. ويمكن أن توفر البيانات الكمية لعدد أكبر من الأحماض الدهنية الفردية، ويمكن استخدامها لتحديد توزيع الموضعية من الأحماض الدهنية على العمود الفقري الجلسرين. ويمكن لكل من نوى تقديم المعلومات الكمية في تجربة واحدة فقط من دون الحاجة إلى تنقية أو الانفصال الخطوات. قوة المجال المغناطيسي يؤثر في الغالب 1 H NMR الأطياف بسبب انخفاض قرارها فيما يتعلق 13 C NMR، ومع ذلك، أدوات NMR حتى أقل تكلفة يمكن تطبيقها بكفاءة كوسيلة من وسائل قياسية في صناعة المواد الغذائية ومراقبة الجودة المختبرات.

Introduction

وقد ثبت أن استهلاك الأحماض الدهنية ن -3 في النظام الغذائي أن يكون مفيدا ضد عدة أمراض مثل أمراض القلب 1، 2، 3، 4 الأمراض الالتهابية ومرض السكري 5. يعتبر النظام الغذائي الغربي الفقراء في ن -3 الأحماض الدهنية، وبالتالي ينصح استهلاك مكملات زيت السمك لتحسين ن -6 / ن -3 التوازن في التغذية المستهلك 1. وعلى الرغم من الزيادة الأخيرة في الأسماك استهلاك المكملات النفط، ما زالت هناك تساؤلات حول سلامة وصحة، ونوعية بعض من هذه المنتجات. التحليل التركيبي سريع ودقيق للمكملات زيت السمك ضروري لتقييم صحيح نوعية هذه المنتجات التجارية وضمان سلامة المستهلك.

المنهجيات الأكثر شيوعا لتقييم ملحق زيت السمكالصورة هي اللوني للغاز (GC) والأشعة تحت الحمراء الطيفي (IR). في حين أن هذه هي أساليب حساسة للغاية، وأنها تعاني من عدة عيوب 6. تحليل GC هو مضيعة للوقت (4-8 ح) لفصل واشتقاق من المركبات الفردية مطلوب 7 و قد تحدث أكسدة الدهون أثناء التحليل 8 و 9. بينما أطياف الأشعة تحت الحمراء يمكن أن يكون الكمي، مطلوب نموذج التنبؤ التي يتم بناؤها باستخدام جزئي الأقل الساحات الانحدار (PLSR)، على الرغم من أن هناك استثناءات فيها العصابات IR يمكن أن يعزى إلى مجمع واحد (10). يتطلب PLSR تحليل عدد كبير من العينات، مما يزيد من وقت التحليل 11. لهذا السبب، هناك اهتمام متزايد في تطوير منهجيات تحليلية جديدة تتيح تحليل دقيق وسريع لعدد كبير من عينات زيت السمك. منظمات مثل OFFIوتعاونت م من المكملات الغذائية (ODS) في المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وإدارة الغذاء والدواء (FDA) مع رابطة الرسمية تحليلية الكيميائيين (AOAC) لتطوير هذه الأساليب الجديدة 12 و 13.

إحدى الطرق التحليلية الواعدة لفحص وتقييم مصفوفات متعددة عنصر، مثل المكملات الغذائية، وغير النووية الرنين المغناطيسي (NMR) الطيفي 14 و 15. NMR الطيفي ديها العديد من المزايا: فهو أسلوب غير المدمرة والكمية، فإنه يتطلب الحد الأدنى من دون إعداد العينات، ويتميز دقة ممتازة والتكاثر. وبالإضافة إلى ذلك، NMR الطيفي هو منهجية صديقة للبيئة لأنها تستخدم كميات صغيرة فقط من المذيبات. العيب الرئيسي للNMR الطيفي هو حساسيتها منخفضة نسبيا بالمقارنة مع غيرها من analytiطرق كال، ومع ذلك، فقد زادت التطورات التكنولوجية الحديثة في الأجهزة مثل حقول المغناطيسية أقوى، تحقيقات المبردة من مختلف الأقطار، ومعالجة البيانات المتقدمة، وتسلسل نبض تنوعا والتقنيات حساسية تصل إلى نطاق نانومتر. في حين NMR الأجهزة من حيث التكلفة عالية، وحياة طويلة من الطيف الرنين المغناطيسي النووي والعديد من تطبيقات NMR تخفيض تكلفة التحليل على المدى الطويل. ويهدف هذا البروتوكول فيديو مفصل للمساعدة الممارسين جديد في مجال تجنب المزالق المرتبطة 1 H و 13 تحليل الطيفي C NMR من مكملات زيت السمك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد نموذج NMR

ملاحظة: الحذر، يرجى الرجوع إلى كل اوراق البيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الكلوروفورم بالديوتيريوم (CDCl 3) المستخدمة في إعداد العينات هي سامة. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند تنفيذ إعداد العينات بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل مغلقة اصبع القدم أحذية).

  1. إعداد 1 H و 13 عينات C
    1. استخراج 120 ميكرولتر (~ 110 ملغ) من زيت السمك من كبسولة الغذائية باستخدام حقنة ووضعه في 4 مل قارورة زجاجية. تسجيل الوزن من زيت السمك.
    2. حل عينة
      1. حل ما يقرب من 120 ميكرولتر من زيت السمك في 500 ميكرولتر من CDCl 3 تحتوي على 0.01٪ من tetramethylsilane (TMS) الذي يستخدم كمرجع لH 1 و 13 التحولات C الكيميائية.
        ملاحظة: TMS هو استخدامد فقط للمعايرة التحول الكيميائي (انظر الأرقام خطوة 2.2.1.2.7 و2.2.2.2.7)، وليس لالكمي (انظر الأرقام خطوة 2.2.1.3 و2.2.2.3) الأغراض.
      2. إعداد 2،6-DI- ثالثي -butyl-4-methylphenol (BHT) حل الأوراق المالية، إن أعرب الكمي في ملغم / ز هو المطلوب، من خلال حل ما يقرب من 220 ملغ من BHT و 15 ملغ من أسيتيل أسيتونات الكروم الثلاثي (الكروم ( ACAC) 3) في 20 مل من CDCl 3 تحتوي على 0.01٪ من TMS. استخدام 500 ميكرولتر من محلول المخزون حل 100 ملغ (± 10 ملغ) من زيت السمك.
    3. بعد حل النفط (وهذا يستغرق بضع ثوان)، ونقل كل من الحل مباشرة في ذات جودة عالية أنبوب NMR 5 ملم وإرفاق الغطاء. تحليل العينات في غضون 24 ساعة بعد إعداد العينات.

إعداد 2. NMR صك

ملاحظة: الحذر، الحذر أن وجود مجالات مغناطيسية قوية تنتجها أجهزة الرنين النووي المغنطيسي يمكن أن تؤثر على الأجهزة الطبية وimplالنمل مثل أجهزة ضبط نبضات القلب والأطراف الاصطناعية الجراحية، فضلا عن العناصر الالكترونية مثل بطاقات الائتمان، والساعات، وما هو مطلوب الحذر إضافية عندما أجريت التحاليل باستخدام مغناطيس غير التدريع. تم استخدام أداتين NMR لشراء 1 H و 13 C NMR الأطياف. مطياف تعمل على 850.23 ميغاهيرتز و213.81 ميغاهيرتز ل1 H و 13 نواة C، على التوالي، ومجهزة صدى الثلاثي معكوس تبريد الهليوم (TCI) 5 ملم التحقيق ومطياف تعمل على 500.20 ميغاهيرتز و125.77 ميغاهيرتز ل1 H و 13 C نوى، على التوالي، مجهزة اسع النطاق لاحظ (BBO) النيتروجين وتبريد 5 مم التحقيق. تم إجراء جميع التجارب في 25 ± 0.1 درجة مئوية وتم معالجتها الأطياف بواسطة حزمة البيانات الرنين المغناطيسي النووي اكتساب التحليل وبرامج معالجة القياسية (انظر قائمة المواد).

  1. إعداد لاكتساب NMR الأطياف
    ملاحظة: 1 H و 13 C NMR الأطيافيمكن الحصول بالتالي دون إزالة عينة من الصك.
    1. إدراج أنبوب NMR إلى التوربينات الدوار (انظر قائمة المواد).
    2. وضع الدوار وأنبوب على الجزء العلوي من متدرج قياس عمق ودفع برفق الجزء العلوي من الأنبوب حتى يلامس الجزء السفلي في الجزء السفلي من قياس.
    3. ضع عينة NMR في بقعة مفتوحة للSampleCase. لاحظ عدد فتحة يتم وضع العينة في.
    4. لتحميل عينة في NMR، والعودة إلى السيطرة على جهاز الكمبيوتر واكتب 'SX #'، حيث # هو فتحة في SampleCase عقد عينتك.
    5. انتظر إشارة الديوتيريوم من CDCl 3 لتظهر على الشاشة نافذة القفل. اذا لم تظهر تلقائيا، اكتب "lockdisp". بمجرد إشارة الديوتيريوم مرئيا، اكتب "تأمين" على سطر الأوامر وحدد "CDCl 3" من قائمة المذيب من أجل قفل العينة باستخدام CDCl 3 الديوتيريوم الرنين.
      ملاحظة: الديوتريوم الصورةقد لا تظهر ignal إذا استخدمت المستعمل السابق مذيب مختلفة. يجب أن المستخدم الانتظار للمؤشر أن العينة باستمرار، ثم قفل.
    6. نوع "bsmsdisp" في سطر الأوامر لضمان الغزل غير نشطة. إذا كان الزر "SPIN" هو أخضر، فوقه لتنشيط الغزل.
    7. اكتب الأمر "جديد" لإنشاء مجموعة جديدة من البيانات. أدخل اسما لمجموعة البيانات في "NAME" علامة التبويب وعدد التجربة في علامة التبويب "EXPNO". استخدام رقم "1" في علامة التبويب "PROCNO". في علامة التبويب "تجربة"، وضرب "حدد" واختيار "بروتون" ملف المعلمة. كتابة عنوان التجربة في علامة التبويب "العنوان". انقر فوق موافق."
    8. اكتب "getprosol" في سطر الأوامر للحصول على المعلمات موحدة لتحقيق NMR الحالي والمذيبات.
    9. كرر الخطوة 2.1.7 لمدة 13 C، واختيار "C13IG" تسلسل النبض في علامة التبويب "تجربة" ل1D C 13 معكوس زتنفصل ATED التجربة.
    10. اكتب "getprosol" في سطر الأوامر للحصول على المعلمات موحدة لتحقيق NMR الحالي والمذيبات.
    11. اكتب الأمر "عتمة" لتنفيذ الضبط التلقائي ومطابقة لجنة التحقيق على حد سواء نوى الكربون والبروتون.
    12. أداء التدرج ذات بعد واحد الملئ لتحقيق حقل مغناطيسي متجانس للغاية، وبالتالي شكل خط الأمثل للإشارات NMR.
      1. استخدم الإجراء التلقائي القياسي ل1D الملئ، وذلك ببساطة عن طريق تنفيذ بالتتابع الأوامر "تشو topshim 1dfast SS"، "تشو topshim tuneb SS"، و "تشو topshim التقرير" على سطر الأوامر.
  2. الأمثل المعلمة
    1. معايرة 90 ° النبض
      1. إنشاء مجموعة بيانات جديدة عن 1 H (انظر الخطوات 2.1.7 و2.1.8).
      2. اكتب الأمر "paropt" على سطر الأوامر لبدء برنامج التشغيل الآلي للمعايرة بول 90 °حد ذاتها. حدد مدة النبضة، P1، كمعلمة إلى تعديل.
      3. تبدأ ب "2" ميكرو ثانية كقيمة أولية من P1، أدخل "2" ميكرو ثانية بزيادات وإجراء تجارب "16".
      4. إنشاء مجموعة بيانات جديدة لمدة 13 C (راجع الخطوة 2.1.9) وتكرار هذه العملية لمدة 13 نواة C (انظر الخطوات 2.2.1.2 و2.2.1.3).
    2. T 1 قياس يقاس طريقة لاغية (16) ل1 H
      ملاحظة: يستخدم أسلوب باطل تسلسل نبض الانتعاش انقلاب، ويتألف من 180 درجة متابعة نبض من قبل تأخير (تاو)، للسماح للاسترخاء على طول محور ض والنهائي 90 ° النبض مما يخلق مغنطة عرضية يمكن ملاحظتها.
      1. إنشاء مجموعة بيانات جديدة عن 1 H (انظر الخطوات 2.1.7 و2.1.8).
      2. اكتب "t1ir1d pulprog" لتغيير تسلسل النبض إلى قلب التجربة استرداد.
      3. اكتب الأوامر التالية في القيادة:د خط لإعداد العرض الطيفي في جزء في المليون، وسط الارسال RF، وعدد من مسح عدد من مسح وهمية وعدد من نقاط البيانات "جنوب غرب 8"، "o1p 3.8"، "م 2"، "س 2 "و" 64K الدفتيريا ".
      4. نوع "P1 (القيمة)" وأدخل القيم مدة 90 ° النبض على النحو الذي يحدده معايرة النبض (راجع الخطوة 2.2.1) واكتب "P2 (القيمة)" لنبض 180 ° (قيمة المدة ل180 ° نبض مدة 90 ° النبض مضروبا اثنين).
      5. تعيين تأخير إعادة تدوير إلى قيمة كبيرة جدا، مثل 10 ثانية عن طريق كتابة "D1 10".
      6. تعيين تاو إلى قيمة قصيرة، مثل 10 مللي، وذلك بكتابة "10ms D7" في سطر الأوامر.
      7. تعيين كسب المتلقي (RG) إلى قيمة مناسبة باستخدام "RGA" القيادة لحساب التلقائي للRG.
      8. تشغيل الطيف عن طريق كتابة الأمر "زج".
      9. تنفيذ فورييه تحول عن طريق كتابة "المتفجرات المخترقة للدروع"في سطر الأوامر.
      10. أداء تصحيح المرحلة التلقائي عن طريق كتابة الأمر "إيه بي كيه" في سطر الأوامر. إذا كانت هناك حاجة تعديلات مرحلة إضافية لزيادة تحسين الطيف، انقر على علامة التبويب "عملية"، ثم انقر على أيقونة "ضبط المرحلة" للدخول في وضع التصحيح المرحلة.
        1. استخدام النظام صفر (0) والرموز من الدرجة الأولى (1) تصحيح المرحلة عن طريق سحب الماوس حتى كل الإشارات هي في وضع امتصاص السلبي. تطبيق وحفظ القيم تصحيح المرحلة بالضغط على زر "العودة وحفظ" للخروج من وضع التصحيح المرحلة.
      11. زيادة تاو حتى كل القمم هي إما إيجابية أو أصبح بلا قيمة بتكرار الخطوات 2.2.2.6-2.2.2.9. لتحديد قيمة T 1، ببساطة تقسيم قيمة تاو حيث أصبح بلا قيمة الذروة مع LN2.
    3. T 1 قياس يقاس طريقة لاغية 16 لمدة 13 C
      1. إنشاء مجموعة بيانات جديدة لمدة 13 C (راجع الخطوة 2.1.9)
      2. نوع "pulprog t1irpg" لتغيير تسلسل النبض إلى قلب التجربة استرداد لنواة الكربون.
      3. اكتب الأوامر التالية في سطر الأوامر لإعداد العرض الطيفي في جزء في المليون، وسط الارسال RF، وعدد من المسح، وعدد من مسح وهمية وعدد من نقاط البيانات: "جنوب غرب 200"، "o1p 98" "NS 8"، "إس 2" و "64K الدفتيريا".
      4. نوع "P1 (القيمة)" وأدخل القيم مدة 90 ° النبض على النحو الذي يحدده معايرة النبض (راجع الخطوة 2.2.1) و "P2 (القيمة)" نوع لنبض 180 ° (قيمة المدة هي 90 ° مدة النبضة مضروبا في اثنين).
      5. تعيين تأخير إعادة تدوير إلى قيمة كبيرة جدا، مثل 100 ق بكتابة "D1 100".
      6. مجموعة تاو إلى قيمة قصيرة، مثل 100 مللي بكتابة "100MS D7" في سطر الأوامر.
      7. تعيين الاستقبالمكاسب إيه (RG) إلى قيمة مناسبة باستخدام "RGA" القيادة لحساب التلقائي للRG.
      8. تشغيل الطيف عن طريق كتابة الأمر "زج".
      9. تنفيذ فورييه تحول عن طريق كتابة "المتفجرات المخترقة للدروع" في سطر الأوامر.
      10. أداء تصحيح المرحلة التلقائي عن طريق كتابة الأمر "إيه بي كيه" في سطر الأوامر. إذا كانت هناك حاجة تعديلات مرحلة إضافية لزيادة تحسين الطيف، انقر على أيقونة "ضبط المرحلة" ومرحلة التصحيح رموز صفر النظام (0) والمرحلة (1) التصحيح من الدرجة الأولى.
        1. في حين النقر على النظام الصفر، ومرحلة من الدرجة الأولى الرموز التصحيح، اسحب الماوس حتى كل الإشارات هي في وضع امتصاص السلبي. تطبيق وحفظ القيم تصحيح المرحلة بالضغط على زر "العودة وحفظ" للخروج من وضع التصحيح المرحلة.
      11. زيادة تاو حتى كل القمم هي إما إيجابية أو أصبح بلا قيمة بتكرار الخطوات 2.2.3.6-2.2.3.9. لتحديدقيمة T 1، ببساطة تقسيم قيمة تاو حيث أصبح بلا قيمة الذروة مع LN2.
  3. أحادي البعد (1D) NMR الأطياف
    1. 1 H-NMR الأطياف
      1. الحصول على البيانات NMR
        1. انتقل إلى مجموعة البيانات 1 H بإنشائه في الخطوة 2.1.7 واستخدام معيار "نبض اكتساب" تسلسل نبض "زج"، بكتابة "pulprog ZG" في سطر الأوامر.
        2. اكتب الأوامر التالية في سطر الأوامر لإعداد العرض الطيفي في جزء في المليون، وسط الارسال RF، وعدد من المسح، وعدد من مسح وهمية، وعدد من نقاط البيانات ومدة النبضة للزاوية 90 ° النبض : "جنوب غرب 8"، "o1p 3.8"، "م 2"، "س 2"، "64K الدفتيريا" و "P1 (على النحو الذي يحدده معايرة النبض)" (راجع الخطوة 2.2.1).
          ملاحظة: نقاط البيانات 32K يمكن استخدامها للصك 500 ميغاهيرتز.
        3. تعيين تأخير تخفيف 7 الصورة للصك 500 ميغاهيرتز أو 9 الصورة للصك 850 ميغاهيرتز بكتابة "7S D1" أو "9S D1"، على التوالي، في سطر الأوامر.
        4. تعيين كسب المتلقي (RG) إلى قيمة مناسبة باستخدام "RGA" القيادة لحساب التلقائي للRG.
        5. اكتب "baseopt digmod" للحصول على الطيف مع تحسين خط الأساس.
        6. بدء عملية الاستحواذ عن طريق كتابة نبض اكتساب القيادة "زج" في سطر الأوامر.
      2. معالجة البيانات NMR
        1. اكتب "64K الاشتراكية" في سطر الأوامر لتطبيق الصفر، وملء تعيين حجم الطيف الحقيقي ل64K.
        2. تعيين خط توسيع المعلمة إلى 0.3 هرتز بكتابة "رطل 0.3" في سطر الأوامر لتطبيق وظيفة الترجيح (تسوس الأسي) مع خط اتساعا عامل من 0.3 هرتز قبل تحويل فورييه.
        3. تنفيذ فورييه تحول عن طريق كتابة "المتفجرات المخترقة للدروع" في الأمرخط.
        4. أداء تصحيح المرحلة التلقائي عن طريق كتابة الأمر "إيه بي كيه" في سطر الأوامر. إذا كانت هناك حاجة تعديلات مرحلة إضافية لزيادة تحسين الطيف، انقر على علامة التبويب "عملية"، ثم انقر على أيقونة "ضبط المرحلة" ومرحلة التصحيح رموز صفر النظام (0) ومن الدرجة الأولى (1) تصحيح المرحلة .
          1. في حين النقر على النظام الصفر، ومرحلة من الدرجة الأولى الرموز التصحيح، اسحب الماوس حتى كل من إشارات في وضع امتصاص إيجابي. تطبيق وحفظ القيم تصحيح المرحلة بالضغط على زر "العودة وحفظ" للخروج من وضع التصحيح المرحلة.
        5. تطبيق متعدد الحدود وظيفة رابع أجل تصحيح خط الأساس على التكامل عن طريق كتابة الأمر "القيمة المطلقة ن".
          ملاحظة: هذا يضمن الأساس الطيفي شقة مع حد أدنى من الكثافة.
        6. التحولات الكيميائية التقرير في جزء من المليون من TMS (δ = 0). انقر على معايرة ( "Calib. فأسهو ") الرمز، ووضع المؤشر مع خط أحمر على أعلى إشارة TMS NMR (الذروة الأقرب إلى 0). غادر انقر واكتب في" 0 ".
      3. تحليل البيانات NMR
        1. دمج المنطقة الطيفية من δ 1.1 إلى δ 0.6 وكذلك القمم في δ 4.98، δ 5.05 وδ 5.81 باستخدام "دمج" رمز (ضمن علامة التبويب "عملية") وتسليط الضوء على ( "تعريف منطقة جديدة") رمز. غادر النقر والسحب من خلال التكامل.
          ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى التركيز على المنطقة، انقر على أيقونة تسليط الضوء على تعطيل واليسار انقر واسحب الماوس لتكبير المنطقة. لضبط شدة العتبة، استخدم زر الماوس الأوسط إذا لزم الأمر. انقر على أيقونة تسليط الضوء مرة أخرى لجعل وظيفة التكامل نشطة، ثم نقل إلى الذروة المقبلة.
          1. تطبيع مجموع التكاملات أعلاه إلى 100 عن طريق النقر بالزر الأيمن على قيمة لا يتجزأ التي تظهرالصورة تحت إشارة وحدد "تطبيع مجموع التكامل". إدخال قيمة "100" في مربع وانقر على "العودة وحفظ" للخروج من وضع التكامل.
        2. عند استخدام BHT كمعيار داخلي، ودمج الذروة في δ 6.98 وتعيين يساوي جزءا لا يتجزأ من millimoles من BHT في 0.5 مل من محلول المخزون.
        3. دمج قمم الفائدة (راجع الخطوة 2.3.1.3.1) تمتد 10 هرتز من كل جانب من الذروة، عندما يكون ذلك ممكنا.
        4. المضي قدما لتنفيذ 13 C-NMR اقتناء الأطياف ومعالجة بطريقة مشابهة.
    2. 13 C-NMR الأطياف
      1. الحصول على البيانات NMR
        1. انتقل إلى مجموعة البيانات 13 C واستخدام معكوس بوابات تنفصل تسلسل نبض "zgig" بكتابة "pulprog zgig" في سطر الأوامر.
          ملاحظة: لتشغيل التجربة الكربون مع decou النطاق العريض القياسيةتسلسل نبض أقر، اكتب "pulprog zgpg" في سطر الأوامر.
        2. اكتب الأوامر التالية في سطر الأوامر لإعداد العرض الطيفي في جزء في المليون، وسط الارسال RF، وعدد من المسح، وعدد من مسح وهمية، وعدد من نقاط البيانات ومدة النبضة للزاوية 90 ° النبض : "جنوب غرب 200"، "o1p 95"، "م 16" "س 2"، "64K الدفتيريا" و "P1 (على النحو الذي يحدده معايرة النبض)" (راجع الخطوة 2.2.1.4).
        3. تعيين تأخير الاسترخاء من 35 الصورة للصك 500 ميغا هرتز أو 45 ق للصك 850 ميغاهيرتز بكتابة "35S D1" أو "45S وD1"، على التوالي، في سطر الأوامر. عند استخدام BHT، يجب أن يكون الاسترخاء تأخير 50 ​​ق في الصك 500 ميغاهرتز و 60 ثانية في الصك 850 ميغاهيرتز.
        4. تعيين كسب المتلقي (RG) إلى قيمة مناسبة باستخدام "RGA" القيادة لحساب التلقائي للRG.
        5. اكتب "baseopt digmod" في سطر الأوامر للحصول على الطيف ثتحسين خط الأساس إيث.
        6. بدء عملية الاستحواذ عن طريق كتابة نبض اكتساب القيادة "زج" في سطر الأوامر.
      2. معالجة البيانات NMR
        1. اكتب "64K الاشتراكية" في سطر الأوامر لتطبيق الصفر، وملء تعيين حجم الطيف الحقيقي ل64K.
        2. تعيين خط توسيع المعلمة إلى 1.0 هرتز بكتابة "رطل 1.0" في سطر الأوامر لتطبيق وظيفة الترجيح (تسوس الأسي) مع خط اتساعا عامل من 1.0 هرتز قبل تحويل فورييه.
        3. تنفيذ فورييه تحول عن طريق كتابة "المتفجرات المخترقة للدروع" في سطر الأوامر.
        4. أداء تصحيح المرحلة التلقائي عن طريق كتابة الأمر "إيه بي كيه" في سطر الأوامر. إذا كانت هناك حاجة تعديلات مرحلة إضافية لزيادة تحسين الطيف، انقر على علامة التبويب "عملية"، ثم انقر على أيقونة "ضبط المرحلة" ومرحلة التصحيح رموز صفر النظام (0) ومن الدرجة الأولى مرحلة (1) تصحيح .
            ملاحظة: للحصول على الأطياف الكربون سجلت على وتيرة ارمو من 214 ميغاهيرتز (الصك 850 ميغاهيرتز) تصحيح الأخطاء التي تعتمد تردد (أولا أجل) قد تكون صعبة وتستغرق وقتا طويلا للمستخدمين الأقل خبرة بسبب الكبيرة آثار خارج صدى لل 90 ° النبض.
        5. تطبيق متعدد الحدود وظيفة رابع أجل تصحيح خط الأساس على التكامل عن طريق كتابة الأمر "القيمة المطلقة ن" في سطر الأوامر.
        6. التحولات الكيميائية التقرير في جزء من المليون من TMS (δ = 0). انقر على معايرة ( "Calib. المحور") الرمز، ووضع المؤشر مع خط أحمر على أعلى إشارة NMR أن يكون المشار إليه. انقر على اليسار ونوع في "0".
      3. تحليل البيانات NMR
        1. دمج المنطقة الطيفية من δ δ 175 إلى 171 باستخدام الرمز "دمج" (ضمن علامة التبويب "عملية") وتسليط الضوء على ( "تعريف منطقة جديدة") رمز. غادر النقر والسحب من خلال التكامل.
          ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى التركيز على المنطقة، انقر على أيقونة تسليط الضوء على تعطيل واليسار انقر واسحب الماوس لتكبير المنطقة. انقر على أيقونة تسليط الضوء مرة أخرى لجعل وظيفة التكامل نشطة، ثم نقل إلى الذروة المقبلة.
          1. تعيين جزءا لا يتجزأ من 100 عن طريق القيام الحق في الضغط على قيمة لا يتجزأ الذي يظهر تحت إشارة وحدد "معايرة الحالي جزءا لا يتجزأ". إدخال قيمة "100" في مربع وانقر على "العودة وإنقاذ" للخروج من وضع التكامل.
        2. عند استخدام BHT كمعيار داخلي، ودمج الذروة في δ 151.45 وتعيين يساوي جزءا لا يتجزأ منوmillimoles من BHT في 0.5 مل من محلول المخزون.
        3. دمج قمم الفائدة تمتد 5 هرتز من كل جانب من الذروة (راجع الخطوة 2.3.2.3.1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم جمع 1 H و 13 الأطياف C NMR لمكملات زيت السمك المتوفرة تجاريا باستخدام أداتين NMR. على ميغاهيرتز 850 و مطياف 500 ميغاهيرتز. هذه الأطياف يمكن استخدامها لتحديد كمية مكونات زيت السمك، مثل حمض الدوكوساهيكسانويك (DHA) وحمض الدهني (EPA)، ومركبات أخرى مثل جيدا مثل ن -1 سلاسل الأسيل ومؤشر مهم من الناحية التغذوية مثل ن -6 / ن -3 النسبة. الكمي لا يمكن أن يؤديها حتى من دون استخدام معيار داخلي، ومع ذلك، يجب التعبير عن النتائج الكمية كنسبة مئوية المولي النسبية. عندما تحتاج البيانات المراد التعبير عنها في القيم المطلقة (ملغ / غ)، مطلوب معيار الداخلية. النتائج التي حصل عليها NMR هي تكرار للغاية مع الانحرافات المعيارية النسبية (RSD) تتراوح ما بين 0.3٪ إلى 2٪ لتحليل 13 C NMR ومن 0.5٪ إلى 2.5٪ للتحليل 1 H NMR، اعتمادا على ر انه الدهون. وكثيرا ما لاحظ RSD أعلى قليلا عن 1 H NMR لأطياف بروتون تميل إلى أن تكون مكتظة، مما يؤثر على دقة التحليل، وخاصة بالنسبة الأصداء التي لديها إشارة إلى نسبة الضوضاء أقل (S / N). وعثر على اتفاق جيد للغاية بين ميغاهيرتز 850 والصك 500 ميغاهيرتز مع RSDS تتراوح بين 1٪ إلى 4٪. وقد لوحظت RSDS عالية نسبيا (ما يصل إلى 8٪) عند مقارنة النتائج التي حصل عليها 1 H و 13 C، وخاصة بالنسبة للمركبات التي تظهر في تركيزات منخفضة مثل ن -1 سلاسل الأسيل. NMR الطيفي تم التحقق من صحة سابقا كأداة لتحليل الدهون، بما في ذلك تحديد بعض مكونات زيت السمك. وأظهرت النتائج أنه في اتفاق جيد مع الطرق التقليدية، مثل GC 17 و 18.

تحليل 1 H NMR

"xfig"> الشكل 1 يقارن أطياف 1 H NMR حصلت على (A) على ميغاهيرتز 850 و (B) أداة 500 ميغاهيرتز. يتميز الطيف 850 ميغاهرتز من دقة أعلى، إلا أن المكونات الرئيسية لزيت السمك بما في ذلك DHA، EPA، ون -6 / ن -3 يمكن أيضا أن نسبة يتم تحديدها من الطيف 500 ميغاهرتز. وتظهر إشارات-H NMR 1 من الأحماض الدهنية زيت السمك التي يمكن استخدامها لأغراض الكميات في الجدول 1، في حين يمكن العثور على احالة NMR كاملة من الطيف 1 H NMR من زيت السمك في أماكن أخرى 19.

أعطى 1 H NMR بيانات موثوق بها لتقدير حجم المبلغ الإجمالي للن -3، ن -6، DHA، والأحماض الدهنية غير المشبعة، ن -1 سلاسل الأسيل، والأحماض الدهنية المشبعة (SFA). لتحليل 1 H NMR، مطلوب استخدام علاقات مناسبة لأن معظم لياليignals تنتمي إلى مجموعة من البروتونات التي هي مشتركة بين الأحماض الدهنية المختلفة والدهون. لهذا السبب، في معظم الحالات تركيز الأحماض الدهنية في زيت السمك يمكن تحديد إلا من خلال الجمع بين مختلف 1 إشارات H NMR، التي تأسست في العلاقات المناسبة. وبالإضافة إلى ذلك، تحتوي هذه المعادلات الحسابية معاملات أن تطبيع عدد مختلف من البروتونات المرتبطة بكل مجموعة. عندما يتم استخدام معيار داخلي ينبغي النظر في المعادلة التالية: C = I / I IS × N IS / N × A × MW / (1) م، حيث C هو تركيز الحليلة في ملغم / غم من زيت السمك، I هو جزء لا يتجزأ من الصدى الذي يعزى بشكل فريد لالدهون من الاهتمام، وأنا هو هو مجال إشارة بروتون الذي ينتمي فريد لمعيار داخلي، N هو عدد البروتونات في المجموعة الوظيفية التي تم تحليلها،N IS هو عدد البروتونات المعيار الداخلي التي تستخدم للتحليل، A هو millimoles من معيار الداخلية، MW هو الوزن الجزيئي للحامض الدهني (معبرا عنها استرات الميثيل)، و m هو مقدار من زيت السمك وأعرب في ز.

مثال 1، DHA: يتم تحديد نسبة DHA من المعادلة C DHA = ¾ I DHA / S، حيث كنت DHA هو جزء لا يتجزأ من الإشارة في δ 2.39 الذي ينتمي إلى H α و H البروتونات β من DHA، وS هو مجموع التكاملات من البروتونات الميثيل من SFA، ن -6، ن -9، ن -3 والأحماض الدهنية غير المشبعة بالإضافة إلى التكامل من قمم سلاسل ن -1 أسيل في δ 4.98، 5.05 δ δ و5.81. ولا يتجزأ I DHA هو نورماlized بضرب من 3/4 لأنه يتوافق مع أربعة بروتونات، في حين أن S لا يتجزأ يتوافق مع ثلاثة البروتونات. 1 H NMR غير قادرة على إعطاء معلومات حول توزيع الموضعية من الأحماض الدهنية على العمود الفقري الجلسرين، وبالتالي يمكن أن تستخدم إلا لتقدير حجم المبلغ الإجمالي من الأحماض الدهنية. أظهر تحليل H NMR 1 من ملحق زيت السمك مغلفة أنه يتكون من 10.5٪ من DHA. تم العثور على تركيز DHA في نفس العينة باستخدام BHT أن يكون 105.23 ملغ / غ. هذه القيم هي قريبة جدا من القيم التي تم الحصول عليها مع 13 C NMR (انظر المثال 2 لمدة 13 تحليل C).

مثال 2، ن -1 أسيل سلاسل: يتم إعطاء تركيز سلاسل ن -1 أسيل كتبها العلاقة C ن 1 = 3 I ن 1 / S، حيث أنا ن-1 هو جزء لا يتجزأ من الإشارة في δ 5.818. هذهإشارة يتوافق مع بروتون واحد، وبالتالي يحتاج إلى تطبيع بضرب ثلاثة. عند استخدام BHT، ن -1 يتم تحديد سلاسل الأسيل بالمعادلة C ن 1 = 2 I ن 1 / I BHT. نتائج لا يمكن التعبير عنها في ملغ / ز لأن MW ن -1 سلاسل الأسيل غير معروف.

مثال 3، ن -6 / ن -3 نسبة: يمكن حساب هذا المؤشر المهم من نسبة كثافة تطبيع من صدى في δ 2.77، والتي تتطابق مع البروتونات مكرر allylic ن -6 سلاسل الأسيل (اثنين من البروتونات) خلال الثلاثي في δ 0.97 ينتمي إلى الأحماض ن -3 الدهنية ويتوافق مع ثلاثة البروتونات. العلاقة هي C ن 6 / C ن 3 = 3/2 I A / I B، حيث I A و B I هي تكاملات الإشاراتفي δ δ 2.77 و 0.97 على التوالي. ن -6 يتم تحديد الأحماض الدهنية من العلاقة C ن 6 = 3 / 2I ن 6 / S، حيث أنا ن-6 هو جزء لا يتجزأ من البروتونات مكرر allylic في δ 2.77.

مثال 4، والأحماض الدهنية غير المشبعة: الأحماض الدهنية غير المشبعة يمكن حسابها من المعادلة C العابرة = I عبر / S، حيث كنت العابرة هي جزء لا يتجزأ من الإشارة في δ 0.91. وتضمنت العينة الحالية 3.07٪ من الأحماض الدهنية غير المشبعة، على النحو الذي يحدده 1 H NMR باستخدام أداة 850 ميغاهيرتز. تم العثور على نفس العينة التي تم تحليلها في أداة 500 ميغاهيرتز لاحتواء 3.03٪ من الأحماض الدهنية غير المشبعة.

مثال 5، والأحماض الدهنية المشبعة (SFA): تركيز SFA يمكن أن يكون CALCULATED من المعادلة C SFA = S - C ن 3 - C ن 6 - C ن 9 - C ن 1 - C العابرة. ن -9 الأحماض الدهنية (حمض الأوليك أساسا) يمكن قياسها كميا وفقا للمعادلة C ن 9 = (3/4 س - 3/2 I ن 6) / S، حيث Q هي جزء لا يتجزأ من البروتونات allylic ن -6 ون -9 في δ 2.01. تم العثور على كمية من SFA في عينة زيت السمك المتوفرة تجاريا أن يكون 36.1٪. تم العثور على نفس العينة تحليلها مع 13 C NMR لاحتواء 33.8٪ SFA. SFA تمثل مجموعة من مختلف FA (على سبيل المثال دهني والنخيلي) مع MW مختلفة، وبالتالي تركيزهم إذا لا يمكن التعبير عنها زيت السمك في ملغ / غ.

مثال 6، مجموع الجامدة: مبلغ إجمالي الجامدة (مجاني وتجمعت) يمكن تحديده من خلال سيجنال من البروتونات الميثيل في الكربون 18 الذي يظهر في δ 0.68، وذلك باستخدام معادلة C = I STE / S. تم العثور على نسبة المولي من إجمالي الجامدة في عينة زيت السمك المتوفرة تجاريا لتكون بنسبة 0.32٪. ويمكن أيضا أن تستخدم BHT لتحديد تركيز المطلق للالجامدة. والجامدة الرئيسية في زيت السمك والكوليسترول وفيتامين D (أو ما السلائف 7 ديهيدروكوليستيرول) وغالبا ما المضافة في الملاحق. هذه المركبات لديها MW مشابهة جدا. ولذلك، النتائج يمكن التعبير عنها في ملغ / غ وتحسب وفقا للمعادلة C = 2/3 I STE / I هو × STE MW / م، حيث MW STE هو الكتلة الجزيئية (386) من الكوليسترول في الدم، والذي يشكل الغالبية العظمى من جزء sterolic في زيت السمك (20). وكانت كمية الجامدة في نفس العينة باستخدام BHT 3.8 ملغ / غرام من زيت السمك. تحديد الفرد من الكولسترول (δ (δ 0.678) هو ممكن على صك 850 ميغاهيرتز بعد تطبيق وظيفة نافذة للقرار تعزيز.

تحليل 13 C NMR

ويوضح الشكل 2 أطياف 13 C NMR حصلت على (A) على ميغاهيرتز 850 و (B) أداة 500 ميغاهيرتز في المنطقة الكربون الكربونيل. أطياف متشابهان جدا ويمكن أن توفر نفس الكمية من المعلومات. وNMR الطيف 13 C يمكن أن تستخدم بنجاح لتحليل الأحماض الدهنية إضافية مثل stearidonic (SDA) وeicosatetraenoic الأحماض (ETA)، مطلوبة ولكن المزيد من مسح لعينات التي هذه الأحماض هي في تركيزات أقل. تتميز أطياف 13 C قبل ارتفاع القرار بسبب العرض الطيفي كبير وتطبيق فصل النطاق العريض، والتييلغي تأثير اقتران العددية وتنتج فانلات. لهذا السبب، محدودة هناك تداخل حتى عند استخدام أداة 500 ميغاهيرتز.

وNMR الطيف 13 C هو أكثر إفادة بكثير بالمقارنة مع H NMR الطيف (1) ويمكن أن توفر البيانات الكمية أكثر شمولا لأنه لوحظ أقل تداخل إشارة (الشكلان 1 و 2). المنطقة الطيفية الأكثر فائدة من الطيف 13 C هي المنطقة الكربون الكربونيل لأنه يوفر معلومات كمية عن عدد كبير من الأحماض الدهنية، وكذلك لتوزيع الموضعية على الهيكل العظمي الجلسرين 19 و 21 و 22. المنطقة مجموعة الميثيل من δ δ 14.5 إلى 13.5 يمكن استخدامها لتحديد سريع من المبلغ الإجمالي للن -3، ن -6، ن -9 ومشبعة الدهنيةالأحماض (SFA)، وكذلك الأحماض الدهنية غير المشبعة. ومع ذلك، في NMR مطياف 500 ميغاهيرتز، هناك تداخل جزئي للن -6 ون -9 الأحماض الدهنية المشبعة (SFA). تطبيق وظيفة نافذة للقرار تعزيز قد يحل هذه المشكلة على الرغم من أن الصك 850 ميغاهرتز لا تزال تعتبر الخيار الأكثر جدارة بالثقة. ويمكن استخدام المنطقة olefinic من الطيف الكربون لالمبلغ الإجمالي للن -3 ون -1 سلاسل الأسيل وكذلك لتحديد الأحماض الدهنية الفردية مثل DHA، EPA، وحمض الأراكيدونيك (AA)، اللينولينيك (سطر) ن -3، وحمض الأوليك (OL) (انظر الجدول 2). 13 C NMR يمكن تطبيقها أيضا لتوصيف زيت السمك من مصادر أخرى، مثل المكملات الغذائية الغنية في استرات إيثيل (EE) باستخدام إشارات الكربون في δ 14.31 (الميثيل) وδ 60.20 (الميثيلين).

لتحليل الكربون، يمكن أن الأحماض الدهنية يكون determINED بقسمة جزءا لا يتجزأ من الأليفاتية، olefinic، وإشارات الكربونيل المناسبة مع تكامل التام من كل السلاسل أسيل، وفقا للعلاقة C العام = I / S (2)، حيث C هو تركيز الحليلة في الخلد (٪ )، أنا هو جزء لا يتجزأ من الصدى الذي يعزى بشكل فريد لالدهون من الفائدة، وS هو جزء لا يتجزأ الكلي للإشارة (ق) التي تمثل محتوى الدهن الكلي للعينة. مجموع S لا يتجزأ من سلاسل أسيل يمكن تحديده من خلال دمج المنطقة من δ δ 175 إلى 171 ويتم تعيين إلى 100.

يتم إجراء تقدير الأحماض الدهنية في ملغم / غم من زيت السمك باستخدام معيار الداخلية على أساس العلاقة التالية: C = I / I IS × A × MW / م (3)، حيث C هو تركيز الحليلة في ملغ / زمن زيت السمك، وأنا هو جزء لا يتجزأ من الصدى الذي يعزى بشكل فريد لالدهون من الفائدة، I IS هو مجال إشارة الكربون الذي ينتمي فريد لمعيار داخلي، A هو millimoles من معيار الداخلية، MW هو الجزيئية وزن مجمع الفائدة (للأحماض الدهنية التي أعرب عنها في استرات الميثيل)، و m هو مقدار من زيت السمك في ز. وتظهر إشارات C-NMR 13 من الأحماض الدهنية زيت السمك التي يمكن استخدامها لأغراض الكميات في الجدول 2، في حين يمكن العثور على احالة NMR الكامل لل13 C NMR الطيف مكان آخر (19).

مثال 1، وكالة حماية البيئة في موقف -2 SN: يتم احتساب مبلغ (٪) من وكالة حماية البيئة على موقف التعطيل -2 بقسمة جزءا لا يتجزأ من الإشارة في δ 172.56 كتبها S. كمية EPA في موقف التعطيل -2 في التعاونmmercially تم العثور على عينة المتاحة لتكون 3.4٪ باستخدام أداة 850 ميغاهيرتز. باستخدام نفس مطياف وBHT كمعيار داخلي، وكمية EPA في موقف التعطيل -2 أعرب في ملغم / غم من زيت السمك هو 29.73 ملغ / غ. تم العثور على نفس العينة التي تم تحليلها في أداة 500 ميغاهيرتز لاحتواء 3.6٪ أو 31.39 ملغم / غم من وكالة حماية البيئة في التعطيل -2 الموقف. نتائج مماثلة يمكن الحصول عليها عند حساب نسب الجزيئية النسبية من وكالة حماية البيئة في التعطيل -2 باستخدام الطيف تنفصل تماما. وذلك لأن الكربون الكربونيل من EPA يتأثر فصل البروتونات إلى نفس درجة لا تذكر مثل الكربون الكربونيل الأخرى، والتي تستخدم كمرجع. ومع ذلك، لوحظ انحرافات كبيرة عند استخدام BHT، لأن الكربون من BHT في δ 151.45، والذي يستخدم لتقدير، يتلقى تعزيز NOE مختلفة بالمقارنة مع الكربون الكربونيل من الأحماض الدهنية. لهذا السبب، ينبغي تجنب الطيف تنفصل تماما عند استخدام المعايير الداخلية أو دمج جarbons مع مولتيبليكيتييس مختلفة.

مثال 2، المبلغ الإجمالي للDHA: يتم احتساب المبلغ الإجمالي (٪) من DHA ببساطة عن طريق إضافة كميات من DHA في التعطيل -1،3 وموقف -2 SN على النحو الذي تحدده إشارات NMR في δ δ 172.48 و172.08 على التوالي. نفس العينة تحليلها مع 1 H NMR (انظر المثال 1 من 1 تحليل H) تم العثور على احتواء 10.3٪ DHA وفقا لتحليل 13 C NMR. ويمكن أيضا أن أعرب كمية من DHA في ملغم / ز باستخدام معيار الداخلي ومعادلة 3. كان المبلغ الإجمالي للDHA 103.25 ملغ / غ.

مثال 3، بمبلغ إجمالي قدره SDA: يتم تحديد المبلغ الإجمالي (٪) من SDA بإضافة التكاملات الإشارات في δ δ 172.99 و172.60 التي تنتمي إلى كربون الكربونيل من SDA على موقف التعطيل -1،3 والتعطيل -2، على التوالي، ثم قسمة مجموع كتبها S. تم العثور على عينة تم تحليلها لاحتواء 3.93٪ SDA أو 34.54 ملغ / غ.

مثال 4، ن -3 سطر: ن -3 سطر (٪) يمكن تحديد بقسمة جزءا لا يتجزأ من الإشارة في δ 131.85 مع S لا يتجزأ. وكانت نسبة المولي ن -3 سطر في عينة زيت السمك تحليلها 0.7٪. تم حساب تركيز المطلق باستخدام BHT كما 5،5 ملغ / غ.

يتم تحديد نسبة المولي من الأحماض الدهنية غير المشبعة بقسمة جزءا لا يتجزأ من الإشارة في δ 13.80 مع S: مثال 5، والأحماض الدهنية غير المشبعة. تم تحليل تحليل نفس العينة التي تم تحليلها مع 1 H NMR ووجد أن 3.07٪ من عبر اتحاد كرة القدم، وأيضا مع 13 C NMR وعثر على محتواه من الأحماض الدهنية غير المشبعة لتكون 3.42٪. تيكان 13 C NMR تحليل لنفس العينة على صك 500 ميغاهيرتز أظهرت المحتوى 3.64٪ من الأحماض الدهنية غير المشبعة. مبلغ عبر الاتحاد الانجليزي في مليمول / غرام من زيت السمك يمكن تحديد باستخدام BHT كمعيار داخلي ومعادلة C = I / I IS × A / م، ولكن النتائج لا يمكن التعبير عنها في ملغ / ز لأن الذروة في δ 13.80 يتوافق مع مختلف الأحماض الدهنية غير المشبعة، وخاصة المشبعة DHA و EPA المتحولة، مع MW مختلفة.

مثال 6، EE: يتم حساب تركيز EE في عينة زيت السمك بقسمة جزءا لا يتجزأ من المنطقة الطيفية من δ δ 60.50 إلى 60.00، والتي تتطابق مع الكربون الميثيلين من EE من مختلف الأحماض الدهنية، مع S. وأظهر تحليل عينة زيت إي فيش أنه يتألف من 100٪ EE. وتجدر الإشارة إلى أنه في عينات EE، EPA كاليفورنيان تحسب إما عن طريق ذروة الكربونيل في δ 173.60 أو عن طريق الكربون الميثيلين EE في δ 60.20، في حين يمكن أن تحسب DHA باستخدام إشارة في δ 60.31 و / أو إشارة في δ 173.09.

ويمكن الاطلاع على قائمة كاملة من الإشارات التشخيصية التي يمكن استخدامها لأغراض القياس الكمي مع 13 C وتحليل NMR 1 H في الجدولين 1 و 2 على التوالي، في حين يمكن العثور على وصف تفصيلي للمعادلات التي يمكن استخدامها لهذا التحليل في أماكن أخرى 19.

NMR بالإضافة إلى ذلك يمكن تطبيقها لتقييم حالة أكسدة مكملات زيت السمك. الشكل 3 يقارن 1 H NMR الأطياف من عينة زيت السمك تحت شرطين الأكسدة. التعرض للتدفئة والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)ضوء. أكسدة الدهون هي عملية معقدة، وتكوين نواتج الأكسدة يعتمد على ظروف الأكسدة. المنتجات الرئيسية هي الأكسدة hydroperoxides (δ 8،0-8،8)، مترافق dienes hydroperoxides (δ 5،4-6،7)، والألدهيدات (δ 9.0- 10).

شكل 1
الشكل (1). تحليل 1 H NMR. 850.23 (A) و500.20 ميغاهيرتز (B) 1 H-NMR الطيف ملحق زيت السمك في CDCl 3 الحل. وتظهر إشارات NMR من EPA و DHA التي يمكن استخدامها لتصميمهم. الذروة في δ 0.97 يمكن أن تستخدم لتحديد المبلغ الإجمالي للأحماض ن -3 الدهنية. يتم اقتصاص المغلف في δ 1،39-1،20، كما أنه ينتمي إلى البروتونات الميثيلين من كل سلسلة الدهنيةالصورة ولا يمكن استخدامها لأي أغراض تحديد الهوية أو الكمي. يتميز NMR الطيف 1 H قبل العرض الطيفي الأضيق (SW) مقارنة مع 13 C NMR الطيف وبالتالي من دقة أقل الطيفي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل 13 C NMR. 213.81 (A) و125.77 ميغاهيرتز (B) 13 C-NMR الطيف ملحق زيت السمك في CDCl 3 الحل في المنطقة الكربونيل الكربون. وتظهر إشارات NMR من EPA و DHA على التعطيل -1،3 والتعطيل -2 الموقف. هذه الإشارات يمكن استخدامها لتحديد كمية EPA و DHA. على الرغم من أن جمعية مهندسي البترولCTRA سجلت عند 213.81 ميغاهيرتز تتميز بدقة أعلى والحساسية، ويمكن أيضا أطياف 125.77 ميغاهيرتز أن تستخدم لتحديد المركبات الرئيسية. تطبيق فصل في C NMR تجربة 13 يلغي تأثير اقتران العددية بين نوى الكربون والهيدروجين وبالتالي تظهر إشارات كما فانلات مما يجعل تحليل أسهل بالمقارنة مع الطيف 1 H NMR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3). أكسدة زيت السمك. وNMR الطيف 1 H من زيت السمك أكسدة يعتمد على الظروف الأكسدة. الأصداء التي تعزى إلى hydroperoxides (δ 8،0-8،8)، جوترد onjugated dienes hydroperoxides (δ 5،4-6،7)، والألدهيدات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جزء في المليون δ بروتون مركب
0.677 CH 3 (18) كولسترول
0.678 CH 3 (18) 7-ديهيدروكوليستيرول
0.88 CH 2 CH 3 (ر)، J ω1، ω2 = 7.27 هرتز ن -9، SFA سلاسل أسيل
0.883 CH 2 CH 3 (ر)، J ω1، ω2 = 7.08 هرتز ن -6 سلاسل أسيل
0.911 CH 2 CH 3 (ر)، J ω(1)؛، ω2 = 7.65 هرتز سلاسل أسيل العابرة
0.973 CH 2 CH 3 (ر)، J ω1، ω2 = 7.63 هرتز ن -3 سلاسل أسيل
1.25 CH 2 CH 3 (ر)، J = 7.20 هرتز استرات إيثيل
1.697 OCOCH2CH 2 (ر)، J H α، Η β = هرتز EPA سلسلة أسيل
2.391 OCOCH 2 CH 2 (ر) DHA سلسلة أسيل
2.772 CH = CHCH 2 CH = CH ن -6 سلاسل أسيل
2.81 CH = CHCH 2 CH = CH ن -3 سلاسل أسيل
3.593 3'a-CH 2 OCO الجلسرين 1-MAG
3.722 3'a، 3217؛ ب-CH 2 OCO (ر) الجلسرين من 1،2-DAG
4.073 2'-CHOH (ر) الجلسرين من 1،3-DAG
4.121 CH 2 CH 3 multiplet استرات إيثيل
4.173 1'b، 3'b-CH 2 OCO (اليوم) الجلسرين من 1،3-DAG
4.238 1'a-CH 2 OCO (اليوم) الجلسرين من 1،2-DAG
4.329 1'b-CH 2 OCO (اليوم) الجلسرين من 1،2-DAG
4.989 -CH = CH 2 رابطة الدول المستقلة (اليوم) ن -1 سلاسل أسيل
5.052 -CH = CH 2 العابر (اليوم) ن -1 سلاسل أسيل
5.082 2'-شوكو الجلسرين من 1،2-DAG
5.268 2 '، -CHOCO الجلسرين من TAG
5.436 CH = CHCH 2 CH = CH 2 ن -1 سلاسل أسيل
5.818 -CH = CH 2 ن -1 سلاسل أسيل

الجدول 1: تخصيص الطيف 1 H NMR. ال يتم عرض 1 التحولات الكيميائية H-NMR إشارات الأحماض الدهنية زيت السمك التي يمكن استخدامها لأغراض القياس الكمي في CDCl 3 الحل. يتم قياس التحولات الكيميائية في جزء في المليون، وتوفير المعلومات حول البيئة الكيميائية للنواة.

جزء في المليون δ كربون
173.24 C1 SFA (SN -1،3)
172.21 C1 OL، LO (SN -1،3)
C1 ETA (SN -1،3)
173.13 C1 DPA (SN -1،3)
173.03 C1 SDA (SN -1،3)
172.97 C1 EPA (SN -1،3)
172.73 C1 ETA (SN -2)
172.69 C1 DPA (SN -2)
172.61 C1 SDA (SN -2)
172.56 C1 EPA (SN -2)
172.48 C1 DHA (SN -1،3)
172.08 C1 DHA (SN -2)
136.8 Cω1، ن -1
131.85 Cω3 LN
130.37 C15 AA
130.11 C9 LN
130.06 C13 LO
129.54 C5 DHA التعطيل -2
129.47 C5 DHA التعطيل -1،3
128.94 C5 EPA
128.76 C6 EPA
128.45 C17 ن -3
127.71 ن -3
127.53 C4 DHA التعطيل -2
127.5 C4 DHA التعطيل -1،3
126.86 Cω4، كل ن -3
114.71 Cω2، ن -1
60.08 استرات DHA، الأثيل
59.96 EPA، استرات إيثيل
59،95-59،85 أخرى استرات اتحاد كرة القدم، الأثيل
33.48 C2 EPA التعطيل -2
33.32 C2 EPA التعطيل -1،3
31.44 C3 ن -1
27.05 Allylic ن -6
26.49 C4 EPA التعطيل -1،3
26.47 C4 EPA التعطيل -2
24.6 C3 EPA
24.48 C3 SDA التعطيل -1،3
24.44 C3 SDA التعطيل -2
14.27 Cω1، كل ن -3
14.13 Cω1، SFA
14.11 Cω1، OL
14.07 Cω1، LO
13.8 Cω1، عبر الاتحاد الانجليزي

الجدول 2: تخصيص الطيف 13 C NMR. التحولات الكيميائية 13 C-الرنين المغناطيسي النووي إشارات حمض الأسماك الدهنية النفط التي يمكن استخدامها لpurp الكمياتوتعرض بيئات نظام تشغيل في CDCl 3 الحل.

التكميلي الشكل S1: مقارنة بين 13 C NMR الأطياف المكتسبة باستخدام النطاق العريض القياسية فصل (A) ومعكوس بوابات فصل (B) تسلسل النبض. سجلت أطياف لنفس العينة مع نفس العدد من المسح الضوئي، ومعالجتها مع المعلمات تجهيز نفسها وتظهر مع نفس عامل المقياس. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التعديلات واستراتيجيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها

جودة الطيفية. وlinewidth للإشارة NMR، وبالتالي القرار من الطيف NMR يعتمد اعتمادا كبيرا على الملئ، وهي عملية لتعظيم الاستفادة من تجانس الحقل المغناطيسي للأرض. لتحليل روتيني، 1D الملئ غير كاف وغير مطلوب الملئ 3D، بالنظر إلى أن يتم تنفيذ ذلك من قبل أفراد NMR على أساس منتظم. إذا لم تكن هذه هي الحالة، يجب تنفيذ عملية الملئ 3D قبل التحليل باستخدام عينة تحتوي على 0.6 مل من H 2 O: D 2 O (90:10). لتحقيق أفضل وأسرع الملئ، تحتاج العينة أن تركز في المنطقة الإثارة / الكشف عن لفائف تردد الراديو (RF)، وذلك باستخدام مقياس متدرج العمق، قبل أن يتم وضعها في تجويف المغناطيس. وثمة عامل آخر يؤثر على الملئ هو الغزل العينة بمعدل دوران 10-20 هرتز. وعلى الرغم من الغزل العينة على هذا المعدل تدور يحسن الحشوات شعاعي (X، Y، XY، XZ، YZ، X 2 -Y 2، الخ)، وبشكل عام لا ينصح لتجنب ظهور العصابات جانب الغزل من الدرجة الأولى أو أعلى. ومع ذلك، عند العمل على الآلات التي تعمل في ارمو ترددات أقل من 400 ميغا هرتز، فمن المستحسن الغزل للتجارب 1D NMR.

القرار، فضلا عن حساسية، تتأثر كسب المتلقي (ر.غ) قيمة. القيم المنخفضة من الربح استقبال تقلل من حساسية، في حين أن القيم أعلى من سبب تجاوز المناسب لتحويل التناظرية إلى الرقمية (ADC). النتائج ADC تجاوز في nonsymmetrical خط الأشكال والإشارات التي لا يمكن استخدامها لأغراض الكمية لأن نقطة الأولى من تسوس التعريفي مجانا (FID) قد تفقد. في معظم الحالات، "RGA" القيادة بحساب قيمة النمو الحقيقي المناسبة. ومع ذلك، في بعض الحالات، فإن قيمة النمو الحقيقي وتحسب على أساس البرنامج هو أعلى من قيمة مثالية وهناك تشويه في الشكل Lorentzian للإشارة NMR. فيمثل هذه الحالة، يجب على المستخدم يدويا مساهمة قيمة النمو الحقيقي أصغر عن طريق كتابة "النمو الحقيقي (القيمة)" في سطر الأوامر. قيمة RG نموذجية للعينات التي تم تحليلها مع هذا البروتوكول هو 8.

في كثير من الأحيان، عند استخدام بالتبريد تبريد تحقيقات NMR مع ارتفاع الجودة عامل (Q-عامل)، وتأخير كبير (الوقت الميت)> الكامل 200US بين نبض الماضي وفترة الكشف هو مطلوب لتجنب القطع الأثرية مثل سنام حول تردد الارسال والمتداول في الأساس من الطيف. ومع ذلك، فإن مثل هذا التأخير الطويل يؤدي إلى كبير سلبي خطأ مرحلة من الدرجة الأولى، والتي يمكن أيضا إدخال المتداول خط الأساس والانخفاضات الكبيرة في جميع أنحاء قاعدة إشارات قوية. في هذه الحالات، وتدور صدى تسلسل نبض استعادة ض يمكن استخدامها لإنتاج أطياف NMR مع تحسن كبير في خطوط الأساس، وعلى الرغم من انخفاض حساسية صغيرة قد تحدث 23.

الفوسفورية. بالإضافة إلى تحليل زيت السمكعينات الغنية في الدهون الثلاثية واسترات إيثيل، NMR يمكن استخدامها لتحليل عينات زيت السمك غنية الدهون الفوسفاتية (الثابتة والمتنقلة). ومع ذلك، هناك حاجة إلى رعاية خاصة لمثل هذه العينات لالثابتة والمتنقلة المجاميع النموذج، الذي يمكن أن يسبب انخفاضا كبيرا في القرار الطيفي والحساسية. لتحليل هذه العينات، وهي مزيج من المذيبات من كلوروفورم بالديوتيريوم: الميثانول (CDCl 3: CD 3 OD) في نسبة 70:30 مطلوب للحصول على الأطياف ذات جودة عالية.

معيار الداخلية. وقد تم اختيار BHT كمعيار داخلي في هذه الدراسة لأنه هو جزيء متماثل إلى حد كبير مع بسيطة 1 H و 13 C NMR الأطياف وأيا من مستويات الذروة التي بلغتها تتداخل مع تلك المكونات زيت السمك. BHT لها إشارة في الطيف 1 H NMR، الذي يظهر على شكل القميص في δ 6.97 وينتمي إلى اثنين من البروتونات أي ما يعادل العطرية (الفقرة - الموقف فيما يتعلق مجموعة OH) وإشارة فيδ 151.45 في 13 C NMR الطيف الذي ينتمي إلى الكربون رباعي العطرية تحمل مجموعة أوه. كل من هذه الإشارات لديها أي تداخل مع أي من المكونات في زيت السمك، وبالتالي يمكن أن تستخدم لأغراض القياس الكمي. ويمكن أيضا مركبات أخرى مثل 1،2،4،5-tetrachloro-3-نترات البنزين (TCNB) أو كلوريد الإثيلين أن تستخدم المعايير الداخلية بديلة، ومع ذلك، فهي تتميز أطول T 1 القيم.

القيود المفروضة على تقنية

ويتحقق الكمي من مختلف الأحماض الدهنية والدهون في مكملات زيت السمك خلال دمج إشارات الرنين المغناطيسي النووي التشخيصية المناسبة في أطياف 1D. وينبغي لهذه الإشارات تنتمي فقط إلى مكون عينة محددة، ويجب أن يكون أي تدخل مع إشارات من المركبات الأخرى. قد تكون هذه مشكلة بالنسبة 1 تحليل H NMR منذ يتميز الطيف 1 H NMR بموجب قرار منخفضة بسبب قصيرة المدى الكيماالتحولات mical. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود اقتران العددية (J) وتنتج multiplets ويجعل التحليل أكثر تعقيدا. على سبيل المثال، استرات إيثيل (EE) يمكن كميا باستخدام 1 H NMR من قبل الثلاثي المميز (J = 7.20 هرتز) لمجموعة الميثيل في δ 1.25 وmultiplet في δ 4.12، الذي ينتمي إلى البروتونات الميثيلين مجموعة استر. ومع ذلك، عند استخدام الأدوات NMR العاملة في ارمو ترددات أقل من 850 ميغا هرتز، وينبغي تجنب تحليل EE باستخدام 1 H NMR بسبب تداخل جزئي للذروة في δ 4.12 مع ذروة في δ 4.14 من TGS، وتداخل إشارة في δ 1.25 مع إشارة واسعة من البروتونات الميثيلين الأليفاتية في δ 1،23-1،35. وقد لوحظت انحرافات كبيرة أيضا بين 1 H و 13 C تحليل وكالة حماية البيئة في بعض العينات، كان 13 C NMR أقرب إلى تكوين المسمى تقدمها رانه المصنعة. وربما هذا هو نتيجة لتداخل الإشارات في δ 1.69، والذي يستخدم لتحليل EPA، مع إشارات من المركبات الأخرى التي تظهر في بعض أنواع مكملات زيت السمك. أخطاء إضافية في quantifications يمكن أن تنشأ عند استخدام معيار داخلي بسبب نقاء غير واثقين من المعيار الداخلي ومن الأخطاء في وزنها.

ويمكن التعبير عن التحليل التركيبي في تركيزات المولي النسبية دون استخدام معيار داخلي. إذا لا بد من التعبير عنها في تركيزات المطلقة، على سبيل المثال كما مليغرام من الأحماض الدهنية للغرام الواحد من النفط (ملغ / غ) النتائج، مطلوب استخدام معيار داخلي. ومع ذلك، في الحالات التي تكون فيها إشارة NMR الفائدة تعود إلى مركبات متعددة مع الأوزان الجزيئية مختلفة، فإن النتائج لا يمكن التعبير عنها ملغم / غم حتى عند استخدام معيار الداخلية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام معيار الداخلية عادة ما يزيد من طول التحليل لأن الصورة الداخلية الأكثر شيوعا tandards، مثل BHT، هي عبارة عن جزيئات صغيرة مع التماثل الجزيئي عالية، مما يؤدي في أوقات الاسترخاء طويلة. منذ ذلك الوقت تم تعيين تكرار (التأخير بين النبضات + اكتساب الوقت) وفقا لأطول وقت الاسترخاء T 1 في العينة، فإن استخدام معيار داخلي تزيد مدة التجارب التي يتطلبها تأخير أطول بين النبضات. وهذا عامل مهم بشكل خاص لمدة 13 تحليل C NMR بسبب طويلة بشكل استثنائي T 1 وقت الاسترخاء نوى الكربون. إضافة مركب ممغطس مثل الكروم (ACAC) 3 يمكن أن تقلل بكفاءة من وقت الاسترخاء T 1. التركيز الموصى به من الكروم (ACAC) 3 هو 0.75 ملغ / مل من محلول. ويمكن اعتبار تركيزات أعلى من الكروم (ACAC) 3 لمزيد من الخفض T 1، ومع ذلك، مطلوب الحذر لتفادي النقص في S / N بسبب توسيع خط.

ntent "> على الرغم من أن 13 C NMR يتميز قرار الطيفي أعلى بكثير بالمقارنة مع 1 H، حساسية التجربة 13 C NMR هي أقل بكثير بسبب وفرة منخفضة الطبيعية (1.1٪) ونسبة مغناطيسية دورانية منخفضة (67،26 10 6 راد ق -1 T -1) المؤرخ 13 نواة C. وبالإضافة إلى ذلك، ومرات استرخاء طويل T 1 من 13 C تزيد من طول التحليل. قد تكون هذه المشكلة عندما يكون النفط المتاحة للتحليل محدودة، لأن زيادة يجب استخدام عدد من عمليات التفحص لتحقيق إشارة إلى نسبة الضوضاء معقولة.

القيود في الحساسية وقرار من أطياف NMR تمنع تحليل العديد من المركبات الصغيرة في زيت السمك التي يمكن تحليلها مع تقنيات أخرى مثل GC. على سبيل المثال، 1 Η NMR غير قادرة على فصل الجامدة الفردية أو الأحماض الدهنية (مثل النخيلي ودهني)، في حين 13 Cليست قادرة على تحديد المركبات التي تظهر في تركيز منخفض جدا في زيت السمك مثل حمض dodecanoic والميريستيك، التي تتداخل مع إشارات من جميع الأحماض الدهنية المشبعة في δ δ 173.24 و172.82. وعلى الرغم من زيادة كمية العينة التي تم تحليلها يجعل تحليل بعض المركبات الصغيرة المجدية، الحذر مطلوب لعينات مركزة للغاية، بسبب زيادة اللزوجة الخاصة بهم. حلول لزجة جدا تحتوي على أكثر من 150 ملغ من النفط وينبغي تجنب لأن هناك انخفاضا في S / N بسبب توسيع خط الناجمة عن انخفاض الأوقات الاسترخاء تدور تدور T 2. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة تأخير أطول بين النبضات بسبب أطول T 1، وهناك العديد من القضايا في الملئ، وبالتالي في القرار.

جميع المركبات التي تم تحليلها في زيت السمك مع NMR يمكن كميا في وقت واحد في لقطة واحدة دون استخدام أي فصل أو تنقية الخطوات. وعلى NMRalysis هو سريع كما يمكن تسجيل الطيف 1 H في أقل من دقيقة واحدة، في حين أن شراء 13 C NMR يستمر 10 دقيقة. وتجدر الإشارة، مع ذلك، أن هناك عدد قليل من العوامل التي تؤثر على الوقت والحصول على البيانات. على وجه التحديد، لمدة 13 C NMR، وقت التشغيل 10 دقيقة يمكن أن يتحقق فقط من دون استخدام المعايير الداخلية، ومع استخدام تحقيقات تبريد بالتبريد، حيث يتم تبريد لفائف RF والمضخم، وبالتالي يتم التقليل من الضوضاء الحرارية. ينبغي أن يتوقع زيادة أضعاف 10-15 في الوقت تجريبي لمدة 13 تحليل C NMR عند درجة حرارة الغرفة وتستخدم (التقليدية) تحقيقات.

أهمية فيما يتعلق بأساليب الحالية

NMR الطيفي أثبت أنه أداة قوية لتحديد النوعي والكمي للتكوين مكملات زيت السمك، وبسبب rapidness لها أنه لديه القدرة على أن تطبق لفحص إنتاجية عالية من نو واسعة mber من عينات زيت السمك. NMR الطيفي هو تعريف المنهج الكمي منذ المنطقة إشارة يتناسب طرديا مع عدد من نوى أن يتسبب في إشارة. في حين يطلب من المواد الكيميائية السامة تماما لتحضير عينات NMR، وهذه الطريقة صديقة للبيئة لأنه يتم استخدام هذه كميات صغيرة من هذه المواد الكيميائية (مثل CDCl 3) بالمقارنة مع الطرق الأخرى التي تتطلب كميات كبيرة من المذيبات إلى أزل العينات. وبالإضافة إلى ذلك، NMR ديها العديد من المزايا بالمقارنة مع الطرق التحليلية الأخرى. لا معايرة مع معايير مطلوب مسبق التحليل، وإعداد العينات الحد الأدنى من دون أي فصل وتنقية الخطوات التي اعتمدت عادة، مما يجعل NMR أداة تحليلية سريعة جدا. بالإضافة إلى ذلك، 13 C NMR هي أفضل منهجية المتاحة لتحديد توزيع الموضعية من مختلف الأحماض الدهنية على هيكل عظمي الجلسرين. في حين أن الإنزيمية تم استخدامها كبديل ليست دائما موثوقة= "XREF"> 24. ولهذا الأمر أهمية خاصة لأن هناك اهتماما كبيرا في دراسة regiospecificity من مختلف الأحماض الدهنية في الأغذية، كما وجد أن هذا يؤثر على وظيفتها في غذاء الإنسان 25 و 26.

التطبيقات المستقبلية

وعلى الرغم من اتفاق بين التحليل NMR وتسمية المنتجات، فضلا عن حقيقة أن هناك بعض الدراسات التي تبين اتفاق بين GC و NMR، ونحن نعتقد أن هناك حاجة دراسات داخل المختبر أكثر صرامة وشاملة لدراسة الاتفاق بين NMR والتقليدية منهجيات لتحليل مكونات زيت السمك باستخدام عدد أكبر من العينات، منتجات زيت السمك من أصول مختلفة، والحلول القياسية المعتمدة.

سوف تطبيقها في المستقبل مهم آخر من NMR في تحليل زيت السمك أن يكون تحديد المنتجات الأكسدة. بالإضافة إلى تقريرمن المركبات الرئيسية في زيت السمك، والعديد من المنتجات الأكسدة الابتدائية والثانوية في زيت السمك، مثل الألدهيدات والبيروكسيدات، موجودة. 1 H NMR يمكن المحتمل بطلب للحصول على تقييم حالة الأكسدة في مكملات زيت السمك، في ظل ظروف الأكسدة المختلفة، كما هو مبين في الشكل (3). والتحدي الأكبر في هذا التحليل يكون التعيين NMR وتحديد المنتجات الأكسدة الفردية. والتقدم في حساسية الأجهزة NMR تسمح أيضا تحديد الجامدة الفردية باستخدام 13 C NMR. ويمكن أيضا NMR الطيفي يمكن تطبيقها لتحليل أنسجة الأسماك ككل حتى من دون أي استخراج باستخدام عالية الدقة السحر زاوية غزل (HR-MAS) NMR.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

اثنين من أهم الخطوات الحاسمة التي تؤثر على دقة أطياف الرنين المغناطيسي النووي الكمية تنطوي على اختيار نبض 90 درجة واستخدام تأخير بين بوlses ≥ 5 × T 1. زاوية نبض يتناسب مع عرض النبض وهي معلمة NMR معايرة التي تعتمد على الأجهزة والعينة. A 90 درجة نبض ضروري لتحويل كامل للطولية (ض) مغنطة للمغنطة عرضية يمكن ملاحظتها (س ص). ومن المهم أن نلاحظ أنه قبل المعايرة النبض، وحققت في NMR يحتاج إلى ضبطها بشكل جيد ومطابقة. هذا وسوف تحسين نقل الطاقة RF إلى عينة، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من S / N وضمان فصل فعال. ضبط التحقيق يتأثر في الغالب من قبل ثابت العزل الكهربائي للعينة، لذلك إذا كان هناك اختلافات في التركيز بين العينات، وتكرار عملية ضبط لكل واحد. وتشمل 1D 13 C NMR التجربة على حد سواء 13 C و 1 قنوات H ضبط تلقائي جدا ومطابقة ضروري لكل من النوى.

تأخير بين النبضات أطول من 5 × T 1 يضمن تفصيل كاملأوفري من صافي مغنطة إلى قيمتها الأصلية. وإذا كان كل الأصداء في الطيف لم استرخاء تماما قبل كل نبضة، وقمعت جزئيا إشارة وهذا يؤدي إلى عدم الدقة في التكامل. T 1 القيمة هي العامل الحاسم الذي يؤثر على طول التجربة وذلك يعتمد على قوة المجال المغناطيسي، وكذلك لزوجة العينة. وبالنظر إلى أن اللزوجة بين عينات مماثلة، يجب تحديد الأوقات T 1 الاسترخاء لكل أداة فقط في بداية الدورة التحليل.

ميزة هامة أخرى للتحليل زيت السمك مع 13 C NMR هي اختيار تسلسل نبض المناسب. الطريقة الأكثر موثوقية لالكمي تحليل 13 C هو عكس بوابات فصل التجربة، حيث يتم تطبيق بروتون النطاق العريض فصل فقط خلال فترة اقتناء وبالتالي ليس هناك نقل الاستقطاب من 1 إلى 13 HC عن طريق تأثير Overhauser النووي (NOE). ومع ذلك، في حين أن التجربة NMR تنفصل تماما يمكن استخدامها لأغراض الكمية، مطلوب الحذر عند استخدام هذه التجربة لأن هناك عوامل NOE مختلفة بين ذرات الكربون مع مولتيبليكيتييس مختلفة والمقارنة بالتالي لا يتجزأ بين الميثيل، الميثيلين والميثان والكربونيل الكربون يجب تجنبها. على الرغم من هذا، عندما تعتبر الكربون الوحيدة لتعدد مماثل والبيئة الكيميائية في التحليل، وطريقة الفصل التام هو موثوق بها. وأحد الأمثلة على ذلك هو كربون الكربونيل من الأحماض الدهنية التي تم العثور عليها لعدم وجود فروق كبيرة في العوامل NOE بعد فصل 27. وبالإضافة إلى ذلك، على الكربون تحمل البروتونات، توفر تجربة تنفصل تماما حساسية أعلى بسبب المساهمات NOE على كثافة إشارة NMR. ويرد المقارنة بين أطياف المكتسبة مع تسلسل نبض اثنين في الشكل S1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل فودز للصحة ديسكفري موضوع في جامعة ولاية أوهايو، وقسم علوم وتكنولوجيا الأغذية في جامعة ولاية أوهايو. فإن الكتاب أود أن أشكر منشأة NMR في جامعة ولاية أوهايو ومرفق NMR في جامعة ولاية بنسلفانيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simopoulos, A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56 (8), 365-379 (2002).
  2. Goodnight, S. H. Jr, Harris, W. S., Connor, W. E. The effects of dietary omega 3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study. Blood. 58 (5), 880-885 (1981).
  3. Harper, C., Jacobsen, T. Usefulness of omega-3 fatty acids and the prevention of coronary heart disease. Am. J. Cardiol. 96 (11), 1521-1529 (2005).
  4. Kremer, J. M., et al. Effects of high-dose fish oil on rheumatoid arthritis after stopping nonsteroidal antiinflammatory drugs. Clinical and immune correlates. Arthritis and Rheumatol. 38 (8), 1107-1114 (1995).
  5. Malasanos, T., Stackpoole, P. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus. Diabetes Care. 14, 1160-1179 (1991).
  6. Han, Y., Wen, Q., Chen, Z., Li, P. Review of Methods Used for Microalgal Lipid-Content Analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
  7. Guillén, M., Ruiz, A. 1H nuclear magnetic resonance as a fast tool for determining the composition of acyl chains in acylglycerol mixtures. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 502-507 (2003).
  8. Sacchi, R., Medina, I., Aubourg, S. P., Addeo, F., Paolillo, L. Proton nuclear magnetic resonance rapid and structure specific determination of ω-3 polyunsaturated fatty acids in fish lipids. J. Am Oil Chem Soc. 70, 225-228 (1993).
  9. Igarashi, T., Aursand, M., Hirata, Y., Gribbestad, I. S., Wada, S., Nonaka, M. Nondestructive quantitative acid and n-3 fatty acids in fish oils by high-resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 737-748 (2000).
  10. Plans, M., Wenstrup, M., Saona, L. Application of Infrared Spectroscopy for Characterization Dietary Omega-3 Oil Supplements. J. Am. Oil Chem. Soc. 92, 957-966 (2015).
  11. Jian-hua, C. I. A. Near-infrared Spectrum Detection of Fish Oil DHA Content Based on Empirical Mode Decomposition and Independent Component Analysis. J Food Nutr Res. 2 (2), 62-68 (2014).
  12. Millen, A. E., Dodd, K. W., Subar, A. F. Use of vitamin, mineral, nonvitamin, and nonmineral supplements in the United States: The 1987, 1992, and 2000 National Health Interview Survey results. J. of Am. Diet Assoc. 104 (6), 942-950 (2004).
  13. Dwyer, J. T., et al. Progress in developing analytical and label-based dietary supplement databases at the NIH office of dietary supplements. J. Food Compos. Anal. 21, S83-S93 (2008).
  14. Monakhova, Y. B., Ruge, I., Kuballa, T., Lerch, C., Lachenmeier, D. W. Rapid determination of coenzyme Q10 in food supplements using 1H NMR spectroscopy. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 83 (1), 67-72 (2013).
  15. Monakhova, Y. B., et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the internet. Drug Test. Anal. 5 (6), 400-411 (2013).
  16. Berger, S., Braun, S. 200 and more NMR experiments: a practical course. , Wiley-VCH. Weinheim. (2004).
  17. Knothe, G., Kenar, J. A. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMRspectroscopy. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 106, 88-96 (2004).
  18. Sacchi, R., Medina, J. I., Aubourg, S. P., Paolillo, I. G. L., Addeo, F. Quantitative High-Resolution 13C NMR Analysis of Lipids Extracted from the White Muscle of Atlantic Tuna (Thunnus alalunga). J. Agric. Food Chem. 41 (8), 1247-1253 (1993).
  19. Dais, P., Misiak, M., Hatzakis, E. Analysis of marine dietary supplements using NMR spectroscopy. Anal. Methods. 7 (12), 5226-5238 (2015).
  20. Pickova, J., Dutta, P. C. Cholesterol Oxidation in Some Processed Fish Products. J. Anal. Oil Chem. Soc. 80 (10), 993-996 (2003).
  21. Siddiqui, N., Sim, J., Silwood, C. J. L., Toms, H., Iles, R. A., Grootveld, M. Multicomponent analysis of encapsulated marine oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR techniques. J. of Lipid Rsrch. 44 (12), 2406-2427 (2003).
  22. Sua´rez, E. R., Mugford, P. F., Rolle, A. J., Burton, I. W., Walter, J. A., Kralovec, J. A. 13C-NMR Regioisomeric Analysis of EPA and DHA in Fish Oil Derived Triacylglycerol Concentrates. J. Am. Oil Chem. Soc. 87, 1425-1433 (2010).
  23. Youlin, X. A., Moran, S., Nikonowiczband, E. P., Gao, X. Z-restored spin-echo 13C 1D spectrum of straight baseline free of hump, dip and roll. Magn. Reson. Chem. 46, 432-435 (2008).
  24. Tengku-Rozaina, T. M., Birch, E. J. Positional distribution of fatty acids on hoki and tuna oil triglycerides by pancreatic lipase and 13C NMR analysis. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 116 (3), 272-281 (2014).
  25. Berry, S. E. E. Triacylglycerol structure and interesterification of palmitic and stearic acid-rich fats:An overview and implications for cardiovascular disease. Nutr. Res. Rev. 22 (1), 3-17 (2009).
  26. Hunter, J. E. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides. Lipids. 36, 655-668 (2001).
  27. Vlahov, G. Regiospecific analysis of natural mixtures of triglycerides using quantitative 13C nuclear magnetic resonance of acyl chain carbonyl carbons. Magnetic Res. in Chem. 36, 359-362 (1998).

Tags

الكيمياء، العدد 123، زيت السمك، NMR الطيفي، أوميغا 3، EPA، DHA، والأحماض الدهنية، والمكملات الغذائية
NMR الطيفي كأداة قوية لتقييم السريع من الدهون الملف من السمك ملاحق النفط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williamson, K., Hatzakis, E. NMR… More

Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter