Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR ספקטרוסקופיה כמו כלי חזק עבור ההערכה המהירה של פרופיל השומנים של תוספי שמן דגים

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55547
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Food Science and Technology, The Ohio State University, 2Foods for Health Discovery Theme, The Ohio State University

Summary

הנה, ברזולוציה גבוהה 1 H ו- 13 C גרעיני תהודה מגנטית (NMR) ספקטרוסקופיה שימש ככלי מהיר ואמין עבור ניתוח כמותי ואיכותי של תוספי שמן דגים כמוס.

Abstract

התזונה המערבית היא עניה בחומצות n -3 שומן, ולכן צריכת תוספי שמן דגים מומלצת להגדיל את צריכת חומרים מזינות החיוניים אלה. מטרת עבודה זו היא להציג את הניתוח האיכותי וכמותי של תוספי שמן דגים כמוסים באמצעות ברזולוציה גבוהה 1 H ו- 13 ספקטרוסקופיה C NMR ניצול שני מכשירי תמ"ג שונים; מגהרץ 500 ומכשיר 850 MHz. פרוטון שני (1 H) ופחמן (13 C) NMR ספקטרה יכולים לשמש לקביעת כמותית של המרכיבים העיקריים של תוספי שמן דגים. כימות של שומני תוספי שמן דגים מושגת באמצעות שילוב של אותות התמ"ג המתאימים ספקטרום 1D הרלוונטי. תוצאות המתקבלות על ידי 1 H ו- 13 C תמ"ג הן בהסכם טוב אחד עם השני, למרות שוני רזולוציה ורגישות בין שני גרעינים ואת שני המכשירים. הצעת 1 H NMRsa יותר לניתוח מהיר לעומת 13 C תמ"ג, כמו הקשת יכולה להיות מוקלטת תוך פחות מ 1 דק ', בניגוד 13 ניתוח C NMR, שנמשך מ 10 דקות עד שעה אחת. ספקטרום 13 C התמ"ג, לעומת זאת, הוא הרבה יותר אינפורמטיבי. זה יכול לספק נתונים כמותיים על מספר גדול יותר של חומצות שומן בודדים יכולים לשמש לקביעת חלוקת מיקומית של חומצות שומן על עמוד השדרה גליצרול. גרעינים שניהם יכולים לספק מידע כמותי בלבד ניסוי אחד ללא צורך של צעדים טיהור או הפרדה. עוצמת השדה המגנטי משפיעה בעיקר ספקטרום 1 H NMR בשל ברזולוציה הנמוכה שלה בגין 13 C תמ"ג, לעומת זאת, אפילו נמוכה עלות מכשירי תמ"ג יכולים להיות מיושמים ביעילות כשיטה סטנדרטית בתעשיית המזון ומעבד איכות מלאה.

Introduction

צריכת חומצות n -3 שומן בתזונה הוכיחה להיות מועיל נגד מספר תנאים כגון הפרעות לב 1, 2, 3, 4 מחלות דלקתיות וסכרת 5. התזונה המערבית נחשבת עניית n -3 חומצות שומן ולכן צריכת תוספי שמן דגים מומלצת לשפר את n -6 / n -3 איזון בתזונה של צרכן 1. למרות העלייה האחרונה צריך תוסף שמן דגים, נותרו שאלות בנוגע לבטיחות, אותנטיות, ואיכות של חלק מהמוצרים הללו. ניתוח ההלחנה המהיר ומדויק של תוספי שמן דגים הוא חיוני כדי להעריך את האיכות כראוי של מוצרים המסחריים אלה ולהבטיח בטיחות צרכן.

השיטות הנפוצות ביותר להערכת תוספת של שמן דגיםים הם גז כרומטוגרפיה (GC) ו אינפרא אדום ספקטרוסקופיה (IR). בעוד אלה הם מאוד שיטות רגישות, הם סובלים ממספר חסרונות 6. ניתוח GC הוא זמן רב (4-8 שעות) כי הפרדת derivatization של תרכובות פרט נדרש 7 ו חמצון שומנים עלול להתרחש במהלך הניתוח 8, 9. בעוד ספקטרוסקופיה IR יכול להיות כמותי, מודל חיזוי נדרש לבנות באמצעות רגרסיה ריבועים לפחות חלקית (PLSR), אם כי יש יוצאים מן הכלל שבהם להקות IR ניתן לייחס יחיד במתחם 10. PLSR דורש ניתוח של מספר גדול של דגימות, אשר מגדיל את זמן הניתוח 11. מסיבה זו, יש עניין גובר בפיתוח מתודולוגיות אנליטיות חדשות המאפשרות ניתוח מדויק ומהיר של מספר גדול של דגימות שמן דגים. ארגונים כגון OffiCE של תוספי תזונה (ODS) במכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לבין מינהל המזון והתרופות (FDA) שיתפו פעולה עם איגוד הרשמי אנליטית כימאים (AOAC) לפתח שיטות חדשות אלה 12, 13.

אחת השיטות אנליטי המבטיחות ביותר עבור ההקרנה ואת ההערכה של מטריצות מרובות רכיבים, כגון תוספי תזונה, הוא תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה 14, 15. יש NMR ספקטרוסקופיה מספר יתרונות: היא טכניקה שאינה הרסנית וכמותיים, זה דורש מינימאלי ללא הכנת מדגם, וזה מאופיין דיוק שחזור מצוין. בנוסף, ספקטרוסקופיה NMR היא מתודולוגיה ידידותית לסביבה משום שהיא מנצלת כמויות קטנות בלבד של ממסים. החיסרון העיקרי של ספקטרוסקופיה NMR הוא רגישות נמוכה יחסית לעומת analyti אחריםשיטות קאל, לעומת זאת, התקדמות טכנולוגית אחרונה מכשור כגון שדות מגנטיים חזקים, בדיקות קריוגני של קטרים ​​שונים, עיבוד נתונים מתקדם, ואת רצפים וטכניקות דופקים תכליתיים הגבירו את הרגישות עד בטווח ננומטר. בעוד מכשור NMR הוא עלות גבוהה, את החיים הארוכים של ספקטרומטרים תמ"ג לבין יישומים הרבים של התמ"ג להקטין את העלות של הניתוח בטווח הארוך. פרוטוקול וידאו מפורט זה נועד לעזור למתרגלים חדשים בתחום להימנע ממלכודות הקשורים 1 H ו- 13 ניתוח ספקטרוסקופיות C התמ"ג של תוספי שמן דגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לדוגמא כנה NMR

הערה: שימו לב, בבקשה להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כלורופורם deuterated (CDCl 3) המשמשים להכנת מדגם הוא רעיל. השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע הכנת המדגם כולל שימוש במנדף וציוד מגן אישי (משקפי בטיחות, כפפות, חלוק מעבדה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעליים).

  1. הכנת 1 H ו- 13 דגימות C
    1. חלץ 120 μL (~ 110 מ"ג) של שמן דגים בקפסולה תזונתית באמצעות מזרק ולמקם אותו בתוך צנצנת זכוכית 4 מיליליטר. רשום את המשקל של שמן דגים.
    2. פירוק לדוגמא
      1. ממיסים כ 120 μL של שמן דגים 500 μL של CDCl 3 המכיל 0.01% של tetramethylsilane (TMS) אשר משמש כנקודת התייחסות עבור H 1 ו- 13 משמרות כימיים C.
        הערה: TMS הוא שימושd רק עבור כיול משמרת כימי (ראה 2.2.1.2.7 מספרי צעד 2.2.2.2.7), לא עבור כימות (ראה מספרי צעד 2.2.1.3 ו 2.2.2.3) למטרות.
      2. כן פתרון מניות 2,6-דוּ טרט -butyl-4-methylphenol (BHT), אם כימות לידי ביטוי מ"ג / g הוא רצוי, על ידי המסה כ 220 מ"ג של BHT ו- 15 מ"ג של הכרום (III) acetylacetonate (Cr ( acac) 3) ב 20 מ"ל של CDCl 3 המכיל 0.01% של TMS. השתמשו 500 μL של פתרון המניות לפרק 100 מ"ג (± 10 מ"ג) של שמן דגים.
    3. לאחר המסת השמן (זה לוקח כמה שניות), ולהעביר את כל הפתרון ישירות לתוך צינור NMR 5 מ"מ באיכות גבוהה ולצרף כובע. ניתוח הדגימות בתוך 24 שעות לאחר הכנת הדגימות.

2. הכנת כלי NMR

הערה: שים לב, צריכה להיזהר כי נוכחותם של שדות מגנטיים חזקים מיוצרת על ידי מכשירי תמ"ג יכולה להשפיע התקנים impl רפואייםנמלים כגון קוצבי לב פרוטזות כירורגי, כמו גם פריטים אלקטרוניים כגון כרטיסי אשראי, שעונים, וכו 'זהירות נוספת נדרשת כאשר הניתוח מבוצע באמצעות מגנטים הלא מיגון. שני מכשירים NMR שימשו לרכישת 1 H ו- 13 ספקטרום C NMR; ספקטרומטר הפועל ב 850.23 MHz ו 213.81 MHz עבור 1 H ו- 13 גרעיני C, בהתאמה, מצויד פוך הליום מקורר משולשת תהודה (TCI) בדיקת 5 מ"מ ו ספקטרומטר הפועל ב 500.20 MHz ו 125.77 MHz עבור 1 H ו- 13 C גרעינים, בהתאמה, מצויד בפס רחב שנצפה (bbo) חנקן-מקוררי חללית 5 מ"מ. כל הניסויים בוצעו על 25 ± 0.1 ºC ואת הספקטרום עובדו על ידי חבילת תוכנות עיבוד רכישה וניתוח נתוני תמ"ג רגילה (ראה רשימת חומרים).

  1. הכנה לרכישת ספקטרום NMR
    הערה: 1 H ו- 13 C NMR ספקטרהניתן לרכוש וכתוצאה מכך מבלי להסיר את המדגם מהמכשיר.
    1. הכנס את צינור NMR לתוך טורבינה טווה (ראה רשימת חומרים).
    2. מניח את הטווה ואת הצינור על גבי מד עומק מדורג ודחף בעדינות את החלק העליון של הצינור עד החלק התחתון שלה נוגע בתחתית המד.
    3. מניחים מדגם תמ"ג מקום פנוי של SampleCase. שימו לב למספר חריץ המדגם ממוקם.
    4. כדי לטעון את המדגם ב NMR, לחזור למחשב המלא סוג "SX #", כאשר # חריץ SampleCase מחזיק המדגם שלך.
    5. מחכה לסימן דאוטריום של CDCl 3 להופיע על מסך החלון המנעול. אם הוא אינו מופיע באופן אוטומטי, סוג "lockdisp". ברגע האות דאוטריום הוא גלוי, סוג "לנעול" על שורת הפקודה ובחר "CDCl 3" מהרשימה של הממס כדי לנעול המדגם באמצעות תהודה דאוטריום CDCl 3.
      הערה: דאוטריום יםignal עשוי שלא להופיע אם המשתמש קודם המשמש כממס שונה. המשתמש צריך לחכות אינדיקטור כי המדגם הוא למטה, לנעול אז.
    6. סוג "bsmsdisp" בשורת הפקודה כדי להבטיח ספינינג אינו פעיל. אם הלחצן "ספין" הוא ירוק, לחץ עליו כדי לבטל ספינינג.
    7. הקלד את הפקודה "החדשה" כדי ליצור מערך נתונים חדש. הזן שם עבור ערכת הנתונים בלשונית "NAME" ואת מספר הניסוי בלשונית "EXPNO". השתמש במספר "1" בלשונית "PROCNO". בלשונית "הניסוי", פגע "בחר" ובחר את קובץ הפרמטר "פרוטון". כתוב את שם הניסוי בלשונית "TITLE". לחץ על "אישור".
    8. הקלד "getprosol" בשורת הפקודה כדי לקבל את הפרמטרים תקן החללית התמ"ג הנוכחי ממס.
    9. חזור על שלב 2.1.7 עבור 13 C, בחירת רצף הדופק "C13IG" בלשונית "ניסוי" עבור g הפוך 1D C 13ated צימוד הניסוי.
    10. הקלד "getprosol" בשורת הפקודה כדי לקבל את הפרמטרים תקן החללית התמ"ג הנוכחי ממס.
    11. הקלד את הפקודה "עתמה" כדי לבצע כוונון אוטומטי התאמה של החללית עבור שני גרעיני פחמן פרוטון.
    12. בצעו שיפוע חד ממדי shimming להשיג בשדה מגנטי הומוגני מאוד, ולכן צורת קו אופטימלי עבור אותות התמ"ג.
      1. השתמש בהליך אוטומטי סטנדרטי עבור shimming 1D, פשוט ברצף ידי ביצוע פקודות "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim ss tuneb," ו "qu topshim דו"ח" על שורת הפקודה.
  2. אופטימיזציה פרמטר
    1. כיול דופק 90 °
      1. צור אוסף נתונים חדש עבור 1 H (ראה צעדים 2.1.7 ו 2.1.8).
      2. הקלד את הפקודה "paropt" על שורת הפקודה כדי להפעיל את תוכנית אוטומציה לכיול 90 ° pulse. משך דופק בחר, P1, כפרמטר להיות שונה.
      3. התחל עם "2" מיקרו-שניות כערך הראשונית של P1, הזן "2" מיקרו-שניות במרווחים ולבצע ניסויים "16".
      4. צור נתונים חדשים להגדיר עבור 13 C (ראה שלב 2.1.9) וחזור על התהליך עבור 13 גרעינים C (ראה צעדים 2.2.1.2 ו 2.2.1.3).
    2. T 1 מדידה שנמדדה בשיטת null 16 עבור 1 H
      הערה: שיטת null משתמשת רצף דופק התאוששות היפוך, מורכב מעקב 180 ° דופק ידי עיכוב (טאו), כדי לאפשר הרפיה לאורך ציר z ודופק סופי 90 ° יוצרת המגנטיזציה הרוחבית הנצפה.
      1. צור אוסף נתונים חדש עבור 1 H (ראה צעדים 2.1.7 ו 2.1.8).
      2. הקלד "pulprog t1ir1d" כדי לשנות את רצף הדופק כדי ניסוי היפוך-ההתאוששות.
      3. הקלד את הפקודות הבאות על commanד קו להגדיר את רוחב ספקטרלי ppm, במרכז משדר RF, מספר סריקות מספר סריקות דמה ומספר נקודות נתונים "SW 8", "3.8 o1p", "NS 2", "DS 2" ו "64K td".
      4. סוג "P1 (ערך)" והזן את ערכי משך עבור 90 ° דופק כפי שנקבע על ידי הכיול הדופק (ראה שלב 2.2.1) ולהקליד "P2 (ערך)" את הדופק 180 מעלות (בערך המשך עבור 180 ° דופק הוא המשך הדופק 90 °, כפול שתיים).
      5. קבע את עיכוב המיחזור לערך גדול מאוד, כגון 10 s ידי הקלדת "D1 10".
      6. הגדר טאו לערך קצר, כגון 10 ms, על ידי הקלדת "10ms D7" בשורת הפקודה.
      7. קבע את רווח המקלט (RG) לערך מתאים באמצעות הפקודה "RGA" עבור חישוב אוטומטי של RG.
      8. הפעל קשת ידי הקלדת הפקודה "ZG".
      9. Execute-טרנספורמציה פורייה על ידי הקלדת "EFP"בשורת הפקודה.
      10. בצע תיקון שלב אוטומטית על ידי הקלדת הפקודה "APK" בשורת הפקודה. אם התאמות שלב נוספות נדרשות להמשיך ולשפר את הספקטרום, לחצו על "כרטיסיית התהליכים," ולאחר מכן לחץ על סמל "התאם שלב" כדי להיכנס למצב תיקון פאזה.
        1. השתמש מסדר אפס (0) והפאזה מסדר הראשון (1) סמלי תיקון על ידי גרירת העכבר עד שכל האותות הם במצב קליט שלילי. ליישם ולשמור את ערכי תיקון שלב על ידי לחיצה על כפתור "חזור ו שמור" כדי לצאת ממצב תיקון פאזה.
      11. הגבר את טאו עד שכל הפסגות הן חיוביות או nulled ידי חזרה על שלבים 2.2.2.6-2.2.2.9. כדי לקבוע את ערך T 1, פשוט לחלק את הערך טאו איפה השיא הוא nulled עם LN2.
    3. T 1 מדידה שנמדדה בשיטת null 16 עבור 13 C
      1. צור נתונים חדשים להגדיר עבור 13 C (ראה שלב 2.1.9)
      2. סוג "pulprog t1irpg" כדי לשנות את רצף הדופק כדי ניסוי היפוך-ההתאוששות עבור גרעיני פחמן.
      3. הקלד את הפקודות הבאות בשורת הפקודה כדי להגדיר את רוחב ספקטרלי ppm, במרכז משדר RF, מספר סריקות, מספר סריקות דמה ומספר נקודות נתונים: "SW 200", "o1p 98" , "NS 8", "DS 2" ו "64K td".
      4. סוג "P1 (ערך)" והזן את הערכים משך עבור 90 ° הדופק כפי שנקבע על ידי כיול הדופק (ראה שלב 2.2.1) וסוג "P2 (ערך)" את הדופק 180 מעלות (בערך משך היא 90 מעלות המשך דופק, כפול שתיים).
      5. קבע את עיכוב המיחזור לערך גדול מאוד, כגון 100 s-ידי הקלדת "D1 100".
      6. טאו מוגדרת לערך קצר, כגון 100 ms-ידי הקלדת "100ms D7" בשורת הפקודה.
      7. הגדר את receivרווח er (RG) לערך המתאים באמצעות הפקודה "RGA" עבור חישוב אוטומטי של RG.
      8. הפעל קשת ידי הקלדת הפקודה "ZG".
      9. Execute-טרנספורמציה פורייה על ידי הקלדת "EFP" בשורת הפקודה.
      10. בצע תיקון שלב אוטומטי על ידי הקלדת הפקודה "APK" בשורת הפקודה. אם התאמות שלב נוספות נדרשות להמשיך ולשפר את הספקטרום, לחץ על סמל "התאם שלב" ואת סמלי תיקון פאזה עבור אפס מסדר (0) והפאזה מסדר הראשון (1) תיקון.
        1. בעוד לחיצה על סמלי תיקון אפס סדר שלב מהסדר הראשון, גרור את העכבר עד שכל האותות הם במצב קליט שלילי. ליישם ולשמור את ערכי תיקון שלב על ידי לחיצה על כפתור "חזור ו שמור" כדי לצאת ממצב תיקון פאזה.
      11. הגבר את טאו עד שכל הפסגות הן חיוביות או nulled ידי חזרה על שלבים 2.2.3.6-2.2.3.9. כדי לקבועהערך T 1, פשוט לחלק את הערך טאו איפה השיא הוא nulled עם LN2.
  3. חד ממדי (1D) NMR ספקטרה
    1. 1 ספקטרום H-NMR
      1. רכישת נתוני התמ"ג
        1. עבור ערכת הנתונים H 1 שנוצרה בשלב 2.1.7 ולהשתמש רצף הדופק תקן "דופק-לרכוש", "ZG", על ידי הקלדת "pulprog ZG" בשורת הפקודה.
        2. הקלד את הפקודות הבאות בשורת הפקודה כדי להגדיר את רוחב ספקטרלי ppm, במרכז משדר RF, מספר סריקות, מספר סריקות דמה, מספר נקודות נתונים ואת המשך הדופק עבור זווית דופקת 90 ° : "SW 8", "3.8 o1p", "NS 2", "DS 2", "64K TD" ו- "P1 (כפי שנקבע על ידי כיול הדופק)" (ראה שלב 2.2.1).
          הערה: נקודות נתונים 32K יכול לשמש מכשיר 500 MHz.
        3. גדר עיכוב הרפיה של 7 ימים עבור מכשיר 500 MHz או 9 ימים עבור מכשיר 850 MHz ידי הקלדה "7S D1" או "-9 D1", בהתאמה, בשורת הפקודה.
        4. קבע את רווח המקלט (RG) לערך מתאים באמצעות הפקודה "RGA" עבור חישוב אוטומטי של RG.
        5. הקלד "baseopt digmod" לרכוש קשת עם בסיס משופר.
        6. התחל הרכישה על ידי הקלדת דופק-לרכוש הפקודה "ZG" בשורת הפקודה.
      2. עיבוד של נתוני התמ"ג
        1. הקלד "64K סי" בשורת הפקודה כדי להחיל אפס מילוי ולהגדיר את גודל הספקטרום האמיתי 64K.
        2. גדר לקו הרחבת פרמטר 0.3 הרץ ידי הקלדה "ליברות 0.3" בשורת הפקודה כדי להחיל פונקצית שקלול (דעיכה מעריכית) עם קו הרחבת גורם של 0.3 הרץ לפני התמרה.
        3. Execute-טרנספורמציה פורייה על ידי הקלדת "EFP" בפקודהקַו.
        4. בצע תיקון שלב אוטומטי על ידי הקלדת הפקודה "APK" בשורת הפקודה. אם התאמות שלב נוספות נדרשות להמשיך ולשפר את הספקטרום, לחצו על "כרטיסיית התהליכים," ולאחר מכן לחץ על סמל "התאם שלב" ואת סמלי תיקון פאזה עבור אפס מסדר (0) ו מסדר הראשון (1) תיקון פאזה .
          1. בעוד לחיצה על סמלי תיקון אפס סדר שלב מהסדר הראשון, גרור את העכבר עד שכל האותות הם במצב קליט חיובי. ליישם ולשמור את ערכי תיקון שלב על ידי לחיצה על כפתור "חזור ו שמור" כדי לצאת ממצב תיקון פאזה.
        5. החל פונקצית פולינום הרביעי-מנת תיקון בסיס קו עם אינטגרציה על ידי הקלדת הפקודה "ABS n".
          הערה: הדבר מבטיח בסיסית ספקטרלי שטוח בעוצמה מינימלית.
        6. משמרות כימיות דווח ב- PPM מ TMS (δ = 0). לחץ על הכיול ( "Calib. Ax"סמל), ומניח את הסמן עם הקו האדום על גבי אות תמ"ג TMS (שיא קרוב 0). קליק השמאלי להקליד 'הוא 0'.
      3. ניתוח נתוני תמ"ג
        1. שלב באזור ספקטרלי מ δ 1.1 ל δ 0.6 וכן פסגות ב δ 4.98, δ 5.05 ו δ 5.81 באמצעות סמל "שלב" (תחת הלשונית "הליך") ואת גולת הכותרת ( "הגדר אזור חדש") סמל. שמאל לחץ וגרור באמצעות אינטגרלים.
          הערה: אם יש צורך להתמקד באזור, לחץ על סמל השיא להשבית עזב לחץ וגרור את העכבר כדי להתקרב לאזור. כדי לכוונן את עוצמת הסף, להשתמש בלחצן העכבר האמצעי במידת הצורך. לחץ על סמל השיא שוב לבצע את פונקצית שילוב פעילה, ולאחר מכן להעביר את השיא הבא.
          1. לנרמל את סכום אינטגרלים מעל ל 100 על ידי לחיצה ימנית על הערך האינטגרלי המופיעים תחת האות ובחר "לנרמל סכום של אינטגרלים". קלט את הערך "100" בתיבה ולחץ על "השיבה השמורה" כדי לצאת ממצב האינטגרציה.
        2. בעת השימוש BHT כסטנדרט פנימי, לשלב את השיא ב δ 6.98 ולהגדיר את שווים אינטגרלי millimoles של BHT לכל 0.5 מ"ל של פתרון המניות.
        3. שלב הפסגות של עניין (ראה שלב 2.3.1.3.1) הארכת 10 הרץ מכל צד של שיא, במידת האפשר.
        4. המשך לבצע 13 רכישת ספקטרום C-NMR ועיבוד בצורה דומה.
    2. 13 ספקטרום C-NMR
      1. רכישת נתוני התמ"ג
        1. עבור אל סט 13 C נתונים ולהשתמש רצף דופק צימוד מגודר ההפוך, "zgig" על ידי הקלדה "pulprog zgig" בשורת הפקודה.
          הערה: כדי להפעיל ניסוי פחמן עם decou בפס הרחב הסטנדרטירצף הדופק pled, סוג "pulprog zgpg" בשורת הפקודה.
        2. הקלד את הפקודות הבאות בשורת הפקודה כדי להגדיר את רוחב ספקטרלי ppm, במרכז משדר RF, מספר סריקות, מספר סריקות דמה, מספר נקודות נתונים ואת המשך הדופק עבור זווית דופקת 90 ° : "SW 200", "95 o1p", "NS 16" "ds 2", "TD 64K" ו- "P1 (כפי שנקבע על ידי כיול הדופק)" (ראה שלב 2.2.1.4).
        3. הגדר עיכוב הרפיה של 35 s עבור המכשיר 500 MHz או 45 s עבור המכשיר 850 MHz ידי הקלדת "35s D1" או "45s D1", בהתאמה, בשורת הפקודה. בעת שימוש BHT, עיכוב הרפיה צריך להיות 50 s במכשיר 500 מגהרץ ו 60 ימים במכשיר 850 MHz.
        4. קבע את רווח המקלט (RG) לערך מתאים באמצעות הפקודה "RGA" עבור חישוב אוטומטי של RG.
        5. הקלד "baseopt digmod" בשורת הפקודה לרכוש קשת wבסיס משופר ה- i.
        6. התחל הרכישה על ידי הקלדת דופק-לרכוש הפקודה "ZG" בשורת הפקודה.
      2. עיבוד של נתוני התמ"ג
        1. הקלד "64K סי" בשורת הפקודה כדי להחיל אפס מילוי ולהגדיר את גודל הספקטרום האמיתי 64K.
        2. גדר לקו הרחבת פרמטר 1.0 ההרץ ידי הקלדה "ליברות 1.0" בשורת הפקודה כדי להחיל פונקצית שקלול (דעיכה מעריכית) עם קו הרחבת גורם של 1.0 הרץ לפני התמרה.
        3. Execute-טרנספורמציה פורייה על ידי הקלדת "EFP" בשורת הפקודה.
        4. בצע תיקון שלב אוטומטי על ידי הקלדת הפקודה "APK" בשורת הפקודה. אם התאמות שלב נוספות נדרשות להמשיך ולשפר את הספקטרום, לחצו על "כרטיסיית התהליכים," ולאחר מכן לחץ על סמל "התאם שלב" ואת סמלי תיקון פאזה עבור אפס מסדר (0) והפאזה מסדר הראשון (1) תיקון .
            הערה: עבור ספקטרום פחמן רשם על תדירות לארמו של 214 MHz (מכשיר 850 MHz) תיקון השגיאות התלויות בתדירות (מהסדר הראשון) עשוי להיות מאתגרת זמן רב למשתמשים מנוסים פחות בגלל ההשפעות חוץ-תהודה הגדולות של 90 ° דופק.
        5. החל פונקצית פולינום הרביעי-מנת תיקון בסיס קו עם אינטגרציה על ידי הקלדת הפקודה "ABS n" בשורת הפקודה.
        6. משמרות כימיות דווח ב- PPM מ TMS (δ = 0). לחץ על הכיול ( "Calib. הציר") סמל, ולמקם את הסמן עם הקו האדום על גבי אות התמ"ג להיות מופנה. לחיצת והקלדת שמאל "0".
      3. ניתוח נתוני תמ"ג
        1. שלב באזור ספקטרלי מ δ 175 ל δ 171 באמצעות סמל "שלב" (תחת הלשונית "הליך") ואת גולת הכותרת ( "הגדר אזור חדש") סמל. שמאל לחץ וגרור באמצעות אינטגרלים.
          הערה: אם יש צורך להתמקד באזור, לחץ על סמל השיא להשבית עזב לחץ וגרור את העכבר כדי להתקרב לאזור. לחץ על סמל השיא שוב לבצע את פונקצית שילוב פעילה, ולאחר מכן להעביר את השיא הבא.
          1. הגדר את אינטגרלי 100 על ידי ביצוע קליק ימני על הערך האינטגרלי שמופיע תחת האות ובחר "כיול נוכחי אינטגרל". קלט את הערך "100" בתיבה ולחץ על "Return ולשמור" כדי לצאת ממצב האינטגרציה.
        2. בעת שימוש BHT כסטנדרט פנימי, לשלב את השיא ב δ 151.45 ולהגדיר את השווים אינטגרלייםmillimoles של BHT לכל 0.5 מ"ל של פתרון המניות.
        3. שלב הפסגות של עניין הארכת 5 הרץ מכל צד של השיא (ראה שלב 2.3.2.3.1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 H ו- 13 ספקטרום C NMR נאספו עבור תוספי שמן דגים זמינים מסחרית באמצעות שני מכשירים NMR; MHz 850 ו ספקטרומטר 500 MHz. ספקטרה אלה יכולים לשמש לקביעת כמותי של הרכיבים של שמן דגים, כגון חומצה docosahexaenoic (DHA) וחומצה eicosapentaenoic (EPA), כמו גם תרכובות אחרות כגון n -1 שרשראות acyl ומדד חשוב מבחינה תזונתית כגון n -6 / n -3 יחס. הכימות יכול להתבצע גם ללא שימוש תקן פנימי, לעומת זאת, תוצאות כמותיות חייבות להיות מבוטאות באחוזים טוחנים יחסיים. כאשר הנתונים צריכים לבוא לידי ביטוי בערכים מוחלטים (מ"ג / g), תקן פנימי נדרש. התוצאות שהושגו על ידי התמ"ג הם מאוד לשחזור עם סטיות תקן יחסית (RSD) החל 0.3% ל 2% עבור 13 ניתוח C NMR ומ 0.5% ל 2.5% עבור 1 ניתוח H NMR, תלוי t הוא השומנים. RSD מעט הגבוה עבור 1 H NMR הוא נצפה לעתים קרובות כי ספקטרום פרוטון נוטה להיות צפוף, אשר משפיע על הדיוק של הניתוח, במיוחד עבור תהודות שיש אות נמוכה יחס רעש (S / N). הסכם טוב מאוד נמצא בין MHz 850 ו המכשיר 500 MHz עם RSDs החל 1% עד 4%. RSDs גבוה יחסית (עד 8%) נצפו כאשר והשוואת התוצאות שהתקבלו על ידי 1 H ו- 13 C, במיוחד עבור תרכובות המופיעים בריכוזים נמוכים כגון n -1 שרשראות acyl. ספקטרוסקופיה NMR אומתה בעבר ככלי לניתוח שומנים, לרבות הקביעה כמה רכיבי שמן דגים. תוצאות המחקר הראו שזה בהסכם טוב עם שיטות מסורתיות, כגון GC 17, 18.

ניתוח 1 H NMR

"XFIG"> איור 1 משווה את ספקטרום NMR H 1 רכשה ב (א) 850 MHz ו (ב) מכשיר 500 MHz. ספקטרום 850 MHz מאופיין ברזולוציה גבוהה, אולם המרכיבים העיקריים של שמן דגים כולל DHA, EPA, ו n -6 / n -3 יחס יכול להיקבע גם מן הספקטרום 500 MHz. 1 אותות H-NMR של חומצות שומן שמן דגים שיכולים לשמש למטרות לכמת מוצג בלוח 1, ואילו משימת NMR השלמה של 1 בספקטרום H NMR של שמן דגים ניתן למצוא במקום אחר 19.

H NMR 1 נתן נתונים אמין עבור כימות הסכום הכולל של n -3, n -6, DHA, חומצות שומן טרנס, n -1 שרשראות acyl, וחומצות שומן רוויות (SFA). עבור 1 הניתוח NMR H, שימוש יחסים מתאימים נדרש משום שרוב היםignals משתייך לקבוצות של פרוטונים המשותפים חומצות שומן ושומנים שונים. מסיבה זו, ברוב מקרי ריכוז חומצות שומן בשמן דגים יכול להיקבע רק על ידי שילוב של 1 אותות H NMR שונים, המאוגדת היחסים המתאימים. בנוסף, משוואות אלה מכילים מקדמי אריתמטי כי לנרמל את מספר שונה של פרוטונים המשויכות לכל קבוצה. כאשר תקן פנימי משמש את המשוואה הבאה צריך להיחשב: C = I / I IS × N IS / N × × MW / m (1), כאשר C הוא ריכוז של אנליטי ב מ"ג / גרם של שמן דגים, I הוא נפרד תהודה כי מיוחסת באופן ייחודי את השומנים של עניין, אני IS הוא האזור של אות פרוטון ששייך באופן ייחודי ההתקן הפנימי, N הוא מספר הפרוטונים של הקבוצה הפונקציונלית שנותחה,N הוא הוא מספר הפרוטונים של ההתקן הפנימי המשמשים לניתוח, A הוא millimoles של תקן פנימי, MW הוא המשקל המולקולרי של חומצת השומן (המתבטא אסטרים מתיל), ו- m הוא הכמות של שמן דגים ביטוי g.

דוגמא 1, DHA: שיעור DHA נקבע על ידי המשוואה C DHA = ¾ שאני DHA / S, איפה אני DHA היא החומצה האינטגרלית של האות ב δ 2.39 השייכת α H ו- H β הפרוטונים של DHA, ו S הוא סכום של אינטגרלים של פרוטונים מתיל של SFA, n -6, n -9, n -3, חומצות שומן טרנס בתוספת אינטגרלים של פסגות שרשראות n -1 acyl ב δ 4.98, δ 5.05 ו δ 5.81. את DHA שאני הנפרד הוא נורמהlized ידי כפל 3/4 כי זה מתאים ארבעה פרוטונים, ואילו S האינטגרלי מקביל שלושה פרוטונים. H NMR 1 הוא לא מסוגל לתת מידע לגבי חלוקת מיקומית של חומצות שומן על עמוד השדרה גליצרול ולכן יכול לשמש רק עבור כימות הסכום הכולל של חומצות שומן. ניתוח 1 H NMR של תוספת שמן דגים כמוסה הראה שהוא מורכב 10.5% של DHA. הריכוז של DHA באותו המדגם באמצעות BHT נמצא 105.23 מ"ג / g. ערכים אלה הם מאוד קרובים לערכים שהתקבלו עם 13 C תמ"ג (ראה לדוגמא 2 עבור 13 ניתוח C).

דוגמה 2, n -1 שרשראות acyl: ריכוז של רשתות n -1 acyl ניתנת על ידי מערכת היחסים C n-1 = 3 אני n-1 / S, איפה אני n-1 הוא אינטגרלי של האות ב δ 5.818. זֶהאות מקבילה פרוטון אחד ובכך צריכה להיות מנורמל על ידי כפל שלוש. בעת השימוש BHT, n -1 שרשראות acyl נקבעים על ידי n-1 C במשוואה = 2 לי n-1 / I BHT. התוצאות לא יכולות לבוא לידי ביטוי מ"ג / g משום MW של n -1 שרשרות acyl אינה ידועה.

דוגמא 3, n -6 / n -3 יחס: מדד חשוב זה ניתן לחשב את היחס של העוצמות המנורמלות של התהודה ב δ 2.77, אשר תואם את פרוטוני BIS-allylic של n -6 שרשרות acyl (שני פרוטונים) על שלישיה בבית δ 0.97 ששייך n -3 חומצות שומן ומתאים שלושה פרוטונים. מערכת היחסים היא C n-6 / C n-3 = 3/2 I A / B ואני, איפה אני A ו- B ואני הם אינטגרלים של אותותב δ 2.77 ו δ 0.97, בהתאמה. n -6 חומצות שומן נקבעים מהקשר C n-6 = 3 / 2I n-6 / S, איפה אני n-6 הוא נפרד פרוטונים BIS-allylic ב δ 2.77.

דוגמה 4, חומצות שומן טרנס: חומצות שומן טרנס ניתן לחשב אותו מהמשוואה C טרנס = אני טרנס / S, איפה אני טרנס הוא אינטגרלי של האות ב δ 0.91. המדגם הנוכחי הכיל 3.07% חומצות שומן טרנס, כפי שנקבע על ידי 1 NMR H באמצעות מכשיר 850 MHz. המדגם הזהה לנתח מכשיר 500 MHz נמצא להכיל 3.03% חומצות שומן טרנס.

דוגמא 5, חומצות שומן רוויות (SFA): הריכוז של SFA יכול להיות calculated מן S = המשוואה C SFA - C n-3 - C n-6 - C n-9 - C n-1 - C טרנס. n -9 חומצות שומן (בעיקר חומצה אולאית) ניתן לכמת פי C במשוואה n-9 = (3/4 ש - 3/2 לי n-6) / S, שבו Q הוא נפרד פרוטונים allylic של n -6 ו -9 n ב δ 2.01. כמות SFA במדגם שמן דגים זמין מסחרי נמצאה 36.1%. המדגם הזהה לנתח עם 13 C תמ"ג נמצא להכיל 33.8% SFA. SFA מייצג קבוצה של שונות FA (למשל סטארית ו פלמיטית) עם MW השונה ובכך הריכוז שלהם אם שמן דגים לא יכול לבוא לידי ביטוי מ"ג / g.

דוגמה 6, סטרולים הכולל: כמות סטרולים הכולל (ללא תשלום אסטרי) יכול להיקבע על ידי sigסופי של פרוטונים מתיל על פחמן 18 המופיע ב δ 0.68, באמצעות המשוואה C = אני Ste / S. היחס הטוחן של סטרולים סכו מדגם שמן דגים זמין מסחרי נמצא להיות 0.32%. BHT יכול לשמש גם לקביעת הריכוז המוחלט של סטרולים. סטרולים העיקרי בשמן דגים הם D כולסטרול וויטמין (או לקודמו 7-dehydrocholesterol) ולעיתים קרובות מתווספים במוספים. יש תרכובות אלה יש MW מאוד דומה. לכן, יכול לבוא לידי ביטוי בתוצאות מ"ג / g ו- מחושבים לפי המשוואה C = 2/3 ואני STE / I הוא STE MW × / m, שבו STE MW הוא המסה המולקולרית (386) של כולסטרול, אשר מהווה את רוב שבר sterolic בשמן דגים 20. כמות סטרולים באותו מדגם באמצעות BHT היה 3.8 מ"ג / גרם של שמן דגים. קביעת הפרט של כולסטרול (δ (δ 0.678) אינו ריאלי על מכשיר 850 MHz לאחר יישום של פונקציה חלון עבור שיפור הרזולוציה.

ניתוח 13 C תמ"ג

איור 2 מדגים את ספקטרום C תמ"ג 13 רכשה ב (א) 850 MHz ו (ב) מכשיר 500 MHz בתחום הפחמן קרבוניל. שתי ספקטרה דומה מאוד והוא יכול לספק את אותה הכמות של מידע. ספקטרום 13 C התמ"ג יכול לשמש בהצלחה לניתוח של חומצות שומן נוספות כגון stearidonic (SDA) ו eicosatetraenoic (ETA) חומצות, אולם יותר סריקות נדרשות עבור דגימות שבו חומצות אלה בריכוזים נמוכים. ספקטרום 13 C מאופיינים ברזולוציה גבוהה בשל רוחב ספקטרלי גדול ואת היישום של decoupling בפס רחב, אשרמבטל את ההשפעה של צימוד סקלרי ומייצר בגופיות. מסיבה זו, יש מוגבל חופף גם כאשר באמצעות מכשיר 500 MHz.

ספקטרום 13 C התמ"ג הוא הרבה יותר אינפורמטיבי לעומת 1 בספקטרום H NMR והוא יכול לספק נתונים כמותיים מקיפים יותר בגלל חופפי אות פחות נצפים (איורים 1 ו 2). באזור ספקטרלי השימושי ביותר של הספקטרום 13 C הוא האזור פחמן קרבוניל משום שהוא מספק מידע כמותי על מספר רב של חומצות שומן כמו גם לחלוקה מיקומית שלהם על שלד גליצרול 19, 21, 22. אזור הקבוצה מהתיל מ δ 14.5 ל δ 13.5 יכול לשמש קביעה המהירה של הסכום הכולל של n -3, n -6, n -9 ו רווי שומןחומצות (SFA), כמו גם חומצות שומן טרנס. עם זאת, ב ספקטרומטר תמ"ג 500 MHz, קיימת חפיפה חלקית של n -6 ו -9 n חומצות שומן רוויות (SFA). היישום של פונקצית חלון עבור שיפור רזולוציה עשוי לפתור את הבעיה למרות מכשיר 850 MHz עדיין נחשב אופציה אמינה יותר. אזור olefinic של ספקטרום פחמן יכול לשמש עבור הסכום הכולל של n -3 ו n -1 שרשרות acyl כמו גם לקביעת חומצות שומן בודדות כגון DHA, EPA, Arachidonic חומצה (AA), לינולנית (LN) n -3, וחומצה אולאית (OL) (ראה טבלה 2). 13 C תמ"ג ניתן גם להחיל על האפיון של שמן דגים ממקורות אחרים, כגון תוספי עשיר אסטרים אתיל (EE) באמצעות אותות הפחמן ב δ 14.31 (מתיל) ו δ 60.20 (מתילן).

לקבלת ניתוח פחמן, חומצות שומן יכולות להיות determשאינו עומד ידי חלוקה הנפרדת האותות אליפטיות, olefinic, ו קרבוניל המתאימים עם הנפרד הכולל של כל רשתות acyl, על פי C היחסים הכללי = I / S (2), כאשר C הוא הריכוז של אנליטי בשומה (% ,) I הוא נפרד תהודה כי מיוחסת באופן ייחודי את השומנים של עניין, ו- S הוא נפרד הכוללת של אות (ים) שמייצג את תוכן השומנים הכולל של המדגם. מדד ה- S הכולל נפרד שרשראות acyl יכול להיקבע על ידי שילוב באזור מ δ 175 ל δ 171 ו מוגדר 100.

כימות של חומצות שומן מ"ג / גרם של שמן דגים מתבצעת באמצעות תקן פנימי על בסיס היחסים הבאים: C = I / I IS × × MW / m (3), כאשר C הוא הריכוז של אנליטי ב מ"ג / gשמן דגים, אני הוא נפרד תהודה כי מיוחסת באופן ייחודי את השומנים של עניין, אני הוא הוא האזור של אות פחמן ששייכת באופן ייחודי ההתקן הפנימי, A הוא millimoles של תקן פנימי, MW הוא מולקולרי המשקל של המתחם של עניין (עבור חומצות שומן לידי ביטוי אסטרים מתיל), ו- m הוא כמות שמן דגים גרם. 13 אותות C-NMR של חומצות שומן שמן דגים שיכולים לשמש למטרות לכמת מוצג בלוח 2, ואילו משימת NMR השלמה של ספקטרום 13 C התמ"ג ניתן למצוא במקום אחר 19.

דוגמא 1, EPA במיקום SN -2: הכמות (%) של EPA על עמדת SN -2 מחושבת על ידי חלוקה האינטגרלית של האות ב δ 172.56 ידי S. כמות ה- EPA במיקום -2 SN בתוך שיתוףמדגם mmercially זמין נמצא להיות 3.4% באמצעות מכשיר 850 MHz. שימוש באותה ספקטרומטר ו BHT כסטנדרט פנימי, בסכום של EPA במיקום SN -2 לידי ביטוי מ"ג / גרם של שמן דגים הוא 29.73 מ"ג / g. מדגם זהה לנתח מכשיר 500 MHz נמצאה להכיל 3.6% או 31.39 מ"ג / גרם של EPA במצב SN -2. תוצאות דומות ניתן להשיג בעת חישוב היחס המולקולרי היחסי של EPA ב SN -2 באמצעות ספקטרום צימוד מלא. הסיבה לכך היא פחמן קרבוניל של EPA מושפע decoupling פרוטון לאותו תואר זניח כמו פחמנים קרבוניל אחרים, אשר משמשים כנקודת התייחסות. עם זאת, סטיות גדולות הם נצפו בעת השימוש BHT, כי הפחמן של BHT ב δ 151.45, המשמש כימות, לקבל שיפור NOE שונה לעומת פחמנים קרבוניל של חומצות שומן. מסיבה זו, ספקטרום צימוד המלא יש להימנע בעת שימוש בסטנדרטים פנימיים או שילוב גarbons עם multiplicities השונה.

דוגמה 2, בסכום כולל של DHA: הסכום הכולל (%) של DHA מחושב פשוט על ידי הוספת כמויות של DHA ב SN -1,3 ו העמדה SN -2 כפי שנקבע על ידי אותות התמ"ג ב δ 172.48 ו δ 172.08, בהתאמה. מדגם זהה לנתח עם 1 H NMR (ראה למשל 1 של 1 ניתוח H) נמצאה להכיל 10.3% DHA פי 13 ניתוח C NMR. כמות DHA יכול גם לבוא לידי ביטוי מ"ג / g באמצעות תקן פנימי ו משוואה 3. הסכום הכולל של DHA היה 103.25 מ"ג / g.

דוגמה 3, הסכום הכולל של SDA: הסכום הכולל (%) של SDA נקבעת על ידי הוספת אינטגרלים של אותות ב δ 172.99 ו δ 172.60 השייכים פחמנים קרבוניל של SDA על העמדה SN -1,3 וSN -2, בהתאמה, אז חלוקת הסכום על ידי S. המדגם נתח נמצא להכיל SDA 3.93% או 34.54 מ"ג / g.

דוגמא 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) ניתן לקבוע על ידי חלוקה האינטגרלית של האות ב δ 131.85 עם S הנפרד. היחס הטוחן של n -3 Ln במדגם שמן דגים נתח היה 0.7%. הריכוז המוחלט באמצעות BHT חושב כמו 5.5 מ"ג / g.

דוגמא 5, חומצות שומן טרנס: היחס הטוחן של חומצות שומן טראנס נקבעת על ידי חלוקה האינטגרלית של האות ב δ 13.80 עם S. ניתוח המדגם הזהה כי נותח עם 1 H NMR ו- נמצא להיות 3.07% של טרנס FA, נותח גם עם 13 C תמ"ג ותוכן חומצת שומן טרנס שלה נמצא להיות 3.42%. Tהוא 13 C תמ"ג ניתוח של המדגם הזהה על מכשיר 500 MHz הראה תוכן 3.64% חומצות שומן טרנס. כמות טרנס האנגלי בשנת מילימול / גרם של שמן דגים יכול להיקבע באמצעות BHT כסטנדרט פנימי ואת המשוואה C = I / I IS × A / m, אולם התוצאות לא יכול לבוא לידי ביטוי מ"ג / g בגלל השיא ב δ 13.80 מתאים חומצות שומן טרנס שונות, בעיקר טראנס DHA ו- EPA טרנס, עם MW השונה.

דוגמה 6, EE: הריכוז של EE במדגם שמן דגים מחושב על ידי חלוקה אינטגרלית באזור ספקטרלי מ δ 60.50 עד 60.00 δ, אשר תואם את פחמנים מתילן של EE של חומצות שומן שונות, עם S. ניתוח מדגם שמן דגים EE הראה כי היא כללה 100% EE. יצוין כי בדגימות EE, CA EPAn יחושב באמצעות השיא קרבוניל ב δ 173.60 או על ידי פחמן EE מתילן בבית δ 60.20, ואילו DHA ניתן לחשב באמצעות אות ב δ 60.31 ו / או את האות ב δ 173.09.

רשימה מלאה של האותות אבחון שיכולות לשמש למטרות כימות עם 13 C ו 1 H ניתוח התמ"ג ניתן למצוא שולחנות 1 ו 2, בהתאמה, ואילו תיאור מפורט של משוואות שניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח זה ניתן למצוא במקום אחר 19.

תמ"ג יכול להיות מיושם גם עבור הערכת מצב החמצון של תוספי שמן דגים. איור 3 משווה את ספקטרום NMR H 1 של מדגם שמן דגים תחת שני תנאים חמצון; חשיפה חימום וחשיפה לקרינה אולטרה סגולית (UV)אוֹר. חמצון שומנים הוא תהליך מסובך, ואת ההרכב של מוצרי חמצון תלוי בתנאים של חמצון. מוצרי החמצון העיקריים הם hydroperoxides (δ 8.0-8.8), hydroperoxides Dienes מצומדות (δ 5.4-6.7), ו אלדהידים (δ 9.0- 10).

איור 1
איור 1. ניתוח תמ"ג 1 H. 850.23 (א) ו- 500.20 MHz (B) 1 H-NMR ספקטרום של תוסף שמן דגים CDCl 3 פתרון. האותות התמ"ג של EPA ו- DHA, שניתן להשתמש בהם עבור הנחישות שלהם מוצגים. השיא ב δ 0.97 יכול לשמש לקביעת הסכום הכולל של חומצות n -3 שומן. המעטפת ב δ 1.39-1.20 חתוכה, כפי שהיא שייכת פרוטונים מתילן של כל שרשרת השומןים ולא יכול לשמש לכל מטרה הזדהות או כימות. ספקטרום 1 H NMR מתאפיין רוחב ספקטרלי צר (SW) לעומת 13 ספקטרום C NMR וכך בהחלטה ספקטרלי נמוכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. 13 ניתוח C NMR. 213.81 (א) ו- 125.77 MHz (B) 13 C-NMR ספקטרום של תוסף שמן דגים CDCl 3 פתרון באזור פחמן קרבוניל. אותות התמ"ג של EPA ו- DHA על SN -1,3 ו SN -2 העמדה מוצגות. אותות אלה יכולים לשמש לקביעת כמותית של EPA ו- DHA. למרות SPECtra רשמה ב 213.81 MHz מאופיינים ברזולוציה גבוהה ורגישות, ספקטרה 125.77 MHz יכול לשמש גם לצורך קביעת המתחמים הגדולים. היישום של צימוד בניסוי 13 C התמ"ג מבטל את ההשפעה של צימוד סקלרי בין גרעיני פחמן ומימן ולכן האותות להופיע בגופיות ביצוע הניתוח קלות לעומת 1 בספקטרום H NMR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. חמצון שמן דגים. הספקטרום 1 H NMR של שמן דגים מחומצן תלוי בתנאי חמצון. הרזוננסים לייחס hydroperoxides (δ 8.0-8.8), גhydroperoxides Dienes onjugated (δ 5.4-6.7), ו אלדהידים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

ppm δ פּרוֹטוֹן מתחם
0.677 CH 3 (18) כולסטרול
0.678 CH 3 (18) 7-dehydrocholesterol
0.88 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7.27 הרץ n -9, SFA שרשראות acyl
0.883 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7.08 הרץ n -6 שרשראות acyl
0.911 CH 2 CH 3 (t), ω J; 1, ω2 = 7.65 הרץ שרשראות acyl Trans
0.973 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7.63 הרץ n -3 שרשראות acyl
1.25 CH 2 CH 3 (t), J = 7.20 הרץ אסטרים אתיל
1.697 OCOCH2CH 2 (t), J H α, Η β = הרץ שרשרת acyl EPA
2.391 OCOCH 2 CH 2 (t) שרשרת acyl DHA
2.772 CH = CHCH 2 CH = CH n -6 שרשראות acyl
2.81 CH = CHCH 2 CH = CH n -3 שרשראות acyl
3.593 3'a-CH 2 OCO גליצרול של 1-MAG
3.722 3'a, 3217; ב-CH 2 OCO (br) גליצרול של 1,2-DAG
4.073 2'-CHOH (br) גליצרול של 1,3-DAG
4.121 CH 2 CH 3 multiplet אסטרים אתיל
4.173 1'b, 3'b-CH 2 OCO (dd) גליצרול של 1,3-DAG
4.238 1'a-CH 2 OCO (dd) גליצרול של 1,2-DAG
4.329 1'b-CH 2 OCO (dd) גליצרול של 1,2-DAG
4.989 -CH = CH 2 cis (dd) n -1 שרשראות acyl
5.052 -CH = CH 2 טרנס (dd) n -1 שרשראות acyl
5.082 2'-שוקו גליצרול של 1,2-DAG
5.268 2'; -CHOCO גליצרול של TAG
5.436 CH = CHCH 2 CH = CH 2 n -1 שרשראות acyl
5.818 -CH = CH 2 n -1 שרשראות acyl

טבלה 1: המשימה של הספקטרום 1 H NMR. ה 1 במשמרות כימיות H-NMR של אותות חומצת שומן שמן דגים שיכולים לשמש למטרות כימות בתמיסת CDCl 3 מוצגים. המשמרות הכימיות נמדדות ppm ולספק מידע על הסביבה הכימית של הגרעינים.

ppm δ פַּחמָן
173.24 C1 SFA (SN -1,3)
172.21 C1 OL, LO (SN -1,3)
ETA C1 (SN -1,3)
173.13 C1 DPA (SN -1,3)
173.03 C1 SDA (SN -1,3)
172.97 C1 EPA (SN -1,3)
172.73 ETA C1 (SN -2)
172.69 C1 DPA (SN -2)
172.61 C1 SDA (SN -2)
172.56 C1 EPA (SN -2)
172.48 C1 DHA (SN -1,3)
172.08 C1 DHA (SN -2)
136.8 Cω1, n -1
131.85 Cω3 LN
130.37 C15 AA
130.11 C9 LN
130.06 C13 LO
129.54 C5 DHA SN -2
129.47 -1,3 SN C5 DHA
128.94 C5 EPA
128.76 C6 EPA
128.45 N C17 -3
127.71 n -3
127.53 C4 DHA SN -2
127.5 -1,3 SN C4 DHA
126.86 Cω4, כל n -3
114.71 Cω2, n -1
60.08 DHA, אסטרים אתיל
59.96 EPA, אסטרים אתיל
59.95-59.85 אסטרים FA, אתיל אחרים
33.48 C2 EPA SN -2
33.32 -1,3 SN C2 EPA
31.44 N C3 -1
27.05 Allylic n -6
26.49 -1,3 SN C4 EPA
26.47 C4 EPA SN -2
24.6 C3 EPA
24.48 -1,3 SN C3 SDA
24.44 C3 SDA SN -2
14.27 Cω1, כל n -3
14.13 Cω1, SFA
14.11 Cω1, OL
14.07 Cω1, LO
13.8 Cω1, FA טראנס

טבלה 2: המשימה של ספקטרום C תמ"ג 13. 13 C-NMR משמר הכימית של אותות חומצת שומן שמן דגים שיכולים לשמש purp quantitationמערכות הפעלה בתמיסת CDCl 3 מוצגים.

משלימת האיור S1: השוואה בין 13 ספקטרום C NMR רכשה באמצעות הפס הרחב הסטנדרטי צימוד (א) ו ההופכי מגודר צימוד (B) רצפים דופקים. ספקטרום נרשמו עבור מדגם זהה עם אותו מספר של סריקות, מעובד עם אותם פרמטרים עיבוד מוצגים עם הגורם בקנה מידה זהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שינויים ואסטרטגיות לפתרון בעיות

איכות ספקטרלי. Linewidth של אות NMR ובכך ההחלטה של ​​ספקטרום התמ"ג תלוי מאוד shimming, שהוא תהליך של אופטימיזציה של הומוגניות של השדה המגנטי. עבור ניתוח שיגרתי, shimming 1D הוא נאות ו shimming 3D אינו נדרש, בהתחשב בעובדה שהיא מבוצעת על ידי אנשי NMR על בסיס קבוע. אם זה לא המקרה, shimming 3D חייב להתבצע לפני ניתוח באמצעות מדגם המכיל 0.6 מ"ל של H 2 O: D 2 O (90:10). כדי להשיג טוב יותר ומהר יותר shimming, המדגם צריך להיות מרוכז באזור עירור / זיהוי של תדר רדיו (RF) סליל, באמצעות מד עומק מדורג, לפני שהוא מושם השחלת מגנט. גורם נוסף שמשפיע shimming הוא מסתובב המדגם בקצב ספין של 10-20 הרץ. למרות ספינינג המדגם בקצב הספין הזה משפר את shims רדיאלי (X, Y, XY, XZ, YZ, X 2 -y 2, וכו '), לא מומלץ בדרך כלל כדי להימנע ממראית העין של להקות צד ספינינג מהמדרגה הראשונה ומעלה. עם זאת, כאשר עובדים על מכשירים הפועלים לארמו תדרים נמוכים מ 400 MHz, ספינינג מומלץ עבור ניסויי 1D NMR.

החלטה, כמו גם רגישות, מושפעי רווח מקלט הערך (RG). ערכים נמוכים של רווח המקלט להפחית את הרגישות, ואילו ערכים גבוהים יותר מאשר הצפת גורם המתאימה של הממיר האנלוגי לספרתי (ADC). תוצאות הצפת ADC בקנה-צורות nonsymmetrical ואת האותות לא יכולים לשמש למטרות כמותית כי הנקודות הראשונות של ריקבון אינדוקציה חינם (FID) עלולים ללכת לאיבוד. ברוב המקרים, הפקודה "RGA" מחשבת ערך RG מתאים. עם זאת, במקרים מסוימים, את ערך RG מחושב על ידי התוכנה הוא גבוה יותר מהערך האידיאלי וישנה עיוות בצורה הלורנצי של אות NMR. בשנתכזה מקרה, המשתמש צריך להזין ידנית ערך RG קטן על ידי הקלדת "RG (ערך)" בשורת הפקודה. ערך RG אופייני דגימות שניתח עם פרוטוקול זה הוא 8.

לעתים קרובות, כאשר באמצעות בהקפאה מקוררת בדיקות NMR עם איכות פקטור גבוה (Q-שלבים), עיכוב גדול (זמן מת)> 200us בין הדופק שעבר תקופת הגילוי נדרש להימנע חפצים כגון גיבן סביב התדר של המשדר וכן מתגלגל בסיס הספקטרום של. עם זאת, עיכוב ארוך כזה גורם שגיאת שלב הראשון מסדר שלילית גדולה, אשר יכול גם להציג מתגלגלים בסיס ומטבלים גדול סביב הבסיס של האותות החזקים. במקרים אלה, רצף דופק-הד ספין משוחזר-z ניתן להשתמש כדי לייצר ספקטרום NMR עם ערכי בסיס השתפרו באופן משמעותי, למרות ירידה ברגישות קטנה עלולה להתרחש 23.

פוספוליפידים. בנוסף הניתוח של שמן דגיםדגימות עשירות טריגליצרידים ו אסטרים אתיל, תמ"ג יכול לשמש לניתוח דגימות שמן דגים עשירות פוספוליפידים (פרספקטיבה). עם זאת, טיפול מיוחד נדרש עבור דגימות כאלה בגלל אגרגטים טופס פרספקטיבה, אשר יכולים לגרום לירידה משמעותית הרזולוציה ספקטרלית ורגישות. לניתוח דגימות אלה, תערובת הממס של כלורופורם deuterated: מתנול (3 CDCl: OD CD 3) ביחס של 70:30 נדרש לקבלת ספקטרום של איכות גבוהה.

תקן פנימי. BHT נבחרה כסטנדרט פנימי במחקר זה כי היא מולקולה סימטרית מאוד עם 1 H פשוט 13 ספקטרום C NMR ואף אחד משיאיו חופפים לאלו של מרכיבי שמן דגים. יש BHT אות בספקטרום 1 H NMR, אשר מופיעה בתור גופייה ב δ 6.97 ושייך שני הפרוטונים השווים ארומטיים (פסק - עמדה בגין לקבוצת OH) ו אות בδ 151.45 בספקטרום 13 C התמ"ג השייכת פחמן הרביעון ארומטי הנושא את קבוצת -OH. אין שני אותות אלה יחפפו המרכיבים בשמן דגים, ולכן יכול לשמש למטרות כימות. תרכובות אחרות כגון 1,2,4,5-tetrachloro-3-nitrobenzene (TCNB) או כלוריד אתילן יכולות לשמש גם סטנדרטים פנימיים אלטרנטיביים, לעומת זאת, הם מאופיינים בערכים כבר T 1.

מגבלות של הטכניקה

כימות של חומצות שומן ושומנים שונים תוספי שמן דגים מושגת באמצעות שילוב של אותות תמ"ג האבחון המתאימים בספקטרום 1D. אותות כאלה צריכים להיות שייכים רק מרכיב מדגם ספציפי חייבים אין התערבות עם אותות תרכובות אחרות. זו עשויה להיות בעיה עבור 1 ניתוח H NMR מאז ספקטרום NMR 1 H מאופיין ברזולוציה נמוכה בשל הטווח הקצר של צ'המשמרות מיכל. בנוסף, הנוכחות של צימוד סקלרי (J) מייצרת multiplets ועושה ניתוח מסובך יותר. לדוגמה, אסטרים אתיל (EE) ניתן לכמת באמצעות 1 H NMR ידי שלישיה מאפיין (J = 7.20 הרץ) של קבוצת מתיל על δ 1.25 ואת multiplet ב δ 4.12, השייכת פרוטונים מתילן של האסטר. עם זאת, בעת שימוש במכשירי NMR הפועלים לארמו תדרים נמוכים מ 850 MHz, הניתוח של EE באמצעות 1 H NMR יש להימנע בשל החפיפה החלקית של השיא ב δ 4.12 עם השיא δ 4.14 של TGS, והחפיפה בין האות ב δ 1.25 עם האות רחב של פרוטונים מתילן אליפטיות ב δ 1.23-1.35. סטיות גדולות גם נצפו בין ניתוח 1 H ו- 13 C של EPA בדגימות כמה, 13 C התמ"ג היה קרוב יותר בהרכב שהכותרת שמספק tהוא היצרן. זהו כנראה בשל חפיפה של האות ב δ 1.69, אשר משמש לניתוח EPA, עם אותות של תרכובות אחרות המופיעות סוגים מסוימים של תוספי שמן דגים. טעויות נוספות quantifications יכול להיווצר בעת שימוש תקן פנימי בשל טוהר ודאית של התקן פנימי מ טעויות במשקל.

ניתוח ההלחנה יכול לבוא לידי ביטוי ריכוזים יחסיים טוחנים ללא שימוש תקן פנימי. אם תוצאות צריכות לבוא לידי ביטוי בריכוזים מוחלטים, למשל כמו מיליגרם של חומצת שומן לגרם שמן (מ"ג / g), שימוש תקן פנימי נדרש. עם זאת, במקרים בם האות של עניין NMR שייך תרכובות מרובות עם משקולות מולקולריות שונות, את התוצאות לא ניתן לבטא מ"ג / g אפילו בעת שימוש תקן פנימי. בנוסף, שימוש התקן פנימי בדרך כלל מגביר את משך ניתוח מכיוון הים הפנימי הנפוץ ביותר tandards, כגון BHT, הם מולקולות קטנות עם סימטריה מולקולרית גבוהה, וכתוצאה מכך זמן הרפיה ארוכה. מאז זמן ההחזרה (עיכוב בין פולסים + זמן רכישה) מוגדר על פי זמן הרפיה הארוך T 1 במדגם, שימוש תקן פנימי יאריך את משך הניסויים כמו עיכובים ארוכים יותר בין פולסים נדרשים. זהו גורם חשוב במיוחד עבור 13 ניתוח C NMR בגלל זמן ההרפיה הארוך במיוחד T 1 של גרעיני פחמן. תוספת של תרכובת פאראמגנטיים כגון Cr (acac) 3 יכול ביעילות להפחית את זמן הרפיה T 1. הריכוז המומלץ של Cr (acac) 3 הוא 0.75 מ"ג / מ"ל של פתרון. ריכוזים גבוהים של Cr (acac) 3 עשויים להיחשב לצורך הפחתה נוספת של T 1, לעומת זאת, זהירות נדרשת כדי למנוע ירידות במדד ה- S / N בשל הרחבת הקו.

ntent "> למרות 13 C התמ"ג מתאפיין רזולוציה ספקטרלית גבוהה בהרבה לעומת 1 H, הרגישות של ניסוי 13 C התמ"ג נמוך משמעותי בשל השפע הטבעי הנמוך (1.1%) ויחס gyromagnetic הנמוך (67.26 10 6 rad s -1 T -1) של 13 גרעיני C. בנוסף, פעמי ההרפיה הארוכה T 1 של 13 C להגדיל את אורך הניתוח. זו עשויה להיות בעיה כאשר הנפט המנותח הוא מוגבל, משום מוגברות מספר סריקות יש להשתמש כדי להשיג אות סבירה יחס רעש.

מגבלות על רגישות הרזולוציה של ספקטרום NMR למנוע הניתוח של תרכובות קטין רבות בשמן דגים כי ניתן לנתח עם טכניקות אחרות כגון GC. לדוגמה, 1 Η התמ"ג אינו מסוגל להפריד סטרולים הפרט או חומצות שומן (פלמיטית למשל ו סטארית) ואילו 13 Cהוא לא מסוגל לקבוע תרכובות המופיעים בריכוז נמוך מאוד בשמן דגים כגון חומצה dodecanoic ו myristic, אשר חופפות בחלקן את האותות של כל חומצות שומן רוויות ב δ 173.24 ו δ 172.82. למרות הגדלת כמות המדגם שנותח עושה הניתוח של כמה תרכובות קטין ריאליות, זהירות נדרשת עבור דגימות מרוכזות מאוד, בגלל הצמיגות המוגברת שלהם. מאוד פתרונות צמיגים המכילים יותר מ 150 מ"ג של שמן יש להימנע כי יש ירידה ב S / N בשל הרחבת הקו שנגרמה פעמי הרפיה המופחתות ספין-ספין T 2. בנוסף, עיכובים ארוכים יותר בין פולסים נדרשים בגלל כבר T 1 ויש כמה בעיות ב shimming וכך בהחלטה.

כל המתחמים נתחו בשמן דגים עם תמ"ג ניתן לכמת בו זמנית תמונה אחת ללא שימוש בכל צעדי פרדה או טיהור. היווצרותו NMRalysis היא מהירה כמו קשת H 1 יכולה להיות מוקלטת בתוך פחות מדקה, ואילו 13 הרכישה C NMR נמשכת 10 דקות. יצוין, עם זאת, כי יש כמה גורמים שמשפיעים על זמן הרכשת נתונים. באופן ספציפי, עבור 13 C תמ"ג, הפעם 10 דקות הריצה יכולה להיות מושגת רק ללא שימוש בסטנדרטים פנימיים, ועם שימוש בדיקות מקוררות בהקפאה, שבו סליל RF ואת המגבר הם התקררו ובכך הרעש התרמי ממוזערת. עלייה של פי 10-15 בזמן הניסוי צריכה להיות צפויה עבור 13 ניתוח C NMR כאשר טמפרטורת חדר חללית (קונבנציונלי) משמש.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

ספקטרוסקופיה NMR הוכיחה להיות כלי רב עצמה עבור קביעה איכותית וכמותיים של רכב תוספי שמן דגים, ובגלל rapidness שלו יש לו את הפוטנציאל להיות מיושמת עבור הקרנת תפוקה הגבוהה של nu המכריע mber של דגימות שמן דגים. NMR ספקטרוסקופיה היא מעצם הגדרתה מתודולוגיה כמותית מאחר שאזור האות הוא ביחס ישר במספר הגרעינים שגורמים אות. בעוד כימיקלים רעילים בחריפויות נדרשים להכין דגימות NMR, שיטה זו היא ידידותית לסביבה בגלל כמויות קטנות כאלה של הכימיקלים הזה (למשל CDCl 3) משמשות להבדיל שיטות אחרות הדורשות כמויות גדולות של ממס כדי elute דגימות. בנוסף, יש NMR מספר יתרונות לעומת שיטות אנליטיות אחרות. אין כיול עם סטנדרטים נדרש לפני הניתוח, וכן הכנת מדגם מינימאלית בלי שום צעדי הפרדה וטיהור בדרך כלל אמצה, אשר הופכת NMR כלי אנליטי מאוד מהר. בנוסף, 13 C תמ"ג הוא המתודולוגיה הזמין הטוב ביותר לקביעת חלוקת מיקומית של חומצות שומן שונות על שלד גליצרול. בעוד הידרוליזה אנזימטית כבר לשמש כחלופה הוא לא תמיד אמין= "Xref"> 24. זה הוא בעל חשיבות ספציפית כי קיים אינטרס משמעותי בלימוד regiospecificity של חומצות שומן שונות במזונות, כפי שהוא כבר נמצא כי זה משפיע על התפקוד שלהם בתזונה אנושית 25, 26.

יישומים עתידיים

למרות ההסכם בין ניתוח NMR ו תווית המוצרים, כמו גם העובדה כי ישנם כמה מחקרים המראים הסכם בין GC ו- NMR, אנו מאמינים כי יותר קפדניים ומקיפים מחקרים במעבדת התוך נדרשים לבחון את ההסכם בין NMR ומסורתי מתודולוגיות לניתוח מרכיבי שמן דגים באמצעות מספר גדול יותר של דגימות, מוצרי שמן דגים של מקורות שונים, וכן פתרונות סטנדרטיים מוסמכים.

יישום עתידי חשוב של התמ"ג ב ניתוח שמן דגים יהיה קביעת מוצרי החמצון. בנוסף להגדרהשל תרכובות הגדולות בשמן דגים, מוצרי חמצון ראשוניים ומשניים מספר בשמן דגים, כגון אלדהידים ו תחמוצות, נוכחים. 1 H NMR ניתן להחילו על ההערכה של מצב חמצון תוסף שמן דגים, בתנאי חמצון שונים, כפי שמוצג באיור 3. האתגר הגדול בניתוח זה יהיה משימת התמ"ג ואת ההזדהות של מוצרי חמצון בודדים. התקדמות הרגישה של חומרת NMR גם תאפשר זיהוי של סטרולים בודדים באמצעות 13 C תמ"ג. ספקטרוסקופיה NMR יכולה להיות מיושמת גם עבור הניתוח של רקמות דג בכללותו אפילו ללא כל מיצוי באמצעות זווית קסם ברזולוציה גבוהה ספינינג (HR-MAS) NMR.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

שני הצעדים הקריטיים ביותר המשפיעים על הדיוק של ספקטרום NMR כמותית לערב את הבחירה של דופק 90 ° ושימוש עיכוב בין pulses ≥ 5 × T 1. הזווית הדופקת היא יחסי רוחב דופק המהווה פרמטר NMR מכויל כי תלוי במכשור, המדגם. 90 ° דופק חיוני ההמרה המלאה של המגנטיזציה אורך (z) אל רוחבי לצפייה (XY) המגנטיזציה. חשוב לציין כי לפני הכיול דופק, את התמ"ג חקר צריך להיות מכוון היטב מתאימה. זה יהיה לייעל את העברת הכוח RF המדגם ובכך למקסם S / N ולהבטיח decoupling יעיל. כוונון הבדיקה מושפע בעיקר על ידי קבוע דיאלקטרי של המדגם, כך שאם יש הבדלים בריכוז בין דגימות, לחזור על תהליך הכוונון עבור כל אחד. ניסוי 1D 13 C התמ"ג כרוך הן 13 C ו- 1 ערוצי H כך הכוונון אוטומטי ההתאמה הכרחית שני הגרעינים.

עיכוב בין פולסים יותר מ 5 × T 1 מבטיח את REC השלםאוברי של המגנטיזציה נטה לשווי הראשוני שלה. אם כל התהודות בספקטרום לא נרגעו לחלוטין לפני כל דופק, האות הוא מורחק חלקית וזה מוביל דיוקי האינטגרציה. T 1 הערך מהווה גורם קריטי שמשפיע על אורך הניסוי וזה תלוי בעוצמת השדה המגנטית כמו גם את הצמיגות של המדגם. בהינתן כי הצמיגות בין הדגימות דומה, פעמי הרפית T 1 יש לקבוע עבור כל מכשיר רק בתחילת פגישת הניתוח.

תכונה חשובה נוספת של ניתוח שמן דגים עם 13 C תמ"ג היא הבחירה של רצף הדופק המתאים. השיטה האמינה ביותר לניתוח כמוני 13 C היא ההופכי המגודר ניסוי decoupling, שבו decoupling פרוטון פס רחב מוחל רק בתקופת הרכישה ובכך אין עברת קיטוב בין 1 H כדי 13C באמצעות אפקט אוברהאווזר הגרעיני (NOE). עם זאת, כל עוד הניסוי NMR צימוד מלא יכול לשמש למטרות כמותית, זהירות נדרשת בעת שימוש בניסוי זה כי ישנם גורמים NOE שונה בין פחמנים עם multiplicities שונים ולכן השוואה בלתי נפרד בין מתיל, מתילן, פחמנים מתאן ו קרבוניל יש להימנע. למרות זאת, כאשר פחמנים רק של ריבוי דומה וסביבה כימית נחשבים בניתוח, שיטת צימוד המלא היא אמינה. אחת הדוגמאות לכך היא פחמנים קרבוניל של חומצות שומן אשר נמצאו אין הבדלים משמעותיים הגורמים NOE לאחר צימוד 27. בנוסף, עבור פרוטונים הנושאת פחמנים, הניסוי צימוד מלא מספק רגישות גבוהה יותר בשל תרומות NOE על עוצמת האות NMR. השוואה בין הספקטרום רכש עם הרצפים דופקים שני מוצגת באיור S1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מזונות עבור Theme הבריאות דיסקברי באוניברסיטה אוהיו ואת מחלקת מזון למדע וטכנולוגיה באוניברסיטת אוהיו. המחברים מבקשים להודות מתקן NMR באוניברסיטה אוהיו ואת המתקן NMR באוניברסיטת פן סטייט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simopoulos, A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56 (8), 365-379 (2002).
  2. Goodnight, S. H. Jr, Harris, W. S., Connor, W. E. The effects of dietary omega 3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study. Blood. 58 (5), 880-885 (1981).
  3. Harper, C., Jacobsen, T. Usefulness of omega-3 fatty acids and the prevention of coronary heart disease. Am. J. Cardiol. 96 (11), 1521-1529 (2005).
  4. Kremer, J. M., et al. Effects of high-dose fish oil on rheumatoid arthritis after stopping nonsteroidal antiinflammatory drugs. Clinical and immune correlates. Arthritis and Rheumatol. 38 (8), 1107-1114 (1995).
  5. Malasanos, T., Stackpoole, P. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus. Diabetes Care. 14, 1160-1179 (1991).
  6. Han, Y., Wen, Q., Chen, Z., Li, P. Review of Methods Used for Microalgal Lipid-Content Analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
  7. Guillén, M., Ruiz, A. 1H nuclear magnetic resonance as a fast tool for determining the composition of acyl chains in acylglycerol mixtures. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 502-507 (2003).
  8. Sacchi, R., Medina, I., Aubourg, S. P., Addeo, F., Paolillo, L. Proton nuclear magnetic resonance rapid and structure specific determination of ω-3 polyunsaturated fatty acids in fish lipids. J. Am Oil Chem Soc. 70, 225-228 (1993).
  9. Igarashi, T., Aursand, M., Hirata, Y., Gribbestad, I. S., Wada, S., Nonaka, M. Nondestructive quantitative acid and n-3 fatty acids in fish oils by high-resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 737-748 (2000).
  10. Plans, M., Wenstrup, M., Saona, L. Application of Infrared Spectroscopy for Characterization Dietary Omega-3 Oil Supplements. J. Am. Oil Chem. Soc. 92, 957-966 (2015).
  11. Jian-hua, C. I. A. Near-infrared Spectrum Detection of Fish Oil DHA Content Based on Empirical Mode Decomposition and Independent Component Analysis. J Food Nutr Res. 2 (2), 62-68 (2014).
  12. Millen, A. E., Dodd, K. W., Subar, A. F. Use of vitamin, mineral, nonvitamin, and nonmineral supplements in the United States: The 1987, 1992, and 2000 National Health Interview Survey results. J. of Am. Diet Assoc. 104 (6), 942-950 (2004).
  13. Dwyer, J. T., et al. Progress in developing analytical and label-based dietary supplement databases at the NIH office of dietary supplements. J. Food Compos. Anal. 21, S83-S93 (2008).
  14. Monakhova, Y. B., Ruge, I., Kuballa, T., Lerch, C., Lachenmeier, D. W. Rapid determination of coenzyme Q10 in food supplements using 1H NMR spectroscopy. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 83 (1), 67-72 (2013).
  15. Monakhova, Y. B., et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the internet. Drug Test. Anal. 5 (6), 400-411 (2013).
  16. Berger, S., Braun, S. 200 and more NMR experiments: a practical course. , Wiley-VCH. Weinheim. (2004).
  17. Knothe, G., Kenar, J. A. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMRspectroscopy. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 106, 88-96 (2004).
  18. Sacchi, R., Medina, J. I., Aubourg, S. P., Paolillo, I. G. L., Addeo, F. Quantitative High-Resolution 13C NMR Analysis of Lipids Extracted from the White Muscle of Atlantic Tuna (Thunnus alalunga). J. Agric. Food Chem. 41 (8), 1247-1253 (1993).
  19. Dais, P., Misiak, M., Hatzakis, E. Analysis of marine dietary supplements using NMR spectroscopy. Anal. Methods. 7 (12), 5226-5238 (2015).
  20. Pickova, J., Dutta, P. C. Cholesterol Oxidation in Some Processed Fish Products. J. Anal. Oil Chem. Soc. 80 (10), 993-996 (2003).
  21. Siddiqui, N., Sim, J., Silwood, C. J. L., Toms, H., Iles, R. A., Grootveld, M. Multicomponent analysis of encapsulated marine oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR techniques. J. of Lipid Rsrch. 44 (12), 2406-2427 (2003).
  22. Sua´rez, E. R., Mugford, P. F., Rolle, A. J., Burton, I. W., Walter, J. A., Kralovec, J. A. 13C-NMR Regioisomeric Analysis of EPA and DHA in Fish Oil Derived Triacylglycerol Concentrates. J. Am. Oil Chem. Soc. 87, 1425-1433 (2010).
  23. Youlin, X. A., Moran, S., Nikonowiczband, E. P., Gao, X. Z-restored spin-echo 13C 1D spectrum of straight baseline free of hump, dip and roll. Magn. Reson. Chem. 46, 432-435 (2008).
  24. Tengku-Rozaina, T. M., Birch, E. J. Positional distribution of fatty acids on hoki and tuna oil triglycerides by pancreatic lipase and 13C NMR analysis. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 116 (3), 272-281 (2014).
  25. Berry, S. E. E. Triacylglycerol structure and interesterification of palmitic and stearic acid-rich fats:An overview and implications for cardiovascular disease. Nutr. Res. Rev. 22 (1), 3-17 (2009).
  26. Hunter, J. E. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides. Lipids. 36, 655-668 (2001).
  27. Vlahov, G. Regiospecific analysis of natural mixtures of triglycerides using quantitative 13C nuclear magnetic resonance of acyl chain carbonyl carbons. Magnetic Res. in Chem. 36, 359-362 (1998).

Tags

כימיה גיליון 123 שמן דגים ספקטרוסקופיה NMR אומגה 3 EPA DHA חומצות שומן תוספי תזונה
NMR ספקטרוסקופיה כמו כלי חזק עבור ההערכה המהירה של פרופיל השומנים של תוספי שמן דגים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williamson, K., Hatzakis, E. NMR… More

Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter