Summary
Her ble høyoppløselige 1H og 13C kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi anvendes som en rask og pålitelig verktøy for kvantitativ og kvalitativ analyse av innkapslede fiskeolje bilag.
Abstract
Den vestlige diett er fattig på N-3 fettsyrer, derfor forbruket av fiskeolje tillegg anbefales det å øke inntaket av disse essensielle næringsstoffer. Formålet med dette arbeidet er å demonstrere den kvalitativ og kvantitativ analyse av innkapslede fiskeolje ved hjelp av høy-oppløsning 1H og 13C NMR-spektroskopi å benytte to forskjellige NMR-instrumenter; en 500 MHz og et 850 MHz instrument. Både proton (1 H) og karbon (13C) NMR-spektre kan anvendes for kvantitativ bestemmelse av de viktigste bestanddeler av fiskeolje bilag. Kvantifisering av lipidene i fiskeolje er oppnådd ved integrering av de passende NMR-signalene i det aktuelle 1D spektra. Resultater oppnådd ved 1H og 13C NMR er i samsvar med hverandre, til tross for forskjellen i oppløsning og følsomhet mellom de to kjerner og de to apparater. 1H NMR tilbuds en hurtigere analyse sammenlignet med 13C NMR spektrum som kan tas opp i løpet av mindre enn ett minutt, i motsetning til 13 C-NMR-analyse, som varer fra 10 minutter til én time. 13C NMR-spektret, er imidlertid mye mer informativ. Det kan gi kvantitative data for et større antall av individuelle fettsyrer, og kan brukes for å bestemme posisjonsmessig fordeling av fettsyrer med glycerol ryggraden. Begge kjerner kan gi kvantitativ informasjon på bare ett eksperiment uten behov for rensing eller separasjonstrinn. Styrken av det magnetiske felt for det meste påvirker 1H NMR-spektra på grunn av sin lavere oppløsning med hensyn til 13C-NMR, men til og med lavere kostnader NMR-instrumenter kan effektivt anvendes som en standard metode av næringsmiddelindustrien og kvalitetskontroll laboratorier.
Introduction
Forbruket av N-3 fettsyrer i dietten har vist seg å være fordelaktig for en rekke tilstander som hjertelidelser 1, 2, 3, 4 inflammatoriske sykdommer og diabetes 5. Den vestlige diett er ansett som dårlig i N-3-fettsyrer, og således forbruket av fiskeolje tillegg anbefales for å forbedre n -6 / n -3 balanse i forbrukerens ernæring 1. Til tross for den siste økningen i fiskeolje supplement forbruk spørs det om sikkerheten, autentisitet, og kvaliteten på noen av disse produktene. Den raske og nøyaktige kompositorisk analyse av fiskeolje kosttilskudd er viktig å evaluere kvaliteten på disse kommersielle produkter og sikre forbrukernes sikkerhet.
De vanligste metoder for vurdering av fiskeolje supplements er gasskromatografi (GC) og infrarød spektroskopi (IR). Selv om disse er meget følsomme metoder, lider de av flere ulemper 6. GC-analyse er tidkrevende (4-8 h) på grunn separasjon og derivatisering av de enkelte forbindelser som er nødvendig for 7 og lipid oksidasjon kan forekomme i løpet av analysen 8, 9. Mens IR-spektroskopi kan være kvantitative, er en forutsigelse modell nødvendig for å bli konstruert ved bruk av partiell minste kvadraters regresjon (PLSR), selv om det er unntak, hvor IR-bånd kan tilskrives en enkelt forbindelse 10. MPCA krever analyse av et stort antall prøver, noe som øker analysetidspunktet 11. Av denne grunn er det en økende interesse for utvikling av nye analytiske metoder som gjør det mulig nøyaktig og rask analyse av et stort antall fiskeoljeprøver. Organisasjoner som Office of Kosttilskudd (ODS) ved National Institutes of Health (NIH) og Food and Drug Administration (FDA) har samarbeidet med Association of Official Analytical Chemists (AOAC) for å utvikle disse nye metoder 12, 13.
En av de mest lovende analytiske metoder for screening og evaluering av flerkomponent-matrikser, slik som kosttilskudd, er Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi 14, 15. NMR-spektroskopi har flere fordeler: det er en ikke-destruktiv og kvantitativ teknikk, krever minimalt eller ingen prøvepreparering, og den er karakterisert ved god nøyaktighet og reproduserbarhet. I tillegg, er NMR-spektroskopi et miljøvennlig metoden fordi den utnytter bare små mengder av løsemidler. Den største ulempen med NMR-spektroskopi er dens forholdsvis lave følsomhet sammenlignet med andre analytical metoder har imidlertid de siste teknologiske fremskritt i instrumentering som for eksempel sterkere magnetfelt, kryogene sonder med forskjellige diametre, avansert databehandling, og allsidig pulssekvenser og teknikker har økt følsomhet opp til den nM-området. Mens NMR instrumentering er høye kostnader, med lang levetid av NMR-spektrometre og de mange anvendelser av NMR senke kostnadene for analysen i det lange løp. Denne detaljerte video-protokollen er ment å hjelpe nye utøvere innen unngå fallgruver forbundet med 1H og 13C NMR spektroskopianalyse av fiskeolje bilag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NMR Prøvepreparering
Merk: Forsiktig, ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Deuterert kloroform (CDCI3) som anvendes i prøvepreparering er giftig. Vennligst bruk alle nødvendige sikkerhetsrutiner når du utfører prøveopparbeidelse inkludert bruk av et avtrekksskap og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk, full lengde bukser, lukket-toe sko).
- Fremstilling av en H, og 13 C-prøvene
- Ekstraher 120 pl (~ 110 mg) av fiskeolje fra et kosttilskudd kapsel ved hjelp av en sprøyte og plassere den i en 4 ml glassampulle. Spill vekten av fiskeolje.
- Prøve oppløsning
- Oppløs ca. 120 ul av fiskeolje i 500 ul CDCI3 inneholdende 0,01% av tetrametylsilan (TMS) som blir brukt som en referanse for 1H og 13 C, kjemisk skift.
MERK: TMS er brukd bare for kjemisk skift kalibrering (trinnumrene 2.2.1.2.7 og 2.2.2.2.7), ikke for kvantifisering (se trinnumrene 2.2.1.3 og 2.2.2.3) formål. - Fremstill en 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) stamløsning, hvis kvantifisering uttrykt i mg / g er ønsket, ved å oppløse ca 220 mg BHT og 15 mg av krom (III) acetylacetonat (Cr ( acac) 3) i 20 ml av CDCI3 inneholdende 0,01% av TMS. Bruk 500 ul av stamoppløsningen for å oppløse 100 mg (± 10 mg) av fiskeolje.
- Oppløs ca. 120 ul av fiskeolje i 500 ul CDCI3 inneholdende 0,01% av tetrametylsilan (TMS) som blir brukt som en referanse for 1H og 13 C, kjemisk skift.
- Etter oppløsning av oljen (dette tar noen få sekunder), overfører hele oppløsningen direkte inn i en høy kvalitet 5 mm NMR-rør og feste en hette. Analyser av prøvene innen 24 timer etter fremstilling av prøvene.
2. NMR Instrument forberedelse
Merk: Forsiktig, pass på at tilstedeværelsen av sterke magnetiske felt som produseres av NMR-instrumenter kan påvirke medisinsk utstyr og implmaur som pacemakere og kirurgiske proteser, samt elektroniske elementer som kredittkort, klokker osv Tilleggs forsiktighet er nødvendig når analysen er utført ved hjelp av ikke-skjerming magneter. To NMR-instrumenter som ble brukt for innhenting av 1H og 13C NMR-spektra; et spektrometer drevet ved 850,23 MHz og 213,81 MHz for 1H og 13 C-kjernene, henholdsvis, som er utstyrt med en trippel resonans heliumkjølt invers (TCI) 5 mm sonde og et spektrometer drevet ved 500,20 MHz og 125,77 MHz for 1H og 13C kjerner, respektivt, som er utstyrt med et bredt bånd observert (BBO) nitrogenavkjølt 5 mm sonde. Alle forsøkene ble utført ved 25 ± 0,1 ° C, og spektrene ble behandlet med en standard NMR-data analyse innsamling og behandling programvarepakke (se Materialer List).
- Forberedelse til ervervelsen av NMR-spektra
Note: 1H og 13C NMR-spektrakan skaffes følgelig uten å fjerne prøven fra instrumentet.- Sett NMR-rør inn i en spinner turbin (se Materialer List).
- Plasser spinneren og røret på oversiden av en gradert dybdemåler og skyv toppen av røret inntil dens nedre del berører bunnen av måleren.
- Plasser NMR prøven i en åpen flekk av SampleCase. Merk sporet nummer prøven er plassert i.
- Slik legger du prøven i NMR, tilbake til kontroll datamaskinen og skriver 'sx #', hvor # er sporet i SampleCase holder prøven din.
- Vent til deuterium signal CDCI3 å vises på den låste vindu skjermen. Hvis den ikke vises automatisk, type "lockdisp". Så snart den deuterium-signalet er synlig, type "låse" på kommandolinjen og velger "CDCI3" fra løsningsmidlet liste for å låse prøven ved den CDCI3 deuterium resonans.
MERK: Deuterium signal kan ikke bli vist hvis tidligere bruker anvendes et annet løsningsmiddel. Bruker skal vente på indikatoren at prøven er nede, deretter låse. - Type "bsmsdisp" i kommandolinjen for å sikre spinnende er ikke aktiv. Hvis "SPIN" knappen er grønn, klikker du på den for å deaktivere spinning.
- Skriv inn den "nye" kommando for å opprette et nytt datasett. Skriv inn et navn for datasettet i "Name" -kategorien, og forsøket nummer i "EXPNO" -kategorien. Bruk nummer "1" i "PROCNO" -kategorien. I "Experiment" fanen, trykk "Velg" og velg "PROTON" parameter fil. Skriv tittelen på eksperiment i "TITLE" -kategorien. Klikk på "OK".
- Type "getprosol" i kommandolinjen for å skaffe standardparametrene for den aktuelle NMR-sonde og løsningsmiddel.
- Gjenta trinn 2.1.7 for 13 C, velge "C13IG" puls-sekvensen i "eksperiment" fane for 1D 13C inverse grerte dekoblet eksperiment.
- Type "getprosol" i kommandolinjen for å skaffe standardparametrene for den aktuelle NMR-sonde og løsningsmiddel.
- Skrive kommandoen "Atma" for å utføre automatisk søking og tilpasning av sonden for både karbon og proton kjerner.
- Utføre en dimensjonal gradient mellomlegg for å oppnå et meget homogent magnetfelt, og dermed optimal linjeform for NMR-signalene.
- Bruk standard automatisk prosedyre for 1D mellomlegg, simpelthen ved i rekkefølge å utføre kommandoene "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss" og "qu topshim rapport" på kommandolinjen.
- parameter optimalisering
- 90 ° puls kalibrering
- Opprett et nytt datasett for en H (se trinn 2.1.7 og 2.1.8).
- Skriv inn kommandoen "paropt" på kommandolinjen for å starte automatisering program for å kalibrere 90 ° pulse. Velg pulsvarighet, p1, som parameteren som skal modifiseres.
- Begynn med "2" mikrosekunder som den innledende verdi av P1, angir "2" uS trinn og utføre "16" eksperimenter.
- Skape et nytt datasett for 13 C (se trinn 2.1.9) og gjenta prosessen for 13 C-kjerner (se trinn 2.2.1.2 og 2.2.1.3).
- T en måling målt ved null-metode 16 for 1H-
MERK: null metoden bruker inversjonsgjenvinning pulssekvens, som består av en 180 ° puls følge av en forsinkelse (tau), for å tillatte avslapning langs z-aksen og en endelig 90 ° puls som skaper den observer transversale magnetisering.- Opprett et nytt datasett for en H (se trinn 2.1.7 og 2.1.8).
- Type "pulprog t1ir1d" for å endre pulssekvensen til den inverse-utvinning eksperiment.
- Skriv inn følgende kommandoer på command linje for å sette opp den spektrale bredde i ppm, midten av RF-senderen, antall skanninger antallet av dummy skanninger og antallet datapunkter "SW 8", "o1p 3,8", "ns 2", "DS 2" og "td 64K".
- Type "p1 (value)" og fyll inn varighetsverdier for 90 ° puls som bestemt av puls kalibrering (se trinn 2.2.1) og skriv "p2 (verdi)" for 180 ° puls (varighet verdi for de 180 ° puls er den 90 ° pulsvarigheten multiplisert med to).
- Sett resirkulerings forsinkelse til en meget stor verdi, for eksempel 10 s ved å skrive "d1 10".
- Sett tau til en kort verdi, for eksempel 10 ms, ved å skrive inn "D7 10 ms" på kommandolinjen.
- Still mottakerforsterkningen (RG) til en passende verdi ved hjelp av kommando "RGA" for automatisk beregning av RG.
- Kjør et spektrum ved å skrive kommandoen "zg".
- Utføre Fourier-transformasjonen ved å skrive "EFP"på kommandolinjen.
- Utføre automatisk fasekorrigering ved å skrive kommandoen "apk" i kommandolinjen. Hvis ytterligere fasejustering er nødvendig for å ytterligere forbedre spekteret, klikk på "fanen Process", klikk deretter på ikonet "Juster Phase" for å gå inn i fase korreksjonsmodus.
- Bruk av nulte orden (0), og første-ordens (1) fasekorreksjons ikoner ved å dra muse inntil alle de signaler som er i negativ absorpsjon modus. Bruke og lagre fasekorreksjonsverdier ved å klikke på "Return og Lagre" -knappen for å avslutte fase korreksjonsmodus.
- Øke den tau inntil alle toppene er enten positive eller nulles ved å gjenta trinn 2.2.2.6-2.2.2.9. For å bestemme T en verdi, er det bare dele tau-verdien når toppen blir nullet med ln2.
- T en måling målt ved null-metode 16 for 13C
- Skape et nytt datasett for 13 C (se trinn 2.1.9)
- Type "pulprog t1irpg" for å endre pulssekvensen til den inverse-gjenvinnings eksperiment for karbonkjerne.
- Skriv inn følgende kommandoer på kommandolinjen for å sette opp den spektrale bredde i ppm, midten av RF-senderen, antall skanninger, antallet dummy skanninger og antallet datapunkter: "sw 200", "o1p 98" , "ns 8", "dS 2" og "td 64K".
- Type "p1 (value)" og fyll inn varighetsverdier for 90 ° puls som bestemt av puls kalibrering (se trinn 2.2.1) og type "p2 (verdi)" for 180 ° puls (varighet verdi er 90 ° pulsvarighet multiplisert med to).
- Sett resirkulerings forsinkelse til en meget stor verdi, for eksempel 100 s ved å skrive "d1 100".
- Set tau til en kort verdi, for eksempel 100 ms ved å skrive "D7 100 ms" på kommandolinjen.
- Sett Motter gevinst (RG) til en passende verdi ved hjelp av kommando "RGA" for automatisk beregning av RG.
- Kjør et spektrum ved å skrive kommandoen "zg".
- Utføre Fourier-transformasjonen ved å skrive "EFP" i kommandolinjen.
- Utfør automatisk fasekorrigering ved å skrive kommandoen "apk" i kommandolinjen. Hvis ytterligere fasejusteringer er nødvendig for å ytterligere forbedre spekteret, klikk på "Juster Phase" -ikonet og fasekorreksjons ikonene for nulte orden (0), og første-ordens (1) korrigering fase.
- Mens klikke på null-orden, og første-ordens fasekorrigerings symboler, flytter musen før alle signalene er i negativ absorpsjon modus. Bruke og lagre fasekorreksjonsverdier ved å klikke på "Return og Lagre" -knappen for å avslutte fase korreksjonsmodus.
- Øke den tau inntil alle toppene er enten positive eller nulles ved å gjenta trinn 2.2.3.6-2.2.3.9. Å bestemmeT en verdi, er det bare dele tau-verdien når toppen blir nullet med ln2.
- 90 ° puls kalibrering
- En-dimensjonal (1D) NMR-spektra
- 1H-NMR-spektra
- Innsamlingen av NMR-dataene
- Gå til den 1H datasett opprettet i trinn 2.1.7 og bruke standard "puls-erverve" pulssekvens "zg", ved å skrive "pulprog zg" i kommandolinjen.
- Skriv inn følgende kommandoer på kommandolinjen for å sette opp den spektrale bredde i ppm, midten av RF-senderen, antall skanninger, antallet dummy skanninger, antallet av datapunkter, og at pulsvarigheten for en 90 ° puls vinkel : "sw 8", "o1p 3,8", "ns 2", "ds 2", "TD 64K" og "P1 (bestemt ved pulskalibrerings)" (se trinn 2.2.1).
MERK: 32K datapunkter kan brukes for 500 MHz instrument. - Sett en avslapping forsinkelse av 7 s til 500 MHz instrument eller 9 s til 850 MHz-instrument ved å skrive "d1 7s" eller "d1 9s", henholdsvis, på kommandolinjen.
- Still mottakerforsterkningen (RG) til en passende verdi ved hjelp av kommando "RGA" for automatisk beregning av RG.
- Type "digmod baseopt" for å erverve et spektrum med forbedret grunnlinje.
- Starte kjøp ved å skrive den puls-innhentingskommando "zg" i kommandolinjen.
- Behandling av NMR-data
- Type "si 64K" i kommandolinjen for å bruke null-fylling og angir størrelsen av den virkelige spektrum til 64K.
- Angir en linje bredere parameteren til 0,3 Hz ved å skrive "lb 0,3" i kommandolinjen for å anvende en vektingsfunksjon (eksponensiell reduksjon) med en linje utvide faktor på 0,3 Hz forut for Fourier-transformasjon.
- Utføre Fourier-transformasjonen ved å skrive "EFP" i kommandoenlinje.
- Utfør automatisk fasekorrigering ved å skrive kommandoen "apk" i kommandolinjen. Hvis ytterligere fasejusteringer er nødvendig for å ytterligere forbedre spekteret, klikk på "tab Process," klikk på "Juster Phase" -ikonet og fasekorreksjons ikonene for nulte orden (0), og første-ordens (1) fasekorreksjon .
- Mens klikke på null-orden, og første-ordens fasekorrigerings symboler, flytter musen før alle signalene er i positiv absorpsjon modus. Bruke og lagre fasekorreksjonsverdier ved å klikke på "Return og Lagre" -knappen for å avslutte fase korreksjonsmodus.
- Anvende et polynom fjerde-ordens funksjon for basislinje-korreksjon på integrasjon ved å skrive kommandoen "abs n".
MERK: Dette sikrer en flat spektral baseline med en minimum intensitet. - Rapporter kjemiske skift i ppm fra TMS (δ = 0). Klikk på kalibrering ( "Calib. Axer ") ikonet, og plasser markøren med den røde linjen på toppen av TMS NMR-signalet (topp nærmest 0). Venstre klikk og skriv inn '0'.
- NMR-data-analyse
- Integrere det spektrale området fra δ 1,1 til S 0,6, så vel som topper ved δ 4,98, δ 5,05 og δ 5.81 ved hjelp av "integrere" -ikonet (under "Process" f) og markeringen ( "Definer ny region") ikon. Venstre klikk og dra gjennom integra.
MERK: Hvis det er behov for å fokusere på en region, og klikk på markøren ikonet for å deaktivere og venstreklikk og dra musen for å zoome inn på området. For å justere terskelen intensitet, bruke den midtre museknappen hvis nødvendig. Klikk på markøren ikonet igjen for å gjøre integreringen funksjonen aktiv, og deretter flytte til neste topp.- Normalisere summen av de ovennevnte integraler til 100 ved å høyreklikke på integralverdien som visess under signalet og velger "Normal summen av integralene". Input verdien "100" i boksen og klikk på "Return og Lagre" for å avslutte integrering modus.
- Ved bruk av BHT som en intern standard, integrere toppen ved δ 6,98 og sette integral lik antall millimol BHT pr 0,5 ml av stamløsningen.
- Integrere toppene av interesse (se trinn 2.3.1.3.1) som strekker seg 10 Hz fra hver side av toppen, når det er mulig.
- Fortsett å utføre 13C-NMR-spektra innsamling og prosessering på en lignende måte.
- Integrere det spektrale området fra δ 1,1 til S 0,6, så vel som topper ved δ 4,98, δ 5,05 og δ 5.81 ved hjelp av "integrere" -ikonet (under "Process" f) og markeringen ( "Definer ny region") ikon. Venstre klikk og dra gjennom integra.
- Innsamlingen av NMR-dataene
- 13C-NMR-spektra
- Innsamlingen av NMR-dataene
- Gå til 13 C-datasettet og bruke den inverse gated utkoblet pulssekvens, "zgig" ved å skrive "pulprog zgig" i kommandolinjen.
MERK: Hvis du vil kjøre en karbon eksperiment med standard bredbånd decouPLED pulssekvens, type "pulprog zgpg" i kommandolinjen. - Skriv inn følgende kommandoer på kommandolinjen for å sette opp den spektrale bredde i ppm, midten av RF-senderen, antall skanninger, antallet dummy skanninger, antallet av datapunkter, og at pulsvarigheten for en 90 ° puls vinkel : "sw 200", "o1p 95", "ns 16" "ds 2", "TD 64K" og "P1 (bestemt ved pulskalibrerings)" (se trinn 2.2.1.4).
- Sett en avslapping forsinkelse på 35 s for 500 MHz instrument eller 45 s til 850 MHz-instrument ved å skrive "d1 35s" eller "d1 45s", henholdsvis, på kommandolinjen. Ved bruk av BHT, bør avslapping forsinkelse være 50 s i 500 MHz-instrument og 60 s i 850 MHz-instrument.
- Still mottakerforsterkningen (RG) til en passende verdi ved hjelp av kommando "RGA" for automatisk beregning av RG.
- Type "digmod baseopt" i kommandolinjen for å skaffe et spektrum with forbedret grunnlinjen.
- Starte kjøp ved å skrive den puls-innhentingskommando "zg" i kommandolinjen.
- Gå til 13 C-datasettet og bruke den inverse gated utkoblet pulssekvens, "zgig" ved å skrive "pulprog zgig" i kommandolinjen.
- Behandling av NMR-data
- Type "si 64K" i kommandolinjen for å bruke null-fylling og angir størrelsen av den virkelige spektrum til 64K.
- Angir en linje bredere parameteren til 1,0 Hz ved å skrive "lb 1.0" i kommandolinjen for å anvende en vektingsfunksjon (eksponensiell reduksjon) med en linje utvide faktor på 1,0 Hz forut for Fourier-transformasjon.
- Utføre Fourier-transformasjonen ved å skrive "EFP" i kommandolinjen.
- Utfør automatisk fasekorrigering ved å skrive kommandoen "apk" i kommandolinjen. Hvis ytterligere fasejusteringer er nødvendig for å ytterligere forbedre spekteret, klikk på "tab Process," klikk på "Juster Phase" -ikonet og fasekorreksjons ikonene for nulte orden (0), og første-ordens fase (1) korrigering .
- Anvende et polynom fjerde-ordens funksjon for basislinje-korreksjon på integrasjon ved å skrive kommandoen "abs n" i kommandolinjen.
- Rapporter kjemiske skift i ppm fra TMS (δ = 0). Klikk på kalibrering ( "Calib. Axis") -ikonet, og plasser markøren med den røde linjen på toppen av NMR signalet som skal refereres. Venstre klikk og skriv inn "0".
- Innsamlingen av NMR-dataene
- NMR-data-analyse
- Integrere det spektrale området fra δ 175 til 171 A ved hjelp av symbolet "integrere" (under "Process" f) og markeringen ( "Definer ny region") ikon. Venstre klikk og dra gjennom integra.
MERK: Hvis det er behov for å fokusere på en region, og klikk på markøren ikonet for å deaktivere og venstreklikk og dra musen for å zoome inn på området. Klikk på markøren ikonet igjen for å gjøre integreringen funksjonen aktiv, og deretter flytte til neste topp.- Sett integrert til 100 ved å gjøre et høyreklikk på integralverdien som vises under signalet og velger "Kalibrer Nåværende Integral". Input verdien "100" i boksen og klikk på "Return og lagre" for å avslutte integrering modus.
- Ved bruk av BHT som en intern standard, integrere toppen ved δ 151,45 og sette integral likmillimol BHT pr 0,5 ml av lagerløsningen.
- Integrere toppene av interesse som strekker seg 5 Hz fra hver side av toppen (se trinn 2.3.2.3.1).
- Integrere det spektrale området fra δ 175 til 171 A ved hjelp av symbolet "integrere" (under "Process" f) og markeringen ( "Definer ny region") ikon. Venstre klikk og dra gjennom integra.
- 1H-NMR-spektra
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1H og 13C NMR-spektra ble tatt for kommersielt tilgjengelige fiskeolje ved hjelp av to NMR-instrumenter; en 850 MHz og 500 MHz-spektrometer. Disse spektra kan bli anvendt til kvantitativ bestemmelse av bestanddeler av fiskeolje, slik som dokosaheksaensyre (DHA) og eikosapentaensyre (EPA), samt andre forbindelser slik som N -1 acylkjeder og ernæringsmessig viktig indeks som for eksempel n -6 / n -3-forhold. Kvantifiseringen kan utføres selv uten anvendelse av en indre standard, men de kvantitative resultatene skal bli uttrykt som relative molare prosentdeler. Når dataene å bli uttrykt i absolutte verdier (mg / g), er en intern standard er nødvendig. De oppnådde NMR-resultatene er svært reproduserbare med relative standard avvik (RSD), i området 0,3% til 2% for 13-C-NMR-analyse og fra 0,5% til 2,5% for 1H-NMR-analyse, avhengig av t han lipid. Den noe høyere RSD for 1H NMR observeres ofte fordi protonspektra har en tendens til å bli overfylt, som påvirker nøyaktigheten av analysen, spesielt for resonanser som har et lavere signal-til-støy-forholdet (S / N). En meget god overensstemmelse ble funnet mellom 850 MHz og 500 MHz instrument med RSDs i området fra 1% til 4%. Relativt høye RSDs (opptil 8%) ble observert når man sammenligner resultatene som ble oppnådd ved 1H og 13C, spesielt for forbindelser som finnes i lavere konsentrasjoner, såsom n -1 acylkjeder. NMR-spektroskopi har tidligere blitt validert som et verktøy for analyse lipid, herunder bestemmelse av noen fiskeoljekomponenter. Resultatene viste at det er i god overensstemmelse med tradisjonelle metoder, for eksempel GC 17, 18.
1H NMR-analyse
"xfig"> Figur 1 sammenligner den 1H NMR-spektra ervervet på (A) en 850 MHz og (B) et 500 MHz instrument. 850 MHz-spektret er karakterisert ved høyere oppløsning, men de viktigste komponentene av fiskeolje, inkludert DHA, EPA, og n -6 / n -3-forholdet kan også bestemmes fra 500 MHz-spektret. De 1 H-NMR signaler av fiskeolje-fettsyrer som kan anvendes for kvantiteringsstandarder formål er vist i tabell 1, mens den fullstendige NMR tilordningen av 1H NMR-spekteret av fiskeolje kan finnes andre steder 19.
1H NMR ga pålitelige data for kvantifisering av den totale mengde av N-3, N -6, DHA, transfettsyrer, n -1 acylkjeder, og mettede fettsyrer (SFA). For den 1H NMR-analyse, er nødvendig for bruk av hensiktsmessige forhold fordi det meste av signals hører til grupper av protoner som er felles for forskjellige fettsyrer og lipider. Av denne grunn, i de fleste tilfeller er konsentrasjonen av fettsyrer i fiskeoljen kan bestemmes bare ved kombinasjon av forskjellige 1H NMR-signaler, innarbeides i de riktige forhold. I tillegg er disse ligningene inneholder aritmetiske koeffisienter som normalisere et forskjellig antall protoner knyttet til hver gruppe. Når en intern standard anvendes den følgende ligning skal betraktes: C = I / I IS x N IS / N x A x MW / m (1), hvor C er konsentrasjonen av analytten i mg / g fiskeolje, jeg er integralet av en resonans som er unikt knyttet til lipid av interesse, i IS er arealet av et proton signal som tilhører entydig til den indre standard, er N antall protoner av den funksjonelle gruppe som er analysert,N er det antall protoner i det indre standarden som blir brukt for analyse, er et antall millimol indre standard, er MW er molekylvekten av fettsyren (uttrykt i metylestere), og m er mengden av fiskeolje uttrykt i g.
Eksempel 1, DHA: Andelen av DHA er bestemt ved ligningen C DHA = ¾ I DHA / S, hvor jeg DHA er integralet av signalet ved δ 2,39 som hører til H-a og H-p-protoner av DHA, og S er summen av integralene metylprotonene SFA, n -6, n -9, N-3, trans-fettsyrer pluss integralene for toppene av n- -1 acylkjede på δ 4,98, S 5,05 og 5,81 δ. Den integrerte I DHA er normaDeretter varmestabiliseres filmen ved å multiplisere med 3/4, fordi den svarer til fire protoner, mens den integrerte S tilsvarer tre protoner. 1H NMR er ikke i stand til å gi informasjon om posisjonsmessig fordeling av fettsyrer med glycerol ryggraden og således kan bare brukes for kvantifisering av den totale mengde fettsyrer. 1H NMR-analyse av en innkapslet fiskeolje supplement viste at det består av 10,5% av DHA. Konsentrasjonen av DHA i den samme prøve ved anvendelse av BHT ble funnet å være 105,23 mg / g. Disse verdier er meget nær de verdier som oppnås med 13C NMR (se eksempel 2 for 13 C-analyse).
Eksempel 2, n -1 acylkjede: Konsentrasjonen av n -1 acylkjede som er gitt ved forholdet C n-1 = 3 I n-1 / S, hvor I n-1 er integralet av signalet ved δ 5,818. Dettesignal tilsvarer et proton og således må bli normalisert ved å multiplisere med tre. Ved bruk av BHT, n -1 acylkjedene er bestemt ved ligningen C n-1 = 2 I n-1 / I BHT. Resultatene kan ikke bli uttrykt i mg / g fordi MW av n -1 acylkjeder er ukjent.
Eksempel 3, n -6 / n -3-forhold: Denne viktig indeks kan beregnes ut fra forholdet mellom den normaliserte intensitetene av resonans ved δ 2,77, hvilket svarer til bis-allyliske protoner n -6 acylkjeder (to protoner) over triplett ved 0,97 δ som tilhører n -3-fettsyrer og tilsvarer tre protoner. Forholdet er C n-6 / n-3 C = 3/2 I A / I B, der A og I B er integra signaleneved δ 2,77 og δ 0,97, respektivt. n -6-fettsyrer blir bestemt fra forholdet C n-6 = 3 / 2I n-6 / S, hvor I n-6 er integralet av bis-allyliske protoner ved δ 2,77.
Eksempel 4, trans-fettsyrer: kan Transfettsyrer beregnes ut fra ligningen C trans = I trans / S, hvor jeg trans svarer til integralet av signalet ved δ 0,91. Den foreliggende Prøven inneholdt 3,07% av transfettsyrer, som bestemt ved 1H-NMR ved hjelp av 850 MHz instrument. Den samme prøve analyseres i et 500 MHz instrument ble funnet å inneholde 3,03% av transfettsyrer.
Eksempel 5, mettede fettsyrer (SFA): Konsentrasjonen av SFA kan være calculrerte fra ligningen C SFA = S - C n-3 - C n-6 - C n-9 - C n-1 - C-trans. n -9-fettsyrer (hovedsakelig oljesyre) kan kvantifiseres i samsvar med ligningen C n-9 = (3/4 Q - 3/2 I n-6) / S, hvor Q er integralet av de allyliske protoner n -6 og -9 n ved δ 2.01. Mengden av SFA i en kommersielt tilgjengelig fiskeolje prøve ble funnet å være 36,1%. Den samme prøve analysert med 13C-NMR ble funnet å inneholde 33,8% SFA. SFA representerer en gruppe av ulike FA (f.eks stearin- og palmitinsyre) med forskjellig molekylvekt og dermed deres konsentrasjon hvis fiskeolje ikke kan uttrykkes i mg / g.
Eksempel 6, og den totale steroler: Mengden av totale steroler (fri og forestret) kan bestemmes ved den signal av metylprotoner på karbon 18 som fremkommer ved δ 0,68, ved hjelp av ligningen C = I ste / S. Det molare forholdet mellom totale steroler i en kommersielt tilgjengelig fiskeolje prøve ble funnet å være 0,32%. BHT kan også benyttes for bestemmelse av den absolutte konsentrasjonen av steroler. De viktigste steroler i fiskeoljer er kolesterol og vitamin D (eller dens forløper 7-dehydrokolesterol) og blir ofte tilsatt i kosttilskudd. Disse forbindelser har en meget lignende MW. Derfor kan resultatene uttrykkes i mg / g og er beregnet i henhold til ligningen C = 2/3 I STE / I ER EN x MW STE / m, hvor MW STE er molekylmassen (386) av kolesterol, som utgjør flertallet av sterolic fraksjonen i fiskeolje 20. Mengden av steroler i den samme prøven ved hjelp av BHT var 3,8 mg / g fiskeolje. Den enkelte bestemmelse av kolesterol (δ (δ 0,678) er gjennomførbart på et 850 MHz instrument etter påføring av en vindusfunksjon for forbedret oppløsning.
13C-NMR-analyse
Figur 2 illustrerer 13C NMR-spektra ervervet på (A) en 850 MHz og (B) et 500 MHz instrument i karbonylkarbonet området. De to spektra er svært like og kan gi den samme mengde informasjon. 13C NMR-spektret kan med hell brukes for analyse av andre fettsyrer, slik som stearidonsyre (SDA) og eikosatetraen (ETA) syrer, er imidlertid flere skanner som kreves for prøver hvor disse syrer er i lavere konsentrasjoner. 13C-spektrene er særpreget ved høy oppløsning på grunn av den store spektrale bredde og anvendelse av bredbånd frikoblingeliminerer virkningen av skalar kopling og produserer sing. Av denne grunn er det begrenset overlappende selv når du bruker en 500 MHz instrument.
13C NMR-spektret er mye mer informativ i forhold til den 1H NMR-spektrum og kan gi mer omfattende kvantitative data fordi mindre signal overlapping er observert (figur 1 og 2). Den mest nyttige spektralområde på den 13 C-spektret er karbonylkarbonet region fordi den gir kvantitativ informasjon om et stort antall av fettsyrer, så vel som for deres posisjons fordeling på glycerol skjelettet 19, 21, 22. Metylgruppen området fra δ 14,5 til 13,5 S kan brukes for rask bestemmelse av den totale mengde av N-3, N -6, n -9 og mettede fettstoffersyrer (SFA), så vel som transfettsyrer. Men i 500 MHz NMR-spektrometer, det er en delvis overlapping av de n -6 og -9 n mettede fettsyrer (SFA). Anvendelsen av et vindu funksjon for oppløsning ekstrautstyr kan løse dette problemet selv om 850 MHz instrument er fortsatt betraktet som en mer pålitelig alternativ. Den olefiniske området av karbonspekteret kan anvendes for den totale mengde av N-3 og N -1 acylkjeder, så vel som for bestemmelse av individuelle fettsyrer så som DHA, EPA, arakidonsyre (AA), linolensyre (Ln) n -3, og oleinsyre (OL) (se tabell 2). 13C NMR kan også anvendes for karakterisering av fiskeolje fra andre kilder, så som kosttilskudd rik på etylestere (EE) ved hjelp av karbon-signaler ved δ 14.31 (metyl) og δ 60.20 (metylen).
For karbon-analyse, kan fettsyrene være determdenne, definert ved å dividere integralet av de egnede alifatiske, olefiniske, og karbonylforbindelser signaler med den totale integralet av alle acylkjeder, i henhold til den generelle forholdet C = I / S (2), hvor C er konsentrasjonen av analytten i mol (% ), er jeg integralet av en resonans som er unikt knyttet til lipid er av interesse, og s er det totale integralet av signal (e) som representerer den totale fettinnholdet i prøven. Den totale integrerte S av acylkjedene kan bestemmes ved å integrere den region fra δ 175 til 171 A, og er satt til 100.
Kvantifisering av fettsyrene i mg / g av fiskeoljen er utført ved bruk av en intern standard på basis av det følgende forhold: C = I / I IS x A x MW / m (3), hvor C er konsentrasjonen av analytten i mg / gfra fiskeolje, er jeg integralet av en resonans som er unikt knyttet til lipid av interesse, I IS er arealet av et karbon-signal som tilhører entydig til den indre standard, A er antall millimol indre standard, MW er molekyl vekten av forbindelsen av interesse (for fettsyrer uttrykt i metylestere), og m er mengden av fiskeolje i g. 13C-NMR-signalene fra fiskeolje-fettsyrer som kan anvendes for kvantiteringsstandarder formål er vist i tabell 2, mens den fullstendige NMR tilordningen av 13C-NMR-spekteret kan finnes andre steder 19.
Eksempel 1, EPA i hver av sn -2 posisjoner: Mengde (%) av EPA i sn -2 posisjon beregnes ved å dividere integralet av signalet ved δ 172,56 etter S. Mengden av EPA ved sn -2 stilling i en commercially tilgjengelige prøve ble funnet å være 3,4% ved hjelp av 850 MHz instrument. Ved å bruke den samme spektrometer og BHT som en intern standard, mengden av EPA ved sn -2 stilling uttrykt i mg / g fiskeolje er 29,73 mg / g. Den samme prøve analyseres i et 500 MHz instrument ble funnet å inneholde 3,6% eller 31,39 mg / g av EPA i sn -2 stilling. Lignende resultater kan oppnås ved beregning av de relative molekylære forhold mellom EPA ved sn -2 ved å bruke en fullstendig avkoblet spektrum. Dette skyldes at karbonylkarbonet av EPA er påvirket av proton-dekobling til den samme ubetydelig grad som de andre karbonylkarboner, som brukes som referanse. Imidlertid er store avvik observert ved anvendelse av BHT, fordi karbonet av BHT ved δ 151,45, som brukes for kvantifisering, får en annen NOE forbedring i forhold til de karbonylkarboner av fettsyrer. Av den grunn bør den fullstendig avkoplet spekteret unngås ved bruk av interne standarder eller integrere carbons med forskjellige multiplicities.
Eksempel 2, total mengde av DHA: Den totale mengde (%) av DHA er ganske enkelt beregnes ved å tilsette de mengder av DHA i sn-1,3 og sn -2 stilling som bestemt ved NMR-signaler ved δ 172,48 og 172,08 δ, henholdsvis. Den samme prøve analysert med 1H NMR (se eksempel 1 av 1H-analyse) ble funnet å inneholde 10,3% DHA i henhold til 13 C-NMR-analyse. Mengden av DHA kan også bli uttrykt i mg / g ved hjelp av en intern standard og ligning 3. Den totale mengde av DHA var 103,25 mg / g.
Eksempel 3, total mengde av SDA: er den totale mengde (%) av SDA bestemt ved tilsetning av integra signalene ved δ 172,99 og 172,60 δ som tilhører de karbonylkarboner av SDA på posisjon sn -1,3 ogsn -2, henholdsvis, og deretter dividere summen av S. Den analyserte prøve ble funnet å inneholde 3,93% SDA eller 34,54 mg / g.
Eksempel 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) kan bestemmes ved å dividere integralet av signalet ved δ 131,85 med integralet S. Det molare forhold mellom N-3 Ln i den analyserte fisken oljeprøven var 0,7%. Den absolutte konsentrasjonen ved hjelp av BHT ble beregnet som 5,5 mg / g.
Eksempel 5, trans-fettsyrer: Det molare forhold av transfettsyrer blir bestemt ved å dividere integralet av signalet ved δ 13,80 med S. Analysen av den samme prøve som ble analysert ved 1H-NMR og ble funnet å være 3,07% trans-FA, ble også analysert med 13C-NMR og dens trans-fettsyreinnhold ble funnet å være 3,42%. Than 13C NMR-analyse av den samme prøven på et 500 MHz instrument viste en 3,64% innhold av transfettsyrer. Mengden av trans-FA i mmol / g fiskeolje kan bestemmes ved hjelp BHT som en intern standard, og ligningen C = I / I IS x A / m, men kan ikke resultatene uttrykt i mg / g fordi toppen ved δ 13,80 svarer til forskjellige trans fettsyrer, hovedsakelig trans DHA og EPA, trans med forskjellig molekylvekt.
Eksempel 6, EE: Konsentrasjonen av EE i en fiskeolje prøve beregnes ved å dividere integralet av den spektrale området fra δ 60,50 til 60,00 A, som svarer til de metylenkarboner av EE av forskjellige fettsyrer, med S. Analysen av en EE fiskeolje Prøven viste at den besto av 100% EE. Det bør bemerkes at i EE prøver, EPA ca.n beregnes enten ved den karbonyl-topp ved 173,60 δ eller ved den metylen EE karbonet i δ 60,20, mens DHA kan beregnes ved hjelp av signalet ved δ 60,31 og / eller signalet ved δ 173,09.
En fullstendig liste over de diagnostiske signaler som kan brukes for kvantifisering formål med 13C og 1H NMR-analyse kan finnes i tabellene 1 og 2 henholdsvis, mens en detaljert beskrivelse av de ligninger som kan anvendes for denne analysen kan bli funnet andre steder 19.
NMR kan i tillegg bli anvendt for vurdering av oksidasjons status av fiskeolje bilag. Figur 3 sammenligner 1H NMR-spektra av en fiskeolje prøve under to oksydasjonsbetingelser; eksponering for varme og eksponering for ultrafiolett (UV)lett. Lipidoksidasjon er en komplisert prosess, og sammensetningen av oksidasjonsprodukter avhenger av forholdene for oksidasjon. De viktigste oksidasjonsprodukter er hydroperoksyder (A) 8,0 til 8,8, konjugerte diener hydroperoksyder (δ 5.4-6.7) og aldehyder (A 9.0- 10).
Figur 1. 1H NMR-analyse. 850,23 (A) og 500,20 MHz (B) 1H-NMR-spektrum av en fiskeolje supplement i CDCI3 løsning. NMR-signalene av EPA og DHA som kan brukes for deres bestemmelse er vist. Toppen ved 0,97 δ kan benyttes for bestemmelse av den totale mengde av N-3 fettsyrer. Innhylle ved δ 1,39 til 1,20 er beskåret, som den hører til de metylenprotoner av alle fettkjedes og kan ikke bli brukt til identifisering eller kvantifisering formål. 1H NMR-spektrum kjennetegnes ved en smalere spektral bredde (SW) sammenlignet med 13C NMR-spektrum og således ved lavere spektral oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. 13C NMR-analyser. 213,81 (A) og 125,77 MHz (B) 13C-NMR-spektrum av en fiskeolje supplement i CDCI3 løsning i karbonylkarbonet regionen. NMR-signalene av EPA og DHA på sn -1,3 og sn -2 stilling vises. Disse signalene kan benyttes til kvantitativ bestemmelse av EPA og DHA. Selv om spectra registrert ved 213,81 MHz er kjennetegnet ved en høyere oppløsning og sensitivitet, kan 125,77 MHz-spektrene også benyttes for bestemmelse av de viktigste forbindelser. Anvendelsen av dekobling i den 13 C-NMR-eksperiment eliminerer virkningen av skalare kopling mellom karbon- og hydrogenkjerner og således vises signalene som sing gjøre analysen lettere i forhold til den 1H NMR-spektrum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fiskeolje oksidasjon. 1H NMR-spektrum av oksydert fiskeolje avhenger av oksydasjons-betingelsene. Resonansene tilskrives hydroperoksyder (A) 8,0 til 8,8, conjugated diener hydroperoksyder (δ 5.4-6.7), og aldehyder er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| δ ppm | proton | forbindelse |
| 0,677 | CH3 (18) | kolesterol |
| 0,678 | CH3 (18) | 7-dehydrokolesterol |
| 0,88 | CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,27 Hz | n -9, SFA acylkjedene |
| 0,883 | CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,08 Hz | n -6 acylkjedene |
| 0,911 | CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,65 Hz | Trans acylkjedene |
| 0,973 | CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,63Hz | N-3 acylkjedene |
| 1,25 | CH 2 CH 3 (t), J = 7,20 Hz | etylestere |
| 1,697 | OCOCH2CH 2 (t), JH α, Η β = Hz | EPA acylkjede |
| 2,391 | OCOCH 2 CH 2 (t) | DHA acylkjede |
| 2,772 | CH = CHCH2CH = CH | n -6 acylkjedene |
| 2,81 | CH = CHCH2CH = CH | N-3 acylkjedene |
| 3,593 | 3'a-CH2-OCO | Glyserol 1-MAG |
| 3,722 | 3'a, 3217, b-CH2-OCO (br) | Glycerol 1,2-DAG |
| 4,073 | 2'-CHOH (br) | Glycerol 1,3-DAG |
| 4,121 | CH2-CH3 multiplett | etylestere |
| 4,173 | 1 'b, 3'b-CH2-OCO (dd) | Glycerol 1,3-DAG |
| 4,238 | 1'A-CH2-OCO (dd) | Glycerol 1,2-DAG |
| 4,329 | 1'b-CH2-OCO (dd) | Glycerol 1,2-DAG |
| 4,989 | CH = CH2 cis (dd) | n -1 acylkjedene |
| 5,052 | CH = CH2 trans (dd) | n -1 acylkjedene |
| 5,082 | 2'-CHOCO | Glycerol 1,2-DAG |
| 5,268 | 2'; -CHOCO | Glyserol av TAG |
| 5,436 | CH = CHCH CH2CH = CH2 | n -1 acylkjedene |
| 5,818 | -CH = CH 2 | n -1 acylkjedene |
Tabell 1: Tilordningen av 1H NMR-spekteret. De 1 H-NMR-data for fiskeolje fettsyresignaler som kan brukes for kvantifisering formål i CDCI3 løsning blir presentert. De kjemiske forskyvninger er målt i ppm og gi informasjon om den kjemiske miljøet til kjernene.
| δ ppm | Karbon |
| 173,24 | C1 SFA (sn -1,3) |
| 172,21 | C1 OL, LO (sn -1,3) |
| C1 ETA (sn -1,3) | |
| 173,13 | C1 DPA (sn -1,3) |
| 173,03 | C1 SDA (sn -1,3) |
| 172,97 | C1 EPA (sn -1,3) |
| 172,73 | C1 ETA (sn-2) |
| 172,69 | C1 DPA (sn-2) |
| 172,61 | C1 SDA (sn-2) |
| 172,56 | C1 EPA (sn-2) |
| 172,48 | C1 DHA (sn -1,3) |
| 172,08 | C1 DHA (sn-2) |
| 136,8 | Cω1, n -1 |
| 131,85 | Cω3 LN |
| 130,37 | C15 AA |
| 130,11 | C9 LN |
| 130,06 | C13 LO |
| 129,54 | C5 DHA sn -2 |
| 129,47 | C5 DHA sn -1,3 |
| 128,94 | C5 EPA |
| 128,76 | C6 EPA |
| 128,45 | C17 n -3 |
| 127,71 | n -3 |
| 127,53 | C4 DHA sn -2 |
| 127,5 | C4 DHA sn -1,3 |
| 126,86 | Cω4, alle n -3 |
| 114,71 | Cω2, n -1 |
| 60.08 | DHA, Etylestere |
| 59.96 | EPA, Etylestere |
| 59,95 til 59,85 | Andre FA, Etylestere |
| 33.48 | C2 EPA sn -2 |
| 33,32 | C2 EPA sn -1,3 |
| 31.44 | C3 n -1 |
| 27.05 | Allylisk n -6 |
| 26.49 | C4 EPA sn -1,3 |
| 26.47 | C4 EPA sn -2 |
| 24,6 | C3 EPA |
| 24.48 | C3 SDA sn -1,3 |
| 24.44 | C3 SDA sn -2 |
| 14.27 | Cω1, alle n -3 |
| 14.13 | Cω1, SFA |
| 14.11 | Cω1, OL |
| 14,07 | Cω1, LO |
| 13.8 | Cω1, trans FA |
Tabell 2: Tilordningen av 13C-NMR-spekteret. De 13C-NMR-data for fiskeolje fettsyresignaler som kan brukes for kvantifisering purpOSE i CDCI3 løsning blir presentert.
Supplemental Figur S1: Sammenligning mellom 13C NMR-spektra ervervet ved å bruke standardbredbånds frakobling (A), og den inverse gated dekopling (B) pulssekvenser. Spektrene ble registrert for den samme prøven med samme antall skanninger, behandlet under de samme prosessparameterne, og er vist med den samme skalafaktor. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modifikasjoner og strategier for feilsøking
Spectral kvalitet. Den linjebredden av NMR-signalet og således oppløsningen av NMR-spekteret er svært avhengig av mellomlegg, som er en fremgangsmåte for optimalisering av homogeniteten i det magnetiske felt. For rutineanalyser, er 1D mellomlegg tilstrekkelig og en 3D-mellomlegg er ikke nødvendig, gitt at den er utført ved NMR personell på en regelmessig basis. Hvis dette ikke er tilfelle, må en 3D-mellomlegg bli utført før analyse ved bruk av en prøve inneholdende 0,6 ml av H2O: D 2 O (90:10). For å oppnå en bedre og raskere mellomlegg, må være sentrert i eksitasjon / detektering region av radiofrekvens (RF) pole, ved hjelp av gradert dybdeanlegget, før den plasseres i magnethullet prøven. En annen faktor som påvirker mellomlegg er spinne prøven ved en spinningshastighet på 10-20 Hz. Selv spinne prøven ved denne spinnhastighet forbedrer de radielle mellomleggene (X, Y, XY, XZ, YZ, X 2 Y 2, etc.), er det generelt ikke anbefalt for å unngå fremkomsten av roterende sidebånd av første eller høyere orden. Imidlertid, når det arbeides på instrumenter som opererer i Larmor lavere frekvenser enn 400 MHz er spinne anbefales for 1D NMR-forsøk.
Oppløsning, såvel som følsomhet, blir påvirket av mottakerforsterkningen (rg) verdi. Lave verdier av mottakerforsterkningen redusere følsomheten, mens verdier over passende årsak overløp til analog-til-digital omformer (ADC). ADC overløps resulterer i ikke-symmetrisk linje-former og signalene kan ikke brukes til kvantitative formål, fordi de første punktene i det frie induksjons decay (FID) kan gå tapt. I de fleste tilfeller kommandoen "RGA" beregner en passende rg verdi. Imidlertid, i noen tilfeller, RG verdien beregnet av programvaren er høyere enn den ideelle verdi, og det er en forvrengning i det Lorentzian form av NMR-signalet. Iet slikt tilfelle bør brukeren manuelt inn en mindre rg verdi ved å skrive "rg (verdi)" i kommandolinjen. En typisk RG verdi for prøvene som analyseres med denne protokollen er åtte.
Ofte når man bruker kryogenisk avkjølt NMR-sonder med en høy kvalitetsfaktor (Q-faktor), en stor forsinkelse (dødtid)> 200us mellom den siste puls og deteksjonsperiode er nødvendig for å unngå gjenstander som for eksempel en hump rundt senderens frekvens og en rulle i spekteret baseline. Imidlertid fører en slik lang forsinkelse et stort negativt første ordens fasefeil, som også kan innføre en grunnlinje rullende og store fall rundt bunnen av den sterke signaler. I disse tilfeller kan en z-restaurert spinnekkopulssekvens benyttes for fremstilling av NMR-spektra med vesentlig forbedret linjene, selv om en liten følsomhet reduksjon kan forekomme 23.
Fosfolipider. I tillegg til analysen av fiskeoljePrøvene som er rike på triglyserider og etylestere, kan NMR bli anvendt for analyse av fiskeoljeprøver som er rik på fosfolipider (PL). Imidlertid er spesiell forsiktighet kreves for slike prøver fordi PLS danne aggregater, noe som kan føre til en betydelig reduksjon i den spektral oppløsning og følsomhet. For analyse av disse prøver, en løsningsmiddelblanding av deuterert kloroform: metanol (CDCI3: CD3OD) i et forhold på 70:30 er nødvendig for å oppnå spektra av høy kvalitet.
Intern standard. BHT ble valgt som indre standard i denne undersøkelse fordi det er en meget symmetrisk molekyl med enkel 1H og 13C NMR-spektra og ingen av sine topper overlapper med de av fiskeolje bestanddeler. BHT har et signal i den 1H NMR-spektrum, som vises som en singlett ved 6,97 δ og representerer de to likeverdige aromatiske protoner (para - posisjon i forhold til OH-gruppen), og et signal vedδ 151,45 i den 13 C-NMR-spektrum som hører til den aromatiske kvaternære karbonatom som bærer OH-gruppen. Begge disse signalene har ikke overlapper med noen av bestanddelene i fiskeolje, og kan således anvendes for kvantifisering formål. Andre forbindelser så som 1,2,4,5-tetraklor-3-nitrobenzen (TCNB) eller etylen-klorid kan også brukes som alternative interne standarder, men de er kjennetegnet ved lengre T 1 verdier.
Begrensninger av teknikken
Kvantifiseringen av forskjellige fettsyrer og lipider i fiskeolje er oppnådd ved integrering av de passende diagnostiske NMR-signalene i 1D spektra. Slike signaler bør tilhøre bare til en bestemt prøvekomponent og må ikke ha noen interferens med signaler fra andre forbindelser. Dette kan være et problem for 1H-NMR-analyse siden 1H NMR-spekteret er karakterisert ved lav oppløsning på grunn av den korte rekkevidden av cheMical skift. I tillegg er nærvær av skalare koblingen (J) frembringer multipletter og gjør analysen mer komplisert. For eksempel kan etylestere (EE) kvantifiseres ved hjelp av 1H NMR av den karakteristiske triplett (J = 7,20 Hz) av metylgruppen ved δ 1,25 og den multiplett ved δ 4,12, som hører til de metylenprotoner av estergruppen. Imidlertid, ved bruk av NMR-instrumenter som opererer i Larmor lavere frekvenser enn 850 MHz, analyse av EE ved hjelp av 1H NMR bør unngås på grunn av delvis overlapping av toppen ved δ 4.12 med topp ved δ 4,14 TGS, og overlappingen av signalet ved δ 1,25 med det brede signal av de alifatiske metylenprotoner ved δ 1,23-1,35. Store avvik ble også observert mellom 1H og 13C analyse av EPA i enkelte prøver, 13C NMR var nærmere den merkede sammensetningen gitt av tHan produsenten. Dette er sannsynligvis på grunn av overlappingen av signalet ved δ 1,69, som brukes for EPA-analyse, sammen med signalene fra andre forbindelser som forekommer i enkelte typer av fiskeolje bilag. Andre feil i quantifications kan oppstå ved bruk av en intern standard på grunn av den usikre renheten av den indre standarden, og fra feil i veie.
kan uttrykkes sammensetningsanalysen i relative molare konsentrasjoner uten anvendelse av en indre standard. Hvis resultatene trenger å bli uttrykt i absolutte konsentrasjoner, for eksempel som milligram fettsyre per gram olje (mg / g), er bruk av en intern standard er nødvendig. Men i tilfeller hvor NMR-signalet av interesse tilhører flere forbindelser med forskjellige molekylvekter, kan ikke resultatene uttrykkes som mg / g, selv ved bruk av en intern standard. I tillegg, ved anvendelse av intern standard vanligvis øker lengden av analysen fordi den vanligste indre s tandards, slik som BHT, er små molekyler med høy molekyl symmetri, noe som resulterer i lange relaksasjonstider. Da repetisjonstiden (forsinkelse mellom pulser + akvisisjonstid) er innstilt i samsvar med den lengste relaksasjonstiden T 1 i prøven, vil bruk av en intern standard øke varigheten av forsøkene som lengre tid mellom pulser er nødvendig. Dette er en særlig viktig faktor for 13 C-NMR-analyse på grunn av den usedvanlig lang T 1 relaksasjonstid for karbonkjerne. Tilsetningen av en paramagnetisk forbindelse så som Cr (acac) 3 effektivt kan redusere T en relaksasjonstid. Den anbefalte konsentrasjon av Cr (acac) 3, er 0,75 mg / ml løsning. Høyere konsentrasjoner av Cr (acac) 3 kan vurderes for ytterligere reduksjon av T 1, imidlertid kreves forsiktighet for å unngå reduksjon i S / N på grunn av linjeutbredelse.
ntent "> Selv om 13C NMR er karakterisert ved et langt større spektral oppløsning sammenlignet 1H, følsomheten av 13C NMR-eksperiment er betydelig lavere på grunn av den lave naturlige rikelighet (1,1%) og den lave gyromagnetiske forhold (67,26 10 6 rad r -1 T -1) av 13 C-kjerner. i tillegg er de lange T 1 relaksasjonstidene 13C øke lengden av analysen. Dette kan være et problem når den tilgjengelige olje for analyse er begrenset, fordi et øket bør brukes antall sveipinger for å oppnå en rimelig signal til støyforhold.Begrensninger i følsomheten og oppløsningen av NMR-spektrene hindre analyse av mange små forbindelser i fiskeolje som kan analyseres med de andre teknikker som GC. For eksempel, er ute av stand til å skille de enkelte steroler eller fettsyrer (for eksempel palmitinsyre og stearinsyre), mens 13 C-1 Η NMRer ikke i stand til å bestemme forbindelser som forekommer i meget lav konsentrasjon i fiskeolje som dodekansyre og myristinsyre, som overlapper med signalene fra alle mettede fettsyrer ved δ 173,24 og 172,82 δ. Selv om økning av mengden av prøven som blir analysert gjør analysen for noen mindre forbindelser bart kreves forsiktighet for svært konsentrerte prøver, på grunn av deres økte viskositet. Meget viskøse oppløsninger som inneholder mer enn 150 mg av olje bør unngås fordi det er en reduksjon i S / N på grunn av linjeutbredelse som følge av de reduserte spinn-spinn T2-relaksasjonstider. I tillegg er lengre forsinkelser mellom pulser nødvendig på grunn av lengre T 1, og det er flere problemer i mellomlegg og dermed i oppløsning.
Alle forbindelsene som ble analysert i fiskeolje med NMR kan kvantifiseres samtidig i et øyeblikksbilde uten å bruke noen separasjons- eller rensetrinn. NMR-enalysis er hurtig som den 1H spekteret kan bli registrert i løpet av mindre enn ett minutt, mens 13 C-NMR-kjøpet varer i 10 min. Det bør bemerkes imidlertid at det er noen faktorer som påvirker datafangsten. Nærmere bestemt administreres i 13C-NMR, på 10 min kjøretid bare kan oppnås uten bruk av intern standard, og ved bruk av kryogent avkjølte prober, karakterisert ved at RF-spolen og forforsterkeren blir avkjølt, og derved den termiske støyen minimaliseres. En 10-15 gangers økning i den eksperimentelle tiden bør være forventet for 13C-NMR-analyse ved romtemperatur (konvensjonelle) prober brukes.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
NMR-spektroskopi viste seg å være et effektivt verktøy for kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av sammensetningen av fiskeolje kosttilskudd, og på grunn av dens rapidness det har potensiale til å bli brukt for høy kapasitets screening av et stort nu mber av fiskeolje prøver. NMR-spektroskopi er per definisjon en kvantitativ metodikk, ettersom signalet området er direkte proporsjonalt med antallet kjerner som forårsaker signalet. Mens akutt giftige kjemikalier er nødvendige for å fremstille NMR-prøvene, denne fremgangsmåten er miljøvennlig fordi slike små mengder av disse kjemikalier (f.eks CDCI3) blir brukt i motsetning til andre metoder som krever store mengder løsningsmiddel for å eluere prøvene. I tillegg har NMR flere fordeler sammenlignet med andre analytiske metoder. Ingen kalibrering med standarder er nødvendig før analyse, og en minimal prøvepreparering uten noen separasjons- og rensetrinn blir vanligvis tatt i bruk, som gjør NMR en meget rask analytisk verktøy. I tillegg er 13C NMR den beste tilgjengelige metodikk for bestemmelse av posisjons fordeling av forskjellige fettsyrer på glycerol skjelettet. Selv om den enzymatiske hydrolyse har blitt brukt som et alternativ er ikke alltid pålitelig= "xref"> 24. Dette er av spesiell betydning fordi det er en betydelig interesse i å studere regiospecificity av ulike fettsyrer i matvarer, som det har vist seg at dette påvirker deres funksjon i menneskets kosthold 25, 26.
fremtidige Applications
Til tross for avtalen mellom NMR analyse og produktenes etikett, samt det faktum at det er noen studier som viser enighet mellom GC og NMR, tror vi at strengere og omfattende intra-laboratoriestudier er pålagt å undersøke avtalen mellom NMR og tradisjonell metoder for analyse av fiskeolje bestanddeler ved hjelp av et større antall prøver, fiskeoljeprodukter av forskjellig opprinnelse, og sertifisert standardløsninger.
Et annet viktig fremtidig anvendelse av NMR i fiskeolje analysen vil være bestemmelsen av oksidasjonsprodukter. I tillegg til bestemmelseav de viktigste forbindelser i fiskeolje, flere primære og sekundære oksidasjonsprodukter i fiskeolje, som for eksempel aldehyder og peroksider, er til stede. 1H NMR kan potensielt anvendes for evaluering av oksidasjons status i fiskeolje kosttilskudd, under forskjellige oksidasjonsbetingelser, som vist i figur 3. Den største utfordringen i denne analysen vil være NMR oppdraget og identifisering av individuelle oksydasjonsprodukter. Fremskritt i følsomhet av NMR-maskinvaren vil også tillate identifisering av de enkelte steroler ved hjelp av 13C NMR. NMR-spektroskopi kan også bli anvendt for analyse av fisk vev som en helhet til og med uten noen ekstraksjon ved hjelp av høyoppløselig av Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR.
Kritiske trinn i protokollen
To av de mest kritiske trinn som påvirker nøyaktigheten av kvantitativ NMR-spektrene omfatter valg av en 90 ° puls, og bruken av en forsinkelse mellom pulses ≥ 5 x T 1. Pulsvinkelen er proporsjonal med pulsbredde som er en kalibrert NMR-parameter som avhenger av instrumentering og prøven. En 90 ° puls er avgjørende for den fullstendige omdannelse av langsgående (z) magnetiseringen til den observerbare tverrgående (XY) magnetisering. Det er viktig å merke seg at før puls kalibrering, NMR probet må være godt avstemt og matchet. Dette vil optimalisere overføring av RF-effekt til prøven, og dermed forlenge S / N og sikre effektiv avkobling. Sonden tuning er mest påvirket av den dielektriske konstant for prøven, slik at dersom det er forskjeller i konsentrasjonen mellom samplene, gjenta justeringsprosessen for hver av dem. 1D 13C NMR eksperiment omfatter både 13 C-og1H kanaler slik automatisk søking og tilpasning som er nødvendig for begge kjerner.
En forsinkelse mellom pulser som er lengre enn 5 x T 1 sikrer den fullstendige recovery av netto magnetisering til sin opprinnelige verdi. Dersom alle resonanser i spekteret ikke er fullstendig avslappet før hver puls, blir signalet delvis undertrykket, og dette fører til unøyaktigheter i integrasjonen. T 1 verdi er en kritisk faktor som påvirker lengden av forsøket, og det er avhengig av den magnetiske feltstyrke, så vel som viskositeten av prøven. Gitt at viskositeten mellom samplene er lik, skal T 1 relaksasjonstider bestemmes for hvert instrument bare i begynnelsen av analysen sesjon.
Et annet viktig trekk ved fiskeolje analyse med 13C-NMR er valget av den passende pulssekvensen. Den mest pålitelige metode for kvantitativ analyse 13 C er den inverse gated dekopling eksperiment, hvor bredbånd proton-dekobling brukes bare under innhentingen perioden, og dermed er det ingen polariseringsoverføring fra 1 time til 13C via den nukleære Overhauser-effekt (NOE). Imidlertid, mens den fullt utkoblet NMR-eksperiment kan anvendes for kvantitative formål kreves forsiktighet ved bruk av dette forsøk fordi det finnes forskjellige NOE-faktorer hos karbonatomer med forskjellige multiplisiteter og derfor integrert sammenligning mellom metyl, metylen, metan og karbonylkarboner må unngås. Til tross for dette, når bare karbonene lignende flertall og kjemisk miljø som ble analysert, er det fullt utkoblet metode pålitelig. Et eksempel på dette er karbonylkarboner av fettsyrer som har vist seg å ha ingen signifikante forskjeller i de NOE-faktorene etter frakobling 27. I tillegg til karbonatomer som bærer protoner, gir det fullstendig avkoplet eksperimentet høyere følsomhet på grunn av NOE-bidrag på NMR-signalintensiteten. En sammenligning mellom spektre oppnås med de to pulssekvenser er vist i figur S1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av mat for Health Discovery tema på Ohio State University og Institutt for ernæringsvitenskap og teknologi ved Ohio State University. Forfatterne ønsker å takke NMR-anlegget ved Ohio State University og NMR-anlegget ved Penn State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avance III 850 NMR instrument | Bruker | ||
| Avance III 500 NMR instrument | Bruker | ||
| TCI 5 mm probe | Bruker | Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N) | |
| BBO prodigy 5 mm probe | Bruker | Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P) | |
| Spinner turbin | Bruker | NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place | |
| Topspin 3.5 | Bruker | ||
| deuterated chloroform | Sigma-Aldrich | 865-49-6 | 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS |
| 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol | Sigma-Aldrich | 128-37-0 | purity >99% |
| Fish oil samples | |||
| NMR tubes | New Era | NE-RG5-7 | 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube |
| BSMS | Bruker | Bruker Systems Management System; control system device |
References
- Simopoulos, A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56 (8), 365-379 (2002).
- Goodnight, S. H. Jr, Harris, W. S., Connor, W. E. The effects of dietary omega 3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study. Blood. 58 (5), 880-885 (1981).
- Harper, C., Jacobsen, T. Usefulness of omega-3 fatty acids and the prevention of coronary heart disease. Am. J. Cardiol. 96 (11), 1521-1529 (2005).
- Kremer, J. M., et al. Effects of high-dose fish oil on rheumatoid arthritis after stopping nonsteroidal antiinflammatory drugs. Clinical and immune correlates. Arthritis and Rheumatol. 38 (8), 1107-1114 (1995).
- Malasanos, T., Stackpoole, P. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus. Diabetes Care. 14, 1160-1179 (1991).
- Han, Y., Wen, Q., Chen, Z., Li, P. Review of Methods Used for Microalgal Lipid-Content Analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Guillén, M., Ruiz, A. 1H nuclear magnetic resonance as a fast tool for determining the composition of acyl chains in acylglycerol mixtures. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 502-507 (2003).
- Sacchi, R., Medina, I., Aubourg, S. P., Addeo, F., Paolillo, L. Proton nuclear magnetic resonance rapid and structure specific determination of ω-3 polyunsaturated fatty acids in fish lipids. J. Am Oil Chem Soc. 70, 225-228 (1993).
- Igarashi, T., Aursand, M., Hirata, Y., Gribbestad, I. S., Wada, S., Nonaka, M. Nondestructive quantitative acid and n-3 fatty acids in fish oils by high-resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 737-748 (2000).
- Plans, M., Wenstrup, M., Saona, L. Application of Infrared Spectroscopy for Characterization Dietary Omega-3 Oil Supplements. J. Am. Oil Chem. Soc. 92, 957-966 (2015).
- Jian-hua, C. I. A. Near-infrared Spectrum Detection of Fish Oil DHA Content Based on Empirical Mode Decomposition and Independent Component Analysis. J Food Nutr Res. 2 (2), 62-68 (2014).
- Millen, A. E., Dodd, K. W., Subar, A. F. Use of vitamin, mineral, nonvitamin, and nonmineral supplements in the United States: The 1987, 1992, and 2000 National Health Interview Survey results. J. of Am. Diet Assoc. 104 (6), 942-950 (2004).
- Dwyer, J. T., et al. Progress in developing analytical and label-based dietary supplement databases at the NIH office of dietary supplements. J. Food Compos. Anal. 21, S83-S93 (2008).
- Monakhova, Y. B., Ruge, I., Kuballa, T., Lerch, C., Lachenmeier, D. W. Rapid determination of coenzyme Q10 in food supplements using 1H NMR spectroscopy. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 83 (1), 67-72 (2013).
- Monakhova, Y. B., et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the internet. Drug Test. Anal. 5 (6), 400-411 (2013).
- Berger, S., Braun, S. 200 and more NMR experiments: a practical course. , Wiley-VCH. Weinheim. (2004).
- Knothe, G., Kenar, J. A. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMRspectroscopy. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 106, 88-96 (2004).
- Sacchi, R., Medina, J. I., Aubourg, S. P., Paolillo, I. G. L., Addeo, F. Quantitative High-Resolution 13C NMR Analysis of Lipids Extracted from the White Muscle of Atlantic Tuna (Thunnus alalunga). J. Agric. Food Chem. 41 (8), 1247-1253 (1993).
- Dais, P., Misiak, M., Hatzakis, E. Analysis of marine dietary supplements using NMR spectroscopy. Anal. Methods. 7 (12), 5226-5238 (2015).
- Pickova, J., Dutta, P. C. Cholesterol Oxidation in Some Processed Fish Products. J. Anal. Oil Chem. Soc. 80 (10), 993-996 (2003).
- Siddiqui, N., Sim, J., Silwood, C. J. L., Toms, H., Iles, R. A., Grootveld, M. Multicomponent analysis of encapsulated marine oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR techniques. J. of Lipid Rsrch. 44 (12), 2406-2427 (2003).
- Sua´rez, E. R., Mugford, P. F., Rolle, A. J., Burton, I. W., Walter, J. A., Kralovec, J. A. 13C-NMR Regioisomeric Analysis of EPA and DHA in Fish Oil Derived Triacylglycerol Concentrates. J. Am. Oil Chem. Soc. 87, 1425-1433 (2010).
- Youlin, X. A., Moran, S., Nikonowiczband, E. P., Gao, X. Z-restored spin-echo 13C 1D spectrum of straight baseline free of hump, dip and roll. Magn. Reson. Chem. 46, 432-435 (2008).
- Tengku-Rozaina, T. M., Birch, E. J. Positional distribution of fatty acids on hoki and tuna oil triglycerides by pancreatic lipase and 13C NMR analysis. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 116 (3), 272-281 (2014).
- Berry, S. E. E. Triacylglycerol structure and interesterification of palmitic and stearic acid-rich fats:An overview and implications for cardiovascular disease. Nutr. Res. Rev. 22 (1), 3-17 (2009).
- Hunter, J. E. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides. Lipids. 36, 655-668 (2001).
- Vlahov, G. Regiospecific analysis of natural mixtures of triglycerides using quantitative 13C nuclear magnetic resonance of acyl chain carbonyl carbons. Magnetic Res. in Chem. 36, 359-362 (1998).
